專利名稱：抗人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶單鏈抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程抗體技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于抑制腫瘤細(xì)胞分裂生長，誘導(dǎo) 腫瘤細(xì)胞凋亡的基因工程單鏈抗體。
背景技術(shù)：
端粒、端粒酶與腫瘤的關(guān)系是近年來受到國際醫(yī)學(xué)界高度重視的研究熱點。腫瘤細(xì)胞 尤其是惡性腫瘤細(xì)胞常常因為獲得永生性而具有了無限增殖能力，而腫瘤細(xì)胞無限增殖能 力的維持則依賴于端粒酶的活性。大量研究表明，各類惡性腫瘤中幾乎都有端粒酶的異常
高表達(dá)(KimNW, 1994)。人端粒酶是由RNA和蛋白質(zhì)組成，其中人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶 (human telomerase reverse transcriptase, hTERT)是端粒酶的催化活性亞單位(TakayaraJ， 1998; KanayaT， 1998; TakayaraM， 1998)。已發(fā)現(xiàn)大約85%的人類惡性腫瘤具有hTERT 的高表達(dá)，所以抑制人端粒酶端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的活性為抗腫瘤藥物的設(shè)計提供了新的目 標(biāo)。
單鏈抗體(single chain Fv， ScFv)是一個重要的基因工程抗體，是在DNA水平上利用 基因工程方法使抗體重鏈可變區(qū)(VH)基因和輕鏈可變區(qū)(VL)基因通過一段約5 25個 氨基酸寡核苷酸(linker)的連接肽， 一般為(Gly4Ser) 4，首尾拼接而形成的重組蛋白。 具有(1)制備方法簡單，成本低；(2)免疫原性弱；(3)能均勻分布于腫瘤且與抗原 結(jié)合特異性強；(4)體內(nèi)周轉(zhuǎn)快；(5)易于進一步進行基因工程改造等特點，因此它的 應(yīng)用領(lǐng)域相當(dāng)廣泛，尤其在腫瘤人工免疫治療方面。ScFv基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)抗體 是繼反義核酸、核酶和顯性負(fù)突變技術(shù)后又一巧妙的基因治療策略，同時又是用于表型敲 除研究的又一有力工具，可作用于各種靶分子。將含抗癌相關(guān)蛋白的抗體基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞,細(xì) 胞表達(dá)的scFv與癌相關(guān)蛋白作用，可能間接抑制腫瘤的生長。目前這方面的研究主要集中 在腫瘤細(xì)胞高表達(dá)的某些蛋白及與腫瘤細(xì)胞耐藥、侵襲和轉(zhuǎn)移等相關(guān)的蛋白上。人端粒酶 逆轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá)和激活在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化中起重要作用,因此他們也就成為抗癌治療 的新的耙標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抗人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶單鏈抗體基因，將該抗體的編碼基因?qū)?入到腫瘤細(xì)胞內(nèi)部進行表達(dá)。體內(nèi)表達(dá)的抗體分子與相應(yīng)的催化亞基特異性結(jié)合，可阻斷 端粒酶裝配，封閉腫瘤細(xì)胞中端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長分裂，誘導(dǎo) 其凋亡。
本發(fā)明的內(nèi)容包括利用生物工程技術(shù)，提供編碼抗hTERT-scFv基因和由此推斷的 氨基酸序列；提供含有所述的抗hTERT-scFv基因的表達(dá)質(zhì)粒和利用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的工程菌； 同時提供從所述工程菌制備重組抗hTERT-scFv的方法，以及將抗hTERT-scFv基因作為治 療對人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶陽性腫瘤藥物制劑應(yīng)用。
本發(fā)明提出的重組抗hTERT-scFv基因，是由連接抗體的Vl和基因VH，建立一個抗 hTERT-scFv基因，該基因由738個堿基對組成。這種scFv的核苷酸序列為SEQ.ID.No.l 。 本發(fā)明的具體過程如下
1、 從穩(wěn)定分泌人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞中提取、純化mRNA。體外 反轉(zhuǎn)錄cDNA。
2、 克隆輕鏈可變區(qū)基因，連入pGEM-T載體(Promega)，進行序列分析，經(jīng)同源對 比分析，證實該基因片段為抗體輕鏈可變區(qū)基因，序列為SEQ.ID.N03。
3、 克隆重鏈可變區(qū)基因，連入pGEM-T載體，進行序列分析，經(jīng)同源對比分析，證 實該基因片段為抗體重鏈可變區(qū)基因，序列為SEQ. ID. N04。
4、 連接抗體輕鏈，重鏈基因，以編碼(Gly4Ser) 4的連接DNA序列，連接抗體輕、 重鏈可變區(qū)，構(gòu)建抗hTERT-scFv基因，序列為SEQ. ID. NOl。
將上述scFv基因克隆到商業(yè)化的pET28a表達(dá)載體(Novagen)上，轉(zhuǎn)化BL21宿主大腸 桿菌，獲得的轉(zhuǎn)化菌株為工程菌株Rosetta/hTERT-scFv。
培養(yǎng)該工程菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3-4小時，利用該單鏈抗體上融合的6個組氨酸 標(biāo)簽，對其進行Ni柱親和層析純化，咪唑濃度梯度洗脫，得到本發(fā)明的分子量為30KD的 單鏈抗體蛋白，其序列為SEQ. ID. N02 。
TRAP-ELISA方法在體外檢測純化的hTERT單鏈抗體蛋白對HeLa細(xì)胞中內(nèi)源端粒酶 逆轉(zhuǎn)錄酶活性的影響。
將上述scFv基因克隆到真核表達(dá)載體pEGFP-Cl(Clontech)上，構(gòu)建可以用于腫瘤基因 治療的細(xì)胞內(nèi)抗體表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-Cl-scFv。
pEGFP-Cl-scFv和pEGFP-Cl質(zhì)粒分別瞬時轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后三天內(nèi)，每隔12 小時用PI染色法測定細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡。


圖1為抗hTERT-scFv基因工程菌表達(dá)分析圖。
其中1為pET28a/Rosetta誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物，2為pET28a-scFv/Rosetta基因工程菌表達(dá) 產(chǎn)物，3為純化得到的hTERT-scFv蛋白，分子量為30KD。 圖2為抗hTERT-scFv對端粒酶活性的抑制反應(yīng)柱形圖。
其中左側(cè)為添加不相關(guān)蛋白的對照反應(yīng)體系端粒酶活性，右側(cè)為加hTERT-scFv后反 應(yīng)體系中的端粒酶活性，可以看到純化的hTERT-scFv對HeLa細(xì)胞端粒酶活性的抑制作用 可以達(dá)到42.6%。該圖代表三次獨立實驗的結(jié)果，數(shù)據(jù)經(jīng)t檢測，"代表p〈0.001。
圖3為真核表達(dá)scFv基因后MTT法測定細(xì)胞活力的柱形圖。
分別轉(zhuǎn)染pEGFP-Cl-scFv和pEGFP-Cl質(zhì)粒后每個不同的時間點(24h, 36h, 48h, 60h， 72h和84h)的HeLa細(xì)胞，用MTT法染色后，酶標(biāo)儀測定0057()，與本底值比較，得相對 細(xì)胞活力。該圖代表三次獨立實驗的結(jié)果，數(shù)據(jù)經(jīng)t檢測，Mt表p〈0.01，"代表p〈0.001。
圖4為真核表達(dá)scFv基因后PI染色法測定細(xì)胞周期的柱形圖。
分別轉(zhuǎn)染pEGFP-Cl-scFv和pEGFP-Cl質(zhì)粒后每個不同的時間點(24h, 36h, 48h, 60h, 72h和84h)的HeLa細(xì)胞，用PI染色后，流式細(xì)胞術(shù)測定處于各細(xì)胞周期的細(xì)胞所占的百 分率。該圖代表三次獨立實驗的結(jié)果，數(shù)據(jù)經(jīng)t檢測，Mt表p〈0.01，"代表p〈0.001。
具體實施方式
實施例1:
1、 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定將分泌hTERT單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)于含10。/。小牛血清 的完全RPMI1640培養(yǎng)基中。培養(yǎng)箱含5%C02的混合氣體，濕度為98%。用ELISA方法 鑒定培養(yǎng)上清中單抗的特異性和滴度。
2、 抗hTERT單克隆抗體輕鏈、重鏈可變區(qū)基因的克隆取生長良好雜交瘤細(xì)胞株， 用Trizol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用PCR技術(shù)，在反應(yīng)體系中加入cDNA和 一套抗體輕鏈或重鏈可變區(qū)引物，10XPCR反應(yīng)緩沖液，終濃度為2.5mM的dNTP， 1 u L7k DNA聚合酶，總反應(yīng)體系為50yL。進行30個循環(huán)反應(yīng)，每個循環(huán)的條件是94'C變 性30秒，55'C退火30秒，72'C延伸1分鐘，最后一個循環(huán)結(jié)束后72'C保溫10分鐘。膠 回收輕鏈和重鏈可變區(qū)基因擴增產(chǎn)物后連入pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌保存陽性克隆。
輕鏈、重鏈可變區(qū)基因的篩選將輕鏈、重鏈可變區(qū)基因連入pGEM-T載體轉(zhuǎn)化大腸 桿菌DH5 a ， PCR驗證轉(zhuǎn)化子。DNA測序分析hTERT抗體重鏈可變區(qū)是由351個核苷酸 組成，其基因序列為SEQ.ID.No.3。輕鏈可變區(qū)是由325個核苷酸組成，其基因序列為 SEQ.ID.No.4。
3、 hTERT-ScFv的構(gòu)建PCR分別在重鏈、輕鏈可變區(qū)片段兩端引入限制性內(nèi)切酶 位點BawHI ， H/"dlI和編碼(Gly4Ser)4的連接DNA序列?；厥占兓螅貽VERLAP PCR 將重鏈和輕鏈可變區(qū)連接成端粒酶ScFv基因片段，割膠回收，用^/wHI和iVa I雙酶切 消化，割膠回收，連入預(yù)先切好的pET28a表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a擴增，PCR 和限制性內(nèi)切酶驗證轉(zhuǎn)化子。序列分析證明構(gòu)建的單鏈抗體具有hTERT抗體的輕、重鏈可
變區(qū)以及(Gly4Ser) 4的連接肽，由738個核苷酸組成其基因序列為SEQ.ID.No.1。
4、 單鏈抗體基因的表達(dá)隨機選取陽性克隆進行小量表達(dá)篩選，挑單菌接種于 Kan+Cm+LB培養(yǎng)液中，pET28a/Rosetta為負(fù)對照，37'C搖床過夜，第二天按ly。接種于2mL 新鮮培養(yǎng)液中，37'C培養(yǎng)2-3h，吸出lmL未誘導(dǎo)菌液，置于1.5mL離心管中，余下菌液 加入IPTG至終濃度為lmM， 37。C培養(yǎng)3-4h。超聲裂解菌體蛋白，ELISA方法挑選與抗原 結(jié)合活性最高的陽性克隆，大量表達(dá)(圖l)。
5、 單鏈抗體蛋白的純化利用該單鏈抗體上融合的6個組氨酸標(biāo)簽，對其進行Ni柱 親和層析純化，咪唑濃度梯度(20到100mM)洗脫得到分子量為30KD的單鏈抗體蛋白
(圖1 )。從DNA序列推導(dǎo)hTERT-scFv是由244個氨基酸組成，其序列為SEQ.ID.No.2。
6、 單鏈抗體蛋白對hTERT活性抑制的檢測依照TRAP-ELISA端粒酶活性檢測試劑 盒說明書操作，收集2Xl(^體外培養(yǎng)的人宮頸癌HeLa細(xì)胞，裂解緩沖液抽提蛋白，以蛋 白裂解液為模板，并在反應(yīng)體系中添加純化的單鏈抗體蛋白，以添加無關(guān)單鏈抗體蛋白的 反應(yīng)作為負(fù)對照，以未添加單鏈抗體的HeLa細(xì)胞裂解液中的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶活力為100%。 該反應(yīng)液在25"C孵育30分鐘后作為模板迸行PCR，迸行35個循環(huán)反應(yīng)，每個循環(huán)的條件 是94'C30秒，59X:60秒。檢測到該純化的單鏈抗體對端粒酶活性有42.6%的抑制活性， 實驗重復(fù)三次后取平均數(shù)土S.D (圖2)。
本發(fā)明構(gòu)建的抗hTERT單鏈抗體具有兩個抗原結(jié)合臂，可以有效地和靶抗原結(jié)合。單 鏈抗體分子量只相當(dāng)于完整抗體的1/6，在臨床應(yīng)用上比完整抗體優(yōu)越免疫原性弱，對 實體瘤滲透能力強，可以用基因工程手段發(fā)酵生產(chǎn)。與傳統(tǒng)的單克隆抗體藥物相比，其可 以驚醒大規(guī)模細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)，且價格低廉，易于普及應(yīng)用，是一種極具應(yīng)用潛力的抗體形 式。
實施例2:
1、 hTERT-scFv真核表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計引物，使用PCR方法在hTERT-scFv基因 的兩端引入H/wcffll和Ba附HI酶切位點。在反應(yīng)體系中加入模版和引物，10XPCR反應(yīng)緩沖 液，終濃度為2. 5mM的dNTP， 1 u LT^DNA聚合酶，總反應(yīng)體系為50 u L。進行30個循環(huán) 反應(yīng)，每個循環(huán)的條件是94'C變性30秒，6CTC退火30秒，72'C延伸1分鐘，最后一個 循環(huán)結(jié)束后72"C保溫10分鐘。用^wtHI和臉oI雙酶切消化，割膠回收，連入預(yù)先切好 的pEGFP-Cl真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a擴增，PCR和限制性內(nèi)切酶驗證轉(zhuǎn)化 子。序列分析驗證陽性克隆。
2、 本發(fā)明依照產(chǎn)品說明書，使用LipofectAMINETM2000脂質(zhì)體(Invitrogen)進行轉(zhuǎn) 染，轉(zhuǎn)染后24-84小時，進行細(xì)胞生長效應(yīng)測定。以每孔5X1()S個細(xì)胞的密度接種6孔板，
在鋪板率達(dá)到90%時，將2.5^il脂質(zhì)體和3嗎質(zhì)粒分別溶解于250 plOPTI-MEM，室溫靜 止5分鐘后，將脂質(zhì)體和質(zhì)粒均勻混合，室溫靜止25分鐘。在6孔板中加入1.5mL無血 清培養(yǎng)基后，加入轉(zhuǎn)染混合液，孵育5小時后，更換新鮮完全培養(yǎng)基。實驗組質(zhì)粒為 pEGFP-Cl-scFv，對照組為載體質(zhì)粒pEGFP-Cl 。
3、 MTT法檢測細(xì)胞存活率轉(zhuǎn)染24小時后每個不同的時間點((24h, 36h, 48h， 60h, 72h 和84h)，對照組和實驗組細(xì)胞分別用胰酶消化，調(diào)整密度為1X10V孔接種96孔板，24小 時后加入MTT， MTT用PBS緩沖液配成5mg/mL溶液，每孔加10uL，孵育3小時，使 MTT還原為甲月替。吸出上清液，加入100uL的酸化異丙醇溶解甲月替。酶標(biāo)儀(Bio-Rad) 檢測570nm波長處吸光值OD57Q。將各測試孔的OD值減去本底OD值(完全培養(yǎng)基加 MTT，無細(xì)胞)，各重復(fù)孔的OD值取平均數(shù)，細(xì)胞的存活率- (實驗組細(xì)胞OD/對照組細(xì) 胞OD) X100% (圖3)。
4、 PI染色法檢測細(xì)胞周期轉(zhuǎn)染24小時后每個不同的時間點(24h, 36h, 48h, 60h, 72h 和84h)，分別收集6孔板中對照組和實驗組細(xì)胞(包括已經(jīng)漂浮的細(xì)胞)，PBS洗滌后，于 70%的乙醇中，4。C固定過夜，1000rpm離心10分鐘后，加入RNase A (10昭/mL)和PI (50嗎/mL)， 37。C反應(yīng)15分鐘，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期(圖4)。
本發(fā)明以人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶為靶點，結(jié)合基因工程技術(shù)，構(gòu)建了具有分子量小，實體 組織穿透力強，免疫原性低等優(yōu)點的單鏈抗體，該抗體被證明有很好的抗原結(jié)合力。且由 于該單鏈抗體可以有效地與端粒酶的催化亞基結(jié)合從而顯著降低了端粒酶活性。在基于抗 人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶單鏈抗體基因的基因治療中，我們也觀測到了該胞內(nèi)抗體的表達(dá)對細(xì)胞 生長和周期顯著的阻礙作用。因此，本發(fā)明有可作為一種新型的抗腫瘤制劑；且由于該基 因工程抗體制備工藝簡單，成本低廉，所以有巨大的市場潛力。
序列表樣例
<no〉復(fù)旦大學(xué)
<120>抗人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶單鏈抗體
<160/ 2 〈170〉 <21()〉 1 <211> 738 <212> DNA
〈213〉大腸桿菌種65"sc力eri'c/n'a coU
<220〉 <400> 1<formula>formula see original document page 8</formula>
<213〉大腸桿菌種65"sc力en'c/n'a coh'J
<221〉 V—segment
<222〉 (l)... (116)
<223〉抗端粒,抗體重鏈可變區(qū)
〈220>
《221〉 V—segment
〈222〉 (137)... (244)
<223>抗端粒酶抗體輕鏈可變區(qū)
《22()>
<221〉 N_segment <222> (117)... (236)
<223〉連接抗端粒酶抗體輕繭鏈可變區(qū)的連接肽 "0()> 2
ttg cag ctg cag gag tct ggt gga gga ttg gtg cag cct咖ggg tea ttg咖etc tea 60 Leu Gin U'u (Uri Glu Ser Gly Gly Giy Lt，u Val Gin P—ro Lys (;iy Ser Leu Lys Leu Ser 1 5 10 15 20
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tat, gcc gat tea gtg aaa gac agg etc acc ate tec aga gat gat tea caa. aac atg etc 240 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Leu Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Gin A幼Met Leu 65 70 75 80
tat etc cfia a.tg acc aac ttg a幼act ga.g gac Tyr Leu Gin Met Thr Asn Leu Lys Thr Ghi Asp 85 90 95 100
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tea ggc gga ggt ggc tct ggc ggt gga ggt teg ggt gga ggc ggt teg gac a.tt gtg atg 420
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Thr (;ln Ser l:)e() Ala. Ser Leu A:l.a. Va.Ser Leu (;:l.y Gin Arg Ala. Th:r :[le Se:r Cys Arg 145 150 155 160
gec age aaa a.gt gtc a,gt a.ca tct. ggc t.at. agt tat atg cac tgg a.ac caa c鄰a.aa cca 540
Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gl.y Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gin Gin Lys Pro 165 170 175 180
gga cag cca ccc aga etc etc ate tat ctt gta. tec aac eta gaa tct ggg gtc cct gec 600
Gly Gin Pro Pro Arg Leu Leu lie Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 185 190 195 200
agg tt.c agt ggc a.gt ggg u't ggg a('.a gac ttc acc etc aac ate cat cct gtg ga名gag 660
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Glu As!) Ala Ala Thr Tyr Tyr Cy's Gin His lie Arg Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly
225 230 235 240 cca age 't.gg a.aa Pro Ser Trp Lys <210> 3 <211〉 351 <212〉 DNA
<213〉大腸桿菌種(^sc力e/7'c/w'a coh'J
<220〉
732
<40()> 3
atgUgcagc tgca卿gtc tggtggagga Uggtgcagc ctaaagggtc
tcatgtgcag cct.ctggatt c.accctcat]t acctac.gcca tgaactgggt
cc鄧gafmgg gttt.gg肌tg gattactcgc ataag肌gta腦igtaatafi
tattatgccg iattxagtgaa agacaggctc accatctcca gagatgattc
ctcta.tctcc eiaatga,ccaa cttgaaaact, g鄧ga,caca.g ccacgtatta ggctatgctt tggactactg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc a <210〉 4
〈211 〉 325
<212、跳
<213>大腸桿菌種(r&r力er/c力is co7/J
<220>
〈■400/ 4
ggacattgtg atgacccagt ct，ccagcttc cttagctgta tctctggggc catctcatgc agggccagca aaagtgtcag tacatc.tggc tatagttata ccaacagaaa ccaggacagc cacccagact cctcatctat cttgtatcca tggggtccct gcc鄉(xiāng)t，tca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcaccc tcctgtggag gaggaggatg ctgcaaccta ttactgtcag caca.ttaggg
ccgccaggct :120
ttttgcaaca 180
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aga,gggccac 60 tgcactggaa 120 accteigtiatc 180 tcaacatcca 240 agcttac(icg 300
ttcggagggg ggaccaagct ggaaatga 32權(quán)利要求
1、一種抗人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶單鏈抗體基因，該單鏈抗體基因是由738個核苷酸組成，其序列為SEQ.ID.No.1。
2、 一種抗人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶單鏈抗體蛋白，由244個氨基酸組成，其序列為 SEQ. ID. No. 2。
3、 一種如權(quán)利要求1所述的單鏈抗體作為治療端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶陽性腫瘤的藥物制劑 的應(yīng)用。
4、 一種如權(quán)利要求1所述的抗人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶單鏈抗體基因的制備方法，其特征 在于具體步驟如下(1) 從穩(wěn)定分泌人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞中提取、純化mRNA，體外 反轉(zhuǎn)錄cDNA;(2) 克隆輕鏈可變區(qū)基因，連入pGEM-T載體，進行序列分析，經(jīng)同源對比分析，證實 該基因片段為抗體輕鏈可變區(qū)基因，序列為SEQ. ID.N03;(3) 克隆重鏈可變區(qū)基因，連入pGEM-T載體，進行序列分析，經(jīng)同源對比分析，證實 該基因片段為抗體重鏈可變區(qū)基因，序列為SEQ. ID. N04;(4) 連接抗體輕鏈，重鏈基因，以編碼(Gly4Ser) 4的連接DNA序列，連接抗體輕、 重鏈可變區(qū)，構(gòu)建抗hTERT-scFv基因，序列為SEQ. ID. N01 。
全文摘要
本發(fā)明屬基因工程抗體技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種功能性表達(dá)純化的新的多肽——抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶單鏈抗體(ScFv)，以及此多肽基因作為腫瘤基因治療制劑的應(yīng)用。該基因工程抗體是由一條連接肽將天然抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)首尾相接的單一肽鏈，通過正確折疊，兩個可變區(qū)由非共價鍵形成具有抗原結(jié)合功能的片段，具有親本抗體結(jié)合抗原的特性和功能，該抗體可以與腫瘤細(xì)胞里廣泛而特異性表達(dá)的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合并使其失去原有活性，從而影響腫瘤細(xì)胞活力，以及細(xì)胞周期的分布，并明顯地誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的程序性死亡。且該ScFv分子量小，僅為完整抗體分子的1/6，易穿入固體組織及腫瘤內(nèi)部，是具有應(yīng)用價值的腫瘤基因治療制劑。
文檔編號C07K16/40GK101104854SQ200710038640
公開日2008年1月16日 申請日期2007年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月29日
發(fā)明者任大明, 朱向瑩, 陳麗珊 申請人:復(fù)旦大學(xué)