專利名稱：一種基因免疫治療腫瘤的靜脈用制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因制劑，特別涉及一種基因免疫治療腫瘤的靜脈用制劑。
背景技術(shù)：
hTERTC27 (C-terminal fragment of the human telomerase reverse transcriptase, hTERTC27)，是一個(gè)27kD的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶C_末端多肽，能引起端粒的 功能異常，使染色體末端快速融合而不影響端粒酶的活性，導(dǎo)致hTERT+ HeLa細(xì)胞的凋亡和 老化，在HeLa細(xì)胞的裸鼠模型上產(chǎn)生了明顯的抑瘤效果(Huang，J. J.，Lin, M. C.，Bai YX, Jing D, Wong BC, Han Sff, Lin J, Xu B, Huang CF, Kung HF. Ectopic expression of a COOH—terminal fragment of the human telomerase reverse transcriptase leads to telomere dysfunction and reduction of growth and tumorigenicity in HeLa cells. Cancer Research. 62:3226-3232, 2002. ；. Huang, J. J., Han Sff, Bai YX, Ng SSM, Jing DD, Wong BCY, Huang CF, Kung HF, and Lin MC. A human TERT C-terminal polypeptide sensitizes HeLa cells to H202_induced senescence without affecting telomerase enzymatic activity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301:627-632，2003.)。在接種了人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U87-MG)的裸鼠 中，hTERTC27也明顯地抑制腫瘤的生長(zhǎng)(Ng SS, Gao Y, Chau DH, Li GH, Lai LH, Huang PT, Huang CF, Huang JJ, Chen YC, Kung HF, Lin MC. A novel glioblastoma cancer gene therapy using AAV—mediated long-term expression of human TERT C-terminal polypeptide. Cancer Gene Therapy. 14:561-72,2007.)。hTERTC27可以作為抗hTERT+腫瘤細(xì)胞的有效基因療法，同時(shí)，hTERTC27能夠誘 導(dǎo)黑色素瘤C57BL/6小鼠體內(nèi)細(xì)胞和體液免疫，顯著地抑制黑色素瘤的生長(zhǎng)。由此可見 hTERTC27可以通過基因調(diào)節(jié)和免疫調(diào)節(jié)雙重機(jī)制共同作用于hTERT+腫瘤細(xì)胞，起到一種廣 譜的抗腫瘤效果。目前黃君健教授和孔祥復(fù)院士等發(fā)現(xiàn)hTERTC7能引起端粒功能失調(diào)不影 響端粒酶活性并抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，成功申請(qǐng)并獲得美國(guó)專利(US 7294708 )。在US 7294708中，采用的是單純的攜帶hTERTC27的質(zhì)粒對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染并觀察 其對(duì)腫瘤細(xì)胞端粒功能的影響，并篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hTERTC27及EGFP質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞株， 在裸鼠皮下接種成瘤，觀察hTERTC27對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。這樣極大的限制了 hTERTC27 作用的發(fā)揮；同時(shí)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hTERTC27的HeLa細(xì)胞裸鼠皮下種植，與自然成瘤有一定的差B.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基因免疫治療腫瘤的制劑。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是
一種基因免疫治療腫瘤的靜脈用制劑，由復(fù)制缺陷型腺病毒裝載人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶 C"末端多肽基因hTERTC27和可接受的藥用輔料組成。
優(yōu)選的，復(fù)制缺陷型腺病毒為Ad5。本發(fā)明的抗腫瘤基因制劑rAdv_hTERTC27，轉(zhuǎn)染效率高，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增值和凋亡 調(diào)節(jié)更為有效。同時(shí)，本發(fā)明的抗腫瘤基因制劑，能有效的將目的肽段轉(zhuǎn)染進(jìn)入樹突狀細(xì)胞 DCs,使DCs激活，分泌IFN- y、IL-2，增加并進(jìn)一步刺激T淋巴細(xì)胞增殖，并促使T淋巴細(xì) 胞對(duì)相應(yīng)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異性的殺傷效應(yīng)CTL，對(duì)腫瘤進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。


圖1是hTERTC27的毒種鑒定電泳圖2是rAdv-hTERTC27病毒感染靶細(xì)胞后的RT-PCR、Western blot電泳圖； 圖3是rAdv-hTERTC27對(duì)肝癌(H印a 1_6)、膠質(zhì)瘤(U87)細(xì)胞增殖和凋亡的影響圖； 圖4是rAdv-hTERTC27對(duì)細(xì)胞端粒酶活性的影響圖； 圖5是rAdv-hTERTC27轉(zhuǎn)染骨髓來(lái)源DCs效果圖； 圖6是rAdv-hTERTC27轉(zhuǎn)染對(duì)DCs分泌細(xì)胞因子的影響； 圖7是rAdv-hTERTC27-DCs促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖的作用； 圖8是rAdv-hTERTC27-DCs促進(jìn)T淋巴細(xì)胞殺傷腫瘤靶細(xì)胞的作用； 圖9是注射rAdv-hTERTC27后對(duì)小鼠肝癌腫瘤體積和生存期的影響圖。
具體實(shí)施例方式一種基因免疫治療腫瘤的靜脈用制劑，由復(fù)制缺陷型腺病毒裝載人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄 酶C-末端多肽基因hTERTC27和可接受的藥用輔料組成。可接受的藥用輔料是本領(lǐng)導(dǎo)技術(shù) 人員所熟知的，如生理鹽水等。優(yōu)選的，復(fù)制缺陷型腺病毒為Ad5。復(fù)制缺陷型腺病毒Ad5是由骨架質(zhì)粒pBHGlox_El，3Cre和穿梭質(zhì)粒 pDC316-hTERTC27-EGFP雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，同源重組產(chǎn)生重組腺病毒。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。rAdv-hTERTC27 (recombinant adenovirus-hTERTC27_EGFP)的制備及鑒定
1)將293細(xì)胞接種于六孔板中，每孔5 X 105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)基為DMEM+10% Hyclone胎 牛血清，置37°C含5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；
2)換液，用新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞生長(zhǎng)至底面積的 80 90% ；取24 ii g骨架質(zhì)粒和6 ii g穿梭質(zhì)粒，混合均勻，其中骨架質(zhì)粒選用pBHGlox_El， 3Cre,穿梭質(zhì)粒選用 pDC316-hTERTC27-EGFP ；
3)將混合均勻的質(zhì)粒用1800 u 1的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，室溫放置5min ；取60 yl 的Lipofectamine2000脂質(zhì)體用1800 u 1的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，室溫放置5min ；
4)將稀釋的混合質(zhì)粒與稀釋的脂質(zhì)體混合，室溫避光放置30imn ；將室溫避光放置 的混合物均勻地與培養(yǎng)好的細(xì)胞混合，參照LipofectamindOOO脂質(zhì)體說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染；
5)轉(zhuǎn)染后第二天，將長(zhǎng)滿的細(xì)胞傳代于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用含5%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底時(shí)，再傳入75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，當(dāng)細(xì)胞 變大變圓，呈葡萄狀，并開始出現(xiàn)明顯噬斑，表明細(xì)胞出毒，待細(xì)胞大部分病變并從底部脫 落后收取出毒細(xì)胞；6)將出毒的細(xì)胞培養(yǎng)瓶先后置于-70°C冰箱和37°C水浴鍋中反復(fù)凍融三次，使病毒 從病變細(xì)胞中充分釋放，將凍融液3000rpm離心5min，收集含病毒的上清液，得第一代毒種 (P1)；
7)用P1轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，培養(yǎng)之后收毒，PCR擴(kuò)增、電泳鑒定無(wú)誤后，得到第二代毒種 (P2)；
8)用P2轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，培養(yǎng)之后收毒，將收獲的病毒上清用DNase酶消化后，用 0. 45um的濾膜過濾，然后過離子柱純化，之后再過分子篩進(jìn)一步純化病毒；
9)將純化的病毒保存于腺病毒保存液中，經(jīng)除鹽處理后用0. 22 ym —次性濾器過濾 除菌，從而得到無(wú)菌的純化病毒重組腺病毒人端粒酶多肽基因rAdv-hTERTC27。電泳鑒定圖如圖1所示。RT-PCR、Western blot檢測(cè)重組腺病毒在H印al_6細(xì)胞株中的表達(dá)
1)將生長(zhǎng)狀態(tài)良好、70% 80%融合的Ifepal-6細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，5X 105cells/孔傳代 接種于 6 孔培養(yǎng)板中，按 M0I=20 轉(zhuǎn)染 rAdv-hTERTC27、rAdv-EGFP，用含 10%FCS 的 RPMI 1640 完全培養(yǎng)基于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中孵育48h，用于RT-PCR和Western blot檢測(cè)；
2)取 1 P g 總 RNA 逆轉(zhuǎn)錄成為 cDNA，反應(yīng)為 42 °C 70min, 70 °C 15min, 4 °C 保存；lOiil cDNA與0. 4iil蛋白酶k混合56 °C 30min,沸水浴lOmin，冰上驟 冷，以破裂病毒衣殼；用Premix Taq進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR，hTERTC27的引物 為hTERTC27-F (5'-ATGACAGTGGTGAACTTCC-3' ) (SEQ ID NO1)，hTERTC27_R (5，-TCAGTCCAGGATGGTCTTG-3，)(SEQ ID NO 2) (PCR 產(chǎn)物 716bp) ;PCR 反應(yīng)程序94 °C 5min，30 個(gè)循環(huán)(94°C 30sec，55°C 30sec，72°C lmin),72°C lOmin，PCR 產(chǎn)物上樣到含有 SYBR Safe DNA染料(0. 1 u g/ml)的1. 0 %瓊脂糖上，在TBE中以100V的電壓跑30min，用 凝膠成像儀觀察結(jié)果；
3)取15ii g總蛋白100°C變性5min，加入等體積2XSDS蛋白電泳上樣緩沖液，混勻 上樣，并加蛋白質(zhì)分子量預(yù)染Marker —起電泳(200V，至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部或進(jìn)入電 泳槽)；電轉(zhuǎn)膜，70V, lh，可見預(yù)染Marker亦轉(zhuǎn)至PVDF膜上；TBST洗膜，5minX3次；封閉液 室溫封閉，2h(封閉完不洗膜);加一抗(1:1000)孵育，4°C振蕩過夜；TBST洗膜，5minX6次； 加HRP標(biāo)記的二抗(1 1000)，室溫孵育lh ；TBST洗膜，5minX6次；暗室曝光現(xiàn)配發(fā)光液， 將ECL試劑盒的A液和B液按1 1混合的，滴加至膜上，在暗室進(jìn)行曝光。小鼠原位肝癌模型的建立
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6小鼠24只，雌雄各半，體重18_21g ；瘤株采用小鼠肝癌細(xì)胞 H印al-6，由上海細(xì)胞庫(kù)提供。方法取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的Ifepal-6細(xì)胞制備密度為5X 107個(gè)/ml的細(xì)胞懸浮液，采 用微量注射器于每只小鼠肝包膜下注射細(xì)胞0. lml(5X106個(gè))，分籠飼養(yǎng)于SPF環(huán)境下，所 有裸鼠自由飲食，觀察體重變化繼續(xù)喂養(yǎng)至產(chǎn)生肝癌，備用。rAdv-hTERTC27對(duì)肝癌(Ifepa 1-6)細(xì)胞增殖和凋亡的影響
1) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H印1-6細(xì)胞，以每孔6000個(gè)細(xì)胞接種在96孔板中；分為3 組，rAdv-hTERTC27、rAdv_EGFP24 和 PBS 組，每組 4 個(gè)復(fù)孔；24 小時(shí)后 rAdv_hTERTC27 和 rAdv-EGFP 分別按照 M0I=30 感染 rAdv_hTERTC27 和 rAdv-EGFP, PBS 組加入與 rAdv-hTERTC27等體積的PBS ；重新置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)；2)細(xì)胞的增值采用CCK-8 clolrimetric assays (Dojindo Molecular Technologies, Inc. , Gaithersbury，MD, USA)進(jìn)行測(cè)定；取出96孔板，各孔中加入10 μ 1 CCK-8溶液，繼 續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，室溫振蕩5分鐘后，通過化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光值(參比波長(zhǎng) 650nm)；
3)觀察不同處理組細(xì)胞凋亡的差異；同步驟1，24小時(shí)后用光學(xué)顯微鏡觀察各組 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；然后在各孔細(xì)胞中分別加入Hochest 33258與PI使其終濃度分別為 10 μ g/ml與100 μ g/ml，4°C避光保存10分鐘后在熒光顯微鏡上進(jìn)行觀察，Hochest染色以 紫外光340nm波長(zhǎng)激發(fā)，熒光顯微鏡下觀察。凋亡細(xì)胞染色呈強(qiáng)藍(lán)色熒光，而正常細(xì)胞只呈微弱熒光，死細(xì)胞則不被染色，由此 可檢測(cè)出凋亡；在熒光顯微鏡下選用大于536nm的激發(fā)光觀察PI染色結(jié)果，染色呈紅色熒 光為死亡細(xì)胞，通過計(jì)數(shù)不同組凋亡和死亡細(xì)胞數(shù)量比較不同處理組間差別。其結(jié)果如圖 3所示。rAdv_hTERTC27對(duì)細(xì)胞端粒酶活性的影響
端粒酶活性采用PCR ELISA試劑盒(Roche，Mannheim, Germany)進(jìn)行測(cè)定。1) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H印1-6細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至約90%融合時(shí)用0.25胰酶消 化，0. OlM pH7.3 PBS洗細(xì)胞3次，于15mL離心管中制成單細(xì)胞懸液；將細(xì)胞稀釋至濃度為 2X105cellS/ml，以每孔500μ 1細(xì)胞懸液將細(xì)胞接種在24孔板中；輕輕搖動(dòng)，使細(xì)胞均勻， 置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)；
2)將各孔細(xì)胞分為3組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，rAdv-hTERTC27和rAdv_EGFP分別按照 M0I=30感染靶細(xì)胞，第三組加入與rAdv-hTERTC27同體積的PBS，重新置于37°C、5%C02培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)；
3)端粒酶活性檢測(cè)每個(gè)EP管加200 μ 1細(xì)胞裂解液，冰上孵育30分鐘，期間搖動(dòng) EP管使細(xì)胞充分裂解，16000Xg 4°C離心20分鐘；取上清，轉(zhuǎn)移至一新的EP管；另取一組 蛋白樣品經(jīng)過100°C水浴10分鐘變性，作為陰性對(duì)照組，用BCA法測(cè)量各組蛋白濃度，按每 個(gè)樣品2 μ g蛋白計(jì)算上樣量并上樣，具體操作步驟見Telomerase PCR ELISA Kit說(shuō)明書。分別采用銀染法和ELISA法對(duì)端粒酶活性進(jìn)行標(biāo)記，各組端粒酶活性結(jié)果如圖4 所示。骨髓來(lái)源樹突狀細(xì)胞(DCs)及rAdv_hTERTC27感染DCs轉(zhuǎn)染效率觀察
1)骨髓來(lái)源樹突狀細(xì)胞的分離取5-6周齡的C57BL/6小鼠，斷頸椎處死，無(wú)菌剝離 股骨和脛骨，剪至紅骨髓，用30 mL注射器吸取RPMI1640將骨髓沖至培養(yǎng)皿中，100目篩網(wǎng) 過濾后458Xg離心6min收集骨髓細(xì)胞，細(xì)胞沉淀加入預(yù)溫的0. 83% Tris-NH4C1 3mL裂解 紅細(xì)胞，裂解5min后加入40 mL RPMI 1640 :458 X g離心6 min，棄上清；
2)臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)(測(cè)定細(xì)胞活力大于95%)，細(xì)胞沉淀加入RPMI1640完 全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，接種至6孔培養(yǎng)板，加入lOng/mL rmGM_CSF、5 ng/mL IL-4， 每孔加完全培養(yǎng)基至4 mL ；至第3天，換含相同濃度細(xì)胞因子的完全培養(yǎng)液；至第5天，半 量換液并補(bǔ)足細(xì)胞因子；至第6天，輕輕吹打收集所有的懸浮細(xì)胞，即為體外擴(kuò)增的小鼠骨 髓來(lái)源的DCs ；每日用相差顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)和形態(tài)變化。3)與 200 ng/mL LPS共培養(yǎng)養(yǎng) 2 4 h 后，按照M0I=200 分別加入rAdv_hTERTC27 或rAdv-EGFP孵育24 h，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。
表達(dá)綠色熒光即為有效轉(zhuǎn)染入DCs的rAdv-hTERTC27或rAdv_EGFP。結(jié)果如圖5 所示。rAdv-hTERTC27 刺激 DCs 分泌細(xì)胞因子 11-2、INF- γ 增加
1、收集rAdv-hTERTC27，rAdv-EGFP或PBS感染24小時(shí)的各組DC培養(yǎng)上清；
2、ELISA法檢測(cè)DC培養(yǎng)上清中INF-γ和IL-2的含量 1) NF-y-ELISA (R&D Systems, USA)
①用IXCalibrator Diluent RD5P 剃度稀釋配制 5000pg/mL、2500 pg/mL、1250 pg/ mL、625 pg/mL、312 pg/mL、156 pg/mL 禾口 78 pg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品，以 1 XCalibrator Diluent RD5P作為Opg/mL (零對(duì)照)；
②用IXCalibratorDiluent RD5P將待檢測(cè)樣品稀釋50倍；
③在酶標(biāo)板中加入AssayDiluent RD1-55，每孔100 L ；
④分別在相應(yīng)的孔中加入100 L標(biāo)準(zhǔn)品、100 L零對(duì)照和100 L待測(cè)樣品，各設(shè)2 個(gè)復(fù)孔，粘貼膜封蓋，置于水平軌道震蕩器上，室溫、500rpm振蕩孵育2h ；
⑤吸掉液體，用WashBuffer約500 L/孔洗滌4次，在濾紙上印干洗滌液；
⑥加入6CkineConjugate 200 L/孔，粘貼膜封蓋，置水平軌道震蕩器上，室溫、 500rpm振蕩孵育2h ；
⑦重復(fù)步驟⑥1次；
⑧加入Substrate Solution 200 L/孔，避光、室溫孵育 20min ；
⑨加入Stop Solution 50 L/ 孔；
⑩在30min內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)處的光密度(OD)值，以570nm為參考波長(zhǎng)； 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的濃度。2) IL-2-ELISA (R&D Systems, USA) 具體操作步驟同上，結(jié)果如圖6所示。轉(zhuǎn)染rAdv_hTERTC27的DCs對(duì)T細(xì)胞增值及細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)效應(yīng)的觀察 (1) T淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)
斷頸處死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1 2分鐘。在超凈臺(tái)中小心剪開小鼠的腹 部外皮，用大頭針固定，再剪開小鼠的腹腔，用鑷子取出小鼠脾臟；在35mm培養(yǎng)皿中放入 4-5mL EZ-Sep Mouse IX淋巴細(xì)胞分離液(使用前搖勻淋巴細(xì)胞分離)；用鑷子固定尼龍 網(wǎng)，然后用注射器活塞輕輕研磨小鼠脾臟，使得分散的單細(xì)胞透過尼龍網(wǎng)進(jìn)入淋巴細(xì)胞分 離液中；把懸有脾臟細(xì)胞的分離液立即轉(zhuǎn)移到離心管中，離心前再覆蓋上大約200μ1的 1640培養(yǎng)基。(2) DCs對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn)
在重組腺病毒感染24h后的rAdv-hTERTC27-DC、rAdv_EGFP-DC、未處理的DC和T淋 巴細(xì)胞共培養(yǎng)；按刺激細(xì)胞(S)效應(yīng)細(xì)胞(T)=I :5、1 :10、1 :20、1 40的比例，在96孔 板加入中加入1X1 O 4/孔的3種DCs各100 μ 1和5X1 O4 μ 1/孔、1 X IO5 μ 1/孔、 2 X IO5 μ 1/孔、4X IO5 μ 1/孔淋巴細(xì)胞100 μ 1，同時(shí)設(shè)立對(duì)照，每組各設(shè)3個(gè)復(fù)孔；細(xì)胞培 養(yǎng)箱孵72h，加入CCK-8試劑20 μ 1/孔，繼續(xù)孵育3 h后，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光 度值(參比波長(zhǎng)650nm)。結(jié)果如圖7所示。(3) rAdv-hTERTC27-DC刺激的T淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用收集體外培養(yǎng)的Hepal-6細(xì)胞，按每孔1 X IO4個(gè)細(xì)胞的密度接種細(xì)胞于96孔板中， 作為靶細(xì)胞。以分別與rAdv-hTERTC27-DC、rAdv-EGFP-DC、未處理的DC與T淋巴細(xì)胞共同 培養(yǎng)24h，收集T淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞。效靶比(E:T)為5:1、20:1、40:1，另外設(shè)只有靶 細(xì)胞和只有效應(yīng)細(xì)胞的對(duì)照孔，共培養(yǎng)48h后用CCK-8法檢測(cè)各組在波長(zhǎng)450 nm下吸光 度值(參比波長(zhǎng)650nm)。按下式計(jì)算CTL的殺傷活性
殺傷率=[1_ (效靶孔值一效應(yīng)孔值)/靶細(xì)胞孔值]X 100% 結(jié)果如圖8所示。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察rAdv_hTERTC27對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用
1)動(dòng)物分為3組，每組8只小鼠組 1 :rAdv-hTERTC27(5X 107pfu)4i2: rAdv-EGFP (5 X 107pfu)；組 3 與 rAdv-hTERTC27 等體積的 PBS ；
2)用微量注射器肝包膜下注射Hepal-6小鼠肝癌細(xì)胞建立小鼠原位肝癌腫瘤模型， 肝包膜下接種后第7天根據(jù)分組尾靜脈注入rAdv-hTERTC27、rAdv-EGFP或PBS ；
3)各組動(dòng)物治療后生存期觀察及腫瘤大小測(cè)量觀察小鼠生活狀態(tài)及生存期；
4)小鼠于瀕死前即取肝臟組織麻醉動(dòng)物，剪開大鼠腹腔，切取肝臟組織，觀察各組腫 瘤生長(zhǎng)情況，并按垂直和水平方向測(cè)量腫瘤大小，腫瘤體積=a2XbX π /6(a為腫瘤的短徑， b為腫瘤的長(zhǎng)徑)。結(jié)果如圖9所示。結(jié)果
圖1是hTERTC27的毒種鑒定電泳圖，由可見在750bp條帶稍下方有明亮條帶，與陽(yáng)性 對(duì)照的位置和亮度相仿，且兩個(gè)樣本均產(chǎn)生該條帶，從圖中可以確定hTERTC27成功包裝進(jìn) 了腺病毒載體中。圖2是rAdv_hTERTC27病毒感染靶細(xì)胞后的RT-PCR及Western Blot電泳圖，由 圖可見，在小鼠肝癌細(xì)胞中成功檢測(cè)到了 hTERTC27的DNA片段和蛋白片段，由此可知重組 腺病毒成功將hTERT攜帶入靶細(xì)胞內(nèi)。圖3是rAdv_hTERTC27對(duì)肝癌(!fepa 1-6)細(xì)胞增殖和凋亡的影響圖。為了檢測(cè) hTERTC27對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，將rAdv-hTERTC27、rAdv-EGFP或PBS感染靶細(xì)胞 孵育48小時(shí)后，細(xì)胞分別用PI和Hochest進(jìn)行染色。由圖可見rAdv_hTERTC27感染細(xì)胞 后誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或死亡明顯強(qiáng)于rAdv-EGFP和PBS組(Fig. 3A)。通過CCK-8檢測(cè)法 可看到rAdv-hTERTC27較rAdv-EGFP或PBS相比明顯抑制了腫瘤細(xì)胞的增值(圖3B)。圖4是rAdv-hTERTC27對(duì)細(xì)胞端粒酶活性的影響圖。為了證明hTERTC27是否是通 過影響端粒酶活性而起到促進(jìn)凋亡作用的，將重組腺病毒感染靶細(xì)胞，48小時(shí)后收集細(xì)胞 提取蛋白，采用TRAP-ELISA檢測(cè)端粒酶活性，如圖所示，在rAdv_hTERTC27、rAdv-EGFP和 PBS三組中端粒酶活性都是陽(yáng)性的，三者之間并沒有明顯差別。ELISA法和銀染法均證實(shí)了 同樣的結(jié)果。圖5是rAdv_hTERTC27轉(zhuǎn)染骨髓來(lái)源DCs效果圖。其中A所示為從小鼠骨髓分離 得到的DCs，培養(yǎng)至第八天，DCs成熟可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。B所示為病毒感染DCs 24小時(shí) 后，綠色熒光所示為轉(zhuǎn)染入DCs的病毒顆粒。當(dāng)M0I=200時(shí)，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到80%。圖6是rAdv-hTERTC27 Ad_6Ckine/IFN γ轉(zhuǎn)染對(duì)DC分泌細(xì)胞因子的影響； rAdv-hTERTC27、rAdv-EGFP或PBS感染DCs24小時(shí)后，培養(yǎng)上清中的IFN- y、IL-2濃度用
8ELISA試劑盒來(lái)測(cè)定，如圖7所示，rAdv-hTERTC27感染DCs組上清中IFN- γ (328. 6 士 11. 26 pg/ml), IL-2 (8. 18士0. 45 pg/ml)明顯高于 rAdv-EGFP 與 PBS 組，IFN- γ 與 IL-2 濃度分 別為 IFN-Y (234. 50士 10. 56 pg/ml, Ρ<0· 05)，IL-2 (3.06士0· 42 pg/ml, Ρ<0· 05)， IFN-y (251. 63士 13. 0 pg/ml, Ρ<0· 05)，IL-2 (2. 65士0.38 pg/ml, Ρ<0· 05)。這部分實(shí) 驗(yàn)結(jié)果證明了 rAdv-hTERTC27可以促進(jìn)DC細(xì)胞分泌細(xì)胞因子增加。這也是rAdv_hTERTC27 免疫治療的重要機(jī)制之一。 圖7是rAdv-hTERT27-DCs促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖；刺激指數(shù)(Si)用來(lái)計(jì)算DC 細(xì)胞刺激后T淋巴細(xì)胞增值程度，如圖8所示rAdv-hTERTC27、rAdv-EGFP、PBS分別感 染DC細(xì)胞后刺激T淋巴細(xì)胞增值水平分別為0. 91 士0. 09,0. 43士0. 01,0. 45士0. 02 (S/ T=I: 5) ；0. 56士0. 02,0. 37 + 0. 01,0. 37 + 0. 02 (S/T=l 10)、0· 46士0. 01,0. 37士0. 01、 0.37 士 0.02 (S/T=l:20) ;0· 41 士 0. 01、0· 35 士 0. 00、0· 39 士 0. 012 (S/T=l:40),由結(jié)果可 見rAdv-hTERTC27感染DC細(xì)胞后，在S/T彡1:10時(shí)，DC細(xì)胞刺激T淋巴細(xì)胞增值的能力 明顯強(qiáng)于rAdv-EGFP與PBS組(P<0. 05)，而rAdv-EGFP與PBS之間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0. 05)。 圖8是rAdv-hTERTC27-DCs促進(jìn)T淋巴細(xì)胞殺傷腫瘤靶細(xì)胞的作用；如圖所 示E/T比值分別為5:1、20:1、40:1，結(jié)果顯示rAdV-hTERTC27_DCs活化的T淋巴細(xì)胞對(duì) H印al-6 細(xì)胞的殺傷率在 E:T=5:1、E:T=20 1 和 E:T=40 1 時(shí)分別為(16. 16士2. 75)%、 (44. 44 士 3. 11) % 和(65. 21 士 2. 98) % ；rAd-EGFP-DCs 禾口 PBS-DCs 活化的 T 淋巴細(xì)胞 在 E:T=5:1、E:T=20 :1 禾口 E:T=40:1 時(shí)分別為(17. 79士2. 95) %、(33. 65士3. 16) %、 (40. 54士3. 18)% 和(16. 99士2. 97)%、(30. 57士2. 64)%、(48. 72士3. 45)%。當(dāng) E:T 彡 20 1時(shí)，rAdv-hTERTC27-DCs活化的T淋巴細(xì)胞對(duì)!fepal-6腫瘤細(xì)胞的殺傷率明顯高于 rAd-EGFP-DC 和 PBD-DC 組(/7<0. 05 )，而 rAd-EGFP-DC 和 PBS-DC 組間差異不具有顯著性 (P>0. 05)。圖9是注射rAdv_hTERTC27后對(duì)小鼠肝癌的影響圖，從圖中可以看出，注射了 rAdv-hTERTC27的小鼠，其肝癌已得到很好的抑制。如圖所示，由大體模型可以直觀地看到 rAdv-hTERTC27治療組較rAdv-EGFP和PBS治療組腫瘤體積明顯縮小(P<0. 05)，測(cè)量腫瘤 體積分別為(1012士21. 43)mm3, (2567士32. 21)mm3, (2789士29. 12)mm3。而 rAdv_hTERTC27 治療組生存期較rAdv-EGFP和PBS治療組明顯延長(zhǎng)(P<0. 05)，分別為68天，34. 5天和31 天。由此可見rAdv-hTERTC27能夠有效地抑制小鼠肝癌的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)了荷瘤小鼠的生存期。 在實(shí)驗(yàn)過程中同時(shí)發(fā)現(xiàn)，對(duì)小鼠而言，rAdv-hTERTC27的注射量為5X107pfu/鼠時(shí)，其效果 最好。本發(fā)明的抗腫瘤基因制劑rAdv_hTERTC27，轉(zhuǎn)染效率高，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增值和凋亡 調(diào)節(jié)更為有效。同時(shí)，本發(fā)明的抗腫瘤基因制劑，能有效的將目的肽段轉(zhuǎn)染進(jìn)入樹突狀細(xì)胞 DCs,使DCs激活，分泌IFN- y、IL-2，增加并進(jìn)一步刺激T淋巴細(xì)胞增殖，并促使T淋巴細(xì) 胞對(duì)相應(yīng)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異性的殺傷效應(yīng)CTL，對(duì)腫瘤進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。通過以上途徑，本發(fā) 明的抗腫瘤基因制劑可應(yīng)用于多種腫瘤的治療。
權(quán)利要求
一種基因免疫治療腫瘤的靜脈用制劑，由復(fù)制缺陷型腺病毒裝載人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶C 末端多肽基因hTERTC27和可接受的藥用輔料組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基因免疫治療腫瘤的靜脈用制劑，其特征在于復(fù)制缺 陷型腺病毒為Ad5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基因免疫治療腫瘤的靜脈用制劑，由復(fù)制缺陷型腺病毒裝載人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶C-末端多肽基因hTERTC27和可接受的藥用輔料組成。本發(fā)明的抗腫瘤基因制劑rAdv-hTERTC27，轉(zhuǎn)染效率高，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增值和凋亡調(diào)節(jié)更為有效。同時(shí)，本發(fā)明的抗腫瘤基因制劑，能有效的將目的肽段轉(zhuǎn)染進(jìn)入樹突狀細(xì)胞DCs，使DCs激活，分泌IFN-γ、IL-2，增加并進(jìn)一步刺激T淋巴細(xì)胞增殖，并促使T淋巴細(xì)胞對(duì)相應(yīng)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異性的殺傷效應(yīng)CTL，對(duì)腫瘤進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。
文檔編號(hào)A61K48/00GK101940796SQ201010295079
公開日2011年1月12日 申請(qǐng)日期2010年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月28日
發(fā)明者何蕾, 孔祥復(fù), 彭英, 黃君健, 龔漢賢 申請(qǐng)人:中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院