神經(jīng)肽sNPF和其受體基因及在桔小實(shí)蠅特異性控制劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種神經(jīng)肽sNPF和其受體基因及在桔小實(shí)蠅 特異性控制劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 柑桔是重要的經(jīng)濟(jì)作物，隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，柑桔產(chǎn)業(yè)規(guī)模不斷擴(kuò)大，已 經(jīng)逐漸成為多地區(qū)的支柱產(chǎn)業(yè)。桔小實(shí)繩(Bactrocera dorsalis)由于其極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng) 能力和入侵?jǐn)U散能力，嚴(yán)重危害多種重要經(jīng)濟(jì)果蔬，尤其是柑桔。目前，桔小實(shí)蠅已成為柑 桔產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的巨大威脅。目前，桔小實(shí)蠅已對(duì)市面上的有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑、擬除蟲(chóng)菊酯和阿 維菌素等農(nóng)藥產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性;農(nóng)藥殘留嚴(yán)重污染環(huán)境，對(duì)食品安全造成了隱患;農(nóng)藥 的特異性較低，威脅到有害生物天敵，有加劇農(nóng)業(yè)有害生物爆發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。
[0003] 短神經(jīng)肽F(short neuropeptide F,sNPF)序列在不同種昆蟲(chóng)中具有較高保守性， 其功能在昆蟲(chóng)中參與調(diào)控了進(jìn)食、生長(zhǎng)、應(yīng)激反應(yīng)、嗅覺(jué)、生殖、激素分泌、學(xué)習(xí)及記憶等多 種生理活動(dòng)。sNPF受體(sNPFR)屬于G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptor，GPCR) 家族。目前，50%以上的臨床用藥以及正在研發(fā)中的藥物以GPCR為作用靶標(biāo)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球 20種最暢銷(xiāo)藥物中就有12個(gè)以GPCR為靶標(biāo)，每年的銷(xiāo)售總額達(dá)500多億美元。因此，該類(lèi)受 體的整個(gè)信號(hào)傳遞系統(tǒng)在藥物開(kāi)發(fā)和設(shè)計(jì)中占有極其重要的地位。由于短神經(jīng)肽在昆蟲(chóng)生 理活動(dòng)中的重要作用，以其受體(sNPFR)作為潛在靶標(biāo)創(chuàng)制害蟲(chóng)特異的殺蟲(chóng)劑來(lái)達(dá)到控制 桔小實(shí)蠅的方法受到越來(lái)越多的重視，也具有良好的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供神經(jīng)肽sNPF和其受體基因及在桔小實(shí)蠅特異性控制劑中的 應(yīng)用。
[0005] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽sNPF基因及其編碼的蛋白質(zhì)，所 述桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽sNPF基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸 序列如SEQ ID N0:10所示。
[0006] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽sNPF基因的擴(kuò)增方法，包括如下 步驟:提取桔小實(shí)蠅總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板采用巢式PCR的擴(kuò)增方法，第一輪 擴(kuò)增的引物為sNPF-1-F和sNPF-1-R，第二輪擴(kuò)增的引物為sNPF-2-F和sNPF-2-R，所述引物 的序列為：
[0007] sNPF-1-F:GGAAAACAAAGCTGTACCAAC，
[0008] sNPF-1-R:CTGCTTTTGCCAATTATATAG，
[0009] sNPF-2-F：CAGCGTTCAAAATGTTCATGTC,
[0010] sNPF-2-R：GCATTTAATTTTTAGCTTGTGC 〇
[0011]在本發(fā)明的另一方面，提供一種桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽sNPF成熟肽(也稱(chēng)sNPFR配體)基 因及其編碼的蛋白質(zhì)，所述桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽sNPF配體的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11~14所 示，所述核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 15~18所示。
[0012] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽sNPF受體基因及其編碼的蛋白 質(zhì)，所述桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽sNPF受體基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:19所示，其編碼的蛋白 質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID N0:20所示。
[0013] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽SNPF受體基因的擴(kuò)增方法，包括 如下步驟:提取桔小實(shí)蠅總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板采用巢式PCR的擴(kuò)增方法，第 一輪擴(kuò)增的引物為sNPFR-1-F和sNPFR-1-R，第二輪擴(kuò)增的引物為sNPFR-2-F和sNPFR-2-R， 所述引物的序列為：
[0014] sNPFR-1-F：GCAATCATAATGGATGCAGTAG,
[0015] sNPFR-1-R：CAAGTGGCTGACTAGTTTCAG,
[0016] sNPFR-2-F：GTGCAACAAAAGCACACATGAATG,
[0017] sNPFR-2-R：CAAGTGGCTGACTAGTTTCAG 〇
[0018] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種前述的桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽sNPF基因及其編碼的蛋白 質(zhì)、桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽sNPF成熟肽基因及其編碼的蛋白質(zhì)、或者桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽sNPFR基因及 其編碼的蛋白質(zhì)，在實(shí)蠅神經(jīng)調(diào)節(jié)方面的應(yīng)用，在實(shí)蠅防治上的應(yīng)用，或者在制備實(shí)蠅殺蟲(chóng) 劑方面的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明提供的桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽sNPFR的配體多肽與SNPFR具 有很好的結(jié)合能力，證明本發(fā)明提供的配體具有體外活性，提供的配體多肽和編碼該配體 多肽的DNA可以用于針對(duì)該GPCR開(kāi)發(fā)藥物，例如桔小實(shí)蠅神經(jīng)調(diào)節(jié)劑。通過(guò)利用按照本發(fā)明 的重組G蛋白-偶聯(lián)受體蛋白的表達(dá)的受體結(jié)合測(cè)定系統(tǒng)，可以篩選對(duì)桔小實(shí)蠅sNPFR特異 性的激動(dòng)劑和拮抗劑(對(duì)模式配體有促進(jìn)作用的為激動(dòng)劑，反之，起拮抗作用的為拮抗劑）， 所獲得的激動(dòng)劑或拮抗劑可以用于桔小實(shí)蠅的防治，在制備實(shí)蠅殺蟲(chóng)劑方面有良好的應(yīng)用 前景。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽sNPF成熟肽對(duì)sNPFR的活性測(cè)定結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0022] 主要試劑及生產(chǎn)者：
[0023] 2 XPrimeSTARMax Premix(Takara公司，日本）
[0024] RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根公司，中國(guó)）
[0025] pGEM-T Easy Vector(Promega公司，美國(guó)）
[0026] DNA連接試劑盒(Takara公司，日本）
[0027] Trans5a感受態(tài)細(xì)胞(Transgen公司，中國(guó)）
[0028] DNA回收試劑盒(Takara公司，日本）
[0029] pcDNA3.1( + )質(zhì)粒（Invitrogen公司，美國(guó)）
[0030]酶NotI(NEB公司，美國(guó)）
[0031] 質(zhì)粒DNA提取試劑盒(QIAGEN，德國(guó)）
[0032] DMEM/F-12medium(Gibco公司，美國(guó)）
[0033] T4DNA連接酶（Takara公司，日本）
[0034] 基因組DNA提取試劑盒(天根公司，中國(guó)）
[0035]水母素 Aequorin質(zhì)粒由美國(guó)堪薩斯州立大學(xué)提供
[0036] ViaFect轉(zhuǎn)染試劑(Promega公司，美國(guó)）
[0037] 腔腸素 Coelanterazine Η儲(chǔ)存溶液（Life-technologies公司，美國(guó)）
[0038] 本發(fā)明實(shí)施例中的各序列合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
[0039] 實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建 議的條件。
[0040] 實(shí)施例一、桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽sNPF及其受體的開(kāi)放閱讀框序列的獲得
[0041] 1、桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽sNPF及其受體的開(kāi)放閱讀框序列引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增
[0042] 基于基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，采用生物信息學(xué)方法，經(jīng)過(guò)對(duì)果蠅sNPF(Genbank N〇.AY626808)和其sNPFR(Genbank No.NP524176)反復(fù)分析及比對(duì)，設(shè)計(jì)桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽 sNPF及其受體(sNPFR)的巢氏PCR特異性引物，序列如下：
[0043]
[0044] 用RNA提取試劑盒提取桔小實(shí)蠅總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0045] 擴(kuò)增桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽sNPF序列：50ul的反應(yīng)體系包含24yL去離子水，20yL 2X PrimeSTAR Max Premix,引物sNPF-1-F(如序列表中SEQ ID N0:1 所示）、sNPF-1-R(如序列 表中SEQ ID N0:2所示)各2yL(濃度均為10μΜ)，2yL桔小實(shí)蠅cDNA模板。第一輪PCR擴(kuò)增條件 如下：預(yù)變性:98°C反應(yīng)2min，隨后，98°C變性10s，55°C退火15s，72°C延伸1.5min，循環(huán)35 次，最后72°C延伸10min。取第一輪PCR擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物2yL作為第二輪PCR擴(kuò)增的模板， 擴(kuò)增引物用sNPF-2-F(如序列表中SEQ ID N0:3所示)和sNPF-2-R(如序列表中SEQ ID N0:4 所示），50ul的反應(yīng)體系的其余組分與第一輪擴(kuò)增時(shí)相同，第二輪PCR擴(kuò)增條件與第一輪相 同。
[0046]擴(kuò)增桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽sNPFR序列：50ul的反應(yīng)體系，以及第一、二輪的PCR擴(kuò)增條件 與前述擴(kuò)增sNPF序列時(shí)相同，只需將第一輪的引物換為sNPFR-1-F(如序列表中SEQ ID N0: 5所示）、sNPFR-1-R(如序列表中SEQ ID N0:6所示），第二輪的引物換為sNPFR-2-F(如序列 表中SEQ ID N0:7所示）、sNPFR-2-R(如序列表中SEQ ID N0:8所示）即可。
[0047] 2、擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建到T載體上
[0048]將前述擴(kuò)增的桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽sNPF和sNPFR產(chǎn)物分別構(gòu)建到T載體上，操作步驟如 下：
[0049] 1)連接:將桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽sNPF擴(kuò)增產(chǎn)物或者sNPFR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pGEM-T Easy Vector上，具體操作見(jiàn)DNA連接試劑盒。
[0050] 2)轉(zhuǎn)化:在超凈工作臺(tái)將2.5yL步驟1)得到的連接產(chǎn)物加入到50yL的Trans5a感受 態(tài)細(xì)胞中，混勾，置冰上冰浴30min。42°(3水浴熱擊65sec，再放入冰浴中5min。加入無(wú)氨節(jié)