專利名稱：Vegf－b/受體復(fù)合物及其應(yīng)用的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及血管內(nèi)皮生長因子-B(VEGF-B)和Flt-1受體的復(fù)合物，涉及使用這種復(fù)合物誘導(dǎo)或拮抗VEGF-B介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答的方法，涉及用于鑒別VEGF-B和/或VEGF-B類似物的檢測試劑盒，還涉及與VEGF-B/Flt-1復(fù)合物結(jié)合的分離的結(jié)合配對(duì)物如抗體。
血管內(nèi)皮生長因子(VEGF或VEGF-A；有時(shí)也稱作血管通透因子或VPF)是PDGF家族的一種促血管生成生長因子，它通過兩種內(nèi)皮受體酪氨酸激酶(RTK)即Flt-1(也稱作VEGFR-1)(Shibuya等，癌基因，5519-524(1990)；de Vrie等，科學(xué)，255989-991(1992)]和Flk-1/KDR(也稱作VEGFR-2)[Matthews等，美國科學(xué)院院刊889026-30(1991)；Terman等，生物化學(xué)生物物理研究通訊，1871579-86(1991)；Millauer等，細(xì)胞，72835-46(1993)]起作用。這些受體似乎在內(nèi)皮細(xì)胞生長和分化的調(diào)節(jié)以及在成熟內(nèi)皮功能的保持方面起關(guān)鍵性作用[Shalaby等，自然，37662-66(1995)；Fong等，自然，37666-70(1995)]。在血管系統(tǒng)的形成和保持以及生理性和病理性血管生成中需要VEGF和其高親和性受體Flt-1和KDR/flk-1。
胎盤生長因子(PlGF)[Maglione等，美國科學(xué)院院刊，889267-71(1991)]是Flt-1 RTK的另一種配體[Park等，生物化學(xué)雜志，26925646-54(1994)]。它也是PDGF家族成員并且與VEGF結(jié)構(gòu)上相關(guān)，但是它的生物學(xué)功能目前尚不完全清楚。
VEGF-B是一種內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子，它清楚地描述在Olofsson等的文章，“血管內(nèi)皮生長因子B，一種新的內(nèi)皮細(xì)胞生長因子”，美國科學(xué)院院刊，932576-81(1996)中。象VEGF和PlGF一樣，VEGF-B是PDGF生長因子家族的一個(gè)成員，并與它們共享很大程度的結(jié)構(gòu)相似性，如一組保守的半胱氨酸殘基，這些半胱氨酸殘基形成二硫鍵，參與該分子的同二聚化和異二聚化。但是，VEGF-B與VEGF僅有約40％-45％的序列相似性，與PlGF僅有約30％的序列相似性?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)VEGF-B與VEGF在多種組織中共表達(dá)，在心臟和骨骼肌組織中特別豐富。它促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂和增殖，并且似乎在內(nèi)皮組織的生長和血管生成中起作用。VEGF-B在體外和體內(nèi)均能增強(qiáng)低濃度的VEGF的促分裂原性活性。
本發(fā)明基于下述發(fā)現(xiàn)，即VEGF-B能夠與Flt-1受體酪氨酸激酶的胞外功能域結(jié)合形成生物活性的復(fù)合物，所述的復(fù)合物介導(dǎo)有用的細(xì)胞應(yīng)答和/或拮抗不希望的生物學(xué)活性。
本文中的VEGF-B的氨基酸序列請(qǐng)參照Eriksson等的PCT申請(qǐng)出版物WO96/26736中所述的人VEGF-B186的序列(Genbank數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)U52819)。Flt-1的氨基酸或核苷酸序列請(qǐng)參照Shibuya等，癌基因，5519(1990)中所述的序列(EMBL數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)X51602)。VEGF-B和/或VEGF-B類似物與Flt-1受體或其類似物的結(jié)合親和性根據(jù)Lee等，美國科學(xué)院院刊931998(1996)中所述的程序進(jìn)行測試。Olofsson等，美國科學(xué)院院刊932576-81(1991)描述了一種用于分析內(nèi)皮細(xì)胞增殖的有用方法。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，本發(fā)明涉及一種用于鑒別具有與VEGF-B基本上相同的結(jié)合細(xì)胞表面受體的親和性的VEGF-B類似物的方法，所述的方法包括如下步驟(a)根據(jù)一種含有受體蛋白的樣品，所述的受體蛋白選自(i)包含F(xiàn)lt-1的殘基1-347所限定的氨基酸序列的多肽鏈，或其VEGF-B特異性受體類似物；(ii)具有結(jié)合VEGF-B的親和性并與Flt-1的殘基1-347共享至少30％氨基酸相同性的多肽鏈；以及(iii)具有結(jié)合VEGF-B的親和性并且由在嚴(yán)格條件下與Flt-1的核苷酸1-1293的核酸序列雜交的核酸所編碼的多肽鏈；(b)將步驟(a)中的樣品與候選的VEGF-B類似物接觸；以及(c)檢測候選的VEGF-B類似物與步驟(a)的受體蛋白之間的特異結(jié)合。
據(jù)信VEGF-B與細(xì)胞表面的受體結(jié)合涉及VEGF-B二聚體與所述的受體結(jié)合，從而導(dǎo)致該受體的二聚化及該受體的自磷酸化，隨后形成細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)并在合適的條件下產(chǎn)生細(xì)胞應(yīng)答如血管發(fā)生。
含有受體蛋白的樣品可以是例如在正常表達(dá)該受體的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中天然產(chǎn)生的可溶性Flt受體。經(jīng)蛋白裂解而從細(xì)胞天然脫落的組織樣品或組織液也可以用做受體樣品。
通過本發(fā)明這一方面鑒別的VEGF-B類似物可以是小分子，例如蛋白質(zhì)或肽或者非蛋白類化合物如DNA或RNA。類似物也可包括與毒素和藥物或放射性同位素連接的VEGF-B或衍生物(包括但不限于VEGF-B單體或二聚體的片段)，它們可以靶向腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)和正調(diào)節(jié)的Flt-1。通過類似于Kim等，自然，362(6243)841-44(1993或Aiello等，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，331(22)1480-87(1994)中所述的技術(shù)，這類分子可用于拮抗或抑制不希望的VEGF-B誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答如腫瘤誘導(dǎo)的血管發(fā)生、銀屑病或視網(wǎng)膜病。
分離VEGF-B/Flt-1復(fù)合物的一個(gè)程序涉及使用Flt-1受體和免疫球蛋白G(IgG)的融合蛋白，隨后進(jìn)行Sepharose A結(jié)合。替代使用Sepharose A的方法包括使用離子交換層析、凝膠過濾或親和層析。含有受體/IgG融合蛋白的條件培養(yǎng)基可以與來自用編碼VEGF-B配體或其類似物的DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基、來自天然表達(dá)該配體的條件培養(yǎng)基或含有候選的配體類似物的溶液相互作用。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及一種用于鑒別具有與VEGF-B基本上相同的結(jié)合細(xì)胞表面受體的親和性的VEGF-B類似物，所述方法包括下述步驟(a)提供一種含有能表達(dá)一種表面受體蛋白的細(xì)胞的樣品，所述的表面受體蛋白具有結(jié)合VEGF-B的親和性并選自如下一組(i)包含F(xiàn)lt-1的殘基1-347所限定的氨基酸序列的多肽鏈或其VEGF-B特異性受體類似物；(ii)具有結(jié)合VEGF-B的親和性并與Flt-1的殘基1-347共享至少30％氨基酸相同性的多肽鏈；以及(iii)具有結(jié)合VEGF-B的親和性并由在嚴(yán)格條件下與包含F(xiàn)lt-1的核苷酸1-1293序列的核酸雜交的核酸所編碼的多肽鏈；(b)將所述的細(xì)胞與候選VEGF-B類似物接觸；以及(c)檢測VEGF-B介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)產(chǎn)生。這種可檢測的細(xì)胞應(yīng)答的例子包括內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管發(fā)生、受體的酪氨酸磷酸化作用以及細(xì)胞遷移。
表達(dá)細(xì)胞表面受體蛋白的細(xì)胞可以是天然表達(dá)該受體的細(xì)胞，或者可以是用受體轉(zhuǎn)染而表達(dá)該受體的細(xì)胞?？蓪碜耘囵B(yǎng)這種細(xì)胞的條件培養(yǎng)基通過Sepharose A柱或基質(zhì)以固定化受體，或者在ELISA試驗(yàn)中，受體可以固定化在纖維素皿上或吸收在塑料上。然后將含有來自表達(dá)配體的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的第二種溶液通過這種固定化的受體。如果需要，配體可放射性標(biāo)記從而便于通過放射性分析技術(shù)測定所結(jié)合的配體的量。這種分析可用于篩選Flt-1受體過量表達(dá)的病癥，即通過檢測與對(duì)照相比所結(jié)合的放射性增加而篩選。這一方法學(xué)也可用于篩選競爭性VEGF-B類似物的存在，即通過檢測與對(duì)照相比所結(jié)合的放射性降低而篩選，這種降低表示試驗(yàn)中所用的放射性標(biāo)記的VEGF-B配體與未經(jīng)標(biāo)記的潛在類似物之間有競爭。
或者，前述分析可反過來固定化VEGF-B配體或候選的類似物并將固定化的配體與來自表達(dá)受體的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基接觸。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明涉及用于鑒別樣品中VEGF-B或VEGF-B類似物的試劑盒，所述的試劑盒包括(a)一種適于接受樣品并含有選自如下一組的受體蛋白的容器(i)包含F(xiàn)lt-1的殘基1-347所限定的氨基酸序列的多肽鏈或其VEGF-B特異性受體類似物；(ii)具有結(jié)合VEGF-B的親和性并與Flt-1的殘基1-347共享至少30％氨基酸相同性的多肽鏈；以及(iii)具有結(jié)合VEGF-B的親和性并由在嚴(yán)格條件下與包含F(xiàn)lt-1的核苷酸1-1293序列的核酸雜交的核酸所編碼的多肽鏈；和(b)用于檢測VEGF-B或候選VEGF-B類似物與所述容器中所含的受體蛋白之間的相互作用的裝置，其中VEGF-B或候選VEGF-B類似物屬于所述容器中的樣品的一部分。所述的檢測裝置可以包括例如用于檢測VEGF-B或VEGF-B類似物與所述的受體蛋白的特異性結(jié)合作用的裝置或用于檢測VEGF-B介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)產(chǎn)生的裝置。
本發(fā)明的另一方面涉及一種分離的配體—受體復(fù)合物，包括兩種分子，一種分子是配體并包括VEGF-B的至少1-115位氨基酸或其受體結(jié)合類似物，第二種分子是受體并選自如下一組(i)包含F(xiàn)lt-1的殘基1-347所限定的氨基酸序列的多肽鏈或其VEGF-B特異性受體類似物；(ii)具有結(jié)合VEGF-B的親和性并與Flt-1的殘基1-347共享至少30％氨基酸相同性的多肽鏈；以及(iii)具有結(jié)合VEGF-B的親和性并由在嚴(yán)格條件下與包含F(xiàn)lt-1的核苷酸1-1293序列的核酸雜交的核酸所編碼的多肽鏈。優(yōu)選地，配體是VEGF-B，受體是也具有結(jié)合VEGF-A和PlGF親和性的Flt-1受體。
配體或復(fù)合物的分離和純化可以通過常規(guī)的程序完成，例如根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)如Harlow等，抗體實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1988)和/或Marshak等，蛋白質(zhì)純化和鑒定的策略，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1996)中所述的技術(shù)用單克隆抗體進(jìn)行免疫親和純化。針對(duì)各個(gè)配體或復(fù)合物的合適的抗體可以通過常規(guī)技術(shù)產(chǎn)生。
可使用無細(xì)胞的復(fù)合物在體內(nèi)或體外與VEGF-B競爭結(jié)合細(xì)胞表面受體或防止在配體結(jié)合后結(jié)合細(xì)胞的受體的二聚化。這種無細(xì)胞復(fù)合物包括至少一種受體分子，例如可溶的FLT(sFLT)，以及一個(gè)VEGF-B二聚體分子，VEGF-B類似物二聚體分子或混合的VEGF-B/VEGF-B類似物二聚體分子，以便二聚體的一個(gè)分子可以與復(fù)合物中的受體分子結(jié)合，二聚體的另一個(gè)分子具有游離的結(jié)合位點(diǎn)以與細(xì)胞表面受體結(jié)合。
本發(fā)明的再一方面提供了一種分離的結(jié)合配對(duì)物，其對(duì)一種配體—受體復(fù)合物上的一個(gè)表位具有結(jié)合親和性，所述的復(fù)合物包括與下述細(xì)胞表面受體的配體結(jié)合功能域具有特異性結(jié)合作用的VEGF-B蛋白或其類似物，所述的細(xì)胞表面受體為(i)包含F(xiàn)lt-1的殘基1-347所限定的氨基酸序列的多肽鏈或其
VEGF-B特異性受體類似物；(ii)具有結(jié)合VEGF-B的親和性并與Flt-1的殘基1-347共享至少30％氨基酸相同性的多肽鏈；以及(iii)具有結(jié)合VEGF-B的親和性并由在嚴(yán)格條件下與包含F(xiàn)lt-1的核苷酸1-1293序列的核酸雜交的核酸所編碼的多肽鏈；其中所述的結(jié)合配對(duì)物對(duì)未復(fù)合的VEGF-B或VEGF-B類似物幾乎沒有結(jié)合親和性。優(yōu)選地，結(jié)合配對(duì)物對(duì)未復(fù)合的所述細(xì)胞表面受體蛋白或其受體類似物也幾乎沒有結(jié)合親和性。結(jié)合配對(duì)物可以是與這種生長因子/受體復(fù)合物反應(yīng)或識(shí)別這種生長因子/受體復(fù)合物的抗體?？墒褂枚嗫寺】贵w或單克隆抗體，但優(yōu)選單克隆抗體。這種抗體可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備，并篩除那些與受體或配體單獨(dú)結(jié)合的抗體。
本發(fā)明的另一方面涉及根據(jù)上述方法獲得的VEGF-B類似物在如下方面中的應(yīng)用，所述的方面為(i)拮抗VEGF-B與細(xì)胞表面受體的結(jié)合，或(ii)拮抗VEGF-B介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)產(chǎn)生。優(yōu)選的VEGF-B類似物包括一種抗體，所述的抗體具有與(i)具有結(jié)合VEGF-B親和性的一種細(xì)胞表面受體的配體結(jié)合功能域，或(ii)VEGF-B的受體結(jié)合功能域或其受體結(jié)合類似物的結(jié)合的特異性。
希望的是，具有結(jié)合VEGF-B親和性的細(xì)胞表面受體的配體結(jié)合功能域顯示與Flt-1的1-347位殘基至少30％、優(yōu)選至少35％的氨基酸相同性，特別優(yōu)選地與其相應(yīng)。希望的是，VEGF-B類似物的受體結(jié)合功能域顯示與VEGF-B的1-115位氨基酸殘基至少50％、優(yōu)選至少65％的序列相同性，特別優(yōu)選地與其相應(yīng)。
本發(fā)明的再一方面涉及選自如下一組的受體蛋白(i)包含F(xiàn)lt-1的殘基1-347所限定的氨基酸序列的多肽鏈或其VEGF-B特異性受體類似物；(ii)具有結(jié)合VEGF-B的親和性并與Flt-1的殘基1-347共享至少30％氨基酸相同性的多肽鏈；以及(iii)具有結(jié)合VEGF-B的親和性并由在嚴(yán)格條件下與包含F(xiàn)lt-1的核苷酸1-1293序列的核酸雜交的核酸所編碼的多肽鏈；在拮抗(a)VEGF-B與細(xì)胞表面受體的結(jié)合，或(b)VEGF-B介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)產(chǎn)生的方法中的應(yīng)用。
所述的多肽鏈與細(xì)胞表面受體競爭VEGF-B并束縛可用的VEGF-B，從而防止其與細(xì)胞表面受體有效地相互作用以及誘導(dǎo)VEGF-B介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答。合適的肽鏈可以是如Kendall等，美國科學(xué)院院刊9010705-709(1993)中所述的受體的可溶形式(sFLT)。
另外，本發(fā)明的一個(gè)方面是提供一種用于拮抗VEGF-B與細(xì)胞表面受體結(jié)合的方法，所述的方法包括提供一種蛋白，所述的蛋白具有結(jié)合Flt-1的殘基1-347所限定的氨基酸序列或其VEGF-B受體結(jié)合序列變體的特異性，并且所述的蛋白與VEGF-B的殘基1-115具有至少50％、優(yōu)選至少65％氨基酸序列相同性，從而當(dāng)將該蛋白提供給表達(dá)所述細(xì)胞表面受體的細(xì)胞時(shí)，其能與所述受體特異地相互作用，從而基本上抑制VEGF-B與所述受體的結(jié)合。該蛋白可以是根據(jù)上述方法獲得的VEGF-B類似物。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供了包括這種生長因子/受體復(fù)合物的藥物制劑。
本發(fā)明的又一方面還提供了一種治療以Flt-1細(xì)胞表面受體的過量表達(dá)為特征的疾病狀態(tài)的方法，所述的方法包括給予患有這種疾病的患者受體結(jié)合有效量的VEGF-B或根據(jù)上述方法獲得的VEGF-B類似物。
當(dāng)受體蛋白包括非Flt-1殘基1-347但仍顯示結(jié)合VEGF-B的親和性的多肽鏈時(shí)，其應(yīng)具備與Flt-1殘基1-347至少30％、有利地至少35％、優(yōu)選地至少65％、特別優(yōu)選地至少90％、最特別優(yōu)選至少95％的氨基酸相同性。有用的VEGF-B類似物應(yīng)顯示與VEGF-B至少50％、優(yōu)選地至少65％、特別優(yōu)選地至少90％、最特別優(yōu)選地至少95％的序列相同性。
附圖的簡要描述本發(fā)明以下將參照舉例性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步描述，其結(jié)果示于附圖中，其中

圖1是Flt-1免疫沉淀物的抗PTyr探查的Western印跡，F(xiàn)lt-1免疫沉淀物來自表達(dá)Flt-1的NIH3T3細(xì)胞，所述細(xì)胞用來自分別用人VEGF和VEGF-B的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的293 EBNA細(xì)胞的條件培養(yǎng)基刺激。
圖2(a)和(b)分別是SDS-PAGE電泳凝膠的長曝光和短曝光照片，示出35S-甲硫氨酸標(biāo)記的鼠VEGF-B186與Flt-1-IgFc融合蛋白的結(jié)合。
圖3是VEGF-B165、VEGF-B167、VEGF-B186和VEGF-C與可溶性VEGFR-1，VEGFR-2和VEGFR-3結(jié)合的SDS-PAGE分析。
圖4是使用NIH3T3 Flt-1細(xì)胞用mVEGF-B186從VEGFR-1/Flt-1頂替[125I]-hVEGF-B165的曲線。
圖5是用mVEGF-B164在NIH-VEGFR-1/Flt-1上的競爭曲線。
圖6示出用過量VEGF165從可溶性VEGFR-1頂替VEGF-B167和VEGF-B186。
圖7是示出VEGF-B186的蛋白裂解過程的SDS-PAGE分析。
圖8是示出VEGF-B186的纖溶酶消化的SDS-PAGE分析。
圖9是示出用于突變分析的VEGF-B167的突變過程及受體結(jié)合表位突變體與可溶性VEGFR-1的結(jié)合的示意圖。
圖10a-圖10c示出VEGF-B的半胱氨酸突變的SDS-PAGE分析。
圖11示出在10μg/ml肝素存在下標(biāo)記的VEGF-B167突變體的SDS-PAGE分析。
圖12示出來自在50ng/ml hVEGF-B186存在下保溫的牛微血管內(nèi)皮(BME)細(xì)胞的RNA的Northern印跡分析。
圖13a和13b示出從在hVEGF-B186存在下保溫的BME細(xì)胞制備的細(xì)胞提取物的信號(hào)識(shí)別蛋白體的受體分析(zymographicanalysis)和反向信號(hào)識(shí)別蛋白體的受體分析。
一般方法細(xì)胞培養(yǎng)物和材料Sf-9細(xì)胞在補(bǔ)加0.1％多聚f-68用于懸浮培養(yǎng)的Sf-900 II SFM(Gibco BRL，Life Technologies)中保持。
High Five細(xì)胞(Invitrogen)在Ex-cell 400培養(yǎng)基(JHR BiosciencesUK)中保持。
293-EBNA，COS-7，293-T和NIH3T3-Flt-1細(xì)胞(Sawano等，細(xì)胞生長及分化7，213-21(1996))在補(bǔ)加10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco′s最小基本培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)。NIH3T3 Flt-1在用200μg/ml新霉素的持續(xù)篩選下保持。
牛腎上腺皮質(zhì)衍生的微血管內(nèi)皮(BME)細(xì)胞在1.5％明膠包被的組織培養(yǎng)瓶上培養(yǎng)于補(bǔ)加15％供體小牛血清的MEMα修飾培養(yǎng)基(Gibco AG，Basel，瑞士)中。
PAE-KDR細(xì)胞(Waltenberger等，生物化學(xué)雜志26926988-95(1994))在加有10％FCS的Ham′s F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
受體Ig-融合體及表達(dá)載體的構(gòu)建a)pIg-VEGFR-1編碼與人IgG1 Fc融合的VEGFR-1前5個(gè)類Ig功能域的表達(dá)質(zhì)粒pIg-VEGFR-1通過將來自pLTR Flt1的HindIII片段(編碼VEGFR-1的1-549位氨基酸)連接進(jìn)pIgplus載體(Ingenius)而構(gòu)建。在克隆前用XhoI和XbaI消化pIgplus載體，平末端化并重新連接以校正用于融合蛋白生產(chǎn)的讀框。
b)spIg-VEGFR-2為構(gòu)建spIg-VEGFR-2，用人胎肺cDNA文庫(Clontech)作為模板，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增編碼VEGFR-2前4個(gè)類Ig功能域的cDNA。使用的引物為5′-atggtacccccaggctcagcatacaaaaagac-3′(SEQ ID NO.1)和5′-gcgtctagagggtgggacatacacaaccag-3′(SEQ ID NO.2)，擴(kuò)增的片段用Kpn-1和Xba-1裂解并克隆到信號(hào)pIg載體(Ingenius)的相應(yīng)位點(diǎn)中。
c)mVEGF-B186pFASTBAC1用EcoRI裂解mVEGF-B186cDNA(Olofsson等，生物化學(xué)雜志27119310-19317(1996))并亞克隆進(jìn)pFASTBAC1(Gibco BRL，LifeTechnologies)。用mVEGF-B186pSG5作為模板，經(jīng)PCR將(His)6標(biāo)記(和一個(gè)腸激酶位點(diǎn))引入缺乏信號(hào)序列的N-末端，使用的引物為5′-atcgagatcttcatcaccatcaccatcacggagatgacgatgacaaacctgtgtcccagttt-3′(SEQ ID NO3)和5′-caagggcggggcttagagatctagct-3′(SEQ ID NO4)(兩個(gè)引物都含有Bgl II位點(diǎn))。擴(kuò)增的片段用Bgl II裂解并克隆進(jìn)pAcGP67A(Pharmingen，U.S.A.)的GP-67的信號(hào)序列同一讀框內(nèi)的BamHI位點(diǎn)。
d)hVEGF-B186pPIC-9使用正向引物5′-ggaattccccgcccaggcccctgtc-3′(SEQ ID NO5)和反向引物5′-ggaattcaatgatgatgatgatgatgagccccgcccttggc-3′(SEQ ID NO6)經(jīng)PCR擴(kuò)增hVEGF-B186。將含有C-末端(His)6標(biāo)記的擴(kuò)增的產(chǎn)物克隆進(jìn)pPIC-9(Invitrogen)的EcoRI位點(diǎn)，與α交配因子信號(hào)序列同一讀框。
所有序列的真實(shí)性經(jīng)測序證實(shí)。
蛋白質(zhì)表達(dá)和純化為進(jìn)行使用Sf9和High Five細(xì)胞的桿狀病毒生產(chǎn)，將mVEGF-B重組噬斑純化并擴(kuò)增(Summersdeng，Tex.Agric.Exp.Stn.Bull.15551-57(1988))，用Ni-NTA超流動(dòng)樹脂(Qiagen)純化相應(yīng)表達(dá)的蛋白質(zhì)以及巴斯德畢赤氏酵母(菌株GS115)表達(dá)的hVEGF-B186。
為進(jìn)行定量免疫印跡，將來自感染的昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)基與作為標(biāo)準(zhǔn)樣品的1-30ng純化的m(His)6VEGF-B186一起在還原性12％SDS-PAGE上電泳并用抗m(His)6VEGF-B186的親和純化的抗體進(jìn)行印跡。
轉(zhuǎn)染，免疫沉淀及可溶性受體結(jié)合使用磷酸鈣沉淀法用hVEGF165pSG5，mVEGF167pSG5，mVEGFkEx1-5pSG5，mVEGF186pSG5，VEGFR-1 pIg和VEGFR-2 pIg轉(zhuǎn)染293-T細(xì)胞或COS-7細(xì)胞。VEGFR-3 EC-Ig pREP7(得自Katri Pajusola博士)和hVEGF-CΔNΔC(His)6pREP7(Joukov等，EMBOJ.163898-911(1997))在293-EBNA細(xì)胞中類似地表達(dá)。在用100μCi/ml Promix TM L-35 S(Amersham)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后將表達(dá)生長因子的細(xì)胞代謝標(biāo)記5-6小時(shí)(除非另有說明)，并收集培養(yǎng)基。當(dāng)指出時(shí)將肝素(10或50μg/ml)加入到標(biāo)記的培養(yǎng)基中。用2μg/mlVEGF抗體MAB 293(R&D Systems)免疫耗竭代謝標(biāo)記的培養(yǎng)基(除了來自VEGF感染的培養(yǎng)基)中內(nèi)源性表達(dá)的VEGF及異二聚體。對(duì)于可溶性受體，感染后48小時(shí)用含0.1％BSA的DMEM更換該培養(yǎng)基并再保溫12小時(shí)。將受體-Ig融合體(在某些情況下其量在用Colloidal.Comassie(Novex，San Diego)染色的10％SDS-PAGE上定量)和來自空白轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的等體積的培養(yǎng)基吸收到蛋白質(zhì)-A-Sepharose上。代謝標(biāo)記的生長因子與受體Ig融合體在+4℃保溫3小時(shí)，用冰冷的結(jié)合緩沖液(PBS 0.5％BSA，0.02％Tween 20和1mM PMSF)洗3次，用含1mM PMSF的PBS洗2次。
抗體產(chǎn)生根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序用純化的m(His)6VEGF-B186免疫兔子并收集得到的抗血清。如Olofsson等，生物化學(xué)雜志27119310-19317(1996)中所述產(chǎn)生抗mVEGF-B N-末端肽的抗血清。將該抗血清對(duì)共價(jià)結(jié)合至CNBr活化的Sepharose CL-4B(Pharmacia)的m(His)6VEGF-B186親和純化。
實(shí)施例1程序表達(dá)人Flt-1受體蛋白的NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)物首先在于DMEM中的0.5％胎牛血清(FCS)中饑餓24小時(shí)，然后在來自己分別用pREP7-hVEGF-A或pREP7-hVEGF-B167轉(zhuǎn)染的293 EBNA細(xì)胞培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基中于37℃刺激該細(xì)胞5分鐘。來自用pREP7單獨(dú)轉(zhuǎn)染的293 EBNA細(xì)胞的條件培養(yǎng)基用作陰性對(duì)照(空白)。所有條件培養(yǎng)基均含1μg/ml肝素。刺激后，在冰冷的含0.1mM原釩酸鈉的PBS中洗細(xì)胞并在含2mM原釩酸鈉、1mg/ml抑蛋白酶肽和1mM PMSF的RIPA緩沖液中裂解。將裂解物超聲波化，離心澄清并與抗flt-1抗體SC316(Santa Cruz)在冰上保溫2小時(shí)。得到的免疫復(fù)合物用蛋白質(zhì)A-瓊脂糖珠沉淀收集。用裂解緩沖液洗滌免疫沉淀物3次，在6％SDS PAGE上電泳分離并轉(zhuǎn)移至硝基纖維素濾膜上。用辣根過氧化物酶(HRP)綴合的抗磷酸酪氨酸抗體RC2OH(TransductionLabs)探查濾膜并用ECL(Amersham)檢測免疫反應(yīng)性。該抗磷酸酪氨酸抗體能識(shí)別Flt-1上的磷酸化的酪氨酸并使得能觀察到Flt-1受體的自磷酸化。
結(jié)果如圖1所示，該圖是從表達(dá)Flt-1的NIH3T3細(xì)胞免疫沉淀的Flt-1的抗PTyr探查的Western印跡，該NIH3T3細(xì)胞用來自VEGF載體、空載體或人VEGF-B167pREP7載體轉(zhuǎn)染的293 EBNA細(xì)胞的補(bǔ)加肝素的條件培養(yǎng)基進(jìn)行刺激，對(duì)于VEGF-A和VEGF-B均觀察到較弱但仍是陽性的酪氨酸磷酸化條帶，表明這些配體均能引起Flt-1的自磷酸化。相反，在該圖中部的空白(-)泳道沒有自磷酸化作用。
這一數(shù)據(jù)顯示人VEGF-B與Flt-1受體結(jié)合并誘導(dǎo)其自磷酸化，表明Flt-1也是人VEGF-B167的受體。
實(shí)施例2程序受體IgG融合蛋白將編碼Flt-1的前3個(gè)免疫球蛋白(Ig)環(huán)的cDNA剪接進(jìn)人IgG重鏈的Fc區(qū)并克隆進(jìn)載體pREP7(Invitrogen)，產(chǎn)生質(zhì)粒pREP7 Flt-1-IgFc。以類似的方式構(gòu)建pREP7 KDR-IgFc。本實(shí)驗(yàn)中所用的Flt-1-Ig Fc和KDR-Ig Fc cDNA是稱為pBJFltKT3的質(zhì)粒構(gòu)建物的RT-PCR產(chǎn)物。使用磷酸鈣方法，用得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293 EBNA細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收集產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基。
35S-標(biāo)記的mVEGF-B186的受體IgG沉淀編碼鼠VEGF-B186的質(zhì)粒pSJ5(Stratagene)(pSJ5 VEGF-B186)經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)染進(jìn)COS細(xì)胞，并用35S-甲硫氨酸和35S-半胱氨酸標(biāo)記細(xì)胞10小時(shí)。35S-標(biāo)記的hVEGF-A16S用作受體結(jié)合的陽性對(duì)照并在用pREP7 VEGF-A轉(zhuǎn)染并如上標(biāo)記的293 EBNA細(xì)胞中產(chǎn)生。在4℃、持續(xù)攪拌下將約1ml的含F(xiàn)lt-1-IgFc或KDR-IgFc的條件培養(yǎng)基與40μl 50％蛋白質(zhì)A瓊脂糖漿液保溫1小時(shí)。來自空白轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基用作陰性對(duì)照。離心收集蛋白質(zhì)A瓊脂糖珠，在室溫、輕攪拌下與1ml含有35S-標(biāo)記的mVEGF-B186或VEGF(-A)的條件培養(yǎng)基在結(jié)合緩沖液(PBS，0.5％BSA，0.02％Tween 20，1μg/ml肝素)中保溫3小時(shí)。離心收集蛋白質(zhì)A瓊脂糖珠，并在冰冷的結(jié)合緩沖液中洗2次，在20mM tris pH7.5中洗1次，在SDS樣品緩沖液中煮沸并在10％PAGE上電泳。
結(jié)果結(jié)果示于圖2(a)和(b)，其分別是SDS-PAGE凝膠的長曝光照片和短曝光照片。在該圖中，泳道1示出免疫沉淀的鼠VEGF-B186；泳道2示出Flt-1-Ig，mVEGF-B186；泳道3示出Flt-1-Ig，空白；泳道4示出空白，mVEGF-B186；泳道5示出KDR-Ig，mVEGF-B186；泳道6示出KDR-Ig，空白。為確定VEGF-B186是否是Flt-1的配體，將含有該因子的cDNA的質(zhì)粒與編碼VEGF(-A)的質(zhì)粒一起或者表達(dá)載體單獨(dú)轉(zhuǎn)染進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并用35S氨基酸標(biāo)記蛋白質(zhì)。用結(jié)合至蛋白質(zhì)A瓊脂糖珠的Flt-1-IgFc或KDR-IgFc沉淀這些細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，用Flt-1-IgFc從VEGF-B186條件培養(yǎng)基中沉淀出一32kDa條帶(在圖2(a)中由位于上面的箭頭指示)。這一與免疫沉淀的VEGF-B186共遷移的條帶在模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的Flt-1-IgFc沉淀物及由蛋白質(zhì)A瓊脂糖沉淀的VEGF-B186沉淀物中沒有出現(xiàn)。用KDR-IgFc也發(fā)現(xiàn)了少量這種32kDa條帶沉淀物。
該數(shù)據(jù)清楚示出鼠VEGF-B186與人Flt-1受體間形成復(fù)合物。
如圖2(a)和2(b)所示，F(xiàn)lt-1-IgFc和KDR-IgFc還沉淀分子量低一些的物質(zhì)，但是這些條帶也見于模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中，其被認(rèn)為代表由COS細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)源性因子，可能是VEGF(-A)。在這些條帶中，由括號(hào)中的箭頭所指示的條帶也可能部分代表與VEGF-B相關(guān)的物質(zhì)。
實(shí)施例3測試VEGF-B與VEGFR-1，VEGFR-2和/或VEGFR-3的結(jié)合為確定VEGF-B是否是VEGFR-1，VEGFR-2或VEGFR-3的配體，用表達(dá)VEGF165、mVEGF-B167、mVEGF-B186或VEGF-C的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，并且在50μg/ml肝素存在下代謝標(biāo)記蛋白VEGF165和mVEGF-B167，收集培養(yǎng)基。
除VEGF轉(zhuǎn)染之外的所有條件培養(yǎng)基均預(yù)清除內(nèi)源性VEGF和VEGF/VEGF-B異二聚體，然后用特異性抗體免疫沉淀各個(gè)蛋白或者將其與結(jié)合在蛋白質(zhì)A-瓊脂糖(PAS)上的含有Flt-1的前5個(gè)類Ig功能域的可溶性受體Ig融合蛋白結(jié)合。在還原條件下用SDS-PAGE分析沉淀的配體。對(duì)于每種配體沉淀約使用50ng可溶性受體。如圖3所示，兩種VEGF-B同種型均特異結(jié)合VEGFR-1，而不結(jié)合VEGFR-2或VEGFR-3。VEGFR-2和VEGFR-3的功能性分別通過與VEGF和VEGF-C的結(jié)合試驗(yàn)證實(shí)。這一試驗(yàn)表明VEGF-B特異結(jié)合VEGFR-1/Flt-1，使得其被鑒別為繼VEGF和PlGF之后的第三個(gè)VEGFR-1的配體。
用特異性抗體及VEGFR-1從mVEGF-B186條件培養(yǎng)基中沉淀出32kD和16kD的兩個(gè)條帶，該32kD條帶相應(yīng)于mVEGF-B186的糖基化分泌形式(Olofsson等，生物化學(xué)雜志27119310-19317(1996))。該16kD形式顯然是蛋白質(zhì)裂解加工的產(chǎn)物，其將在以下部分詳細(xì)描述。
實(shí)施例4VEGF-B/VEGFR-1結(jié)合的進(jìn)一步檢驗(yàn)用NIH3T3細(xì)胞檢驗(yàn)VEGF-B與細(xì)胞表面表達(dá)的VEGFR-1的能力。與用可溶性受體獲得的數(shù)據(jù)一致，來自mVEGF-B186感染的而不是模擬感染的High Five細(xì)胞的條件培養(yǎng)基與125I-VEGF競爭結(jié)合NIH3T3-Flt1，如圖4所示。使用定量免疫印跡測算mVEGF-B186的半數(shù)最大抑制濃度為3ng/ml，而重組mVEGF164以1.5ng/ml的半數(shù)最大抑制濃度與碘化hVEGF165競爭(圖4和圖5)。這一作用是特異于VEGFR-1的，因?yàn)橛肞AE-KDR細(xì)胞沒有觀察到競爭作用。因此很明顯的是，盡管mVEGF-B186與VEGF121一樣缺少見于VEGF165中的C-末端堿性殘基，但是其仍與NIH3T3-Flt1細(xì)胞上的VEGFR-1結(jié)合。還發(fā)現(xiàn)VEGF-B同樣能很好地結(jié)合含有VEGFR-1的3個(gè)N-末端類似Ig功能域(殘基1-347)的VEGFR-1Ig融合體以及含有5個(gè)類似Ig功能域的VEGFR-1Ig融合體。
由于凝聚及蛋白質(zhì)穩(wěn)定性問題，純化的His標(biāo)記的VEGF-B(人和小鼠(His)6VEGF-B186，以及覆蓋人和小鼠(His)6VEGF-B的外顯子1-5的C-末端缺失突變體)僅在高濃度與碘化的VEGF競爭結(jié)合VEGFR-1。
實(shí)施例5VEGF競爭研究
如結(jié)合試驗(yàn)中所述標(biāo)記和預(yù)清除在轉(zhuǎn)染的293-T細(xì)胞中表達(dá)的mVEGF-B167和mVEGF-B186，唯一的區(qū)別是對(duì)于mVEGF-B167在標(biāo)記的培養(yǎng)基中使用10μg/ml肝素。當(dāng)指出時(shí)，向結(jié)合反應(yīng)物中加入2μg重組hVEGF165作為非標(biāo)記的競爭劑。將等體積的代謝標(biāo)記的因子與可溶性VEGFR-1結(jié)合或用親和純化的N-末端肽VEGF-B抗體免疫沉淀2小時(shí)，用冰冷的10mM Tris-HCl pH8.0，1％TritonX-100，25mM EDTA，1mM PMSF洗兩次，用含有1mM PMSF的PBS洗兩次。用15％SDS-PAGE分析沉淀物。如圖6所示，這兩種同種型以及mVEGF-B167與VEGFR-1的結(jié)合由過量的rhVEGF導(dǎo)致消失，由此表明VEGF-B與VEGFR-1的結(jié)合可被過量的VEGF競爭。這一試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)相互作用的特異性以及提示VEGF和VEGF-B在受體上的相互作用位點(diǎn)是重疊的、部分重疊的或至少是緊密相鄰的。
實(shí)施例6對(duì)與細(xì)胞表面受體的結(jié)合的競爭為進(jìn)行該競爭試驗(yàn)，用表達(dá)天然mVEGF-B186的重組病毒(mVEGF-B186pFASTBAC1)和模擬病毒感染High Five細(xì)胞，感染48小時(shí)后收集培養(yǎng)基并立即應(yīng)用或于-70℃冷凍。
使用Iodo-Gen試劑(Pierce)用125I標(biāo)記重組mVEGF164(得自Herbert Weich博士)或h VEGF165(R&D體系或Peprotech)，并在PD-10柱(Pharmacia)上凝膠過濾純化。mVEGF和hVEGF的比活分別是2.2×105cpm/ng和1.0×105cpm/ng。為進(jìn)行結(jié)合分析，將PAE-KDR和NIH3T3-Flt1細(xì)胞種在用0.2％明膠包被的24孔板中，生長至鋪滿，用冰冷的結(jié)合緩沖液(對(duì)于PAE-KDR為Ham’s F12，0.5mg/ml BSA，10mM Hepes pH7.4，對(duì)于NIH3T3-Flt1為DMEM，0.5mg/ml BSA，10mM Hepes pH7.4)洗兩次，在含有遞增量的未標(biāo)記VEGF或來自VEGF-B感染或模擬感染的昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)基的結(jié)合緩沖液中與0.5ng/ml[125I]-VEGF保溫，同時(shí)進(jìn)行3份重復(fù)試驗(yàn)。在+4℃保溫2小時(shí)后，用冰冷的結(jié)合緩沖液洗細(xì)胞三次，用含有0.5mg/mlBSA的PBS洗兩次，并在0.5M NaOH中裂解細(xì)胞。用γ計(jì)數(shù)器測定溶解的放射性。圖4示出使用NIH 3T3 Flt-1細(xì)胞用mVEGF-B186從VEGFR-1/Flt1置換[125I]-hVEGF165，圖5示出mVEGF164在NIH-VEGFR-1/Flt-1上的競爭。
在一類似的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)mVEGF-B186不與[125I]-VEGF競爭PAE-KDR細(xì)胞上的VEGFR-2。
使用純化的重組(His)6VEGF-B186的競爭分析表明僅有一小部分該蛋白是生物學(xué)活性的，因?yàn)樘烊坏?自身的信號(hào)序列)未純化的VEGF-B186更有效地與碘化的VEGF競爭VEGFR-1結(jié)合。
實(shí)施例7VEGF-B186的蛋白裂解加工在COS細(xì)胞中表達(dá)的mVEGF-B186被O-連鍵糖基化，這種糖基化將表觀分子量從胞內(nèi)型的25kDa增至分泌型的32kDa。如上所述，當(dāng)mVEGF-B186在293-T細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，除了32kDa型外還出現(xiàn)了更快的遷移型16kDa條帶。當(dāng)標(biāo)記COS細(xì)胞較長時(shí)間時(shí)，在來自該細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中也觀察到該條帶。進(jìn)行下述試驗(yàn)以比較在293-T細(xì)胞中表達(dá)的由mVEGF-B186和mVEGF-B167形成的二聚體和C-末端截短型mVEGF-BkEx1-5的遷移以及它們結(jié)合sVEGFR-1的能力。含有C-末端Kemptide基序的mVEGF-B外顯子1-5突變體(Mohanraj等，蛋白質(zhì)表達(dá)及純化，8175-82(1996))，mVEGF-BkEx1-5pSG5由聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生。
在293-T細(xì)胞中表達(dá)VEGF-BkEx1-5、VEGF-B167和VEGF-B186。代謝標(biāo)記該細(xì)胞，在10μg/ml肝素存在下標(biāo)記模擬轉(zhuǎn)染的和VEGF-B167轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。將收集的培養(yǎng)基預(yù)清除VEGF和異二聚體并用親和純化的N-末端VEGF-B肽抗體免疫沉淀或與VEGFR-1結(jié)合。在非還原條件下用SDS-PAGE分析結(jié)合的配體，結(jié)果如圖7所示。
可以看出mVEGF-B186以三種不通的二聚體多肽遷移，最短的形式為34kDa，中間的形式為48kDa，全長型為60kDa。34kDa條帶的遷移稍快于mVEGF-BkEx1-5，提示潛在的裂解位點(diǎn)更接近C-末端，可能位于所翻譯的外顯子6A的起始處(Olofsson等，生物化學(xué)雜志27119310-19317(1996))。
上述試驗(yàn)清楚表明較長的mVEGF-B186同種型被蛋白裂解加工，產(chǎn)生含有用于結(jié)合VEGFR-1的受體結(jié)合表位的較短形式。mVEGF-B186的這種蛋白裂解加工的功能方面尚未完全清楚。由于該mVEGF-B186同種型穩(wěn)定地從細(xì)胞中分泌，所以蛋白裂解加工似乎不是調(diào)節(jié)該蛋白的釋放或可利用性的一個(gè)方式。
如圖7所示，免疫沉淀形式和受體結(jié)合形式之間的VEGF-B信號(hào)的相對(duì)密度的比較表明信號(hào)強(qiáng)度似乎與二聚體中的加工的亞基的水平相關(guān)，由此提示加工導(dǎo)致對(duì)受體的親和性增加。據(jù)信48kDa條帶由加工的單體(16kDa)和全長單體(32kDa)形成的二聚體組成。34kDa條帶由各16kDa的兩個(gè)加工的單體形成的二聚體組成。明顯的是包含由VEGF-B加工產(chǎn)生的16kDa類似物的這兩種二聚體均比由兩個(gè)全長32kDa單體形成的≈60kDa二聚體更好地結(jié)合VEGFR-1受體。
實(shí)施例8纖溶酶裂解進(jìn)行下述試驗(yàn)以確定在COS細(xì)胞中表達(dá)的全長形式的VEGF-B186是否可以通過加入纖溶酶而裂解，并且這種裂解是否會(huì)影響VEGFR-1結(jié)合。這可能是在血管生成過程中的基底膜降解位點(diǎn)的生理學(xué)機(jī)制。
用mVEGF-B186轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，代謝標(biāo)記75分鐘，將收集的培養(yǎng)基預(yù)清除VEGF和異二聚體。然后將培養(yǎng)基在37℃與0.1U/ml纖溶酶(Boehringer Mannheim)保溫0、5、15、30和60分鐘。加入1mM PMSF和0.1酪蛋白單位抑酶肽終止反應(yīng)。用親和純化的N-肽VEGF-B抗體免疫沉淀培養(yǎng)基并也與VEGFR-1 Ig結(jié)合。沉淀的蛋白在還原條件下用SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖8所示。
與全長形式的量遞減相一致的是出現(xiàn)了一個(gè)15kDa片段，而后是12kDa的二級(jí)片段。因此纖溶酶裂解確實(shí)發(fā)生了，但是顯然沒有給出與上述VEGF-B186的內(nèi)源性蛋白裂解加工相同的片段。但無論如何，這一N-末端片段完全能與sVEGFR-1相互作用，提示在受體結(jié)合表位包含在對(duì)蛋白酶如纖溶酶有抗性的N-末端片段這一點(diǎn)上，VEGF-B類似于VEGF。
實(shí)施例9受體表位的突變分析對(duì)VEGF的VEGFR-2表位的晶體結(jié)構(gòu)測定和定位分析指出一些熱點(diǎn)氨基酸殘基，對(duì)于配體—受體相互作用最重要的殘基是Ile-46，Ile-83，Glu-64，Phe-17，Gln-79，Pro-85，Ile-43和Lys-84(Muller等，美國科學(xué)院院刊947192-7(1997))。這些殘基參與VEGFR-1結(jié)合的程度尚不太清楚。通過帶電荷氨基酸至丙氨酸的掃描誘變(Keyt等，生物化學(xué)雜志2715638-5646(1996))，提示VEGF中的VEGFR-1結(jié)合表位涉及一段酸性殘基(Asp-63，Glu-64和Glu-67)，這些氨基酸殘基在VEGF-B中是保守的(Asp-63，Asp-64和Glu-67)，在PlGF中保守程度較低。
為了分析在VEGF和VEGF-B之間保守的并參與VEGF/VEGFR-1結(jié)合的這些酸性氨基酸殘基是否也是VEGF-B/VEGFR-1結(jié)合的關(guān)鍵因素，將Asp63，Asp64和Glu67突變成丙氨酸。這一突變策略示于圖9，該圖示意性示出野生型VEGF-B和不同的突變體。
VEGF-B167的潛在的受體表位突變體在轉(zhuǎn)染的293-T細(xì)胞中表達(dá)并在50μg/ml肝素存在下代謝標(biāo)記。為了研究VEGF-B同二聚體，用VEGF抗體(MAB 293，R&D Systems)免疫耗竭內(nèi)源性VEGF和由VEGF和過量表達(dá)的VEGF-B形成的VEGF異二聚體。VEGF-B突變體或者用親和純化的N-末端肽抗體免疫沉淀或者與可溶性VEGFR-1 Ig結(jié)合。在還原條件下用SDS-PAGE分析沉淀物，結(jié)果明顯示出前兩個(gè)酸性氨基酸殘基的突變和全部3個(gè)氨基酸殘基的突變均不破壞VEGF-B與VEGFR-1的結(jié)合。因此基于全部3個(gè)帶電荷的氨基酸殘基至丙氨酸的突變或者僅前兩個(gè)帶電荷的氨基酸殘基至丙氨酸的突變的這一數(shù)據(jù)表明保守的酸性殘基不是VEGF-B與VEGFR-1結(jié)合的關(guān)鍵因素。
實(shí)施例10VEGF-B167中的保守的半胱氨酸的突變分析為檢測保守的半胱氨酸對(duì)VEGF-B二聚體的形成的貢獻(xiàn)以及測試基于反平行共價(jià)VEGF二聚體模型的結(jié)構(gòu)預(yù)測，將半胱氨酸-51(Cys2)和半胱氨酸-60(Cys 4)突變成絲氨酸殘基。在mVEGF-B167pSG5中的半胱氨酸至絲氨酸的突變體是通過采用輔助噬菌體M13KO7(Viera等，酶學(xué)方法1533-11(1987))和dut- ung- E.coli菌株RZ1032(Kunkel等，酶學(xué)方法154367-382(1987))經(jīng)基于M13的體外單鏈誘變而產(chǎn)生的。進(jìn)行了兩種突變，即單突變體(C2S和C4S)以及雙突變體(C2S，C4S)。突變策略見圖9。
突變的和野生型VEGF-B167在293-T細(xì)胞中單獨(dú)表達(dá)或以共轉(zhuǎn)染形式以不同組合表達(dá)，并代謝標(biāo)記，將培養(yǎng)基預(yù)清除VEGF和異二聚體。結(jié)果示于圖10a-c。培養(yǎng)基用親和純化的N-末端VEGF-B抗體免疫沉淀并在非還原條件(圖10a)或還原條件(圖10b)下分析，或者將培養(yǎng)基與可溶性VEGFR-1 Ig結(jié)合(圖10c)。如圖10b所示，所有突變體均以大致相同的量表達(dá)。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)VEGF-B167被裂解，在兩種剪接變體中很有可能C-末端區(qū)相同，其由外顯子1-5編碼并含有半胱氨酸結(jié)和受體結(jié)合表位。野生型VEGF-B167在非還原條件下遷移成42kDa和46kDa兩條帶，但是僅有46kDa形式能與VEGFR-1結(jié)合(參見圖2A和圖3C)。據(jù)信42kDa形式相當(dāng)于由異常二硫鍵結(jié)合在一起的二聚體，因?yàn)樵诓缓l(fā)現(xiàn)于VEGF-B167的C-末端部分的附加的8個(gè)半胱氨酸的VEGF-B186或VEGF-BkEx1-5中未見這些雙聯(lián)體。單突變體C4S產(chǎn)生單體。還觀察到一些遷移為42kDa條帶的二聚體，其不能與受體結(jié)合。令人驚奇的是C2S突變體雖然部分作為單體產(chǎn)生，但是其仍能形成與受體結(jié)合的二聚體。單突變體的共轉(zhuǎn)染(C2S+C4S)導(dǎo)致46kDa條帶的量增加，恢復(fù)受體結(jié)合能力，提示可通過在未突變的半胱氨酸之間形成類似VEGF的二硫鍵而互補(bǔ)受損的二聚化作用(Potgens等，生物化學(xué)雜志26932879-85(1994))。單突變體與雙突變體的共轉(zhuǎn)染不能互補(bǔ)。
一些VEGF-B167突變體如上所述表達(dá)，并在10μg/ml肝素存在下代謝標(biāo)記細(xì)胞。收集的培養(yǎng)基與VEGFR-1 Ig保溫，并將結(jié)合的配體在非還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如圖11所示?？梢钥闯鯟4S突變體和雙突變體C2SC4S顯示殘留的受體結(jié)合活性，其可以解釋為可溶性受體與單體的相互作用。
因此，對(duì)VEGF-B二聚體形成起作用的保守的半胱氨酸的突變分析表明VEGF和PDGF有結(jié)構(gòu)保守性。
實(shí)施例11對(duì)VEGF-B的生物學(xué)應(yīng)答使用基于牛VEGFR-1序列的特異性引物的RT-PCR分析示出VEGFR-1 mRNA由牛腎上腺皮質(zhì)衍生的微血管內(nèi)皮(BME)和牛主動(dòng)脈內(nèi)皮(BAE)細(xì)胞表達(dá)。為確定VEGF-B對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)應(yīng)答，將含有5μg/泳道細(xì)胞總RNA的影印膜與[32P]標(biāo)記的cRNA探針雜交，該細(xì)胞總RNA從在50ng/ml hVEGF-B186存在下保溫的鋪滿的BME細(xì)胞單層中制備。BME細(xì)胞(Furie等，細(xì)胞生物學(xué)雜志981033-41(1984))在1.5％明膠包被的組織培養(yǎng)瓶中于補(bǔ)加15％供體小牛血清的MEMα修飾培養(yǎng)基(Gibco AG，Basel，瑞士)中培養(yǎng)。將細(xì)胞因子加入到BME細(xì)胞的鋪滿單層中，在此之前24小時(shí)已將新鮮制備的完全培養(yǎng)基加入到細(xì)胞中。使用Trizol試劑(LifeTechnologies AG，Basel，瑞士)在0、1、3、9、24和48小時(shí)后制備總細(xì)胞RNA。如Pepper等，細(xì)胞生物學(xué)雜志111743-55(1990)所述進(jìn)行濾膜的Northern印跡分析、UV-交聯(lián)和亞甲藍(lán)染色、體外轉(zhuǎn)錄、雜交和雜交后洗滌。如Pepper等，細(xì)胞生物學(xué)雜志111743-55(1990)；Pepper等，細(xì)胞生物學(xué)雜志122673-84(1993)所述從牛u-PA cDNA(Kratzschmar等，基因125177-83(1993))、人t-PAcDNA(Fisher等，生物化學(xué)雜志26011223-30(1985))和牛PAI-1cDNA(Pepper等，細(xì)胞生物學(xué)雜志111743-55(1990))制備32P-標(biāo)記的cRNA探針。結(jié)果示于圖12。上樣RNA的完整性和均一性通過在移印和交聯(lián)后用亞甲藍(lán)染色濾膜而確定(圖的下半部分)，示出了28S和18S核糖體RNA。
Northern印跡分析表明VEGF-B186(50ng/ml)增加了BME細(xì)胞中尿激酶型纖溶酶原活化劑(u-PA)mRNA和纖溶酶原活化劑抑制劑1(PAI-1)mRNA的穩(wěn)定狀態(tài)水平。也就是說該試驗(yàn)顯示內(nèi)皮細(xì)胞通過誘導(dǎo)PAI-1 mRNA和u-PA mRNA來應(yīng)答VEGF-B。因此VEGF-B與其在內(nèi)皮細(xì)胞上的受體的結(jié)合刺激了u-PA和PAI-1的活性，u-PA和PAI-1是胞外基質(zhì)降解及細(xì)胞粘附和遷移的重要調(diào)節(jié)物。
實(shí)施例12信號(hào)識(shí)別蛋白體的受體分析及反向信號(hào)識(shí)別蛋白體的受體分析將在濃度為0、1、3、10、30和100ng/ml hVEGF-B186存在下保溫的從BME細(xì)胞制備的細(xì)胞抽提物、濃度為30ng/ml的VEGF或濃度為30ng/ml的重組人bFGF(得自P.Sarmientos博士的155個(gè)氨基酸形式)如下所述進(jìn)行信號(hào)識(shí)別蛋白體的受體分析及反向信號(hào)識(shí)別蛋白體的受體分析。在35mm明膠包被的組織培養(yǎng)皿中的BME細(xì)胞的鋪滿單層用無血清培養(yǎng)基洗兩次并加入含在含胰Kunitz胰蛋白酶抑制劑(200KIU/ml)的無血清培養(yǎng)基中的細(xì)胞因子。保溫15小時(shí)后，制備細(xì)胞抽提物并如Vassalli等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志1591653-68(1984)和Pepper等，細(xì)胞生物學(xué)雜志111743-55(1990)所述進(jìn)行信號(hào)識(shí)別蛋白體的受體分析及反向信號(hào)識(shí)別蛋白體的受體分析。結(jié)果示于圖13a-b，表明重組hVEGF-B186增加了BME細(xì)胞中的u-PA和PAI-1活性。圖13a示出對(duì)BME細(xì)胞抽提物的信號(hào)識(shí)別蛋白體的受體分析，圖13b示出反向信號(hào)識(shí)別蛋白體的受體分析。可以看出VEGF-B186誘導(dǎo)了劑量依賴型的BME細(xì)胞中的u-PA和PAI-1活性的增加。用作對(duì)照的VEGF明顯沒有誘導(dǎo)PAI-1活性，表明PAI-1快速與VEGF誘導(dǎo)的tPA形成復(fù)合物。這一復(fù)合物通過對(duì)VEGF處理的細(xì)胞的培養(yǎng)物上清進(jìn)行信號(hào)識(shí)別蛋白體的受體分析而觀察到。與VEGF不同(Pepper等，生物物理研究通訊189824-31(1992))，VEGF-B186不增加t-PA活性。試驗(yàn)表明內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)答VEGF-B是通過增加u-PA和PAI-1的合成以及增加所得蛋白的活性來進(jìn)行。然而，PAI-1誘導(dǎo)的動(dòng)力學(xué)比u-PA的動(dòng)力學(xué)要快而短時(shí)，前者在1小時(shí)內(nèi)誘導(dǎo)并在3小時(shí)觀察到最大效應(yīng)，而后者在9小時(shí)后誘導(dǎo)并且延長至48小時(shí)。這一點(diǎn)與用bFGF和VEGF觀察到的現(xiàn)象一致(Pepper等，細(xì)胞生物學(xué)雜志111743-55(1990)；Pepper等，生物化學(xué)生物物理研究通訊181902-906(1991)；Mandriota等，生物化學(xué)雜志2709709-16(1995))。
實(shí)施例11和12示出重組hVEGF-B186增加BME細(xì)胞中的u-PA和PAI-1的穩(wěn)定狀態(tài)水平，在類似的試驗(yàn)中，VEGF-B186還誘導(dǎo)BAE細(xì)胞中的PAI-1 mRNA而不誘導(dǎo)u-PA mRNA。
實(shí)用性Flt-1酪氨酸激酶受體和VEGF-B和/或VEGF-B類似物之間形成受體可以用于治療以Flt-1受體過量表達(dá)為特征的疾病，其是通過向患有這種疾病的患者給予結(jié)合Flt-1受體或拮抗受體有效量的VEGF-B或VEGF-B類似物來完成。這種以Flt-1受體過量表達(dá)為特征的疾病的一個(gè)例子是血管內(nèi)皮瘤。Flt-1受體還在各種腫瘤中過量表達(dá)(Warren等，臨床研究雜志95(4)1789-97(1995)；Hatva等，美國病理學(xué)雜志146(2)368-78(1995))。VEGFR-1和VEGF-B或VEGF-B類似物之間形成復(fù)合物還可用于治療以Flt-1受體的表達(dá)不足為特征的狀態(tài)，這種狀態(tài)可包括正常成人內(nèi)皮或者需要增加血管形成的狀態(tài)。在給定情況中給藥量取決于患者的特征以及疾病的性質(zhì)并可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定。
VEGF-B或VEGF-B類似物可以合適地經(jīng)靜脈內(nèi)給藥或者通過類似于目前VEGF或FGF的定位輸送系統(tǒng)的定位輸送系統(tǒng)給藥。這種系統(tǒng)的例子包括使用質(zhì)粒形式的DNA(Isner等，柳葉刀348370(1996))或使用重組腺病毒(Giordano等，自然醫(yī)學(xué)2534-39(1996))。VEGF-B也可通過類似于應(yīng)用于VEGF的技術(shù)以蛋白質(zhì)形式提供(Bauters等，美國生理學(xué)協(xié)會(huì)，H1263-271(1994)；Asahara等，循環(huán)912793(1995))或通過使用缺陷型皰疹病毒(Mesri等，循環(huán)研究76161(1995))。小分子VEGF-B類似物可以口服給藥。也可使用其它的標(biāo)準(zhǔn)送藥模式如皮下或腹膜內(nèi)注射。
VEGF-B蛋白/Flt-1受體復(fù)合物也可用于生產(chǎn)抗體，該抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。通常，可使用常規(guī)的抗體生產(chǎn)技術(shù)產(chǎn)生抗VEGF-B/Flt-1復(fù)合物的抗體。例如，通過免疫接種由重組DNA表達(dá)獲得的融合蛋白可以產(chǎn)生特異性的單克隆抗體?？筕EGF-B/受體復(fù)合物的嵌合抗體和人源化抗體也包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。具體地，標(biāo)記的單克隆抗體可以用于篩選以Flt-1受體的過量表達(dá)或表達(dá)不足為特征的疾病狀態(tài)。這種疾病狀態(tài)的例子包括血管和淋巴管的內(nèi)皮細(xì)胞腫瘤如血管內(nèi)皮瘤。
在本發(fā)明的診斷/預(yù)后裝置的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體、生長因子或受體被標(biāo)記，并且三者其中之一是底物結(jié)合性的，從而可通過確定抗體和生長因子/受體復(fù)合物結(jié)合后附著于底物的標(biāo)記的量來確定抗體復(fù)合物的相互作用。在一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，該診斷/預(yù)后裝置可以常規(guī)的ELISA試劑盒形式提供。
上述描述和實(shí)施例僅是舉例說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。由于本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)所述實(shí)施方案作出不偏離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)的修改，因此本發(fā)明應(yīng)被理解為包括所有落入所附權(quán)利要求范圍內(nèi)的變異及其等價(jià)物。
參考文獻(xiàn)-Ferrara，N.&Davis-Smyth，T.(1997)內(nèi)分泌綜述18，4-25.-Risau，W.(1997)自然386，671-4-Folkman，J.(1995)自然醫(yī)學(xué)1，27-31.-Barleon，B.，Sozzani，S.，Zhou，D.，Weich，H.A.，Mantovani，A.&Marme，D.(1996)血液87，3336-43.-Clauss，M.，Weich，H.，Breier，G.，Knies，U.，Rockl，W.，Waltenberger，J.& Risau，W.(1996)生物化學(xué)雜志.271，17629-34.-Fong，G.H.，Rossant，J.，Gertsenstein，M.& Breitman，M.L.(1995)自然376，66-70.-Shalaby，F(xiàn).，Rossant，J.，Yamaguchi，T.P.，Gertsenstein，M.，Wu，X.F.，Breitman，M.L.& Schuh，A.C.(1995)自然376，62-66.-Shalaby，F(xiàn).，Ho，J.，Stanford，W.L.，F(xiàn)ischer，K.D.，Schuh，A.C.，Schwartz，L.，Bernstein，A.& Rossant，J.(1997)細(xì)胞89，981-90.-Carmeliet，P.，F(xiàn)erreira，V.，Breier，G.，Pollefeyt，S.，Kieckens，L.，Gertsenstein，M.，F(xiàn)ahrig，M.，Vandenhoeck，A.，Harpal，K.，Ebenhardt，C.，Declercq，C.，Pawling，J.，Moons，L.，Collen，D.，Risau，W.& Nagy，A.(1996)自然380，435-439.-Ferrara，N.，Carver-Moore，K.，Chen，H.，Dowd，M.，Lu，L.，O’Shea，K.S.，Powell-Braxton，L.，Hilan，K.J.& Moore，M.W.(1996)自然380，438-442.-Pepper，M.S.，F(xiàn)errara，N.，Orci，L.& Montesano，R.(1991)生物化學(xué)生物物理研究通訊181，902-906.-Chapman，H.A.(1997)細(xì)胞生物學(xué)當(dāng)前觀點(diǎn)9，714-724.-Bacharach，E.，Itin，A.& Keshet，E.(1992)美國科學(xué)院院刊89，10686-10690.-Maglione，D.，Guerriero，V.，Viglietto，G.，Delli-Bovi，P.& Persico，M.G.(1991)美國科學(xué)院院刊88，9267-9271.-Olofsson，B.，Pajusola，K.，Kaipainen，A.，Von Euler，G.，Joukov，V.，Saksela，O.，Orpana，A.，Pettersson，R.F.，Alitalo，K.& Eriksson，U.(1996)美國科學(xué)院院刊93，2576-2581.-Grimmond，S.，Lagercrantz，J.，Drinkwater，C.，Silins，G.，Townson，S.，Pollock，P.，Gotley，D.，Carson，E.，Rakar，S.，Nordenskjold，M.，Ward，L.，Hayward，N.& Weber，G.(1996)基因組研究6，124-131-Joukov，V.，Pajusola，K.，Kaipainen，A.，Chilov，D.，Lahtinen，I.，Kukk，E.，Saksela，O.，Kalkkinen，N.& Alitalo，K.(1996)EMBO J.15，290-298.-Lee，J.，Gray，A.，Yuan，J.，Louth，S.-M.，Avraham，H.& Wood，W.(1996)美國科學(xué)院院刊93，1988-1992.-Orlandini，M.，Marconcini，L.，F(xiàn)erruzzi，R.& Oliviero，S.(1996)美國科學(xué)院院刊93，11675-11680.-Yamada，Y.，Nezu，J.，Shimane，M.& Hirata，Y.(1997)基因組42，483-8.-Park，J.E.，Chen，H.H.，Winer，J.，Houck，K.A.& Ferrara，N.(1994)生物化學(xué)雜志269，25646-25654.-Olofsson，B.，Pajusola，K.，von Euler，G.，Chilov，D.，Alitalo，K.&Eriksson，U.(1996)生物化學(xué)雜志271，19310-19317.-Keyt，B.A.，Nguyen，H.V.，Berleau，L.T.，Duarte，C.M.，Park，J.，Chen，H.& Ferrara，N.(1996)生物化學(xué)雜志271，5638-5646.-Potgens，A.J.，Lubsen，N.H.，van Altena，M.C.，Vermeulen，R.，Bakker，A.，Schoenmakers，J.G.，Ruiter，D.J.& de Waal，R.M.(1994)生物化學(xué)雜志269，32879-85.-Muller，Y.A.，Li，B.，Christinger，H.W.，Wells，J.A.，Cunningham，B.C.& de Vos，A.M.(1997)美國科學(xué)院院刊94，7192-7.-Sawano，A.，Takahashi，T.，Yamaguchi，S.，Aonuma，M.& Shibuya，M.(1996)細(xì)胞生長及分化7，213-21.-Furie，M.B.，Cramer，E.B.，Naprstek，B.L.& Silverstein，S.C.(1984)細(xì)胞生物學(xué).98，1033-41.-Mohanraj，D.，Wahlsten，J.L.& Ramakrishnan，S.(1996)蛋白質(zhì)表達(dá)及純化8，175-82.-Viera，J.& Messing，J.(1987)單鏈質(zhì)粒DNA的產(chǎn)生，酶學(xué)方法153，3-11.-Kunkel，T.A.，Roberts，J.D.& Zakour，R.A.(1987)無需表型篩選的快速有效的定點(diǎn)誘變，酶學(xué)方法154，367-382.-Summers，M.D.& Smith，G.E.(1988)桿狀病毒載體及昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)程序方法手冊(cè)，Tex.Agric.Exp.Sm，Bull.1555，1-57.-Joukov，V.，Sorsa，T.，Kumar，V.，Jeltsch，M.，Claesson-Welsh，L.，Cao，Y.，Saksela，O.，Kalkkinen，N.& Alitalo，K.(1997)EMBO J.16，3898-911.-Vassalli，J.D.，Dayer，J.M.，Wohlwend，A.& Belin，D.(1984)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志159，1653-68.-Pepper，M.S.，Belin，D.，Montesano，R.，Orci，L.& Vassalli，J.D.(1990)細(xì)胞生物學(xué)雜志111，743-55-Kratzschmar，J.，Haendler，B.，Kojima，S.，Rifkin，D.B.& Schleuning，W.D.(1993)基因125，177-83.-Fisher，R.，Waller，E.K.，Grossi，G.，Thompson，D.，Tizard，R.&Schleuning，W.D.(1985)生物化學(xué)雜志260，11223-30.-Pepper，M.S.，Vassalli，J.D.，Orci，L.& Montesano，R.(1993)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞研究204，356-363.-Mandriota，S.J.，Seghezzi，G.，Vassalli，J.-D.，F(xiàn)errara，N.，Wasi，S.，Mazzieri，R.，Mignatti，P.& Pepper，M.S.(1995)生物化學(xué)雜志270，9709-9716.-Davis-Smyth，T.，Chen，H.，Park，J.，Presta，L.G.& Ferrara，N.(1996)EMBO J.15，4919-27.-Barleon，B.，Totzke，F(xiàn).，Herzog，C.，Blanke，S.，Kremmer，E.，Siemeister，G.，Marme，D.& Martiny-Baron，G.(1997)生物化學(xué)雜志272，10382-8.-Wiesmann，C.，F(xiàn)uh，G.，Christinger，H.W.，Eigenbrot，C.，Wells，J.A.& de Vos，A.M.(1997)細(xì)胞91，695-704.-Plouet，J.，Moro，F(xiàn).，Bertagnoli，S.，Coldeboeuf，N.，Mazarauil，H.，Clamens，S.& Bayard，F(xiàn).(1997)生物化學(xué)雜志272，13390-13396.-Park，J.E.，Keller，G.A.& Ferrara，N.(1993)分子生物學(xué)細(xì)胞4，1317-1326.-Takahashi，T.& Shibuya，M.(1997)癌基因14，2079-2089.-Seetharam，L.，Gotoh，N.，Maru，Y.，Neufeld，G.，Yamaguchi，S.&Shibuya，M.(1995)癌基因10，135-147.-DiSalvo，J.，Bayne，M.L.，Conn，G.，Kwok，P.W.，Trivedi，P.G.，Soderman，D.D.，Palisi，P.M.，Sullivan，K.A.& Thomas，K.A.(1995)生物化學(xué)雜志270，7717-7723.-Cao，Y.，Chen，H.，Zhou，L.，Chiang，M.-K.，Anand-Apte，B.，Weatherbee，J.A.，Wang，Y.，F(xiàn)ang，F(xiàn).，F(xiàn)lanagan，J.G.& Tsang，M.L.-S.(1996)生物化學(xué)雜志271，3154-3162.-Stefansson，S.& Lawrence，D.A.(1996)自然383，441-443.
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人埃扎·考佩萊寧；比吉塔·奧洛夫松；余吉·甘吉；烏爾夫·埃里克松；凱里·阿利塔羅(ii)發(fā)明名稱VEGF/受體復(fù)合物及其應(yīng)用(iii)序列數(shù)6(iv)通訊地址(A)收信人Evenon，McKeown，Edwards & Lenahan PLLC(B)街道1200 G Street，N.W.，Suite 700(C)城市華盛頓(D)州DC(E)國家美國(F)ZIP20005(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，Version #1.25(vi)本申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朩O(B)申請(qǐng)日1997年12月19日(C)分類(vii)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S60/033,697
(B)申請(qǐng)日1996年12月20日(viii)律師/代理人信息(A)姓名EVANS，Joseph D.
(B)注冊(cè)號(hào)26，269(C)卷號(hào)1064/43148PC(ix)電訊信息(A)電話(202)628-8800(B)傳真(202)628-8844(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度32bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1ATGGTACCCC CAGGCTCAGC ATACAAAAAG AC32(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度30bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO2GCGTCTAGAG GGTGGGACAT ACACAACCAG 30(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度62bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO3ATCGAGATCT TCATCACCAT CACCATCACG GAGATGACGA TGACAAACCT GTGTCCCAGT60TT 62(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度26bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO4CAAGGGCGGG GCTTAGAGAT CTAGCT 26(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度25bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO5GGAATTCCCC GCCCAGGCCC CTGTC 25(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度41bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性
(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO6GGAATTCAAT GATGATGATG ATGATGAGCC CCGCCCTTGG C 4權(quán)利要求
1.一種用于鑒別VEGF-B類似物的方法，所述的類似物的特征在于具有與VEGF-B基本上相同的結(jié)合細(xì)胞表面受體的親和性，所述的方法包括如下步驟(a)提供一種含有選自如下一組的受體蛋白的樣品(i)包含F(xiàn)lt-1的殘基1-347所限定的氨基酸序列的多肽鏈或其VEGF-B特異性受體類似物；(ii)具有結(jié)合VEGF-B的親和性并與Flt-1的殘基1-347共享至少30％氨基酸相同性的多肽鏈；以及(iii)具有結(jié)合VEGF-B的親和性并由在嚴(yán)格條件下與包含F(xiàn)lt-1的核苷酸1-1293序列的核酸雜交的核酸所編碼的多肽鏈；(b)將步驟(a)的所述樣品與候選VEGF-B類似物接觸；以及(c)檢測所述的候選VEGF-B類似物與步驟(a)的受體蛋白之間的特異性結(jié)合。
2.一種用于鑒別VEGF-B類似物的方法，所述的類似物的特征在于具有與VEGF-B基本上相同的結(jié)合細(xì)胞表面受體的親和性，所述的方法包括如下步驟(a)提供一種含有能表達(dá)一種表面受體蛋白的細(xì)胞的樣品，所述的表面受體蛋白具有結(jié)合VEGF-B的親和性并選自如下一組(i)包含F(xiàn)lt-1的殘基1-347所限定的氨基酸序列的多肽鏈或其VEGF-B特異性受體類似物；(ii)具有結(jié)合VEGF-B的親和性并與Flt-1的殘基1-347共享至少30％氨基酸相同性的多肽鏈；以及(iii)具有結(jié)合VEGF-B的親和性并由在嚴(yán)格條件下與包含F(xiàn)lt-1的核苷酸1-1293序列的核酸雜交的核酸所編碼的多肽鏈；(b)將所述的細(xì)胞與候選VEGF-B類似物接觸；以及(c)檢測VEGF-B介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)產(chǎn)生。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中步驟(c)中所檢測的所述VEGF-B介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答是內(nèi)皮細(xì)胞增殖。
4.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的VEGF-B介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答是血管發(fā)生。
5.一種用于鑒別樣品中VEGF-B或VEGF-B類似物的試劑盒，所述的試劑盒包括(a)一種適于接受樣品并含有選自如下一組的受體蛋白的容器(i)包含F(xiàn)lt-1的殘基1-347所限定的氨基酸序列的多肽鏈或其VEGF-B特異性受體類似物；(ii)具有結(jié)合VEGF-B的親和性并與Flt-1的殘基1-347共享至少30％氨基酸相同性的多肽鏈；以及(iii)具有結(jié)合VEGF-B的親和性并由在嚴(yán)格條件下與包含F(xiàn)lt-1的核苷酸1-1293序列的核酸雜交的核酸所編碼的多肽鏈；(b)用于檢測VEGF-B或候選VEGF-B類似物與所述容器中所含的受體蛋白之間的相互作用的裝置，所述的VEGF-B或候選VEGF-B類似物屬于所述容器中的樣品的一部分。
6.權(quán)利要求5所述的試劑盒，其中所述的檢測裝置包括用于檢測VEGF-B或VEGF-B類似物與所述的受體蛋白的特異性結(jié)合作用的裝置。
7.權(quán)利要求5所述的試劑盒，其中所述的檢測裝置包括用于檢測VEGF-B介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)產(chǎn)生的裝置。
8.一種分離的配體—受體復(fù)合物，包括兩種分子，一種分子是配體并包括VEGF-B的至少1-115位氨基酸或其受體結(jié)合類似物，第二種分子是受體并選自如下一組(i)包含F(xiàn)lt-1的殘基1-347所限定的氨基酸序列的多肽鏈或其VEGF-B特異性受體類似物；(ii)具有結(jié)合VEGF-B的親和性并與Flt-1的殘基1-347共享至少30％氨基酸相同性的多肽鏈；以及(iii)具有結(jié)合VEGF-B的親和性并由在嚴(yán)格條件下與包含F(xiàn)lt-1的核苷酸1-1293序列的核酸雜交的核酸所編碼的多肽鏈。
9.權(quán)利要求8所述的復(fù)合物，其中所述的受體也具有結(jié)合VEGF的親和性。
10.權(quán)利要求8所述的復(fù)合物，其中所述的配體是VEGF-B或與VEGF-B的1-115位氨基酸具有至少50％氨基酸序列相同性的VEGF-B類似物或其受體結(jié)合氨基酸序列變體或異種同系物。
11.一種分離的結(jié)合配對(duì)物，其對(duì)一種配體—受體復(fù)合物上的一個(gè)表位具有結(jié)合親和性，所述的復(fù)合物包括與下述細(xì)胞表面受體的配體結(jié)合功能域具有特異性結(jié)合作用的VEGF-B蛋白或其類似物，所述的細(xì)胞表面受體為(i)包含F(xiàn)lt-1的殘基1-347所限定的氨基酸序列的多肽鏈或其VEGF-B特異性受體類似物；(ii)具有結(jié)合VEGF-B的親和性并與Flt-1的殘基1-347共享至少30％氨基酸相同性的多肽鏈；以及(iii)具有結(jié)合VEGF-B的親和性并由在嚴(yán)格條件下與包含F(xiàn)lt-1的核苷酸1-1293序列的核酸雜交的核酸所編碼的多肽鏈；所述的結(jié)合配對(duì)物對(duì)未復(fù)合的VEGF-B或VEGF-B類似物幾乎沒有結(jié)合親和性。
12.權(quán)利要求11所述的分離的結(jié)合配對(duì)物，其中所述的結(jié)合配對(duì)物對(duì)未復(fù)合的所述細(xì)胞表面受體蛋白或其受體類似物幾乎沒有結(jié)合親和性。
13.權(quán)利要求11所述的結(jié)合配對(duì)物，其中所述的結(jié)合配對(duì)物是抗體。
14.權(quán)利要求13所述的結(jié)合配對(duì)物，其中所述的結(jié)合配對(duì)物是單克隆抗體。
15.權(quán)利要求13所述的結(jié)合配對(duì)物，其中所述的結(jié)合配對(duì)物是多克隆抗體。
16.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法獲得的VEGF-B類似物在如下方法中的應(yīng)用，所述的方法為(1)拮抗VEGF-B與細(xì)胞表面受體的結(jié)合，或(ii)拮抗VEGF-B介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)產(chǎn)生。
17.權(quán)利要求16的應(yīng)用，其中所述的VEGF-B類似物包括一種抗體，所述的抗體具有與(i)由Flt-1的1-347位氨基酸所限定的細(xì)胞表面受體的配體結(jié)合功能域或其VEGF-B特異性受體類似物，或(ii)由VEGF-B的1-115位氨基酸所代表的VEGF-B受體結(jié)合功能域，或其受體結(jié)合類似物的結(jié)合的特異性。
18.一種選自如下一組的受體蛋白(i)包含F(xiàn)lt-1的殘基1-347所限定的氨基酸序列的多肽鏈或其VEGF-B特異性受體類似物；(ii)具有結(jié)合VEGF-B的親和性并與Flt-1的殘基1-347共享至少30％氨基酸相同性的多肽鏈；以及(iii)具有結(jié)合VEGF-B的親和性并由在嚴(yán)格條件下與包含F(xiàn)lt-1的核苷酸1-1293序列的核酸雜交的核酸所編碼的多肽鏈；在拮抗(a)VEGF-B與細(xì)胞表面受體的結(jié)合，或(b)VEGF-B介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)產(chǎn)生的方法中的應(yīng)用。
19.一種用于拮抗VEGF-B與細(xì)胞表面受體結(jié)合的方法，所述的方法包括提供一種蛋白，所述的蛋白具有結(jié)合Flt-1的殘基1-347所限定的氨基酸序列或其VEGF-B受體結(jié)合序列變體的特異性，并且所述的蛋白與VEGF-B的殘基1-115具有至少50％氨基酸序列相同性，從而當(dāng)將該蛋白提供給表達(dá)所述細(xì)胞表面受體的細(xì)胞時(shí)，其能與所述受體特異地相互作用，從而基本上抑制VEGF-B與所述受體的結(jié)合。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所述的蛋白是根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法獲得的VEGF-B類似物。
21.一種治療以Flt-1細(xì)胞表面受體的過量表達(dá)為特征的疾病狀態(tài)的方法，所述的方法包括給予患有這種疾病的患者受體結(jié)合有效量的VEGF-B拮抗劑，其中所述的VEGF-B拮抗劑包括根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法獲得的VEGF-B類似物，或VEGF-B的抗體。
22.一種治療以Flt-1細(xì)胞表面受體的表達(dá)不足為特征的狀態(tài)的方法，所述的方法包括給予處于這種狀態(tài)的患者受體結(jié)合有效量的VEGF-B或VEGF-B激動(dòng)劑，所述的VEGF-B激動(dòng)劑包括根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法獲得的VEGF-B類似物。
23.一種VEGF-B類似物，其包括VEGF-B的VEGFR-1結(jié)合片段。
24.權(quán)利要求23所述的VEGF-B類似物，其中所述的類似物選自由VEGF-B的蛋白裂解過程產(chǎn)生的結(jié)合受體的16kDa片段，由VEGF-B經(jīng)纖溶酶消化產(chǎn)生的結(jié)合受體的片段，含有C-末端Kemptide基序的結(jié)合受體的外顯子1-5突變片段，以及包含至少一種所述結(jié)合受體的片段的二聚體。
25.權(quán)利要求23所述的VEGF-B類似物，其包括兩個(gè)由VEGF-B的蛋白裂解過程產(chǎn)生的結(jié)合受體的16kDa片段的二聚體。
26.權(quán)利要求23所述的VEGF-B類似物，其是全長的VEGF-B單體和由VEGF-B的蛋白裂解過程得到的結(jié)合受體的16kDa片段的二聚體。
27.編碼權(quán)利要求24的VEGF-B類似物的多核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了血管內(nèi)皮生長因子－B(VEGF－B)和Flt－1酪氨酸激酶受體的復(fù)合物;這種VEGF－B/Flt－1復(fù)合物在檢測VEGF－B或具有與VEGF－B基本上相同的結(jié)合細(xì)胞表面受體的親和性的VEGF－B類似物中的應(yīng)用,和/或在促進(jìn)或拮抗VEGF－B介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答中的應(yīng)用;以及針對(duì)這種VEGF－B/Flt－1復(fù)合物的特異結(jié)合配對(duì)物例如抗體。
文檔編號(hào)C07K14/71GK1241258SQ97180819
公開日2000年1月12日 申請(qǐng)日期1997年12月19日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月19日
發(fā)明者埃扎·考佩萊寧, 余吉·甘吉, 凱里·阿利塔羅, 比吉塔·奧洛夫松, 烏爾夫·埃里克松 申請(qǐng)人:路德維格癌癥研究所, 赫爾辛基大學(xué)許可貿(mào)易公司