本發(fā)明涉及中藥活性成分的制備方法，具體為具有抗胃潰瘍作用的黨參均一多糖的分離純化方法及其抗胃潰瘍作用。

背景技術(shù)：

黨參（Radix Codonopsis）為桔梗科黨參屬植物，具有補中益氣、健脾益肺的功效，臨床用于脾肺虛弱，氣短心悸，食少便溏，虛喘咳嗽，內(nèi)熱消咳等癥。黨參主要含有多糖、皂苷、三萜、生物堿等成分，其中多糖含量最大，為黨參的重要成分之一?，F(xiàn)代藥理研究表明，黨參多糖在抗衰老、調(diào)節(jié)機體免疫力、抗缺氧、抗應(yīng)激、抗氧化等多個方面具有較好的生物活性。

但是，文獻報道的藥理研究大多都針對黨參總多糖，目前對組成均一、結(jié)構(gòu)明確的黨參多糖的藥理活性及其機制研究幾乎沒有相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是通過對黨參多糖按分子量進行分級，然后進行藥效學(xué)活性篩選，得到一種具有組成均一的抗胃潰瘍的活性多糖。

本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種具有抗胃潰瘍的黨參均一多糖，結(jié)構(gòu)通式如圖6所示。

該多糖分子量為3000，是β-D-呋喃果糖殘基以β-(2→1)-糖苷鍵連接而成的直鏈均一多糖。

上述具有抗胃潰瘍的黨參均一多糖的分離提取方法，包括如下步驟：

（1）、提取黨參總多糖；

根據(jù)前期獲得的專利（200710062520.5），提取黨參總多糖。

（2）、黨參多糖的超濾分離

將黨參總多糖用蒸餾水稀釋10～30倍，水浴加熱至20℃～90℃充分溶解，于10℃以下靜置12～72小時，濃縮至1～3g/mL，以60%～95%的乙醇醇沉，靜置4～24小時，離心，沉淀干燥；重復(fù)上述操作1-3次；黨參總多糖溶液先后通過1-10萬分子量的濾膜及1000-10000分子量濾膜，得到黨參均一多糖，記作CPS-A。

黨參多糖CPS-A的結(jié)構(gòu)鑒定如下：

對本發(fā)明獲得的黨參多糖CPS-A采用高效凝膠滲透色譜法進行純度及分子量測定：

色譜條件：Shodex OHpak SB-804色譜柱，流動相為超純水，流速0.3mL/min，檢測器為示差折光檢測器；將黨參多糖CPS-A用適量水溶解，然后進樣分析，分析結(jié)果呈單一對稱峰，說明該組分為分子量均一的多糖（如見圖1所示）。

對本發(fā)明獲得的黨參多糖CPS-A進行結(jié)構(gòu)測定：

CPS-A經(jīng)純度鑒別，證明已是單一組成，可以進行結(jié)構(gòu)分析。

CPS-A經(jīng)完全水解，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，可知其為果糖，以¹H和¹³CNMR進一步分析。

上述分析證明：CPS-A分子量為3000，是β-D-呋喃果糖殘基以β-(2→1)-糖苷鍵連接而成的直鏈均一多糖。

黨參均一多糖在治療胃潰瘍藥物中的應(yīng)用，下述藥效學(xué)實驗證實CPS-A具有抗胃潰瘍的藥理活性。

本發(fā)明中黨參多糖CP-A對乙醇誘導(dǎo)的急性胃潰瘍大鼠的抑制作用如下：

將SD大鼠隨機分為6組，每組10只大鼠：空白組，模型組，黨參多糖高、中、低劑量組，陽性對照（枸櫞酸鉍鉀）組。空白組按照10mL/kg灌胃生理鹽水，模型組灌胃蒸餾水10mL/kg，黨參多糖高、中、低劑量組按照黨參多糖0.8g/kg、0.4g/kg、0.2g/kg灌胃。陽性藥物組按照枸櫞酸鉍鉀100mg/kg灌胃。每日1次，連續(xù)7天后，動物禁食不禁水24小時，第8天開始給藥前禁水。給藥3小時后，除空白組外，各組均給1mL 70%乙醇灌胃?？瞻捉M給1mL蒸餾水。造模1小時以后，腹腔注射戊巴比妥鈉45mg/kg麻醉大鼠，5分鐘以后腹主動脈抽血處死動物。取出胃，沿胃大彎剪開胃壁，觀察胃黏膜，進行胃潰瘍指數(shù)的測定，計算胃黏膜損傷指數(shù)，然后一半胃組織放入10%中性福爾馬林溶液中固定，一半制備10%組織勻漿，用于檢測胃組織中MPO、SOD、GSH-Px活性和MDA、NO含量。所有數(shù)據(jù)均用±s表示，多組間數(shù)據(jù)差異的顯著性檢驗采用單因素方差分析。

結(jié)果如圖7、圖8、表1和表2。

圖7表明正常組大鼠胃黏膜光滑平整，沒有出血現(xiàn)象。模型組大鼠胃黏膜有嚴(yán)重條索狀出血損傷，CPS-A高劑量組和中劑量組出血較少。

圖8表明光鏡下A（正常組）胃黏膜細胞排列整齊，致密，規(guī)則，未見細胞壞死脫落等異常，損傷程度0級（按照Lacy法進行胃黏膜損傷程度分級）。B（模型組）胃黏膜細胞廣泛壞死脫落，細胞核固縮，細胞質(zhì)裂解，細胞排列紊亂，間質(zhì)疏松，損傷侵及黏膜細胞下層，損傷程度III級。C（CPS-A高劑量組）胃黏膜表層細胞排列不規(guī)則,黏膜下層細胞排列整齊，損傷程度I級。D（CPS-A中劑量組）胃黏膜細胞廣泛壞死脫落，但是未損傷至腺體。損傷程度II級。E（CPS-A低劑量組）胃黏膜細胞層變薄，細胞排列疏松并且廣泛壞死脫落，細胞核固縮，細胞質(zhì)裂解，損傷侵及腺體，損傷程度III級。F（陽性藥物枸櫞酸鉍鉀組）胃黏膜細胞基本正常，黏膜上層細胞排列疏松不規(guī)則，細胞核固縮，未延伸至下層細胞，損傷程度I級。

表1 CPS-A對乙醇誘導(dǎo)大鼠胃潰瘍胃組織氧化應(yīng)激的影響

表1表明CPS-A能夠不同程度提高大鼠胃組織中SOD和GSH-Px活性，降低MPO活性和NO、MDA含量。并且大鼠胃組織GSH-Px活性隨著CPSa劑量的增加而增加，MDA含量隨著CPSa劑量的增加而減小，MPO活性隨著CPSa劑量的增大而減小。

表2 大鼠胃潰瘍指數(shù)及潰瘍抑制率（±s）

表2表明枸櫞酸鉍鉀組、CPS-A高劑量和中劑量組能夠顯著降低大鼠胃潰瘍指數(shù)（按照Guth法進行胃潰瘍指數(shù)測定）。

附圖說明

圖1表示 CPS-A分子量分布圖。

圖2表示CPS-A的氣相色譜與標(biāo)準(zhǔn)單糖對照圖。

圖3表示CPS-A的紅外色譜圖。

圖4表示CPS-A核磁共振¹H-NMR譜圖。

圖5表示CPS-A的¹³C-NMR譜圖。

圖6表示CPS-A的結(jié)構(gòu)式。

圖7表示CPS-A對乙醇誘導(dǎo)大鼠胃潰瘍胃組織形態(tài)的影響，其中，A表示正常組，B表示模型組，C表示黨參CPS-A高劑量組（50mg/kg），D表示黨參CPS-A中劑量組（25mg/kg），E表示黨參CPS-A低劑量組（12.5mg/kg），F(xiàn)表示陽性藥物枸櫞酸鉍鉀組（100mg/kg）。

圖8表示CPS-A對乙醇誘導(dǎo)大鼠胃潰瘍胃組織切片光鏡結(jié)果（10×10），其中，A表示正常組，B表示模型組，C表示黨參CPS-A高劑量組（50mg/kg），D表示黨參CPS-A中劑量組（25mg/kg），E表示黨參CPS-A低劑量組（12.5mg/kg），F(xiàn)表示陽性藥物枸櫞酸鉍鉀組（100mg/kg）。

具體實施方式

下面對本發(fā)明的具體實施例進行詳細說明。

實施例1

黨參多糖CPS-A的制備，包括如下步驟：

取黨參總多糖100g，加2000mL蒸餾水，80℃溶解1小時，期間不斷攪拌。4℃靜置12小時，離心。上清液濃縮至100mL，90%乙醇醇沉，4℃靜置12小時，離心。沉淀干燥后，重復(fù)之前的操作，得到多糖沉淀，以3000mL蒸餾水，80℃溶解1小時，期間不斷攪拌，4℃靜置12小時，離心，上清液依次以100000分子量膜、5000分子量膜超濾，壓力為1.5個大氣壓，將最后通過5000分子量膜的濾液濃縮，干燥，得36.45g CPS-A。

實施例2

黨參多糖CPS-A的制備，包括如下步驟：

取黨參總多糖100g，加3000mL蒸餾水，85℃溶解1.5小時，期間不斷攪拌。4℃靜置24小時，離心。上清液濃縮至100mL，95%乙醇醇沉，4℃靜置24小時，離心。沉淀干燥后，重復(fù)之前的操作，得到多糖沉淀，以4000mL蒸餾水，85℃溶解1.5小時，期間不斷攪拌，4℃靜置24小時，離心，上清液依次以100000分子量膜、5000分子量膜超濾，壓力為2.0個大氣壓，將最后通過5000分子量膜的濾液濃縮，干燥，得40.30g CPS-A。

實施例3

黨參多糖CPS-A的制備，包括如下步驟：

取黨參總多糖100g，加2500mL蒸餾水，85℃溶解1小時，期間不斷攪拌。4℃靜置24小時，離心。上清液濃縮至100mL，95%乙醇醇沉，4℃靜置24小時，離心。沉淀干燥后，重復(fù)之前的操作，得到多糖沉淀，以3500mL蒸餾水，85℃溶解1小時，期間不斷攪拌，4℃靜置24小時，離心，上清液依次以100000分子量膜、5000分子量膜超濾，壓力為2.5個大氣壓，將最后通過5000分子量膜的濾液濃縮，干燥，得41.50g CPS-A。

本實施例的黨參多糖CPS-A的結(jié)構(gòu)鑒定如下：

1、糖組分分解及氣相色譜分析

取30mg CPS-A，放入具塞試管，加入2mol/L的三氟乙酸2mL，封管，100℃水解12h，取出后N₂吹干，備用。采用糖腈乙酰法制備衍生物：分別稱取標(biāo)準(zhǔn)單糖和多糖樣品水解后的糖樣各10mg，加入鹽酸羥胺10mg，內(nèi)標(biāo)肌醇7mg，吡啶0.5mL，于90℃水浴加熱30min并振蕩，取出冷卻至室溫，加入醋酸酐0.5mL，在85℃繼續(xù)加熱30min進行乙酰化，產(chǎn)物濃縮至干，加入0.5mL氯仿溶解，溶液經(jīng)0.45濾膜過濾后，0.2μL進樣，氣相色譜儀進行分析。結(jié)果如圖2所示，與標(biāo)準(zhǔn)單糖比較，CPS-A水解產(chǎn)物對應(yīng)于果糖。

2、紅外吸收光譜

樣品采用KBr壓片法測定，結(jié)果如圖3所示，從IR圖中CPS-A呈現(xiàn)典型的多糖的特征吸收峰，在波數(shù)840cm^-1處無吸收，說明不含α-糖苷鍵，而含β-糖苷鍵。

3、核磁共振光譜

¹H及¹³CNMR譜的分析

樣品溶于D₂O中，常溫下測定，結(jié)果見圖4和圖5。參照文獻數(shù)據(jù)，CPS-A的¹³CNMR譜信號與β-D-吡喃果糖多糖的C信號相似，結(jié)合文獻苷化位移規(guī)律，可知CPS-A中的果糖以-β（1, 2）-鍵連接。對各信號歸屬如下：62.0 （C-1），103.4 （C-2），77.0 （C-3），74.5 （C-4），81.5 （C-5），60.8 （C-6）。

最后所應(yīng)說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照本發(fā)明實施例進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，都不脫離本發(fā)明的技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋權(quán)利要求保護范圍中。