專(zhuān)利名稱(chēng)：多肽的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多肽用于測(cè)定酶調(diào)節(jié)所述多肽磷酸化狀態(tài)的能力的的用途。本發(fā)明另一方面涉及測(cè)定這種活性的方法，以及鑒定修飾所述酶的這種能力的物質(zhì)的方法。
胰島素是通過(guò)結(jié)合胰島素受體進(jìn)而激活其內(nèi)在酪氨酸激酶而影響大量生長(zhǎng)和代謝途徑的肽激素。這個(gè)事件導(dǎo)致了大量能夠結(jié)合胰島素受體(IR)特定酪氨酸殘基的蛋白的磷酸化。胰島素受體底物(IRS)家族也屬于以這種方式磷酸化的蛋白。
胰島素受體底物1(IRS-1)是一種能夠被大量蛋白激酶(酪氨酸特異性或絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶)在酪氨酸和/或絲氨酸殘基和/或蘇氨酸殘基上磷酸化的細(xì)胞蛋白。就此而言，認(rèn)為取決于酶，存在著不同的酪氨酸或絲氨酸/蘇氨酸殘基的特異性磷酸化。除了經(jīng)由比如酪氨酸激酶的磷酸化，例如，除了胰島素受體(White 2002)、IGF-1受體(White 2002)或JAKI/2(Thirone等1999)，已知IRS-1也經(jīng)由比如絲氨酸/蘇氨酸激酶被磷酸化，例如，來(lái)自PKC家族的激酶(Schmitz-Peiffer 2002)、抑制因子κB激酶復(fù)合體(Gao等2002)、c-Jun NH(2)-末端激酶(JNK，Aguirre等2000)、蛋白激酶A(Sun等1991)、促分裂原活化蛋白激酶(Mothe等1996)、蛋白激酶B(Paz等1999)、酪蛋白激酶(Tanasijevic等1993)、糖原合成酶激酶β(Eldar-Finkelmann等1997)、AMP活化激酶(Jakobsen等2001)或磷酸肌醇3激酶(Freund等1995)。IRS分子是胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵分子，并在細(xì)胞功能如生長(zhǎng)、存活和代謝的維持中起重要作用。磷酸化IRS蛋白就此而言作為“停泊”蛋白，其具有大量的胰島素受體停泊位點(diǎn)，并具有復(fù)雜的胞內(nèi)信號(hào)分子網(wǎng)絡(luò)，所述胞內(nèi)信號(hào)分子帶有所謂的信號(hào)識(shí)別復(fù)合體(SRC)同源區(qū)段2結(jié)構(gòu)域(SH2結(jié)構(gòu)域)。而且這些Sh2結(jié)構(gòu)域蛋白的活化也激活了某些信號(hào)級(jí)聯(lián)，其依次導(dǎo)致了位于信號(hào)級(jí)聯(lián)更下游的各種效應(yīng)物的活化，最終導(dǎo)致了胰島素信號(hào)向其它胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)的分支系列的傳送(綜述見(jiàn)White2002)。
IRS屬于大小為160-185kDA且作為胰島素受體底物的磷酸蛋白家族。已知IRS家族有四個(gè)成員(IRS-1、IRS-2、IRS-3和IRS-4)。它們?cè)诮M織分布、亞細(xì)胞定位、發(fā)育特異性表達(dá)、與胰島素受體的結(jié)合性質(zhì)以及它們與之相互作用的SH2蛋白的性質(zhì)方面存在著差異。IRS家族的四個(gè)成員就基礎(chǔ)蛋白結(jié)構(gòu)而言有著極為相似的結(jié)構(gòu)它們都有氨基(N)末端結(jié)合細(xì)胞膜磷脂的普列克(plextrin)同源區(qū)段結(jié)構(gòu)域(PH結(jié)構(gòu)域)，以及磷酸酪氨酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(PTB結(jié)構(gòu)域)，其直接與PH結(jié)構(gòu)域的羧基(C)末端相連，并參與位于胰島素受體β亞基的靠膜區(qū)(juxtamember region)的Asp-Pro-Glu磷酸化酪氨酸(NPEpY)序列的識(shí)別。此外，它們還有稍微不那么強(qiáng)保守的C末端部分，其具有含特異性SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白能夠與之結(jié)合的多個(gè)潛在的酪氨酸磷酸化基序。
IRS-1包含21個(gè)可能的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，其中一些位于能夠結(jié)合SH2結(jié)構(gòu)域蛋白的氨基酸序列基序中。IRS-1在能夠被各種激酶，比如象來(lái)自PKC家族的激酶(Schmitz-Peiffer 2002)、抑制因子κB激酶復(fù)合體(Gao等2002)、c-Jun NH(2)-末端激酶(JNK，Aguirre等2000)、蛋白激酶A(Sun等1991)、促分裂原活化蛋白激酶(Mothe等1996)、蛋白激酶B(Paz等1999)酪蛋白激酶(Tanasijevic等1993)、糖原合成酶激酶β(Eldar-Finkelmann等1997)、AMP活化激酶(Jakobsen等2001)或磷酸肌醇3激酶(PI3激酶，F(xiàn)reund等1995)所識(shí)別的基序中，另外含有30個(gè)潛在的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)。胰島素受體信號(hào)途徑中的抑制效應(yīng)至少部分地可通過(guò)最近發(fā)現(xiàn)的IRS-1的絲氨酸/蘇氨酸的磷酸化來(lái)解釋?zhuān)@被認(rèn)為是和與胰島素受體相互作用的削弱和/或IRS-1的酪氨酸磷酸化的減少和/或與能結(jié)合酪氨酸磷酸化了的IRS-1的后序信號(hào)蛋白的相互作用的削弱有關(guān)(見(jiàn)White綜述2002)。到目前為止已有可能證明各種激酶如來(lái)自PKC家族的激酶(Schmitz-Peiffer 2002)、抑制因子κB激酶復(fù)合體(Gao等2002)，c-Jun NH(2)-末端激酶(JNK，Aguirre等2000)、蛋白激酶A(Sun等1991)、促分裂原活化蛋白激酶(Mothe等1996)、蛋白激酶B(Paz等1999)、酪蛋白激酶(Tanasijevic等1993)、糖原合成酶激酶β(Eldar-Finkelmann等1997)或磷酸肌醇3激酶(Freund等1995)在體外直接磷酸化IRS-1。而且，在每種情況中，完整細(xì)胞中增加的激酶活性抑制了胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑的活性。此外，體外RS-1絲氨酸/蘇氨酸殘基上的磷酸化在一些研究中被認(rèn)為是與減少的經(jīng)由胰島素受體的酪氨酸磷酸化直接相關(guān)(Le Marchand-Brustel 1999)。IRS-1、2、3、4的序列是公眾可得的。這些基因的編碼多核苷酸序列和相關(guān)蛋白序列可由NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄號(hào)NM 005544(人IRS-1)，XM007095(人IRS-2)，NM032074(大鼠IRS-3)，NM003604(人IRS-4)獲得。NCBI是國(guó)家生物技術(shù)信息中心(郵政地址國(guó)家生物技術(shù)信息中心，國(guó)家醫(yī)學(xué)圖書(shū)館，大廈38A，貝塞斯達(dá)，MD20984，美國(guó)；網(wǎng)址www.ncbi.nhm.nih.gov)。其中，Araki等1993和Siemeister等1996中業(yè)已描述了IRS-1基因的克隆；Araki等1994，Lavan等1997a和Lavan等1997b中業(yè)已描述了IRS-2至4的克隆。
用于測(cè)定各種激酶磷酸化IRS-1的能力和測(cè)量這種活性的各種現(xiàn)有技術(shù)方法是公知的，所述方法基于放射性檢測(cè)法(如放射性標(biāo)記磷酸鹽向底物的轉(zhuǎn)移)或非放射性檢測(cè)法。
因而，已知通過(guò)與放射性標(biāo)記的ATP和待測(cè)激酶孵育將放射性磷酸鹽殘基轉(zhuǎn)移至IRS-1的方法，作為所述激酶磷酸化IRS-1的能力的函數(shù)，來(lái)測(cè)定IRS-1在全長(zhǎng)IRS-1蛋白、其具有至少一個(gè)磷酸化位點(diǎn)的片段或多肽上的磷酸化。接著親和層析或電泳分離IRS-1，并通過(guò)流式閃爍或放射自顯影檢測(cè)轉(zhuǎn)移磷酸鹽的量(例如Eldar-Finkerlamn等1997中描述的全長(zhǎng)IRS-1蛋白和糖原合成酶激酶3β，Siemeister等1995中描述的IRS-1片段(氨基酸516-777)和胰島素受體、IGF-1受體或者重組胰島素受體激酶，或De Fea等1997中描述的伴有含PKC家族活化蛋白激酶的細(xì)胞溶解物的IRS-1肽(氨基酸601-616))。此外，正是從Siemeister等1995起，通過(guò)如下方法測(cè)定磷酸化IRS-1片段如IRS-1片段(氨基酸516-777)和胰島素受體、IGF-1受體或者重組胰島素受體激酶的能力，即與放射性標(biāo)記的ATP孵育，逐滴將底物加到荷正電的膜上(硝化纖維或類(lèi)似材料)，洗滌并通過(guò)放射自顯影或測(cè)量放射性發(fā)射檢測(cè)結(jié)合的放射性標(biāo)記的底物。
孵育放射性標(biāo)記的ATP和生物素化IRS-1多肽，將底物逐滴加到包被有鏈霉親和素的膜上，洗滌并通過(guò)放射自顯影或測(cè)量放射性發(fā)射檢測(cè)結(jié)合的放射性標(biāo)記底物是另一種用于測(cè)定激酶磷酸化IRS-1的能力的方法(見(jiàn)De Fea等1997)。
上文所述的放射性測(cè)定方法的缺點(diǎn)是顯而易見(jiàn)的，因?yàn)榉派湫圆僮鞒袚?dān)著相當(dāng)大的危險(xiǎn)，費(fèi)用極其昂貴，因此特別是對(duì)于高通量方法(HTS方法)適用性低。
上述基于短肽使用的方法的缺點(diǎn)在于這些短肽有不適宜的動(dòng)力學(xué)常數(shù)(Vmax，Km)，而且肽的三維結(jié)構(gòu)與生理學(xué)酶底物的三維結(jié)構(gòu)差異很大。這一方面通過(guò)完全不同的折疊得以證明，這樣決定酶-底物相互作用的特異性的某些生物空間不存在，這導(dǎo)致了無(wú)識(shí)別(因而無(wú)修飾)或者非特異性識(shí)別(因而非特異性修飾)并最終導(dǎo)致了不正確的結(jié)果。此外，肽短意味著它們只有一個(gè)或少數(shù)磷酸化位點(diǎn)，這樣必須多樣化的肽來(lái)研究不同酶對(duì)特定底物的磷酸化修飾。這反過(guò)來(lái)也導(dǎo)致費(fèi)用增加和對(duì)HTS形式的方法僅僅是條件性適用。
因此本發(fā)明的目的是提供一種可能的測(cè)定蛋白磷酸化酶和/或去磷酸化酶活性的方法，其沒(méi)有上述缺點(diǎn)。
本發(fā)明目的是通過(guò)使用多肽(Def GGs to the peptide)測(cè)定酶、其功能性片段或衍生物調(diào)節(jié)多肽磷酸化狀態(tài)的能力來(lái)完成的，其中所述多肽是生物素化的。
本發(fā)明是基于發(fā)明人的這樣的研究成果，其令人驚訝地表明即使用多肽或全長(zhǎng)蛋白也不存在鏈霉親和素對(duì)生物素結(jié)合的空間位阻，而且生物素化也不會(huì)干擾激酶對(duì)所研究底物的磷酸化。
用于本發(fā)明目的術(shù)語(yǔ)多肽是指含有通過(guò)肽鍵連接的氨基酸并具有至少50個(gè)以此種方式線性連接的氨基酸的分子。較短的這類(lèi)分子稱(chēng)之為肽。術(shù)語(yǔ)蛋白涉及含有至少一個(gè)多肽鏈的分子，但是也可由大量結(jié)合或連接在一起的多肽鏈組成。術(shù)語(yǔ)蛋白因而囊括了術(shù)語(yǔ)多肽。
本發(fā)明多方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，多肽的長(zhǎng)度是50個(gè)氨基酸和以上，優(yōu)選50-300個(gè)。
本發(fā)明多方面的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，多肽的大小是1kDa和以上，優(yōu)選1-100kDa，并且特別優(yōu)選10-50kDa。
本文酶的底物是指適于被所述酶修飾的任何分子。用于本發(fā)明目的天然底物是以其在天然生理或病理環(huán)境中發(fā)生的方式排列且能夠被相關(guān)酶修飾的分子。
酶對(duì)磷酸化狀態(tài)的調(diào)節(jié)涉及酶修飾底物的本性，其中將至少一個(gè)磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至底物或除去。因此與本發(fā)明相關(guān)的酶具有催化一種和/或另一種反應(yīng)的能力。因此它們至少具有這種激酶和/或磷酸酶的能力，但是可能另外還具有其它酶學(xué)特性(如蛋白酶特性等)。各種酶的分類(lèi)及其特性是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
本文酶的功能性片段是酶的任何片段(與天然存在的形式相比大小減少或者截短的分子)，其仍具有調(diào)節(jié)至少一種多肽磷酸化狀態(tài)的能力。就此而言術(shù)語(yǔ)酶的“功能性衍生物”包括與天然存在的形式相比的酶修飾的每種類(lèi)型，其不代表截短物，酶的衍生物仍有調(diào)節(jié)至少一種多肽磷酸化狀態(tài)的能力。就此而言，本發(fā)明也涉及酶片段的功能性衍生物，其能夠調(diào)節(jié)至少一種多肽的磷酸化狀態(tài)。
測(cè)定酶調(diào)節(jié)多肽的磷酸化狀態(tài)能力就此而言既可以定性又可以定量(如作為可計(jì)量的測(cè)量)進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明的用途具有由此獲得的結(jié)果信息更豐富的優(yōu)點(diǎn)，這歸因于所用底物的長(zhǎng)度，因?yàn)樗鼈儼粟呌趯?duì)應(yīng)于生理學(xué)環(huán)境的三級(jí)結(jié)構(gòu)。此外，所用的多肽，與現(xiàn)有技術(shù)的已知多肽形成對(duì)照，具有良好的動(dòng)力學(xué)常數(shù)(如對(duì)于IRS-1Km 19μM與肽相比＞200μM，參見(jiàn)Siemeister等1995)，而且分析具有大量磷酸化位點(diǎn)的底物只需要一個(gè)底物，并且也能夠例如用于測(cè)定不同酶的能力。
一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例涉及測(cè)定酶磷酸化多肽的能力的用途。
用于本發(fā)明多方面具有激酶活性的特別有利類(lèi)型的酶涉及絲氨酸/蘇氨酸或酪氨酸激酶。其中特別合適的激酶的例子包括胰島素受體、IGF-1受體、trK受體、EGF受體、酪蛋白激酶II、蛋白激酶C家族成員、蛋白激酶B/Akt、促分裂原活化蛋白激酶(MAP激酶)、GSK-3β、ERK1/2、IKKβ激酶、AMP激酶、P13激酶或JNK。
根據(jù)本發(fā)明的用途另外同樣也適于測(cè)定酶去磷酸化多肽的能力。
本發(fā)明的另一方面涉及用于測(cè)定酶、其功能性片段或衍生物調(diào)節(jié)生物素化多肽的磷酸化狀態(tài)的能力的方法。
用于測(cè)定生物素化多肽的磷酸化程度的合適方法涉及例如適合于測(cè)定短肽的磷酸化程度的已知方法。這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員很熟悉的。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法涉及以如下步驟測(cè)定酶、其功能性片段或衍生物磷酸化多肽能力的方法a)使酶或功能性片段或衍生物與生物素化多肽接觸，并在合適的反應(yīng)混合物中起始磷酸化反應(yīng)，b)使反應(yīng)混合物與偶聯(lián)于載體且能夠結(jié)合生物素化多肽的部件接觸，c)測(cè)定與部件結(jié)合的多肽磷酸化狀態(tài)。
本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案涉及測(cè)定酶、其功能性片段或衍生物磷酸化多肽能力的方法，其步驟為a)使酶或功能性片段或衍生物與具有至少一個(gè)磷酸化殘基的生物素化的多肽接觸，并在合適的反應(yīng)混合物中起始磷酸化反應(yīng)，b)使反應(yīng)混合物與偶聯(lián)于載體且能夠結(jié)合生物素化多肽的部件接觸，c)測(cè)定與部件結(jié)合的多肽磷酸化狀態(tài)。
就此而言的部件可以是適于結(jié)合生物素化多肽的任何類(lèi)型分子或超分子結(jié)合(如實(shí)體或裝置)。此例中結(jié)合可能發(fā)生在生物素部分或多肽本身上，而對(duì)于結(jié)合多肽本身的情況，優(yōu)選是依賴于磷酸化狀態(tài)的結(jié)合(如參照單個(gè)或多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，僅在磷酸化或者非磷酸化狀態(tài)下結(jié)合)。因此部件優(yōu)選的實(shí)施方案涉及鏈霉親和素或磷酸特異性抗體(如能夠識(shí)別多肽上特定殘基的磷酸化并與此處磷酸化的多肽特異結(jié)合的抗體)。
此外，用于本發(fā)明多方面目的的反應(yīng)混合物在本質(zhì)上可是生化混合物(如在體外)或細(xì)胞混合物。生化混合物的組成就此而言取決于待研究酶的需要，但是合適的組分和組成，如ATP、調(diào)節(jié)期望PH環(huán)境和期望鹽濃度以確保酶活性的緩沖液，是相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。在生化混合物的情況下，可能酶和/或多肽是通過(guò)重組和/或作為部分或完全由天然來(lái)源純化的分子和/或以來(lái)自生物材料的抽提物的形式提供的，特別是細(xì)胞或組織抽提物。
其中，生物材料可包括組織或器官(如大腦、血液、肝臟、脾臟、腎臟、心臟、血管)的細(xì)胞，優(yōu)選脊椎動(dòng)物的，包括人，或來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞。用于本發(fā)明目的的細(xì)胞就此而言包括所有類(lèi)型的細(xì)胞，如真核或原核單細(xì)胞生物(比如細(xì)菌，如大腸桿菌(E.coli)或酵母，如裂變酵母(S.pombe)或釀酒酵母(s.cerevisiae))或來(lái)源于多細(xì)胞生物的細(xì)胞系(比如象HeLA、COS、NIH-3T3、CHO等)，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。脊椎動(dòng)物，包括人的組織集合或器官的細(xì)胞，可通過(guò)常規(guī)的技術(shù)如血樣采集、活組織檢查或外科技術(shù)獲得。這些重組分子的制備，來(lái)自細(xì)胞或組織的天然分子的純化以及細(xì)胞或組織抽提物的制備都是本領(lǐng)域技術(shù)人員充分熟知的(參見(jiàn)下文列出的標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)的例子)。
適用于本發(fā)明多方面目的的細(xì)胞體系同樣是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且優(yōu)選包括初始來(lái)自組織集合的分離細(xì)胞(優(yōu)選來(lái)自脊椎動(dòng)物，特別優(yōu)選哺乳動(dòng)物且更優(yōu)選人)，特別優(yōu)選培養(yǎng)的細(xì)胞系的形式；它們還包括單細(xì)胞的生命形式(真核生物或原核生物)，比如象酵母或細(xì)菌細(xì)胞，特別是培養(yǎng)的菌株的形式。
載體可以是適于介由生物素-鏈霉親和素相互作用從反應(yīng)混合物中去除與它們偶聯(lián)的肽、或適于標(biāo)記肽的任何類(lèi)型的分子或超分子結(jié)合(如實(shí)體或裝置)。合適的裝置有，例如膜、板或各種形狀的實(shí)體(文中一般稱(chēng)之為珠子)，是由現(xiàn)有技術(shù)充分熟知的各種材料制成的。載體的性質(zhì)就此而言取決于方法的目標(biāo)(如診斷，尋找活性物質(zhì)或發(fā)現(xiàn)新作用配偶體)和檢測(cè)的方式，并且合適載體的選擇落在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)。
在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，向反應(yīng)混合物中加入放射性標(biāo)記的γ32P-ATP，并在完成至少一次清洗步驟后，通過(guò)測(cè)量載體上殘留的放射性確定磷酸化狀態(tài)，所述載體優(yōu)選為膜或板。以這種方式，有可能簡(jiǎn)單地除去反應(yīng)混合物中不與鏈霉親和素結(jié)合的組分，包括游離的放射性，這樣多肽的磷酸化狀態(tài)僅基于固定在載體上的放射性就可確定。在該例中，適合于結(jié)合生物素化的多肽的部件特別是鏈霉親和素。
在本發(fā)明方法的另一實(shí)施方案中，向反應(yīng)混合物中加入能夠特異結(jié)合磷酸化多肽的抗體(BSP)。在該例中抗體既可以代表部件本身，又可在部件之外另行加入(在此情況下，后者優(yōu)選不是磷酸特異性抗體，并特別優(yōu)選鏈霉親和素)。在該例中磷酸化狀態(tài)的確定是通過(guò)測(cè)定結(jié)合多肽的抗體量進(jìn)行的。標(biāo)記和檢測(cè)抗體的合適操作是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。因而，有可能一方面使用合適標(biāo)記的可被直接檢測(cè)的一抗，或者使用合適標(biāo)記的針對(duì)所述一抗FC部分(可結(jié)晶片段)的二抗，從而增加檢測(cè)的特異性。
術(shù)語(yǔ)抗體就此而言包括單克隆抗體和多克隆抗血清、重組制備的抗體和重組制備的單鏈抗體。這類(lèi)抗體的選擇和制備落在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)，就此而言的參考文獻(xiàn)也可參見(jiàn)下文列出的標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)。用于這類(lèi)抗體的合適標(biāo)記在現(xiàn)有技術(shù)中也是已知的，并且包括例如，酶標(biāo)記CIP(小牛堿性磷酸酶)或HRP(辣根過(guò)氧化物酶)，經(jīng)由特定波長(zhǎng)光輻照激發(fā)產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的熒光分子，如得克薩斯紅(Texas Red)、Cy3、FITC(異硫氰酸熒光素)，或已知的熒光蛋白。合適標(biāo)記的選擇同樣是與本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力相符的。合適標(biāo)記或非標(biāo)記的一抗和二抗及其制備是已知的現(xiàn)有技術(shù)中，而且這些抗體在商業(yè)上可通過(guò)多家供應(yīng)商獲得。例如，一抗和二抗可通過(guò)Becton Dickinson、Pharmacia或Santa Cruz Biotech獲得。
在上述方法的優(yōu)選實(shí)施方式中，結(jié)合多肽的抗體量通過(guò)在完成至少一次清洗步驟后，測(cè)量載體優(yōu)選膜或板上殘留的抗體量來(lái)確定。
在本發(fā)明方法的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，與偶聯(lián)于部件的載體是包含第一信號(hào)發(fā)生器的第一載體，而多肽偶聯(lián)于包含第二信號(hào)發(fā)生器的第二載體，當(dāng)兩個(gè)信號(hào)發(fā)生器彼此直接鄰近時(shí)，能夠產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)，由此通過(guò)測(cè)定是否產(chǎn)生了可檢測(cè)的信號(hào)來(lái)確定磷酸化狀態(tài)。在該例中載體優(yōu)選為珠子。這里部件優(yōu)選為磷酸特異性抗體。在該例中載體可直接或間接地與抗體相連，優(yōu)選通過(guò)與偶聯(lián)于載體的蛋白A間接相連。在該例中第二載體可直接或間接地與多肽連接，優(yōu)選通過(guò)生物素化多肽的生物素部分間接相連；這優(yōu)選介由與偶聯(lián)于載體的鏈霉親和素進(jìn)行。
信號(hào)發(fā)生器在該例中可以是適于產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的任何部件或分子；例子包括熒光團(tuán)，其暴露于能量被激發(fā)后，發(fā)射可直接或通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)已知的合適手段經(jīng)信號(hào)擴(kuò)大后檢測(cè)的光。在該例中選擇信號(hào)發(fā)生器用于本發(fā)明目的，從而僅當(dāng)部件(即優(yōu)選磷酸特異性抗體)與多肽發(fā)生直接相互作用時(shí)才產(chǎn)生信號(hào)。合適的載體和信號(hào)發(fā)生器(如ALPHAScreenTM或LANCETM，Perkin-Elmer Life Sciences；HTRFTM，CIS Bio International的形式)是已知的。在這些例子中，對(duì)信號(hào)發(fā)生至關(guān)重要的是載體彼此直接鄰近。因此非常令人驚訝的是這類(lèi)方法適于與多肽結(jié)合使用，雖然后者明顯大于現(xiàn)有技術(shù)中所使用的肽。
適合本發(fā)明多方面目的的多肽優(yōu)選是酶的天然底物，優(yōu)選是未截短的長(zhǎng)度。特別適合的多肽包括胰島素受體激酶的所有底物。就此而言特別要提及胰島素受體底物(IRS)家族的多肽，優(yōu)選IRS-1、2、3或4，并且特別優(yōu)選IRS-1或其功能性片段或衍生物。這是指具有被胰島素受體磷酸化能力的片段或衍生物(或片段的衍生物)。還優(yōu)選IRS為人IRS-1。
此外，特別優(yōu)選使用IRS-1，特別是具有SEQ ID No.1所示序列的人IRS-1，(即)由SEQ ID No.2所示序列編碼的人IRS-1用于本發(fā)明多方面目的。此外，前述多肽特別適用于確定胰島素受體磷酸化它們的能力。
優(yōu)選IRS-1片段是具有SEQ ID No.3所示氨基酸序列的多肽。
可在不同的水平采用本發(fā)明的多方面。因此其在鑒定物質(zhì)修飾酶或其功能性片段或衍生物調(diào)節(jié)多肽磷酸化狀態(tài)的能力方面的用途特別有利。
稱(chēng)之為測(cè)定法的合適的分析方法或系統(tǒng)在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的，其測(cè)量機(jī)體特定靶分子(在多肽磷酸化的狀態(tài)下稱(chēng)之為“靶”，)的活性或濃度或量作為潛在活性物質(zhì)的活性參數(shù)。其可能的例子是體外測(cè)定，即生化測(cè)定，其中混合分離的或部分分離的成分以提供反應(yīng)混合物，并可在此基礎(chǔ)上測(cè)量潛在活性物質(zhì)的活性。其它可能性還有細(xì)胞測(cè)定系統(tǒng)(測(cè)定法)，其中可測(cè)定細(xì)胞環(huán)境中靶蛋白的活性(即本例中酶的活性)和潛在活性物質(zhì)對(duì)該靶分子的活性。
測(cè)定法就此而言是可在其基礎(chǔ)上監(jiān)控生物過(guò)程的任何類(lèi)型的分析方法。這按照慣例需要(不僅)代表部分生理代謝途徑和調(diào)控機(jī)制而且代表在細(xì)胞或生化體系中再現(xiàn)的病理狀態(tài)的分子過(guò)程和信號(hào)級(jí)聯(lián)?；钚晕镔|(zhì)的藥理學(xué)活性可根據(jù)它干預(yù)這些途徑和機(jī)制的能力來(lái)測(cè)定。
對(duì)于尋找活性物質(zhì)的目的特別是高通量篩選活性物質(zhì)的用途，測(cè)定法必須是可重復(fù)且優(yōu)選也是可升級(jí)和強(qiáng)壯的(即對(duì)外部影響敏感性小)。測(cè)定法應(yīng)該優(yōu)選適于高通量篩選對(duì)靶分子活性有影響能力的化學(xué)物質(zhì)。其中，測(cè)定法的性質(zhì)就此而言取決于所用靶分子的性質(zhì)(如基礎(chǔ)生化分子的確切類(lèi)型或性質(zhì)，如多肽或多核苷酸)和“讀出”，即以其為基礎(chǔ)確定靶分子活性的參數(shù)。
現(xiàn)有技術(shù)中已知的各類(lèi)測(cè)定法，且大多數(shù)也可經(jīng)商業(yè)途徑從商業(yè)供應(yīng)商獲得。
適于測(cè)量?jī)蓚€(gè)結(jié)合配偶體相互作用的測(cè)定法包括，例如，放射性同位素分析或熒光分析，如熒光極化分析，例如由商業(yè)途徑從Panvera，Perkin-Elmer Life Sciences(NEN、LANCETM、ALPHAScreenTM)或CIS Bio International(HTRFTM)獲得。測(cè)定法的其它例子包括細(xì)胞測(cè)定法，其中細(xì)胞系穩(wěn)定(誘導(dǎo)型或組成型；染色體型或游離型)或瞬時(shí)地表達(dá)期望的重組蛋白。這些測(cè)定法包括，例如報(bào)告基因測(cè)定法，其中基于其表達(dá)處于相關(guān)啟動(dòng)子控制下的報(bào)告酶的活性，測(cè)量特定啟動(dòng)子的調(diào)控或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)成員的調(diào)控。對(duì)于這類(lèi)測(cè)定法，有必要產(chǎn)生表達(dá)這樣的報(bào)告基因的重組細(xì)胞系，所述報(bào)告基因處于其本身待研究或被待研究的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)體調(diào)控的明確啟動(dòng)子控制之下。合適的報(bào)告酶通常是相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括螢火蟲(chóng)熒光素酶，海腎(Renilla)熒光素酶(它們都可從Packard Reagents購(gòu)買(mǎi))，β-半乳糖苷酶等。合適細(xì)胞系的選擇是相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，其中取決于分析的目的或“讀出”。它們通常是可簡(jiǎn)單培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，比如HeLA、COS、CHO或NIH-3T3細(xì)胞系。
適于測(cè)量蛋白磷酸化或激酶活性的有，例如熒光極化，如從Panvera商業(yè)上可獲得的均相時(shí)間分辨熒光(homogeneous time resolvedfluorescence)(HTRFTM，CIS Bio International)或LANCETM分析(Perkin-Elmer Life Sciences)或增強(qiáng)發(fā)光臨近均相分析(amplifiedluminescent proximity homogeneous assay)(Perkin-Elmer Life Sciences的ALPHAScreenTM)。使用Perkin-Elmer Life Sciences的ALPHAScreenTM測(cè)量激酶的活性對(duì)本發(fā)明目的特別有利，例如這是通過(guò)待研究激酶在有ATP存在的生化混合物中磷酸化生物素化肽進(jìn)行的。然后磷酸化的肽被特異性的抗磷酸抗體結(jié)合，該抗體上偶聯(lián)有綴合了蛋白A或提供了合適二抗的受體珠。相同的混合物中含有與肽的生物素部分結(jié)合的偶聯(lián)了鏈霉親和素的供體珠。肽的結(jié)合使受體珠和供體珠直接相鄰，發(fā)動(dòng)了級(jí)聯(lián)化學(xué)反應(yīng)，并產(chǎn)生高度擴(kuò)增的可檢測(cè)的發(fā)光信號(hào)供體珠中的光敏劑經(jīng)由激光激發(fā)而被激發(fā)，將周?chē)难蹀D(zhuǎn)化成純態(tài)氧。然后純態(tài)氧擴(kuò)散到受體珠上，此處激發(fā)了二甲基噻吩衍生物，因而釋放出波長(zhǎng)為370nm的化學(xué)熒光，其依次激發(fā)受體珠上更多的熒光團(tuán)發(fā)射波長(zhǎng)為520-620nm的光。由于純態(tài)氧對(duì)熒光團(tuán)的激發(fā)僅發(fā)生在供體珠和受體珠密切靠近時(shí)，只有在此時(shí)才會(huì)產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。
其它類(lèi)型的測(cè)定法和其它類(lèi)型的“讀出”同樣是相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員所充分熟知的。
就此而言特別要提及高通量(HTS，高通量篩選)方法形式的用途，通過(guò)它能夠在最短時(shí)間內(nèi)分析大量的物質(zhì)。
取決于目的，調(diào)節(jié)的修飾可意味著酶調(diào)節(jié)的抑制或激活。修飾的性質(zhì)就此而言包括最終對(duì)酶催化的多肽的磷酸化狀態(tài)產(chǎn)生作用的所有可能的影響，如酶-底物的相互作用的修飾或者酶催化活性的修飾，也包括(優(yōu)選在使用細(xì)胞反應(yīng)混合物分析的情況中)酶表達(dá)的修飾等。
本發(fā)明的另一方面涉及一種方法，用于鑒定修飾酶或其功能性片段或衍生物調(diào)節(jié)多肽磷酸化狀態(tài)的能力的物質(zhì)，其步驟為a)按照本發(fā)明上述方法之一，測(cè)定酶或其功能性片段或衍生物調(diào)節(jié)多肽磷酸化狀態(tài)的能力，其中反應(yīng)混合物中不加待測(cè)物質(zhì)，b)按照本發(fā)明上述方法之一，測(cè)定酶或其功能性片段或衍生物調(diào)節(jié)多肽磷酸化狀態(tài)的能力，其中向反應(yīng)混合物中加入待測(cè)物質(zhì)，c)比較來(lái)自a)和來(lái)自b)的能力。
本發(fā)明的方法特別適合鑒定用于治療非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)、腫瘤(IGFRK)或用于治療炎癥過(guò)程(IKK激酶)的藥理學(xué)活性物質(zhì)。下文通過(guò)多個(gè)附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更詳細(xì)的說(shuō)明，而并不由此限制本發(fā)明的主題。
實(shí)施例1所用的IRS-1片段為了證明生物素化來(lái)自胰島素信號(hào)途徑的多肽底物及在本發(fā)明用途和方法中采用它的可能性，選擇來(lái)自人IRS-1大小為262個(gè)氨基酸的片段(氨基酸516-氨基酸777)，其編碼中心潛在的酪氨酸(粗體)和絲氨酸磷酸化位點(diǎn)(以下劃線標(biāo)出)(Siemeister等J.Biol.Chem 1995)。該片段包括五個(gè)潛在的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，這在圖3中已著重指出，并在下文中和它們的基序一起用粗體表示出來(lái)。

代表YMXMSP基序中四個(gè)可能的絲氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)的絲氨酸612、632、662和731，定位于胰島素受體的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)附近，容納于SH2區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)之中。這些絲氨酸殘基突變成丙氨酸導(dǎo)致了IRS-1介導(dǎo)的磷脂酰-肌醇三磷酸鹽激酶(PI3K)的活性增加(Mothe等1996)，這表明它們有抑制功能。然而，不能排除還有其它絲氨酸磷酸化位點(diǎn)的存在，但是目前還不知道。
實(shí)施例2hIRS-1-p30的克隆和生物素化為進(jìn)行研究，人IRS-1的262個(gè)氨基酸長(zhǎng)的結(jié)構(gòu)域D516-P777(hIRS-1-p30)最初在如Siemeister等1995所述的大腸桿菌中表達(dá)。在該例中表達(dá)載體通過(guò)常規(guī)方法制備，將具有SEQ ID No.10(hIRS-1-p30的cDNA序列)所示序列的多核苷酸插入到質(zhì)粒pET3d(以Novagen訂貨號(hào)69421購(gòu)買(mǎi)獲得)中。為此目的，首先用酶NcoI(由Roche Diagnostics GmbHMannheim訂貨號(hào)835315購(gòu)買(mǎi)獲得)和BamHI(由Roche DiagnosticsGmbH Mannheim訂貨號(hào)656275購(gòu)買(mǎi)獲得)在標(biāo)準(zhǔn)條件下消化空載體，然后用自旋柱純化(由Qiagen，Hilden訂貨號(hào)28104購(gòu)買(mǎi)獲得)。
在該例中生物素化按照商業(yè)供應(yīng)商N(yùn)-Zyme，達(dá)姆施塔特，德國(guó)的規(guī)定使用常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。hIRS-1-p30胰島素受體片段的表達(dá)如Siemeister等1995所述進(jìn)行。為了檢查表達(dá)效果，制備大腸桿菌(E.coli菌株BL21，由Novagen訂貨號(hào)69451-3購(gòu)買(mǎi)獲得)的蛋白抽提物，在標(biāo)準(zhǔn)條件下用SDS-PAGE分離(例如見(jiàn)下文列出的標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn))，并在標(biāo)準(zhǔn)條件下用考馬斯亮藍(lán)染色溶液染色證明(例如見(jiàn)下文列出的標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn))。hIRS-1-p30的純化同樣地根據(jù)Siemeister等進(jìn)行。hIRS-1-p30的生物素化利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶促進(jìn)行。
實(shí)施例3ALPHAScreenTM用麥芽凝集素親和純化的大鼠肝臟胰島素受體對(duì)生物素化IRS-1片段的磷酸化在如圖4所示的實(shí)驗(yàn)中，用麥芽凝集素親和純化的大鼠肝臟胰島素受體(WGA-IR，序列登錄號(hào)NP_058767或由Sigma訂貨號(hào)70543購(gòu)買(mǎi)獲得)與各種濃度的人胰島素(如由Sigma訂貨號(hào)I-9266購(gòu)買(mǎi)獲得)和85nM生物素化IRS片段在50mM Tris緩沖液，PH7.4，8mM MgCl2，2mMMnCl2中4℃孵育10分鐘，然后加入ATP(終濃度為50μM)在30℃孵育30分鐘。加入EDTA至終濃度20mM終止反應(yīng)，用直接與受體p-Tyr(由Perkin-Elmer Life Sciences訂貨號(hào)676061C購(gòu)買(mǎi)獲得)偶聯(lián)的特異抗體檢測(cè)IRS-1的磷酸化，其產(chǎn)生如圖4所示的讀出。借助于這種方法有可能確定胰島素的EC50是10nM。
實(shí)施例4ALPHAScreenTMPKC和重組胰島素受體激酶對(duì)生物素化IRS-1片段的磷酸化Perkin-Elmer Life Sciences的ALPHAScreenTM使得檢測(cè)磷酸化IRS-1片段與識(shí)別磷酸化了的絲氨酸或酪氨酸殘基(p-Ser/p-Tyr抗體)的抗體間的相互作用成為可能。在該例中生物素化IRS-1結(jié)合鏈霉親和素供體，而抗體被受體偶聯(lián)的蛋白A或結(jié)合于受體的合適二抗結(jié)合。如果發(fā)生了相互作用，則受體實(shí)現(xiàn)并保持與供體直接鄰近，這樣由供體產(chǎn)生的純態(tài)氧原子能夠通過(guò)擴(kuò)散抵達(dá)受體珠中的化學(xué)發(fā)光基團(tuán)，其最終導(dǎo)致可檢測(cè)光的發(fā)射。
IRS-1與蛋白激酶C和ATP孵育30分鐘后，隨后加入p-Ser抗體(由Biosource比利時(shí)訂貨號(hào)44-550購(gòu)買(mǎi)獲得)，并再孵育120分鐘，通過(guò)用Perkin-Elmer Fusion或AlphaQuest儀器測(cè)量，檢測(cè)和量化前述分析產(chǎn)生的光強(qiáng)度(所謂的“讀出”)，如圖5A和B中柱形圖所示。有和沒(méi)有PKC時(shí)產(chǎn)生的光強(qiáng)度的比較如圖11A所示。在如圖11B所示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，重組胰島素受體激酶(IRK，氨基酸941-1343，NCBI登錄號(hào)NM_000208)通過(guò)與多聚賴氨酸在50mM Tris緩沖液PH7.4，8mM MgCl2，50μM ATP反應(yīng)緩沖液中30℃孵育10分鐘，然后加入IRK底物IRS，接著在30℃孵育30分鐘活化。用直接與受體偶聯(lián)的p-Tyr特異性抗體(由Perkin-ElmerLife Sciences訂貨號(hào)6760601C購(gòu)買(mǎi)獲得)檢測(cè)IRS-1的磷酸化，其產(chǎn)生如圖11B所示的讀出。前述的研究首次能夠證明生物素化多肽可被激酶磷酸化。這通過(guò)28kDA大小的hIRS-1片段在生物素化狀態(tài)下被絲氨酸激酶PKCδ和胰島素受體的酪氨酸激酶磷酸化得以證實(shí)。在該例中通過(guò)磷酸特異性抗體的檢測(cè)同樣是成功的，不會(huì)因與生物素殘基連用的多肽的大小所致的空間位阻產(chǎn)生對(duì)檢測(cè)反應(yīng)的干擾。由此在ALPHAScreenTM原理的基礎(chǔ)上，利用因生物素化而成為可能的純化和檢測(cè)手段產(chǎn)生可測(cè)定多肽的磷酸化狀態(tài)的均相分析體系是可能的。這是第一次將該測(cè)定原理應(yīng)用于具有多肽大小的蛋白片段(更確切地是28kDa)。這使得改進(jìn)用于與細(xì)胞的磷酸化和去磷酸化機(jī)器相互作用的藥學(xué)活性物質(zhì)的研究-診斷磷酸化依賴性紊亂/鑒定針對(duì)大和甚至結(jié)構(gòu)完整的生理學(xué)底物上的特定多肽的新蛋白激酶成為可能，因而大大地增加了基于其進(jìn)行這些研究的磷酸化或去磷酸化及以這種方式產(chǎn)生的數(shù)據(jù)提供的信息的特異性。此外，這里使用的分析系統(tǒng)的讀出不是放射性的，而是發(fā)光的，這構(gòu)成了用于高通量篩選(HTS)方法的優(yōu)點(diǎn)。因此這里描述的分析可用于所有調(diào)節(jié)多肽和蛋白磷酸化狀態(tài)的酶的高通量篩選，比如激酶和磷酸酶，用于鑒定新的活性物質(zhì)或驗(yàn)證已知的活性物質(zhì)。同樣也適用于其它方法，比如前述的尋找新的磷酸化特定多肽的酶，例如全細(xì)胞裂解液中新的IRS-1磷酸化激酶。


圖1IRS-1-IRS-4(SEQ ID No.1-4)的蛋白序列。四個(gè)家族成員的序列登錄號(hào)(NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù))是NM-005544(人IRS-1)、M007095(人IRS-2)、NM032074(大鼠IRS-3)、NM_003604(人IRS-4)。
圖2IRS-1-IRS-4(SEQ ID No.5-8)的編碼DNA序列。四個(gè)家族成員的序列登錄號(hào)(NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù))是NM-005544(人IRS-1)、M007095(人IRS-2)、NM032074(大鼠IRS-3)、NM_003604(人IRS-4)。
圖3用于本研究的IRS-1蛋白的包含262個(gè)氨基酸的結(jié)構(gòu)域(hIRS-1-p30)。絲氨酸612、632、662和731以下畫(huà)線標(biāo)出。YXXM酪氨酸磷酸化基序用粗體表示。
圖4使用經(jīng)由麥芽凝集素親和層析純化的胰島素受體的ALPHAScreenTM結(jié)果圖5ALPHAScreenTM結(jié)果圖6胰島素受體、IRS-1和絲氨酸激酶相互作用的概述7有抑制效應(yīng)的絲氨酸磷酸化的可能的分子機(jī)制的概述圖參考文獻(xiàn)White，M.F.(2002)“IRS蛋白和常見(jiàn)的糖尿病途徑”Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.283，E413-422Thirone AC，Carvalho CR，Saad MJ.(1999)“生長(zhǎng)激素刺激JAK2的酪氨酸激酶活性并誘導(dǎo)大鼠組織中胰島素受體底物和Shc的酪氨酸磷酸化”Endocrinology 140，55-62Schmitz-Peiffer C，Craig DL，Biden TJ.(2002)“神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生足以解釋用棕櫚酸鹽預(yù)處理的C2C12骨骼肌細(xì)胞中胰島素刺激PKB途徑的抑制”Ann.N.Y.Acad.Sci.967，146-157Gao Z，Hwang D，Bataille F，Lefevre M，York D，Quon MJ，YeJ.(2002)“抑制因子κB激酶復(fù)合體對(duì)胰島素受體底物1的絲氨酸磷酸化”J.Biol.Chem.277，48115-48121Aguirre V，Werner ED，Giraud J，Lee YH，Shoelson SE，White MF.(2000)“胰島素受體底物-1的Ser307的磷酸化阻斷與胰島素受體的相互作用并抑制胰島素的作用”J.Biol.Chem.275，9047-9054Sun XJ，Rothenberg P，Kahn CR，Backer JM，Araki E，Wilden PA，CahillDA，Goldstein BJ，White MF.(1991)“胰島素受體底物IRS-1的結(jié)構(gòu)決定了獨(dú)特的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白”
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實(shí)驗(yàn)室方法的標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)Sambrook等(1989)《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular CloningALaboratory Manual.)，第二版。冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，NY.545pp；《當(dāng)代分子生物學(xué)方案》(Current Protocols in Molecular Biology)，定期更新，如2000卷；Wiley&Sons，Inc；編輯Fred M.Ausubel，Roger Brent，Robert Eg.Kingston，David D.Moore，J.G.Seidman，John A.Smith，KevinStruhl.
《當(dāng)代人類(lèi)遺傳學(xué)方案》(Current Protocols in Human Genetics)，定期更新；Wiley&Sons，Inc；編輯Nicholas C.Dracopoli，Honathan L.Haines，Bruce R.Korf，Cynthia C.Morton，Christine E.Seidman，J.G.Seigman，Douglas R.Smith.
《當(dāng)代蛋白質(zhì)科學(xué)方案》(Current Protocols in Protein Science)，定期更新；Wiley&Sons，Inc；編輯John E.Coligan，Ben M.Dunn，Hidde L.Ploegh，David W.Speicher，Paul T.Wingfield.
《細(xì)胞分子生物學(xué)》(Molecular Biology of the Cell)，第三版；Alberts，B.，Bray，D.，Lewis，J.，Raff，M.，Roberts，K.，Watson，J.D.；GarlandPublishing，Inc.New York&London，1994；《分子生物學(xué)簡(jiǎn)要方案》(Short Protocols in Molecular Biology)，第5版，F(xiàn)rederick M.Ansubel(編輯)，Roger Brent(編輯)，Robert E.Kingston(編輯)，David D.Moore(編輯)，J.G.Seidman(編輯)，John A.Smith(編輯)，Kevin Struhl(編輯)，2002年10月，John Wiley&Sons，Inc.，New York“
材料和方法除非另有說(shuō)明，所述的方法是相關(guān)技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如可在上述引證文獻(xiàn)中找到，特別是關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)方法的文獻(xiàn)(在本文中也稱(chēng)之為標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn))縮略詞氨基酸使用三字母或單字母的代碼(通常也縮寫(xiě)為AA)(也見(jiàn)所示的標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn))；核苷酸使用普遍常規(guī)的單字母縮寫(xiě)(也見(jiàn)所示的標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn))。
權(quán)利要求
1.多肽用于測(cè)定酶、其功能性片段或衍生物調(diào)節(jié)所述多肽磷酸化狀態(tài)的能力的用途，其中所述多肽是生物素化的。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，用于測(cè)定酶磷酸化所述多肽的能力。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，用于測(cè)定酶去磷酸化所述多肽的能力。
4.用于測(cè)定酶、其功能性片段或衍生物調(diào)節(jié)生物素化多肽的磷酸化狀態(tài)的能力的方法。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，用于測(cè)定酶、其功能性片段或衍生物磷酸化所述多肽的能力，其步驟為a.使酶或功能性片段或衍生物與生物素化多肽接觸，并在合適的反應(yīng)混合物中起始磷酸化反應(yīng)，b.使反應(yīng)混合物與偶聯(lián)于載體且能夠結(jié)合生物素化多肽的部件接觸，c.測(cè)定與部件結(jié)合的多肽的磷酸化狀態(tài)。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，用于測(cè)定酶或其功能性片段或衍生物去磷酸化所述多肽的能力，其步驟為a.酶或功能性片段或衍生物與具有至少一個(gè)磷酸化殘基的生物素化的多肽接觸，在合適反應(yīng)混合物中開(kāi)始磷酸化反應(yīng)，b.使反應(yīng)混合物與載體偶聯(lián)且能夠結(jié)合生物素化多肽的部件接觸，c.測(cè)定與部件結(jié)合的多肽磷酸化狀態(tài)。
7.如權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的方法，其中載體是膜或板。
8.如權(quán)利要求4-7任一項(xiàng)所述的方法，其中部件是鏈霉親和素或磷酸特異性抗體。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其中向反應(yīng)混合物中加入放射性標(biāo)記的γ32P-ATP，并在完成至少一次清洗步驟后，通過(guò)測(cè)量膜或板上殘留的放射活性確定磷酸化狀態(tài)。
10.如權(quán)利要求4-8任一項(xiàng)所述的方法，其中向反應(yīng)混合物中加入能夠特異結(jié)合磷酸化多肽的抗體，并通過(guò)測(cè)定結(jié)合多肽的抗體量確定磷酸化狀態(tài)。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中結(jié)合多肽的抗體量通過(guò)在完成至少一次清洗步驟后，測(cè)量膜或板上殘留的抗體量來(lái)確定。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其中與鏈霉親和素偶聯(lián)的載體是包含第一信號(hào)發(fā)生器的第一載體，而多肽偶聯(lián)于包含第二信號(hào)發(fā)生器的第二載體，當(dāng)兩個(gè)信號(hào)發(fā)生器彼此直接鄰近時(shí)，能夠產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)，由此通過(guò)測(cè)定是否產(chǎn)生信號(hào)確定磷酸化狀態(tài)。
13.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的用途或如權(quán)利要求4-12任一項(xiàng)所述的方法，其中多肽的長(zhǎng)度為50個(gè)氨基酸和以上，優(yōu)選50-300個(gè)。
14.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的用途或如權(quán)利要求4-12任一項(xiàng)所述的方法，其中多肽的大小是1kDa和以上，優(yōu)選1-100kDa，特別優(yōu)選10-50kDa，尤其是25-35kDa。
15.如權(quán)利要求1-3或14任一項(xiàng)所述的用途或如權(quán)利要求4、5或7-14任一項(xiàng)所述的方法，其中酶是激酶，優(yōu)選酪氨酸激酶。
16.如權(quán)利要求1-3或12-15任一項(xiàng)所述的用途或如權(quán)利要求4-15任一項(xiàng)所述的方法，其中多肽是酶的天然底物，優(yōu)選為未截短的長(zhǎng)度。
17.如權(quán)利要求1-3或12-16任一項(xiàng)所述的用途或如權(quán)利要求4-16任一項(xiàng)所述的方法，其中多肽是胰島素受體底物(IRS)，優(yōu)選IRS-1、2、3或4，特別優(yōu)選IRS-1或其功能性片段或衍生物。
18.如權(quán)利要求17所述的用途或方法，其中IRS-1是具有SEQ ID No.1所示序列或由SEQ ID No.2所示序列編碼的人IRS-1。
19.如權(quán)利要求18所述的用途或方法，其中IRS-1片段具有SEQ IDNo.3所示的氨基酸序列，并且優(yōu)選由其組成。
20.如權(quán)利要求1-3或12-19任一項(xiàng)所述的用途或如權(quán)利要求4-19任一項(xiàng)所述的方法，其中酶是下列激酶或其功能性片段或衍生物胰島素受體、IGF-1受體、trK受體、EGF受體、酪蛋白激酶II、蛋白激酶C、蛋白激酶B/Akt、促分裂原活化蛋白激酶(MAP激酶)、GSK-3、ERK或JNK。
21.如權(quán)利要求1-3或12-20任一項(xiàng)所述的用途或如權(quán)利要求4-20任一項(xiàng)所述的方法，用于鑒定修飾酶或其功能性片段或衍生物調(diào)節(jié)多肽磷酸化狀態(tài)的能力的物質(zhì)。
22.用于鑒定修飾酶或其功能性片段或衍生物調(diào)節(jié)多肽磷酸化狀態(tài)的能力的物質(zhì)的方法，其步驟為a.按照權(quán)利要求3-21任一項(xiàng)所述的方法，測(cè)定酶或其功能性片段或衍生物調(diào)節(jié)多肽磷酸化狀態(tài)的能力，其中反應(yīng)混合物中不加待測(cè)物質(zhì)，b.按照權(quán)利要求3-21任一項(xiàng)所述的方法，測(cè)定酶或其功能性片段或衍生物調(diào)節(jié)多肽磷酸化狀態(tài)的能力，其中向反應(yīng)混合物中加入待測(cè)物質(zhì)，c.比較來(lái)自a)和來(lái)自b)的能力。
23.如權(quán)利要求21所述的用途或如權(quán)利要求21或22任一項(xiàng)所述的方法，用于鑒定治療非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)的藥理學(xué)活性物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及多肽用于測(cè)定酶、其功能性片段或衍生物調(diào)節(jié)所述多肽磷酸化狀態(tài)的能力的用途，所述發(fā)明的特征在于所述多肽是生物素化的。
文檔編號(hào)C07K14/47GK1795273SQ200480014092
公開(kāi)日2006年6月28日 申請(qǐng)日期2004年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月22日
發(fā)明者N·特納格爾斯, A·坎特, H·蒂林 申請(qǐng)人:塞諾菲-安萬(wàn)特德國(guó)有限公司