水稻ABA受體OsPYL3基因、其編碼蛋白及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種水稻ABA受體基因、其編碼蛋白及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是我國最重要的糧食作物，也是種植面積最大、分布范圍最廣、可供直接食用 的主糧作物。外界脅迫如冷害、干旱等嚴(yán)重危害著水稻的質(zhì)量和產(chǎn)量，水稻抵御外界脅迫能 力的提高是世界水稻育種中亟待解決的實(shí)際問題。脫落酸（ABA)是植物的一種重要激素， 調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的各個方面，如種子成熟、萌發(fā)；同時，ABA又是一種防御激素，在植物應(yīng) 對外界脅迫，特別是非生物脅迫（如：干旱、低溫冷害、鹽害等）的反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作 用。ABA受體PYLs (Pyrabactin Resistance Like)家族基因的鑒定和研宄是近年來植物激 素領(lǐng)域的重大突破進(jìn)展，其參與的ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑簡單概括就是：ABA與受體PYLs類蛋 白結(jié)合，使后者構(gòu)象發(fā)生變化，促進(jìn)PYLs與A亞家族的PP2C類磷酸酶（如ABII、ABI2、HUA1 等）結(jié)合，從而抑制PP2C磷酸酶的活性，致使SnRK(SNFl_relatedprotein kinase)類蛋白 激酶的激酶活性被激活，激活后的SnRK能磷酸化修飾下游的轉(zhuǎn)錄因子（如ABFs/AREBs)，最 終啟動ABA信號下游相關(guān)基因（如RD29，RAB16等）的表達(dá)。PYLs基因家族在擬南芥中的 研宄已經(jīng)非常深入，但在單子葉植物水稻中的研宄較少

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供水稻ABA受體OsPYL3基因、其編碼蛋白及其應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明水稻ABA受體OsPYL3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
[0005] 本發(fā)明水稻ABA受體0sPYL3基因的編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0006] 本發(fā)明水稻ABA受體0sPYL3基因在提高水稻耐冷、耐旱、及水稻對外界脅迫的防 御能力的用途。
[0007] 本發(fā)明的有益效果：
[0008] 本發(fā)明在分子水平上首次成功地克隆出水稻ABA受體0SPYL3基因。
[0009] 本發(fā)明利用PCR方法從水稻中克隆出水稻ABA受體0sPYL3基因。本發(fā)明獲 得的0sPYL3基因編碼區(qū)全長序列與Rice Genome Annotation Project中公布的L0C_ 0s02gl5640. 1 相對應(yīng)。
[0010] 本發(fā)明通過遺傳轉(zhuǎn)化手段，將0sPYL3基因在水稻中過量表達(dá)，通過一系列脅迫實(shí) 驗(yàn)證明0sPYL3基因過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻比非轉(zhuǎn)基因水稻耐冷、耐旱，提高了水稻對外界脅 迫的防御能力。
[0011] 通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將水稻ABA受體0SPYL3基因在水稻中過量表達(dá)，并獲得了穩(wěn)定遺 傳的高世代轉(zhuǎn)基因材料。表型實(shí)驗(yàn)分析表明，轉(zhuǎn)基因材料比非轉(zhuǎn)基因的材料耐冷、耐旱。并 且在逆境脅迫條件下會啟動一系列防御反應(yīng)，如萌發(fā)遲緩、保衛(wèi)細(xì)胞關(guān)閉等。水稻ABA受體 0sPYL3基因的發(fā)現(xiàn)，將對水稻ABA信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研宄提供較大的理論依據(jù)，并對水稻產(chǎn) 量的提高提供較大的實(shí)踐空間，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0012] 圖1為GFP融合OsPYL3基因的激光共聚焦顯微鏡亞細(xì)胞定位影像圖；
[0013] 圖2為OsPYL3基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻分子鑒定結(jié)果；
[0014] 圖3為OsPYL3基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻及其對照在不同濃度ABA處理5天時的照 片；
[0015] 圖4為0 μΜΑΒΑ處理OsPYL3基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻及其對照過程中萌發(fā)率統(tǒng)計(jì) 結(jié)果；
[0016] 圖5為1 μΜΑΒΑ處理OsPYL3基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻及其對照過程中萌發(fā)率統(tǒng)計(jì) 結(jié)果；
[0017] 圖6為3 μΜΑΒΑ處理OSPYL3基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻及其對照過程中萌發(fā)率統(tǒng)計(jì) 結(jié)果；
[0018] 圖7為OsPYL3基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻苗期冷處理結(jié)果；
[0019] 圖8為冷處理4天后的植株移到正常條件下恢復(fù)7天后的存活率統(tǒng)計(jì)；
[0020] 圖9為OsPYL3基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻冷處理后電導(dǎo)率測定結(jié)果；
[0021] 圖10為OsPYL3基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻干旱處理結(jié)果；
[0022] 圖11為復(fù)水恢復(fù)7天后存活率統(tǒng)計(jì)結(jié)果；
[0023] 圖12為OsPYL3基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻失水率測定結(jié)果；
[0024] 圖13為OsPYL3基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻及其對照在ABA處理不同時間后，ABA響 應(yīng)基因 LEA3的基因表達(dá)特征；
[0025] 圖14為OsPYL3基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻及其對照在ABA處理不同時間后，ABA響 應(yīng)基因 RAB16A的基因表達(dá)特征；
[0026] 圖15為OsPYL3基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻及其對照在ABA處理不同時間后，ABA響 應(yīng)基因 OsABA45的基因表達(dá)特征。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實(shí)施方式】，還包括各【具體實(shí)施方式】間的 任意組合。
【具體實(shí)施方式】 [0028] 一：本實(shí)施方式水稻ABA受體OsPYL3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO : 1所示。
【具體實(shí)施方式】 [0029] 二：本實(shí)施方式水稻ABA受體0sPYL3基因的編碼蛋白的氨基酸序列 如 SEQ ID NO : 2 所示。
【具體實(shí)施方式】 [0030] 三：本實(shí)施方式水稻ABA受體0sPYL3基因在提高水稻耐冷、耐旱、及 水稻對外界脅迫的防御能力的用途。
[0031] 通過以下實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證本發(fā)明的效果：
[0032] (1)水稻ABA受體0sPYL3基因的克隆：
[0033] -、以水稻品種日本晴為材料，用購買自Invitrogen公司的TRIzol試劑盒的操作 手冊提取葉片總RNA ;
[0034] 二、采用DNase I處理步驟一提取的總RNA ;
[0035] 三、取1 μ g步驟二處理后的總RNA用于cDNA的合成，cDNA的合成操作按照購買 自 BD Biosciences Clontech 公司的 BD SMART? RACE cDNA Amplification Kit 試劑盒的 使用手冊進(jìn)行，獲得cDNA;
[0036] 四、以獲得的cDNA為模板通過正向引物Fl與反向引物Rl擴(kuò)增0sPYL3基因 ，PCR 反應(yīng)條件如下：94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸35S，共38循環(huán)，再 72°C延伸lOmin，將PCR產(chǎn)物在ABI3130測序儀（ABI公司）上進(jìn)行測序；測序結(jié)果表明水稻 ABA受體基因0sPYL3由615個堿基組成，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No :1所示。
[0037] 正向引物 Fl :5' -ATGGTGGAGGTGGGAGGAGGAG-3'
[0038] 反向引物 Rl :5' -TCACCGGTCGAGGGGCTCGGITTG-3'
[0039] (2)水稻ABA受體基因 0sPYL3的亞細(xì)胞定位研宄
[0040] 一、載體構(gòu)建：將獲得的0sPYL3基因的cDNA，裝入gateway系統(tǒng)的PENTRY入 門載體（購買自Invitrogen)，LR反應(yīng)進(jìn)入含GFP基因的pH7WGF表達(dá)載體（購買自 Invitrogen)，形成一個CaMV 35S啟動子驅(qū)動的0sPYL3與eGFP融合體質(zhì)粒；
[0041] 二、目的載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV1301 ;
[0042] 三、挑取單克隆置于含相應(yīng)抗生素的液體LB液體培養(yǎng)基中，28°C搖床160? 180rpm培養(yǎng)過夜；
[0043] 四、將過夜培養(yǎng)的菌液以I :100的比例轉(zhuǎn)接于新的IOmL液體LB培養(yǎng)基中，液體LB 培養(yǎng)基中含有IOmM的MES(pH5. 6)和40 μΜ的乙酰丁香酮，28°C搖床160?180rpm培養(yǎng)不 少于16h ;
[0044] 五、當(dāng)菌液濃度達(dá)到OD = 3. 0時，3200g離心lOmin，棄上清，收集菌體；
[0045] 六、用IOmM的CaCl2重懸并將濃度調(diào)整為OD 6QQ= L 5, P19的濃度調(diào)整為OD 6Q。= 1. 0,重懸菌液中添加乙酰丁香酮至終濃度為200 μ M，室溫靜置至少3h ;
[0046] 七、目的質(zhì)粒農(nóng)桿菌重懸液與P19農(nóng)桿菌重懸液兩者等比例混合；
[0047] 八、選擇煙草植株上部生長狀態(tài)良好的葉片，用去掉針頭的ImL注射器將菌液注 射到煙草葉片背面；
[0048] 九、三天后在激光共聚焦顯微鏡下觀察。
[0049] GFP融合0sPYL3基因的激光共聚焦顯微鏡亞細(xì)胞定位影像圖如圖1 ;左邊顯示的 是GFP信號，右邊是明亮的視野。從圖1可以看出水稻ABA受體0sPYL3基因定位于胞質(zhì)和 細(xì)胞核內(nèi)。
[0050] (3) 0sPYL3基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻的獲得：
[0051] 將0sPYL3基因的cDNA，裝入gateway系統(tǒng)的PENTRY入門載體，然后LR反應(yīng)裝入 過量表達(dá)載體PH7WG2中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入黑龍江水稻品種龍粳11中，針對0sPYL3基因， 鑒定20株以上單拷貝插入的純合過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻。
[0052] (4) 0sPYL3基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻分子鑒定：
[0053] 一、以待鑒定0sPYL3基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻和其對照為材料，用購買自 Invitrogen公司的TRIzol試劑盒的操作手冊提取葉片總RNA ;
[0054] 二、采用DNase I處理步驟一提取的總RNA ;
[0055] 三、取1 μ g步驟二處理后的總RNA用于cDNA的合成，cDNA的合成操作按照購買 自 BD Biosciences Clontech 公司的 BD SMART? RACE cDNA Amplification Kit 試劑盒的 使用手冊進(jìn)行，獲得cDNA;
[0056] 四、以獲得的cDNA為模板通過正向引物F2與反向引物R2,水稻內(nèi)參ubiquitin 正向引物F6與反向引物R6，以及SYBR Green PCR master mix(TransStart)進(jìn)行 Quantitative real-time PCR0 數(shù)據(jù)從 Bio-Rad chromo 4real_time PCR detector 上獲 得；用Taact方法分析倍數(shù)變化。
[0057] 正向引物 F2 :5 ' -AAGGGAACATTGAGATTGGC-3 '
[0058] 反向引物 R2 :5 ' -CGGTCAGGATGGAGGAGTAA-3 '
[0059] 0sPYL3基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻分子鑒定結(jié)果如圖2 (以3株具有代表性的能穩(wěn)定 遺傳的0sPYL3基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻為例）。0sPYL3基因在對照Control中的表達(dá)水平 設(shè)為I ;0sPYL3基因過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻的3個株系中，0sPYL3-l表達(dá)量是Control的110 倍，0sPYL3-2表達(dá)量是Control的29倍，0sPYL3-3表達(dá)量是Control的37倍。以上結(jié)果 證明本實(shí)驗(yàn)所采用的實(shí)驗(yàn)材料確實(shí)是0sPYL3基因過量表達(dá)的。
[0060] (5)水稻ABA受體0SPYL3基因過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻萌發(fā)期表型分析：
[0061] 一、選用成熟的T3代純合0sPYL3基因過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻種子和其對照放于 50°C烘箱中干燥7天，打破休眠。
[0062] 二、將種子剝皮進(jìn)行消毒（70 %酒精浸泡30s，30 %次氯酸鈉浸泡15min并重復(fù)兩 次，滅菌水清洗4?5遍）。
[0063] 三、1/2MS培養(yǎng)基（1%蔗糖，4%phytagel，pH5.8)中分別加 ΟμΜ ΑΒΑ、1μΜ ABA 和 3 μ M ABA(A1049, Sigma-Aldrich)。
[0064] 四、將消過毒的具有代表性的3個株系的0sPYL3基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻及其對照 在不同濃度的ABA培養(yǎng)基中各播種20粒，以胚芽鞘出現(xiàn)為基準(zhǔn)定義為萌發(fā)，每隔12h統(tǒng)計(jì) 一次，計(jì)算萌發(fā)率。
[0065] 圖3為0sPYL3基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因