一種Nogo-A受體結(jié)合肽及其衍生物與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種Nog0-A受體結(jié)合肽及其衍生物與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著人類壽命的延長，人口老齡化問題日益突出，一些中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central neverous system, CNS)的疾病發(fā)病率越來越高，而有效治療手段缺乏。主要原因是中樞神 經(jīng)系統(tǒng)是處理信息的人體司令部，其功能依賴于大量的基本結(jié)構(gòu)單位神經(jīng)元所形成的神經(jīng) 網(wǎng)絡(luò)。由于神經(jīng)元本身不能分裂，一旦神經(jīng)元受損只能通過神經(jīng)突起的再生長而達(dá)到神經(jīng) 網(wǎng)絡(luò)的重新連接，進(jìn)而達(dá)到功能的恢復(fù)，而受損神經(jīng)元本身再生的能力很弱，這就導(dǎo)致了主 要的中樞神經(jīng)損傷疾病沒有很好的療效。中樞神經(jīng)損傷疾病包括有神經(jīng)外傷、腦中風(fēng)、神經(jīng) 退行性疾病等。目前這類疾病還沒有有效的藥物能讓病人的神經(jīng)功能得以恢復(fù)。哺乳動物 外周神經(jīng)（peripheral neverous system, PNS)損傷后有很強(qiáng)的再生能力，而中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS)再生能力很差，損傷后的突起及神經(jīng)元幾乎不能再生。由于這個原因， CNS外傷、中風(fēng) 等疾病都不能完全恢復(fù)其感覺、運(yùn)動和認(rèn)知功能。早在1913年，Cajal就認(rèn)識到神經(jīng)再生 的能力受到外在因素限制。他觀察到如果損傷視束，視束本身沒有再生能力。如果將外周 神經(jīng)移植物縫合到損傷處，一些突起能夠生長進(jìn)去。他認(rèn)為，中樞通路不能再生是由于神經(jīng) 元所處的神經(jīng)膠質(zhì)環(huán)境造成的。許多年過去，Cajal的觀察被人們遺忘。一直到1970年， 許多臨床和神經(jīng)學(xué)家都相信中樞神經(jīng)再生是不可能的。
[0003] I988 年，Schwab 和 Caroni 在培養(yǎng)背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（dorsal root ganglia, DRG) 和誘導(dǎo)分化神經(jīng)母細(xì)胞瘤中加入來源于PNS的鞘磷酯或CNS的鞘磷酯或少突膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā) 現(xiàn)CNS的鞘磷酯或少突膠質(zhì)細(xì)胞能引起生長錐的崩潰，突起生長受抑制，而來源于PNS的鞘 磷酯對其生長沒有影響。這表明CNS的再生障礙與CNS的鞘磷酯有關(guān)。他們用SDS-PAGE 方法從成體中樞髓磷脂中分離出大小為35kD和250kD兩個蛋白質(zhì)，取名為NI-35/250,有特 別地抑制DRG和神經(jīng)母細(xì)胞瘤突起生長的作用。而且用此制備的抗體能在一定程度上提高 脊髓損傷后皮質(zhì)脊髓通路的再生。
[0004] 2000年，3個研究小組獨(dú)立的確定了 NI-250的編碼序列，并命名為Nogo-A。Nogo 基因通過不同的剪接能產(chǎn)生3種變異體：N〇g〇-A(1162個氨基酸），N〇g〇-B(373個氨基酸） 和Nogo-C (199個氨基酸）。他們的C-末端含有相同的188個氨基酸，這188個氨基酸與 reticulon(RTN)基因家族成員具有同源性。Reticulon是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相聯(lián)系的蛋白質(zhì)組成的 一個家族，大部分蛋白質(zhì)功能還不清楚，為了和已發(fā)現(xiàn)的其它3種相區(qū)別，Nogo蛋白又被稱 為RTN4。3個Nogo異構(gòu)體含有兩個疏水區(qū)，使蛋白質(zhì)兩次跨膜。兩個跨膜區(qū)之間的細(xì)胞表 面中間環(huán)區(qū)域，有一段長度為66個氨基酸的肽段，稱為Nogo-66,它具有抑制軸突生長的活 性。Nogo-A另一個具有抑制突起生長活性的區(qū)域?yàn)镹ogo-A 544 725。它處在蛋白質(zhì)的N末端， 所以也稱之為氨基-Nogo-A(amino-Nogo-A)。不久便找到了與Nogo-66結(jié)合的Nogo-66的 受體（nogo_66receptor, NgR)。后來又發(fā)現(xiàn)了另外兩個同源的NgR，因此與Nogo-66結(jié)合的 受體后來又被稱為NgRl。Nogo-A主要在少突膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，但在許多神經(jīng)元中也能表 達(dá)。
[0005] 除Nogo-A以外，另兩個髓磷脂來源的生長抑制分子，髓磷脂相關(guān)糖蛋 白（oligodendrocyte-myelin glycoprotein, 0MG)和少突細(xì)胞髓磷脂糖蛋白 (myelin-associated glycoprotein, MAG)也能結(jié)合NgR，產(chǎn)生抑制效應(yīng)。NgR是一種糖基磷 脂酰肌醇錨定（glycosylphosphatidyl-anchored，GPI_anchored)的蛋白質(zhì)，由 473 個氨基 酸組成。該蛋白N端富含亮氨酸重復(fù)序列（leucine-rich repeat, LRR)的結(jié)構(gòu)域，其C末 端富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)。NgR借助于C末端的GPI結(jié)構(gòu)附著于細(xì)胞膜表面。NgR并不是跨膜 蛋白，而是GPI錨定的蛋白質(zhì)，向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號需要其它蛋白質(zhì)參與，共同形成受體復(fù)合 物來傳導(dǎo)信號。NgR受體復(fù)合物中的p75NTR和LING0-1能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)生長抑制信號。進(jìn)一步 研究發(fā)現(xiàn)，在許多成體神經(jīng)元表達(dá)的腫瘤壞死因子受體家族成員一一TAJ/TR0Y，能夠代替 P75NTR，作為NgRl的共受體。
[0006] 封閉Nogo-66受體可使神經(jīng)元對Nogo-66不敏感而免遭軸突再生障礙。因而，推 測阻斷Nogo-66與其受體結(jié)合將有助于人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的恢復(fù)。Nogo-66受體也 就成為了治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)外傷、中風(fēng)等疾病的一個潛在靶標(biāo)。使用Nogo-66受體拮抗劑 NEP1-40,能減弱Nogo-A對突起生長的抑制。當(dāng)大鼠脊髓損傷后，給予NEP1-40治療可促 進(jìn)皮質(zhì)脊髓束和中縫脊髓束纖維再生，動物運(yùn)動功能明顯改善。小鼠局部腦梗塞后，使用 NEP1-40能提高軸突的再生，運(yùn)動功能恢復(fù)。在Nogo-66受體基因敲除小鼠身上也觀察到， 脊髓損傷后紅核脊髓束和中縫脊髓束纖維再生增強(qiáng)。
[0007] Nogo-A在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用也已得到證實(shí)，在脊髓損傷和中風(fēng)中抑制 Nogo-A的表達(dá)有利于軸突生長和恢復(fù)。IN-I單克隆抗體具有抗Nogo-A的作用，同時具有 較強(qiáng)的中和軸突生長抑制作用。已有研究表明在脊髓損傷后注射IN-1，神經(jīng)纖維再生距離 增長并且功能得到了恢復(fù)，IN-I也能夠引起中風(fēng)后神經(jīng)元的生長。更有針對Nogo-A蛋白 特殊區(qū)域例如N末端和C末端革El向抗體，能夠有利于中風(fēng)后功能的改善并有利于皮質(zhì)脊髓 束再生?？ǖ俸婉R庫斯等研究發(fā)現(xiàn)，在中風(fēng)的老鼠中，Nogo-A或Nogo-66受體（NgR)基因 缺陷實(shí)驗(yàn)組以及服用NgR抗體和Nogo-A拮抗劑組的老鼠具有更強(qiáng)的神經(jīng)代償性發(fā)芽和結(jié) 構(gòu)可塑性。
[0008] Nogo-A通過特異性結(jié)合受體NgR通過多位點(diǎn)的相互作用激活，啟動神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制軸突再生和結(jié)構(gòu)的重塑性，從而在缺血缺氧腦損傷疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮 作用。有研究表明大鼠腦缺血缺氧后及受體表達(dá)均增高，強(qiáng)烈抑制神經(jīng)纖維的再生作用，參 與腦缺血一系列的病理生理過程。郎嘉等研究發(fā)現(xiàn)，全腦缺血引起、及在皮層的表達(dá)顯著增 強(qiáng)，高壓氧治療可顯著減輕神經(jīng)損傷，降低、及在皮層的表達(dá)。趙紅等研究表明，在腦梗死早 期，表達(dá)增強(qiáng)，應(yīng)用抗體可明顯促進(jìn)受損的中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突生長和功能恢復(fù)。這些研究表 明，調(diào)控Nogo-A/NgR可影響腦缺血的發(fā)展和結(jié)果。
[0009] 近年研究表明，Nogo-A和NgR在神經(jīng)退行疾病中（AD和PD)發(fā)病中有一定的作 用。2006年Gil和Zhu等報道，在AD海馬組織中，Nogo-A是過表達(dá)的，并與老年斑相聯(lián)系， Nogo-66受體是也過表達(dá)的，與神經(jīng)原纖維纏結(jié)相聯(lián)系。同年P(guān)ark等相繼在《The Journal of Neuroscience》上報道，在AD患者腦內(nèi)，Nogo-A和Nogo-66受體的分布均發(fā)生異常。同 時發(fā)現(xiàn)NgR與APP相互作用可降低淀粉樣蛋白（amyloid beta protein，Αβ)沉淀所形成 的老年斑。表現(xiàn)為阻止NgR表達(dá)則增加 AD轉(zhuǎn)基因模型小鼠腦內(nèi)APP的水平及增加 A β沉積 形成的老年斑，使得突起營養(yǎng)發(fā)生障礙，而給這些小鼠灌注可溶性NgR片斷則降低Aβ水平 及Αβ沉淀所形成的老年斑，突起營養(yǎng)不良的狀況得到明顯改善。在轉(zhuǎn)APP基因的SH-SY5Y 細(xì)胞系，NgR過度表達(dá)也同樣能降低Αβ產(chǎn)生。以上研究提示Nogo-66受體可作為APP處 理過程中的阻斷劑。Nogo-66受體提供了一個能干預(yù)AD病理過程的新靶標(biāo)，使人們關(guān)注突 起功能障礙在該病中所起的作用。
[0010] 研究如何促進(jìn)神經(jīng)元的再生能力，恢復(fù)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)成為治療神經(jīng)損傷是治療神經(jīng) 損傷的關(guān)鍵。阻斷Nogo-66與其受體結(jié)合將有助于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的恢復(fù)。因此， Nogo-66受