D138-CAR細(xì)胞是CTL其天然受體對病毒潛伏蛋白有特 異性，如衍生自邸V、HIV、HTLV-1等的那些。運些病毒特異性CTL可接受來自?？诳乖蔬f 細(xì)胞加工潛伏病毒抗原的生理共刺激并通過其CAR殺死腫瘤細(xì)胞。運種雙特異性使重定向 的CTL接受來自?？诳乖蔬f細(xì)胞的生理共刺激，同時通過CAR探索抗腫瘤活性。
[0082] 本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到生成運類細(xì)胞是常規(guī)的。
[008引IX.包含CD138-特異性CAR的宿主細(xì)胞
[0084] 本發(fā)明的細(xì)胞的實施方式包含能夠表達(dá)CD138-特異性CAR的那些細(xì)胞并且包含 例如T-細(xì)胞、NK-細(xì)胞和NKT-細(xì)胞。本文所用的術(shù)語"細(xì)胞"、"細(xì)胞系"和"細(xì)胞培養(yǎng)物" 可互換使用。所有運些術(shù)語也包括其后代，其是任意或全部的后代。應(yīng)理解，由于有意或偶 然的突變，所有的后代可能不是相同的。在表達(dá)異源核酸序列的內(nèi)容中，"宿主細(xì)胞"可指代 原核或真核細(xì)胞，并且其包括能夠復(fù)制載體和/或表達(dá)由載體編碼的異源基因的任何可轉(zhuǎn) 化的生物體。宿主細(xì)胞可用作，且已經(jīng)用作載體的受主。宿主細(xì)胞可W是"轉(zhuǎn)染的"或"轉(zhuǎn) 化的"，其指外源性核酸轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)到宿主細(xì)胞中的過程。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞包括原代對象細(xì)胞及 其后代。本文所用的術(shù)語"工程改造的"和"重組的"細(xì)胞或宿主細(xì)胞往往指其中已經(jīng)導(dǎo)入 外源性核酸序列，例如載體的細(xì)胞。因此，重組細(xì)胞與不含重組導(dǎo)入的核酸的天然出現(xiàn)的細(xì) 胞不同。在本發(fā)明的實施方式中，宿主細(xì)胞是免疫細(xì)胞，如T細(xì)胞，包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞（也 稱為TC、細(xì)胞毒性T淋己細(xì)胞、C化、T-殺傷-細(xì)胞、溶細(xì)胞性T-細(xì)胞、CD8+T-細(xì)胞或殺傷 T細(xì)胞），NK細(xì)胞，NKT細(xì)胞，并且本發(fā)明中也包含其它可引發(fā)效應(yīng)功能的免疫細(xì)胞。
[0085] 在某些實施方式中，考慮到RNA或蛋白質(zhì)序列可W與其他選定的RNA或蛋白質(zhì)序 列在相同宿主細(xì)胞中共表達(dá)?？赏ㄟ^用兩種或更多種不同的重組載體共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞來實 現(xiàn)共表達(dá)。或者，可將單個重組載體構(gòu)建成包含多個不同RNA編碼區(qū)的，其然后可在用單一 載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞中表達(dá)。
[0086] -些載體可采用控制序列，運些控制序列使得它們在原核和真核細(xì)胞中復(fù)制和/ 或表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還會理解解育全部上述宿主細(xì)胞W維持細(xì)胞并進(jìn)行載體復(fù)制的條 件。也理解并知曉能進(jìn)行載體W及由載體編碼的核酸及其關(guān)聯(lián)多膚、蛋白或膚的大規(guī)模生 產(chǎn)的技術(shù)和條件。
[0087] 本發(fā)明中所用的細(xì)胞是真核細(xì)胞，包括哺乳動物細(xì)胞，但可在載體或DNA的重組 工程改造操作中采用原核細(xì)胞W整合到載體中。細(xì)胞特別是人，但可與感興趣的動物相關(guān)， 尤其是家養(yǎng)動物，如馬科、?？?、鼠科、綿羊、犬科、貓科等，用于它們相應(yīng)的動物中。在運些 物種中，可包括各種類型的細(xì)胞，如T細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞等。
[008引例如相對于接受它們的個體，運類細(xì)胞可W是自體同源細(xì)胞、同源細(xì)胞、異體細(xì) 胞，并且甚至在一些情況中可W是異種細(xì)胞。可通過改變主要組織相容性復(fù)合物（"MHC") 的特征、通過滅活β2-微球蛋白來防止形成功能性I類血K分子、滅活I(lǐng)I類分子、提供一 種或多種MHC分子的表達(dá)、通過增強或抑制與細(xì)胞毒性相關(guān)的基因的表達(dá)W增強或滅活細(xì) 胞毒性能力來修飾細(xì)胞。
[0089] 在一些情況中，感興趣的可W是具體克隆或寡克隆細(xì)胞，其中該細(xì)胞具有特定特 異性，如具有特定抗原特異性或?qū)れ胛稽c特異性的Τ細(xì)胞和Β細(xì)胞。
[0090] 具有CD 138-特異性CAR的本發(fā)明的細(xì)胞也可表達(dá)第二CAR,也可表達(dá)接合物分子， 和/或可W是病毒特異性的，并且任意重組表達(dá)構(gòu)建體可W處于或不處于HRE的調(diào)控之下。
[0091] 編碼CD138-特異性CAR的表達(dá)載體可作為一種或多種DNA分子或構(gòu)建體導(dǎo)入，其 中可存在至少一種標(biāo)記物，其將能夠選擇含有構(gòu)建體的宿主細(xì)胞?？蒞常規(guī)方式制備構(gòu)建 體，其中基因和調(diào)控區(qū)域可適當(dāng)分離、連接、克隆到合適的克隆宿主中、通過限制或測序或 其他常規(guī)方式來分析。具體地，使用PCR，可分離包括功能單元的全部或部分的個體片段，其 中可使用"引物修復(fù)"、連接、體外誘變等引入一個或多個突變（如果需要）。一旦完成并證 明具有合適序列的構(gòu)建體然后可通過任意常規(guī)方式導(dǎo)入CTL中。構(gòu)建體可被整合并包裝到 非復(fù)制、缺陷型病毒基因組中，如腺病毒、腺-相關(guān)病毒（AAV)或單純瘤疹病毒化SV)或其 他，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒，用于感染或轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞中。如果需要，構(gòu)建體可包括用于轉(zhuǎn)染的病毒 序列。或者，可通過融合、電穿孔、基因槍、轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染等導(dǎo)入構(gòu)建體。宿主細(xì)胞可在導(dǎo) 入構(gòu)建體之前在培養(yǎng)基中生長并增殖，之后是適當(dāng)?shù)奶幚鞼導(dǎo)入構(gòu)建體并整合構(gòu)建體。然 后細(xì)胞增殖并通過構(gòu)建體中存在的標(biāo)記物篩選?？沙晒κ褂玫母鞣N標(biāo)記物包括hpd、新霉 素抗性、胸巧激酶、潮霉素抗性等。
[0092] 在許多情況中，在希望終止治療、該細(xì)胞變成腫瘤、在對該細(xì)胞存在后缺少該細(xì)胞 的情況感興趣的研究中的或其它事件的情況下，人們可能希望能夠殺死修飾的細(xì)胞。為了 運一目的，可提供特定基因產(chǎn)物的表達(dá)，其中人們可在受控的條件下殺死修飾的細(xì)胞。自殺 基因產(chǎn)物，如脫冬酶9,是運類產(chǎn)物的示例。
[0093] 通過示例的方式，如下治療癌癥患者或易患癌癥的患者或疑似患有癌癥的患者。 如本文所述修飾的細(xì)胞可給予患者并且停留延長的時間段。個體可接受一次或多次細(xì)胞給 藥。示例性的細(xì)胞包括低氧應(yīng)答CD138-特異性CART細(xì)胞。該細(xì)胞可經(jīng)修飾W至少表達(dá) 低氧應(yīng)答CD138-特異性CAR并且向有此需要的個體提供。
[0094]X.將構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞中
[0095] 低氧應(yīng)答CD138-特異性CAR構(gòu)建體或本文所述的任意構(gòu)建體可作為一種或多種 DNA分子或構(gòu)建體導(dǎo)入，其中可存在至少一種標(biāo)記物，其將能夠選擇含有構(gòu)建體的宿主細(xì) 胞?？蒞常規(guī)方式制備構(gòu)建體，其中基因和調(diào)控區(qū)域可適當(dāng)分離、連接、克隆到合適的克隆 宿主中、通過限制或測序或其他常規(guī)方式來分析。具體地，使用PCR，可分離包括功能單元 的全部或部分的個體片段，其中可使用"引物修復(fù)"、連接、體外誘變等引入一個或多個突變 (如果需要）。一旦完成并證明具有合適序列的構(gòu)建體然后可通過任意常規(guī)方式導(dǎo)入宿主 細(xì)胞中。構(gòu)建體可被整合并包裝到非復(fù)制、缺陷型病毒基因組中，如腺病毒、腺-相關(guān)病毒 (AAV)或單純瘤疹病毒化SV)或其他，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒，用于感染或轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞中。如果需 要，構(gòu)建體可包括用于轉(zhuǎn)染的病毒序列?；蛘撸赏ㄟ^融合、電穿孔、基因槍、轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染 等導(dǎo)入構(gòu)建體。宿主細(xì)胞可在導(dǎo)入構(gòu)建體之前在培養(yǎng)基中生長并增殖，之后是適當(dāng)?shù)奶幚?W導(dǎo)入構(gòu)建體并整合構(gòu)建體。然后細(xì)胞增殖并通過構(gòu)建體中存在的標(biāo)記物篩選?？沙晒κ?用的各種標(biāo)記物包括hpd、新霉素抗性、胸巧激酶、潮霉素抗性等。
[0096] 在一些情況中，可具有同源重組的目標(biāo)位點，其中需要將構(gòu)建體整合在特定 基因座中。例如，可敲除內(nèi)源基因并用通過使用本領(lǐng)域已知的材料和方法用于同源重 組的構(gòu)建體編碼的基因代替（在相同或其他基因座）。對于同源重組，可使用OMEGA 或 0-載體。參見，例如，Thomas 和 Capecchi，Cell(1987)51, 503-512 ;Mansour 等， 化 1:ure (1988) 336,；348-352 ;和 Joyner 等，化1:ure (1989) 338, 153-156。
[0097] 可用于制備大量構(gòu)建體DM并用于進(jìn)行轉(zhuǎn)繞的含有可用元件，如細(xì)菌或酵母復(fù)制 起點、可選擇和/或可擴增標(biāo)記物、用于在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中表達(dá)的啟動子/增強子元 件等的載體是本領(lǐng)域熟知的，并且許多是市售可得的。
[0098]XI.給予細(xì)胞
[0099] 本發(fā)明包括向有此需要的個體給予細(xì)胞，一旦已經(jīng)適當(dāng)?shù)刂苽浼?xì)胞，包括工程改 造的細(xì)胞W表達(dá)CD138-特異性CAR并且，至少在一些情況中，在給予個體之前增殖細(xì)胞。
[0100] 已經(jīng)用DNA構(gòu)建體修飾的細(xì)胞在選擇性條件下在培養(yǎng)基中生長，并且選擇具有構(gòu) 建體的細(xì)胞然后可增殖并使用例如聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)一步分析W確定宿主細(xì)胞中存在構(gòu)建 體。一旦已經(jīng)鑒定或確認(rèn)修飾的宿主細(xì)胞，然后可根據(jù)計劃使用它們，例如在培養(yǎng)中增殖或 導(dǎo)入宿主生物體。
[0101] 根據(jù)細(xì)胞的性質(zhì)，可W多種方式將細(xì)胞導(dǎo)入宿主生物體，例如哺乳動物。在具體實 施方式中，（例如）在骨髓中局部導(dǎo)入細(xì)胞，但在替代性實施方式中，細(xì)胞全身給予并定位 到癌癥或者經(jīng)修飾定位到癌癥。所采用的細(xì)胞數(shù)量將取決于多種情況、導(dǎo)入的目的、細(xì)胞的 壽命、待使用的方案、給藥的次數(shù)、細(xì)胞繁殖的能力、重組構(gòu)建體的穩(wěn)定性等。細(xì)胞可W分散 體應(yīng)用，通常注射到或接近感興趣的位點。細(xì)胞可W在生理上可接受的基質(zhì)中。
[010引 DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)不需要在每種情況中產(chǎn)生整合。在一些情況中，導(dǎo)入的DNA的瞬時維持可 能是足夠的。通過運種方式，可能有短期效果，其中可將細(xì)胞導(dǎo)入宿主，然后在預(yù)定的時間 后開啟，例如，在細(xì)胞已經(jīng)能夠定位到特定位點之后。
[0103] 可根據(jù)需要給予細(xì)胞。根據(jù)所需的響應(yīng)、給藥方式、細(xì)胞壽命、存在的細(xì)胞數(shù)量，可 采用多種方案。給藥的次數(shù)將至少部分取決于上述因素。
[0104] 應(yīng)理解，該系統(tǒng)易受許多因素的影響，如對配體的細(xì)胞響應(yīng)、表達(dá)效率、W及適當(dāng) 地，分泌水平、表達(dá)產(chǎn)物的活性、患者的具體需求，運些可隨著時間和環(huán)境變化，由于缺少細(xì) 胞導(dǎo)致的細(xì)胞活性缺失率或單個細(xì)胞的表達(dá)活性等。因此，即使存在可大規(guī)模給予群體的 通用細(xì)胞，預(yù)期對于各個體患者監(jiān)測各患者的個體合適劑量，并且運類監(jiān)測患者的實踐在 本領(lǐng)域中是常規(guī)的。
[0105] 通過靜脈內(nèi)輸注給予CAR-修飾的T-細(xì)胞。劑量范圍可W是，例如，IxlOVm2至 2xl〇s/m2。
[0106] 在特定情況中，向患有表達(dá)CD138抗原的癌癥的個體給予多個CD138CAR-表達(dá)免 疫細(xì)胞。在【具體實施方式】中，需要單次給藥。在其他實施方式中，需要多次給予細(xì)胞。例 如，在第一次給予工程改造的免疫細(xì)胞之后，可能檢測個體例如，是否存在癌癥或者腫瘤數(shù) 量和/或尺寸降低。在癌癥顯示需要進(jìn)一步治療的情況中，如在第一次給藥之后腫瘤生長， 向個體另外遞送一次或多次相同的CD138-CAR表達(dá)細(xì)胞（或任選地，另一類癌癥療法，包括 另一類免疫療法和/或化療、手術(shù)和/或放療）。在一些情況中，個體中腫瘤尺寸的減小表 明CD138CAR表達(dá)免疫療法是有效的，因此向該個體提供進(jìn)一步給藥。
[0107] XI.編碼CD138-特異性CAR的多核巧酸
[010引本發(fā)明還包括包含編碼本文定義的CD138-特異性CAR的核酸序列的組合物和具 有該核酸序列的細(xì)胞。在特定方面中，該核酸分子是重組核酸分子且可W是合成的。其可 包含DNA、RNAW及PNA(膚核酸）并且可W是其雜合體。
[0109] 此外，處于其他目的，設(shè)想核酸分子可含有例如硫醋鍵和/或核巧酸類似物。運些 修飾可用于針對細(xì)胞中的核酸內(nèi)切酶和/或外切酶穩(wěn)定核酸分子。運些核酸分子可由適當(dāng) 的載體轉(zhuǎn)錄，其包含允許細(xì)胞中所述核酸分子轉(zhuǎn)錄的嵌合基因。在運一方面，還應(yīng)立即，運 類多核巧酸可用于"基因祀向"或"基因治療"方法。在另一個實施方式中，運些核酸分子 是標(biāo)記的。檢測核酸的方法是本領(lǐng)域熟知的，例如Southern和Nodhern印跡、PCR或引物 延伸。在基因治療方法期間，該實施方式可用于篩選方法W驗證是否成功導(dǎo)入上文所述核 酸分子。
[0110] 運些核酸分子可W是包含前述核酸分子中任一種的重組產(chǎn)生的嵌合核酸分子，其 可單獨使用或聯(lián)用。在具體方面中，運些核酸分子是載體的一部分。
[0111] 本發(fā)明因此還設(shè)及包含載體的組合物，其包含本發(fā)明所述的核酸分子。
[0112] 許多合適在載體是分子生物學(xué)領(lǐng)域普通技術(shù)人員所已知的，其選擇取決于所需的 功能并且包括質(zhì)粒、粘粒、病毒、隧菌體和遺傳工程中常用的其它載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟 知的方法可用于構(gòu)建各種質(zhì)粒和載體；參見例如，Sambrook等（1989)和Ausubel,化rrent ProtocolsinMolecularBiology(《新編分子生物學(xué)新方法》），紐約的格林出版聯(lián)合公 司和韋利出版公司（GreenPublishingAssociatesandWileyInterscience) (1989)， (1994)所述的技術(shù)。或者，本發(fā)明的多核巧酸和載體可重組到脂質(zhì)體中W用于遞送至祀細(xì) 胞。可使用克隆載體來分離DNA的單個序列。可將相關(guān)序列轉(zhuǎn)移到表達(dá)載體中，該載體中需 要特定多膚的表達(dá)。一般的克隆載體包括地luescriptSK、pGEM、pUC9、地R322和pGBT9。 一般的表達(dá)載體包括pTRE、pCAkn-EK、祀SP-1、P0P13CAT。
[0113] 在【具體實施方式】中，存在一種包含核酸序列的載體，所述核酸序列是調(diào)控序列，其 可操作地連接編碼本發(fā)明所定義的CD138-特異性CAR的核酸序列。運類調(diào)控序列（控制 序列）是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的且可包括啟動子、拼接盒（splicecassette)、翻譯起始密 碼子、用于將插入片段導(dǎo)入載體的翻譯和插入位點。在【具體實施方式】中，該核酸分子操作性 連接所述表達(dá)控制序列，從而在真核或原核細(xì)胞中表達(dá)。
[0114] 設(shè)想載體是包含編碼本文定義的CD138-特異性CAR的核酸分子的表達(dá)載體。在 具體方面中，該載體是病毒載體，如慢病毒載體。慢病毒載體是市售可得的，包括來自例如 克隆泰克公司（Clontech)(加利福尼亞州芒廷維尤）或復(fù)能基因公司（GeneCopoeia)(馬 里蘭州羅克維爾）。
[011引術(shù)語"調(diào)控序列"指影響其連接的編碼序列的表達(dá)所必需的DNA序列。運類控制 序列的本質(zhì)根據(jù)宿主生命體而不同。在原核生物中，控制序列通常包括啟動子、核糖體結(jié)合 位點和終止子。在真核生物中，通常控制序列包括啟動子、終止子且在一些情況下包括增強 子、反式激活因子或轉(zhuǎn)錄因子。術(shù)語"控制序列"旨在包括至少W下所有組分：其存在是表 達(dá)所必需的，且還可包括其他有利的組分。
[0116] 術(shù)語"可操作地連接"表示并置位置，其中如此描述的組分的關(guān)系允許其W所需方 式發(fā)揮功能。"可操作地連接"至編碼序列的控制序列W在與控制序列相容的條件下完成編 碼序列表達(dá)的方式連接。在控制序列是啟動子的情況下，優(yōu)選使用雙鏈核酸對本領(lǐng)域技術(shù) 人員而旨是顯而易見的。
[0117] 因此，在某些實施方式中，所述載體是一種表達(dá)載體。"表達(dá)載體"是一種構(gòu)建體， 其可用于轉(zhuǎn)化所選宿主并提供所選宿主中編碼基因的表達(dá)。表達(dá)載體可例如是克隆載體， 雙向載體或整合載體。表達(dá)包括核酸分子的轉(zhuǎn)錄，優(yōu)選轉(zhuǎn)錄為可翻譯的mRNA。確保原核和 /或真核細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)控元件是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。在真核細(xì)胞的情況下，其通常 包括確保轉(zhuǎn)錄起始的啟動子且任選地包括確保轉(zhuǎn)錄終止和轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定化的聚A信號。允許 在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)的可能調(diào)控元件包括，例如，大腸桿菌中的Pi^、lac、trp或tac啟動 子，并且允許在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)控元件的示例是酵母中的AOXl或GALl啟動子或 者哺乳動物和其它動物細(xì)胞中的CMV-、SV40-、RSV-啟動子（勞氏肉瘤病毒）、CMV-增強子、 SV40-增強子或球蛋白內(nèi)含子。
[0118] 除負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄起始的元件外，運類調(diào)控元件還可包含轉(zhuǎn)錄終止信號，如SV40聚A位 點或tk聚A位點，其在多核巧酸的下游。此外，根據(jù)所用的表達(dá)系統(tǒng)，能夠引導(dǎo)多膚至細(xì) 胞隔室或?qū)⑵浞置谥两橘|(zhì)中的前導(dǎo)序列可添加至所述核酸序列的編碼序列中并且是本領(lǐng) 域熟知的。運些前導(dǎo)序列與翻譯、起始和終止序列W適當(dāng)方式組裝，且優(yōu)選能夠引導(dǎo)翻譯 后蛋白質(zhì)或其部分分泌至周質(zhì)空間或胞外介質(zhì)的前導(dǎo)序列。任選地，異質(zhì)性序列可編碼 包含N端鑒定膚的融合蛋白，所述N端鑒定膚具有所需特性，例如表達(dá)的重組蛋白的穩(wěn)定 化或簡化純化；參見同上。本文中，合適的表達(dá)載體是本領(lǐng)域已知的，例如Okayama-Berg cDNA表達(dá)載體pcDVl(法瑪西亞公司（Pharmacia))、pEF-Neo、pCDM8、pRc/CMV、pcDNAl、 pcDNA3(英杰公司（Invitrogen))、pEF-DHFR和祀F-ADA(Raum等.CancerImmunol Immunother(2001)50(3)，141-150)或pSPORTUGIBCOB化公司）。
[0119] 在一些實施方式中，運些表達(dá)控制序列是載體中的真核啟動子系統(tǒng)，能夠轉(zhuǎn)化或 轉(zhuǎn)染真核宿主細(xì)胞，但也可使用用于原核宿主的控制序列。一旦載體整合到合適宿主中，即 將宿主維持在適于核巧酸序列的高水平表達(dá)的條件下，并根據(jù)需要可隨后收集和純化本發(fā) 明的多膚。在特定實施方式中，通過相應(yīng)低氧環(huán)境的表達(dá)控制序列來調(diào)控一個或多個可編 碼序列。
[0120] 其他調(diào)控元件可包括轉(zhuǎn)錄W及翻譯增強子。有利地，上述本發(fā)明的載體包含可 選擇和/或可評分的標(biāo)志物。用于選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的可選擇標(biāo)志物基因是本領(lǐng)域技術(shù) 人員熟知的且包括例如作為選擇化化的基礎(chǔ)的抗代謝物抗性，其賦予對氨甲蝶嶺的抗 性巧eiss,PlantPhysiol. (Life-Sci.Adv. ) 13(1994),143-149);噸t，其賦予對氨基糖 武類新霉素、卡那霉素和己龍霉素的抗性〇ferrera-Estrella，EMBOJ. 2(1983),987-995) W及hygro,其賦予對潮霉素的抗性（Marsh,Gene32(1984), 481-485)。已描述了其他 可選擇基因，即trpB，其允許細(xì)胞利用嗎I噪代替色氨酸；hisD，其允許細(xì)胞利用組氨醇代 替組氨酸（Hartman,Proc.化tl.Acad.Sci.USA85 (1988)，8047);甘露糖-6-憐酸異構(gòu) 酶，其允許細(xì)胞利用甘露糖（W094/20627)和0DC(鳥氨酸脫簇酶），其賦予對鳥氨酸脫 簇酶抑制劑，2-(二氣甲基）-Dk鳥氨酸，DFM0的抗性（McConlogue，1987,刊于化rrent CommunicationsinMolecularBiology(《分子生物學(xué)的當(dāng)前通信》），冷泉港實驗室編） 或來自±曲霉的脫氨酶，其賦予對殺稻攝菌素-S的抗性（Tamura,Biosci.Biotechnol. Biochem. 59(1995), 2336-2338)〇
[0121] 有用的可評分標(biāo)志物也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可W商購。有利地，所述標(biāo)記 物是編碼W下物質(zhì)的基因：巧光素酶（Giacomin，Pl.Sci. 116(1996),59-72 ;Sc化antha，J. Bact. 178 (1996) ,121)、綠色巧光蛋白（Gerdes,陽BSLett. 389(1996),44-47)或-葡糖醒 酸糖巧酶（Jefferson,EMB0J. 6 (1987)，3901-3907)。對于簡單和快速地篩選含有所述載體 的細(xì)胞、組織和生物體而言，該實施方式是特別有用的。
[0122] 如上所述，所述核酸分子可單獨或者作為載體的部分用于細(xì)胞，W在細(xì)胞中表達(dá) 編碼的多膚。向細(xì)胞中導(dǎo)入含有編碼CD138-特異性CAR構(gòu)建體中任一種的DNA序列的核 酸分子或載體，其繼而產(chǎn)生感興趣的多膚。所述的核酸分子和載體可經(jīng)設(shè)計用于直接導(dǎo)入 或通過脂質(zhì)體或病毒載體（例如，腺病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）導(dǎo)入細(xì)胞中。在某些實施方式中， 細(xì)胞是例如T-細(xì)胞、CART-細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT-細(xì)胞、MSC、神經(jīng)干細(xì)胞或造血干細(xì)胞。
[0123] 根據(jù)上文，本發(fā)明設(shè)及衍生遺傳工程改造中常規(guī)使用的載體，尤其是質(zhì)粒、粘粒、 病毒和隧菌體的方法，該載體包含編碼本文定義的CD138-特異性CAR的多膚序列的核酸分 子。優(yōu)選地，所述載體是表達(dá)載體和/或基因轉(zhuǎn)移或祀向載體。源自病毒如逆轉(zhuǎn)錄病毒、痘 苗病毒、腺相關(guān)病毒、瘤疹病毒或牛乳頭瘤病毒的表達(dá)載體可用于遞送所述多核巧酸或載 體到祀細(xì)胞群中?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法來構(gòu)建重組載體；參見例如Sambrook 等（在上述引文中）、Ausubel(1989,在上述引文中）或其他標(biāo)準(zhǔn)教科書中描述的技術(shù)。替 代地，可將所述核酸分子和載體重建成用于遞送到祀細(xì)胞的脂質(zhì)體。含有本發(fā)明的核酸分 子的載體可通過熟知的方法轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞中，其根據(jù)細(xì)胞宿主的類型而變化。例如，氯 化巧轉(zhuǎn)染通常用于原核細(xì)胞，而憐酸巧處理或電轉(zhuǎn)可用于其它細(xì)胞宿主，參見Sambrook,同 上。
[0124]XII.通常的載體
[0125] 本發(fā)明的載體可用于重組工程改造W產(chǎn)生并且在至少一些情況中表達(dá)CD138-特 異性識別部分，包括CD138-特異性CAR或CD138-特異性接合分子。
[0126] 使用術(shù)語"載體"指代運載體核酸分子，其中可插入核酸序列W導(dǎo)入細(xì)胞，其可在 該細(xì)胞中復(fù)制。核酸序列可W是"外源的"，運表示該序列相對于導(dǎo)入載體的細(xì)胞是外來 的，或者該序列與細(xì)胞中的序列同源，但是其位于宿主細(xì)胞核酸內(nèi)原本未發(fā)現(xiàn)該序列的位 置上。載體包括質(zhì)粒、娠粒、病毒（隧菌體、動物病毒和植物病毒）和人工染色體（例如， YAC)。本領(lǐng)域技術(shù)人員有條件通過標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)構(gòu)建載體（參見，例如，Maniatis等，1988 和Ausubel等，1994,兩者通過引用納入本文）。
[0127] 術(shù)語"表達(dá)載體"是指包含編碼能夠被轉(zhuǎn)錄的RNA的核酸的任何類型的遺傳構(gòu)建 體。在一些情況中，RNA分子然后翻譯成蛋白、多膚或膚。在其他情況中，運些序列未經(jīng)翻 譯，例如，在反義分子或核酶的產(chǎn)生中。表達(dá)載體可含有多種"控制序列"，其是指特定宿主 細(xì)胞中可操作連接的編碼序列的轉(zhuǎn)錄和可能的翻譯所需的核酸序列。除了控制轉(zhuǎn)錄和翻譯 的控制序列W外，載體和表達(dá)載體可含有還具有其他功能并在下文中描述的核酸序列。
[012引本發(fā)明中采用的調(diào)控序列包括一種或多種低氧應(yīng)答元件，其功能上連接到表達(dá)受 調(diào)控的表達(dá)構(gòu)建體。W下描述了可采用的其它調(diào)控元件。
[0129]"啟動子"是一種控制序列，其是核酸序列的一個區(qū)域，在該區(qū)域中控制轉(zhuǎn)錄的起 始和速率。其可含有調(diào)控蛋白和分子（如RNA聚合物和其他轉(zhuǎn)錄因子）可結(jié)合的遺傳元件 W啟動核酸序列的具體轉(zhuǎn)錄。術(shù)語"可操作地定位"、"可操作地連接"、"控制下"和"轉(zhuǎn)錄控 制下"表示啟動子位于相對于核酸序列的正確功能位置和/或取向W控制該序列的轉(zhuǎn)錄起 始和/或表達(dá)。
[0130] 啟動子一般包含功能為定位RNA合成的起始位點的序列。其熟知的示例是TATA 盒，但在一些缺少TATA盒的啟動子中，例如，哺乳動物末端脫氧核巧酸轉(zhuǎn)移酶基因的啟動 子和SV40晚基因的啟動子，與其起始位點本身重疊的離散元件有助于固定啟動的位置。其 他啟動子元件調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始的頻率。通常，運些位于起始位點上游30-110b