專利名稱：：用于癌癥和其他疾病的親病灶性靶向基因遞送系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明總的涉及治療各種疾病、紊亂或病癥的方法和組合物。具體地，本發(fā)明涉及制備治療上有效的載體的方法和系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
：在所有基因治療方案中約有70%是針對(duì)治療轉(zhuǎn)移性癌癥的。大部分有效方案涉及通過基于細(xì)胞的細(xì)胞因子或腫瘤抗原基因轉(zhuǎn)移進(jìn)行的癌癥免疫治療方式，另一些涉及腫瘤內(nèi)運(yùn)送溶瘤病毒或帶有前藥、化學(xué)保護(hù)劑、反義構(gòu)建體或腫瘤抑制基因的載體。然而，阻礙有效的癌癥基因治療發(fā)展和應(yīng)用的尚未解決的主要問題是在體內(nèi)運(yùn)送至靶細(xì)胞的效率低下，這一問題取消和排除了許多直接治療方法(Tseng和Mulligan,Surg.Oncol.Clin.N.Am.11:537-569,2002)。在這個(gè)方面，親病灶性靶向方法的出現(xiàn)為癌癥基因治療提供了新的范例。通過靶向病變的組織病理-而不是癌細(xì)胞本身-以優(yōu)化轉(zhuǎn)移部位的有效載體濃度，循環(huán)基因治療載體在臨床前研究中的安全性和有效性均得到顯著增加(Gordon等人，CancerRes.60:3343-3347,2000;Gordon等人，Hum.GeneThei..12:193-204,2001)。通過進(jìn)一步增強(qiáng)基于鼠白細(xì)胞病毒的載體(選擇性轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂細(xì)胞)的固有特性和表現(xiàn)出腫瘤破壞性和抗血管生成活性的細(xì)胞周期控制基因的重要特異性(Gordon等人，Hum.GeneTher.12:193-204,2001),親病灶性載體的臨床前和臨床表現(xiàn)確立了系統(tǒng)遞送基因藥物以生理監(jiān)視和治療原發(fā)的、遠(yuǎn)距離的、轉(zhuǎn)移的和潛伏的癌癥的可能性。期望提供改良載體、制備改良載體的系統(tǒng)和施用該載體的治療方案，以使靶向遞送系統(tǒng)能被應(yīng)用于臨床環(huán)境。
發(fā)明內(nèi)容本/>開內(nèi)容涉及"靶向的"病毒和非病毒顆粒，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒、腺病毒載體顆粒、腺相關(guān)病毒載體顆粒、皰滲病毒載體顆粒和假型病毒如水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)，以及含有病毒蛋白作為病毒體部分的非病毒載體或其他脂蛋白體基因轉(zhuǎn)移載體。還提供了用于產(chǎn)生靶向病毒顆粒的新型逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的人生產(chǎn)細(xì)胞在制備顆粒中的應(yīng)用、大規(guī)模制備病毒顆粒的生產(chǎn)方法和收集并保存靶向病毒載體的方法。在一種實(shí)施方式中，提供了一種制備靶向遞送載體的方法。該方法包括用以下物質(zhì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染生產(chǎn)細(xì)胞l)第一質(zhì)粒，其包含編碼經(jīng)修飾含膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的4070A雙嗜性包膜蛋白的核酸序列；2)第二質(zhì)粒，其包含i)與啟動(dòng)子有效連接的核酸序列，其中該序列編碼病毒gag-pol多肽；ii)與啟動(dòng)子有效連接的核酸序列，其中該序列編碼能將抗藥性賦予生產(chǎn)細(xì)胞的多肽；和iii)SV40復(fù)制起點(diǎn)；3)第三質(zhì)粒，其包含i)與啟動(dòng)子有效連接的異源核酸序列，其中該序列編碼診斷性或治療性多肽；ii)5，和3，長末端重復(fù)序列；iii)iK逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝序列；iv)5，LTR上游的CMV啟動(dòng)子；v)與啟動(dòng)子有效連接的核酸序列，其中該序列編碼能將抗藥性賦予生產(chǎn)細(xì)胞的多肽；vi)SV40復(fù)制起點(diǎn)。生產(chǎn)細(xì)胞是表達(dá)SV40大T抗原的人細(xì)胞。在一方面，生產(chǎn)細(xì)胞是293T細(xì)胞。該方法還包括在允許靶向遞送載體在培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的生產(chǎn)細(xì)胞，分離上清液并將其引入閉環(huán)多管系統(tǒng)(closedlo叩manifoldsystem)中以收集載體。圖19A和圖19B展示了一個(gè)閉環(huán)多管系統(tǒng)的例子。在一種實(shí)施方式中，靶向遞送載體是病毒顆粒。在另一實(shí)施方式中，耙向遞送載體是非病毒顆粒。在一個(gè)方案中，第一質(zhì)粒是Bvl/pCAEP質(zhì)粒，第二質(zhì)粒是pCgpn質(zhì)粒，第三質(zhì)粒是pdnGl/C-REX質(zhì)粒、pdnGl/C-REXII質(zhì)粒、pdnGl/UBER扁REX質(zhì)粒。收集的顆粒的病毒滴度通常約為1x107-1x1011、1x108-1x101、1x109-1xio11、5x108—5x1010、2x109-5x1010、3x109—5x1010、4x109—1x1010、5x109-lx10，3x109—5xIO11，至少為5x108、1x109、2xl09、3xl09、4xl09、5xl09、8xl09、lx101、5xl010或lxlO"集落形成單位(cfu)/毫升。此外，病毒顆粒的直徑通常約為10nm-1000腿、20nm-500腿、50腿-300nm、50nm-200廳或者50纖-150腿。在一種實(shí)施方式中，膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括馮維勒布蘭德因子(vonWillebrandfactor)D2結(jié)構(gòu)域衍生的肽。馮維勒布蘭德因子通常來源于哺乳動(dòng)物。所述肽包括Gly-His-Val-Trp-Arg-Glu-Pro-Ser-PheMet-Ala-Lys-Ser-Ala-Ala(SEQIDNO:l)或Gly-His-Val-Gly-Trp-Arg-Glu-Pro-Ser-PheMet-Ala-Lys畫Ser匿Ala-Ala(SEQIDN0:8)氨基酸序列。在另一種實(shí)施方式中，所述肽包含于4070A雙嗜性包膜蛋白的gp70部分中。在另一種實(shí)施方式中，治療性多肽為細(xì)胞周期蛋白Gl的N末端缺失突變體、白介素2(IL-2)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)或胸苷激酶。本文披露的靶向遞送載體通常包含編碼診斷性或治療性多肽的核酸序列。如本"i兌明書其他部分所詳述，本發(fā)明的治療性蛋白質(zhì)和多肽的例子包括但不限于自殺蛋白、凋亡誘導(dǎo)蛋白、細(xì)胞因子、白介素和TNF家族蛋白質(zhì)幾大類。診斷性蛋白質(zhì)或多肽的例子包括例如綠色熒光蛋白和螢光素酶。本發(fā)明的基因靶向遞送系統(tǒng)可用于選擇性靶向于具有暴露的細(xì)胞外基質(zhì)成分的組織，所述細(xì)胞外基質(zhì)成分例如是膠原(如I型膠原和IV型膠原)、層粘連蛋白、纖連蛋白、彈性蛋白、糖胺聚糖、蛋白聚糖或RGD序列。組織中可被本發(fā)明的載體顆粒感染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞包括但不限于內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、結(jié)締組織的成纖維細(xì)胞和彈性纖維細(xì)胞；骨中的骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞；脈管系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞；胃腸道和呼吸道的上皮細(xì)胞和上皮下細(xì)胞；纖維化肝臟的血管細(xì)胞、結(jié)締組織細(xì)胞和肝細(xì)胞，以及炎性組織的修補(bǔ)性單個(gè)核細(xì)胞和浸潤性粒細(xì)胞。可被本發(fā)明的載體顆粒預(yù)防或治療的疾病或病癥'包括但不限于與外露的細(xì)胞外基質(zhì)成分相關(guān)的疾病或病癥。這種疾病或病癥包括但不限于以異?；虿皇芸刂频募?xì)胞增殖和/或異常血管發(fā)生為特征的或與之相關(guān)的疾病。涉及異常細(xì)胞增殖和/或血管發(fā)生的疾病包括，例如癌癥(如實(shí)體瘤和血液腫瘤，特別是轉(zhuǎn)移性癌癥)、心血管疾病(如動(dòng)脈粥樣硬化和再狹窄)、慢性炎癥(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病)、糖尿病(糖尿病性視網(wǎng)膜病)、銀屑病、子宮內(nèi)膜異位癥、新生血管性青光眼和肥胖性心血管疾?。桓斡不?；結(jié)締組織病(包括韌帶、腱和軟骨相關(guān)疾病)；與膠原暴露相關(guān)的血管病。載體顆?？杀挥糜谶f送治療性基因，以恢復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞功能和對(duì)抗血栓形成，并且抑制與新內(nèi)膜形成相關(guān)的增殖和纖維化反應(yīng)。載體顆粒還可被用于預(yù)防或治療血管損傷；再狹窄；纖維化如肝和肺纖維化；潰瘍性損傷；炎癥區(qū)域；激光損傷部位如眼睛；角膜渾濁；手術(shù)部位；關(guān)節(jié)炎性關(guān)節(jié)；傷疤；和瘢痕疙瘩。載體顆粒還可被用于創(chuàng)傷愈合。特別地，載體顆粒可被用于預(yù)防或治療腫瘤，包括原發(fā)或繼發(fā)的惡性和非惡性胂瘤、血液疾?。灰约邦A(yù)防或治療癌癥或腫瘤的轉(zhuǎn)移。盡管申請(qǐng)人:不希望限于任何理論，胂瘤在侵襲正常組織或器官時(shí)會(huì)分泌酶，例如膠原酶或金屬蛋白酶，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)成分暴露。通過將載體顆粒靶向于這些暴露的細(xì)胞外基質(zhì)成分，載體顆?？稍诮咏[瘤的暴露基質(zhì)成分處聚集，從而感染腫瘤細(xì)胞。這些腫瘤包括但不限于癌、肉瘤，例如乳腺癌、皮膚癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、腦癌、喉癌、月旦嚢癌、胰腺癌、直腸癌、曱狀旁腺癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、神經(jīng)組織癌、頭頸癌、結(jié)腸癌、胃癌、支氣管癌、腎癌、基底細(xì)胞癌、潰瘍型和乳頭樣鱗狀細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)移性皮膚癌、骨肉瘤、尤因肉瘤、網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤、骨髓瘤、巨細(xì)胞瘤、小纟田月包肺癌、膽結(jié)石、胰島細(xì)胞瘤、原發(fā)性腦腫瘤、急性和慢性淋巴細(xì)胞瘤和粒細(xì)胞瘤、毛細(xì)胞瘤、腺瘤、增生、髓樣癌、嗜鉻細(xì)胞瘤、粘膜神經(jīng)瘤、腸神經(jīng)節(jié)瘤、增生性角膜神經(jīng)瘤、馬方綜合征樣體質(zhì)腫瘤、腎母細(xì)胞瘤、精原細(xì)胞瘤、卵巢胂瘤、平滑肌(leiomyomater)胂瘤、宮頸發(fā)育異常和原位癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、一見網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、軟組織肉瘤、纖維肉瘤、惡性類癌瘤、局部皮膚損傷、蕈樣肉芽腫、橫紋肌肉瘤、卡波西肉瘤、成骨肉瘤和其他肉瘤、惡性高鈣血癥、腎細(xì)胞瘤、真性紅細(xì)胞增多癥、腺癌、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、白血病、淋巴瘤、惡性黑素瘤、表皮樣癌和其他癌和肉瘤。惡性胂瘤如各種白血病。血液病的實(shí)例包括但不限于急性髓細(xì)胞性白血病、急性前髓細(xì)胞性白血病、急性淋巴母細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性髓細(xì)胞性白血病、骨髓增生異常綜合征和鐮狀細(xì)胞貧血。在一種實(shí)施方式中，提供了一種預(yù)防或減少受試對(duì)象患上與暴露的細(xì)胞外基質(zhì)成分相關(guān)的疾病或病癥的風(fēng)險(xiǎn)的方法。該方法包括向受試對(duì)象施用本發(fā)明的耙向載體。在另一種實(shí)施方式中，提供了一種抑制癌癥患者的癌轉(zhuǎn)移的方法。該方法包括向受試對(duì)象施用本發(fā)明的靶向載體。在另一種實(shí)施方式中，提供了一種治療患有與暴露的細(xì)胞外基質(zhì)成分成分相關(guān)的疾病或病癥的受試對(duì)象的方法。該方法包括向受試對(duì)象施用本發(fā)明的靶向載體。該方法還可任選地包括向受試對(duì)象施用其他治療劑，例如化療藥劑和生物制劑，或者在施用靶向載體之前、同時(shí)或之后與其他療法如放射治療、手術(shù)和熱解聯(lián)合治療受試對(duì)象。化療藥劑的實(shí)例包括但不限于烷基化劑，如塞替派和環(huán)磷酰胺(CYTOXAN);磺酸烷基酯，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶類，如苯并多巴、卡波醌、美妥替p底(metm'edopa)和uredopa;乙烯亞胺和曱基蜜胺(methylamelamines),包括六曱蜜胺、三亞乙基蜜胺、三亞乙基磷酰胺、三亞乙基硫代磷酰胺和三羥曱蜜胺(trimethylolomelamine);乙酰精寧(特別是泡番荔枝辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone));喜樹堿(包括合成的類似物托泊替康)；苔蘚抑素；callystatin;CC-1065(包括它的阿多來新、卡折來新和比折來新合成類似物)；自念珠藻環(huán)肽類(cryptophycins)(特別是自念珠藻環(huán)肽1和自念珠藻環(huán)肽8);多拉司他?。欢嗫仔?包括合成類似物KW-2189和CBI-TMI);艾榴塞洛素(eleutherobin);水鬼蕉石咸(pancratistatin);sarcodictyin;〉每纟帛素(spongistatin);氮芥類,長口苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、二氯曱基二乙胺、鹽酸氧化氮芥、美法侖、新氮芥、苯芥膽甾醇、潑尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亞硝基脲類，如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司??；抗生素，如烯二炔抗生素(如卡里奇霉素，特別是卡里奇霉素Yll和卡里奇霉素phill,參見如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.，33:183-186(1994);達(dá)內(nèi)霉素(dynemicin)，包括達(dá)內(nèi)霉素A;雙膦酸鹽化合物，如氯膦酸鹽；埃斯培拉霉素(esperamicin);以及#斤制癌菌素發(fā)色團(tuán)和相關(guān)色蛋白烯二炔抗生素發(fā)色團(tuán))、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放線菌素、安曲霉素、偶氮絲氨酸、博來霉素、放線菌素C、卡柔比星(carabicin)、洋紅霉素、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔紅霉素、地托比星、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(曱烯土霉素TM)(包括嗎啉代-多柔比星、氰嗎啉代-多柔比星、2-吡咯啉并-多柔比星和去氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊達(dá)比星、麻西羅霉素、絲裂霉素類如絲裂霉素C、麥考酚酸、諾拉霉素、橄欖霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑霉素、鏈佐星、殺結(jié)核菌素、烏苯美司、凈司他丁、佐柔比星；抗代謝藥，如氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);葉酸類似物，如二曱葉酸(demopterin)、氨甲喋呤、蝶羅呤、三曱曲沙；。票呤類似物，如氟達(dá)拉濱、6-巰嘌呤、硫咪。票呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷；雄激素類，如卡普睪酮、丙酸屈他雄酮、環(huán)硫雄醇、美雄烷、睪內(nèi)酪；抗腎上腺素藥，如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦；葉酸補(bǔ)充劑，如亞葉酸(frolinicacid);醋葡醛內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧。定;安口丫口定；bestrabucil;t匕生群；edatraxate;defofamine;:f火7jof山胺；；也口丫醌；依氟鳥氨酸；依利醋銨；埃博霉素(epothilone);依托格魯；確酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達(dá)明；類美登醇，如美登素和安絲菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達(dá)醇；硝氨丙吖啶；噴司他??；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSKTM;雷佐生；根瘤菌素(rhizoxin);西佐喃；鍺螺胺；替奴佐酸；三亞胺醌；2,2'，2"-三氯三乙胺；單端孢霉烯(特別是T-2毒素、verracurinA、桿孢菌素A和anguidine);烏拉坦；長春地辛；達(dá)卡巴嗪；甘露莫司??；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷；gacytosine;阿糖胞苷("Am-C");環(huán)磷酰胺；噻替派(thiopeta);紫杉烷(taxoid),如紫杉醇(TAXOL丁m,BristolMeyersSquibbOncology,Princeton，N丄)和多西紫杉醇(TAXOTERE,Rhone-PoulencRorer，Antony，法國)；苯丁酸氮芥；吉西他濱(GemzarTM);6-硫代鳥噪呤；巰嘌呤；氨曱喋呤；鉑類似物，如順鉑和卡鉑；長春堿；柏；依托泊苷(VP-16);異環(huán)磷酰胺；米托蒽醌；長春新堿；長春瑞濱(Navdbine);諾肖林；替尼泊苷；依達(dá)曲沙；柔紅霉素；氨基蝶呤；xeoloda;伊班膦酸鹽；CPT-11;拓樸異構(gòu)酶抑制劑RFS2000;二氟甲基鳥氨酸(DMFO);類視黃醇，如視黃酸；卡培他濱；和上述任意化合物的藥學(xué)可接受的鹽、酸或衍生物。定義"化療藥劑"還包括用于調(diào)節(jié)或抑制激素對(duì)腫瘤的作用的抗激素藥，如抗雌激素藥和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERMs),包括例如他莫昔芬(包括諾瓦得士(Nolvadex)TM)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮和托瑞米芬(法樂通(Fareston)TM);調(diào)節(jié)腎上腺產(chǎn)生雌激素的芳香酶抑制劑，例如4(5)-咪唑，氨魯米特、醋酸曱地孕酮(美可治(Megace)TM)、j衣西美坦、福美坦、法倔唑、伏氯唑(RivisorTM)、來曲唑(弗隆(Femara)tm)和阿那曲唑(瑞寧得(Arimidex)tm);和抗雄激素藥物，例如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；和上述任意化合物的藥學(xué)可接受的鹽、酸或衍生物。17在一種具體實(shí)施方式中，與靶向載體聯(lián)用的治療藥劑是酪氨酸激酶抑制劑，如ZD1839(易瑞沙(Iressa)tm，AstmZenecaK,K.);IMC-C225或西妥昔單抗(愛必妥(Erbitux)tm);曲妥單抗(赫賽汀(HERCEPTIN)tm);曱磺酸伊馬替尼(格列衛(wèi)(CLEEVEC)tm,以前稱為STI-571);和索拉非尼(多吉美(Nexavar)tm)。生物制劑可以是治療性抗體，例如利妥昔單抗(RITUXANTM);阿侖單抗(坎帕斯(CAMPATH)tm);和吉妥珠單抗奧唑米星(麥羅塔(MYLOTARG)tm)。通過使用靶向載體實(shí)施本發(fā)明，接受治療的受試對(duì)象(特別是人類受試對(duì)象)不僅自身疾病得到預(yù)防或緩解，其生活質(zhì)量也有所改善，因?yàn)楸景l(fā)明的靶向治療方法能大大減輕或消除通常與其他治療類型例如化療和生物治療相關(guān)的副作用，包括脫發(fā)或毛發(fā)減少、骨髓抑制、肝功能和腎功能明顯改變、惡心和嘔吐、粘膜炎、皮疹或便秘。在該實(shí)施方式的一種變化方案中，該方法包括第一期方案，該第一期方案包括用本文所述的病毒顆粒接觸受試對(duì)象，其中受試對(duì)象接觸i)約1x109-6x109單位/天的第一病毒顆粒劑量水平，給受試對(duì)象連續(xù)施用1至大約6天；ii)約7x109-約1x1(V。單位/天的第二病毒顆粒劑量水平，給受試對(duì)象連續(xù)施用1至大約3天，再接著給予第一載體劑量；和iii)約1x101Q-約5x101()單位/天的病毒顆粒劑量水平，給受試對(duì)象連續(xù)施用1-3天，再接著給予第二載體劑量。該方法還包括第二期方案，該第二期方案包括用如本文所述產(chǎn)生的病毒顆粒接觸受試對(duì)象，其中給受試對(duì)象施用約1x109-約5x10"單位/天的病毒顆粒劑量水平，連續(xù)1至大約15天，之后轉(zhuǎn)為第一期方案。根據(jù)該變化方案，該方法任選地包括在第一期和第二期方案之前、同時(shí)或之后向受試對(duì)象施用化療藥劑。病毒顆粒的第一劑量水平可為約4xl09-5x109單位/天。病毒顆粒的第二劑量水平可為約9x109-約lxlO'。單位/天。病毒顆粒的第三劑量水平可為約1x101。-約2xi010單位/天。本文披露的靶向遞送載體可經(jīng)局部、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、結(jié)腸內(nèi)、氣管內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、血管內(nèi)、鞘內(nèi)、顱內(nèi)、骨髓內(nèi)、胸膜內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、眼內(nèi)、骨內(nèi)和/或滑膜腔內(nèi)施用。在另一實(shí)施方式中，提供了一種質(zhì)粒，其包含與啟動(dòng)子功能連接的多克隆位點(diǎn)，其中該啟動(dòng)子支持異源核酸序列的表達(dá)；5'和3'長末端重復(fù)序列；Y逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝序列；位于5'LTR上游的CMV啟動(dòng)子；與啟動(dòng)子有效連接的核酸序列，其中該序列編碼能將抗藥性賦予含有該質(zhì)粒的生產(chǎn)細(xì)胞的多肽；和SV40復(fù)制起點(diǎn)。質(zhì)粒的實(shí)例包括pC-REXII、pC-REX和pUBER-REX。其他衍生物的實(shí)例包括那些含有編碼治療性或診斷性多肽的異源核酸序列的質(zhì)粒。在其他實(shí)施方式中，提供了一種制備靶向遞送載體的試劑盒。該試劑盒主要包括含有本文披露的用于產(chǎn)生(例如)病毒顆粒的質(zhì)粒的容器。該試劑盒還可包括適合質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的生產(chǎn)細(xì)胞，和用質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染生產(chǎn)細(xì)染的生產(chǎn)細(xì)胞的方法。例如，供制備耙向遞送載體的試劑盒可包括含有Bvl/pCAEP質(zhì)粒、pCgpn質(zhì)粒和pdnGl/C-REX質(zhì)粒、pdnGl/C-REXII質(zhì)?；騪dnGl/UBER-REX質(zhì)粒的容器。該試劑盒還可包括293T細(xì)胞和說明書，用于用質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞和在允許產(chǎn)生靶向病毒顆粒的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。在其他實(shí)施方式中，提供了一種治療肺瘤病癥的試劑盒。該試劑盒包括含有按本文所述方法制備的、存在于藥學(xué)可接受載體中的病毒顆粒的容器和向受試對(duì)象施用病毒顆粒的說明書。可按照表1提供的示例性治療方案進(jìn)4亍施用。在另一實(shí)施方式中，提供了一種進(jìn)行基因治療商業(yè)活動(dòng)的方法。該方法包括生產(chǎn)靶向遞送載體，和通過收集載體顆粒、將其混懸于適宜的培養(yǎng)基溶液中并保存混懸液而建立載體庫。該方法還包括向醫(yī)師或保健提供者提供顆粒和使用顆粒的說明書，以施用于需要的受試對(duì)象(患者)。載體的使用說明書還可包括表1提供的示例性治療方案。該方法任選地包括給患者或者患者的保險(xiǎn)提供者開賬單。在另一種實(shí)施方式中，提供了一種進(jìn)行基因治療商業(yè)活動(dòng)的方法，包括向醫(yī)師或保健提供者提供本文所披露的試劑盒。在另一種實(shí)施方式中，提供了一種采用治療性病毒顆粒治療具有一個(gè)或多個(gè)含有癌細(xì)胞的腫瘤的受試對(duì)象的方法。該方法包括a)通過以下步驟確定治療性病毒顆粒的劑量i)根據(jù)受試對(duì)象紳瘤內(nèi)存在的癌細(xì)胞數(shù)或腫瘤中的腫瘤細(xì)胞總數(shù)來確定受試對(duì)象的胂瘤負(fù)荷；ii)用治療性病毒顆粒的生理感染復(fù)數(shù)(pMOI)乘以腫瘤負(fù)荷；和iii)將得到的數(shù)值除以治療性病毒顆粒的滴度，得到向受試對(duì)象施用治療性病毒顆粒的體積；和b)向受試對(duì)象施用已確定的治療性病毒顆粒的劑量。根據(jù)該實(shí)施方式，受試對(duì)象每天按確定的劑量^矣受治療性病毒顆粒的治療，連續(xù)1-5天或1至大約6天。任選地，受試對(duì)象連續(xù)在周一、周三和周五按確定的每日劑量接受治療性病毒顆粒的治療。受試對(duì)象可一皮允許^f木息1-2天，該時(shí)間也組成治療周期。受試對(duì)象可經(jīng)2-8個(gè)治療周期的治療，優(yōu)選3-4個(gè)治療周期。根據(jù)該實(shí)施方式，也可以按照以下公式計(jì)算以毫升為單位的治療性病毒顆^立的劑量腫瘤負(fù)荷(癌細(xì)胞數(shù))xpMOI病毒滴度(集落形成單位(C.F.U.)/ml)其中pM0I是4-250，優(yōu)選IOO。根據(jù)該實(shí)施方式，方法還可包括以下步驟在受試對(duì)象用確定劑量的治療性病毒顆粒治療之后，測(cè)定受試對(duì)象的腫瘤負(fù)荷；重新計(jì)算治療性病毒顆粒的劑量；和向受試對(duì)象施用重新計(jì)算的劑量的治療性病毒顆粒。根據(jù)該實(shí)施方式，還可以用以下公開計(jì)算腫瘤負(fù)荷(目標(biāo)病變或肺瘤的最長直徑之和(cm))x1xl(f癌細(xì)月包/cm。目標(biāo)病變或腫瘤可通過測(cè)徑器或通過放射成像如MRI、CT、PET或SPECT掃描加以測(cè)量。根據(jù)該實(shí)施方式，治療性病毒顆?？山?jīng)局部、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、結(jié)腸內(nèi)、氣管內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、血管內(nèi)、鞘內(nèi)、顱內(nèi)、骨髓內(nèi)、胸膜內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、目艮內(nèi)、骨內(nèi)和/或滑膜腔內(nèi)給藥。優(yōu)選地，治療性病毒顆粒通過靜脈內(nèi)輸注施用于受試對(duì)象。根據(jù)該實(shí)施方式，受試對(duì)象為哺乳動(dòng)物，優(yōu)選為人類。根據(jù)該實(shí)施方式，所述癌癥選自乳腺癌、皮膚癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、腦癌、子宮癌、喉癌、膽嚢癌、胰腺癌、直腸癌、曱狀旁腺癌、曱狀腺癌、腎上腺癌、神經(jīng)組織癌、頭頸癌、結(jié)腸癌、胃癌、支氣管癌、腎癌、基底細(xì)胞癌、潰瘍型和乳頭樣鱗狀細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)移性皮膚癌、骨肉瘤、尤因肉瘤、網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤、骨髓瘤、巨細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺癌、膽結(jié)石、胰島細(xì)胞瘤、原發(fā)性腦肺瘤、急性和慢性淋巴細(xì)胞瘤和粒細(xì)胞瘤、毛細(xì)胞瘤、腺瘤、增生、髓樣癌、嗜4各細(xì)胞瘤、粘膜神經(jīng).瘤、腸神經(jīng)節(jié)瘤、增生性角膜神經(jīng)瘤、馬方綜合征樣體質(zhì)腫瘤、腎母細(xì)胞瘤、精原細(xì)胞瘤、卵巢腫瘤、平滑肌腫瘤、宮頸發(fā)育異常和原位癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、軟組織肉瘤、惡性類癌瘤、局部皮膚損傷、蕈樣肉芽肺、橫紋肌肉瘤、卡波西肉瘤、成骨肉瘤和其他肉瘤、惡性高4丐血癥、腎細(xì)胞瘤、真性紅細(xì)胞增多癥、腺癌、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、白血病、；林巴瘤、惡性黑素瘤和表皮樣癌。癌癥優(yōu)選為骨肉瘤、肉瘤、胰腺癌、乳腺癌或結(jié)腸癌。根據(jù)該實(shí)施方式，治療性病毒顆粒為本文所公開的本發(fā)明的病毒載體，例如為逆轉(zhuǎn)錄病毒(優(yōu)選雙嗜性)載體的病毒載體，該載體具有經(jīng)修飾包含膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的包膜蛋白，并且編碼針對(duì)癌癥的治療劑(如細(xì)胞周期蛋白Gl的殺細(xì)胞突變體)。根據(jù)該實(shí)施方式，所述方法還可包括以下步驟在施用治療性病毒顆粒之前、同時(shí)或之后向受試對(duì)象施用化療藥劑、生物制劑或放射治療。當(dāng)結(jié)合附圖閱讀下面的發(fā)明詳述后，可更全面地理解本發(fā)明的這些及其它方面、實(shí)施方式、目的和特征，以及最佳實(shí)施方式。圖1A顯示1號(hào)患者在第一個(gè)治療周期結(jié)束一天后的代表性MRI，圖示在手術(shù)床區(qū)域內(nèi)的胰腺區(qū)中有一個(gè)大的圓形復(fù)發(fā)腫瘤(T;括出的區(qū)域)，和一個(gè)增大的主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)(N),表明胂瘤轉(zhuǎn)移。圖IB顯示1號(hào)患者在第二個(gè)治療周期結(jié)束四天后的后續(xù)MRI,圖示復(fù)發(fā)腫瘤(T;括出的區(qū)域)形狀呈不規(guī)則性，40-50%的胂瘤出現(xiàn)大面積的中心性壞死(nec)，主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N)大小明顯減小。圖lC為表明Rexin-G引起1號(hào)患者的血清CA19-9水平降低的圖。血清CA19-9水平(U/ml)(標(biāo)于縱軸)表示為時(shí)間(日期)(標(biāo)于橫軸)的函數(shù)。箭頭標(biāo)明每個(gè)治療周期的開始。圖2A提供2號(hào)患者在第一個(gè)治療周期伊始的代表性腹部CT掃描，圖示在胰腺頭(T)侵占腸系膜上靜脈(SMV)和腸系膜上動(dòng)脈(SMA)的區(qū)域有一6.0cm3肺塊。圖2B提供2號(hào)患者在第二個(gè)治療周期結(jié)束兩天后的后續(xù)腹部CT掃描，圖示胰腺腫瘤腫塊(T)的大小縮小，并且遠(yuǎn)離腸系膜上血管(SMV和SMA)縮回。箭頭標(biāo)明每個(gè)治療周期的開始。圖2C為表明Rexin-G阻止2號(hào)患者原發(fā)腫瘤生長的圖。通過Rexin-G連續(xù)治療，注意到腫瘤大小呈進(jìn)行性減小。腫瘤體積(cn)采用以下公式計(jì)算寬度2x長度x0.52(O'Reilly等人，Cell88,277，1997)(標(biāo)于縱軸),并表示為時(shí)間(標(biāo)于橫軸)的函數(shù)。箭頭標(biāo)明每個(gè)治療周期的開始。圖3A描述的數(shù)據(jù)表明Rexin-G加吉西他濱誘導(dǎo)患轉(zhuǎn)移性胰腺癌的3號(hào)患者腫瘤消退。原發(fā)腫瘤的腫瘤體積(cm,標(biāo)于Y軸上，并表示為時(shí)間(日期)的函數(shù)。箭頭標(biāo)明Rexin-G輸注開始。圖3B描述的數(shù)據(jù)表明Rexin-G加吉西他濱誘導(dǎo)患轉(zhuǎn)移性胰腺癌的3號(hào)患者腫瘤消退。門靜脈節(jié)結(jié)的腫瘤體積標(biāo)于Y軸上，并表示為時(shí)間(曰期)的函數(shù)。箭頭標(biāo)明Rexin-G輸注開始。圖3C描述的數(shù)據(jù)表明Rexin-G加吉西他濱誘導(dǎo)患轉(zhuǎn)移性胰腺癌的3號(hào)患者腫瘤消退。肝臟節(jié)結(jié)數(shù)標(biāo)于Y軸上，并表示為時(shí)間(日期)的函數(shù)。箭頭標(biāo)明Rexin-G輸注開始。圖4A縱軸為1號(hào)患者的收縮壓(以mmHg表示)，而橫軸為REXIN-G輸注時(shí)間。圖4B縱軸為1號(hào)患者的每分鐘脈搏率，而橫軸為REXIN-G輸注時(shí)間。圖4C縱軸為1號(hào)患者的每分鐘呼吸頻率，而橫軸為REXIN-G輸注時(shí)間。圖5A描述的數(shù)據(jù)顯示1號(hào)患者的血紅蛋白(gms0/。)、白細(xì)胞計(jì)凄丈和血小板計(jì)數(shù)(標(biāo)于Y軸)，其表示為治療天數(shù)(標(biāo)于X軸)的函數(shù)。圖5B描述的數(shù)據(jù)表明Rexin-G對(duì)1號(hào)患者的肝功能無不良作用。AST(U/L)、ALT(U/L)和膽紅素(mg%)標(biāo)于Y軸，并表示為治療天數(shù)(標(biāo)于X軸)的函數(shù)。圖5C顯示1號(hào)患者的血尿素氮(mg°/。)、肌酐(mgQ/。)和鉀(mmol/L)水平(標(biāo)于Y軸.)，并表示為治療天數(shù)(標(biāo)于X軸)的函數(shù)。以劑量水平I(4.5x109cfu/劑)連續(xù)施用6天，休息期為2天，接著以劑量水平11(9x109cfu/劑)連續(xù)施用2天，再以劑量水平111(1.4x101Qcfu/劑)連續(xù)施用2天。圖6提供的數(shù)據(jù)表明Rexin-G的劑量遞增對(duì)2號(hào)患者的血液動(dòng)力學(xué)功能無不良作用。對(duì)每個(gè)劑量水平，收縮壓(mmHg)、脈搏率/分鐘和呼吸頻率/分鐘均作為輸注時(shí)間(標(biāo)于橫軸)的函數(shù)在縱軸上作圖。圖7A表示2號(hào)患者的血紅蛋白(gms0/。)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)和血小板計(jì)數(shù)(標(biāo)于Y軸)，其表示為治療天數(shù)(標(biāo)于X軸)的函數(shù)。圖7B描述的數(shù)據(jù)表明Rexin-G對(duì)2號(hào)患者的肝功能無不良作用。AST(U/L)、ALT(U/L)和膽紅素(mg%)標(biāo)于Y軸上，并表示為治療天數(shù)(標(biāo)于X軸)的函數(shù)。圖7C表示2號(hào)患者的血尿素氮(mg%)、月幾酐(mg0/0)和鉀(mmol/L)水平(標(biāo)于Y軸)，其表示為治療天數(shù)(標(biāo)于X軸)的函數(shù)。以劑量水平I(4.5x109cfu/劑)連續(xù)施用5天，接著以劑量水平11(9x109cfu/劑)連續(xù)施用3天，再以劑量水平in(1.4x10"cfu/劑)連續(xù)施用2天。圖8A表示3號(hào)患者的血紅蛋白(gms0/。)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)和血小板計(jì)數(shù)(標(biāo)于Y軸)，其表示為治療天數(shù)(標(biāo)于X軸)的函數(shù)。圖8B描述的數(shù)據(jù)表明Rexin-G對(duì)3號(hào)患者的肝功能無不良作用。AST(U/L)、ALT(U/L)和膽紅素(mg。/。)標(biāo)于Y軸上，并表示為治療天數(shù)(標(biāo)于X軸)的函數(shù)。圖8C表明Rexin-G對(duì)3號(hào)患者的腎功能無不良作用。血尿素氮(mg%)、肌酐(mgQ/。)和鉀(mmol/L)水平標(biāo)于Y軸上，并表示為治療天數(shù)(標(biāo)于X軸)的函數(shù)。以劑量水平I(4.5xlO、fu/劑)連續(xù)施用6天。圖9顯示對(duì)Rexin-G納米顆粒的大小測(cè)量。采用精度檢測(cè)儀(Franklin,MA02038U.S.A.),通過動(dòng)態(tài)光散射(DLS)以分批模式分析載體樣品，以流體力學(xué)半徑(rh)確定其分子大小。采用精度反巻積軟件由DLS數(shù)據(jù)計(jì)算確定不同大小群。Rexin-G臨床使用批次的平均顆粒大小分別為95、105和95nm,并且未纟企測(cè)到病毒聚集。圖10展示GTI表達(dá)載體GlnXSvNa的高感染滴度(HIT)形式。pRV109質(zhì)粒提供強(qiáng)CMV啟動(dòng)子。所得pREX表達(dá)載體具有用于在表達(dá)SV40大T抗原的生產(chǎn)細(xì)胞系(293T)中進(jìn)行游離型復(fù)制和質(zhì)粒拯救的SV40起點(diǎn)、用于在大腸桿菌中篩選和維持的氨節(jié)青霉素抗性基因和由SV40e.p.驅(qū)動(dòng)的可測(cè)定載體滴度的新霉素抗性基因。目的基因最初克隆為具有NotI和SalI突出端的PCR產(chǎn)物。擴(kuò)增片段經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn)證后，通過將相應(yīng)片段克隆至pGlXsvNa(GeneTherapyInc.)中而插入逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pREX中，接著切除該質(zhì)粒的KpnI片段，并與線性化的(KpnI消化的')pRV109質(zhì)粒連接得到相應(yīng)的HIT/pREX載體。圖IIA展示pC-REX質(zhì)粒的限制酶切圖譜。質(zhì)粒來源于GlXSvNa(GeneticTherapy,Inc.),CMV即啟動(dòng)子增強(qiáng)子克隆至位于5'LTR上游的獨(dú)特SacII位點(diǎn)中。編碼診斷性或治療性多肽的異源核酸序列(HS)可包含在NotI和SalI限制性酶切位點(diǎn)之間。neo基因由具有嵌套o(hù)ri的SV40e.p.驅(qū)動(dòng)。所得pC-REX質(zhì)粒設(shè)計(jì)用于在293T細(xì)胞中制備高滴度載體。圖11B展示pdnGl/C-REX質(zhì)粒的限制酶切圖譜。該質(zhì)粒與圖11A所示的pC-REX質(zhì)?；鞠嗤煌幵谟谒芯幋a209個(gè)氨基酸(630bp)的顯性陰性突變dnGl的核酸序列(472-1098核苷酸；41-249氨基酸；登錄號(hào)U47413),該序列通過PCR制備而包含了Notl和Sail突出端。圖11C展示pdnGl/C-REX的限制性酶切結(jié)果。圖12A展示Bvl/pCAEP質(zhì)粒的限制酶切圖譜。CAEP(P二PstI)的制備是在靠近CAE雙嗜性包膜蛋白(4070A)N末端處、在成熟gp70多肽的氨基酸6和7之間加入獨(dú)特PstI位點(diǎn)。Bvl為來源于vWF的膠原結(jié)合十肽，側(cè)翼為關(guān)鍵連接體，并且作為符合閱讀框的編碼序列插入PCAEP的Pst1位點(diǎn)。圖12B展示Bvl/pCAEP的限制性酶切結(jié)果。圖13A展示pCgpn質(zhì)粒的限制酶切圖譜。該質(zhì)粒編碼由CMV立即早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)的MoMuLvgag-pol。側(cè)翼為EcoRI克隆位點(diǎn)的gag-pol編碼序列來源于3P0克隆，作為pGag-pol-gpt(Moarkowitz等人,1988)。載體骨架為pcDNA3.1+(Invitrogen)。來源于牛生長激素的聚腺苷酸化信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止序列可增強(qiáng)RNA穩(wěn)定性。SV40復(fù)制起點(diǎn)連同e.p.用f在表達(dá)SV40大T抗原的細(xì)胞系中進(jìn)行游離型復(fù)制。圖13B展示pCgpn的限制性酶切結(jié)果。圖14展示新型pC-REXII(即EPEIUS-REX)質(zhì)粒的圖語。圖15展示插入治療性細(xì)胞因子基因IL-2的新型pC-REXII(即EPEIUS-REX)質(zhì)粒的圖語。圖16展示插入治療性細(xì)胞因子基因GM-CSF的新型pC-REXII(即EPEIUS-REX)質(zhì)粒的圖譜。圖17A-G展示一系列利用pC-REXII的MCS位點(diǎn)靠近HStk(報(bào)告)基因的輔助啟動(dòng)子。圖17H展示在肺瘤細(xì)胞中不同基因從圖17A-G所示輔助啟動(dòng)子開始表達(dá)的Westernblot結(jié)果。圖18表示來自pIRES的CMV啟動(dòng)子序列的核酸序列。圖19A展示制備靶向載體的閉環(huán)多管系統(tǒng)。圖19B提供關(guān)于閉環(huán)多管系統(tǒng)部件的信息。圖20A展示新型pB-RVE質(zhì)粒的圖譜，pB-RVE是一種增強(qiáng)的CMV表達(dá)質(zhì)粒，帶有靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包膜構(gòu)建體(Epeius-BVl):最小的雙嗜性env(4070A),其通過在成熟蛋白質(zhì)(CAE-P)N末端附近加入獨(dú)特限制酶切位點(diǎn)加以修飾；經(jīng)基因工程改造而展現(xiàn)出膠原結(jié)合基序(GHVGWREPSFMALSAA);并經(jīng)PCR再生以去除所有上游(5')和下游(3')的病毒序列。除了SV40啟動(dòng)子/增強(qiáng)子以外，質(zhì)粒骨架(phCMVl)還提供優(yōu)化的CMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子/內(nèi)含子以驅(qū)動(dòng)表達(dá)，使得能在表達(dá)SV40大T抗原的載體生產(chǎn)細(xì)胞(293T)中進(jìn)行游離型復(fù)制。通過卡那霉素抗性基因提供陽性篩選。圖20B展示pB-RVE的限制性酶切結(jié)果。圖21A展示新型pdnGl/UBER-REX質(zhì)粒的圖語。該質(zhì)粒編碼209氨基酸(630bp)的顯性陰性突變dnGl(472-1098核苷酸；41-249氨基酸；登錄號(hào)U47413)。該質(zhì)粒來源于GlXSvNa(GTI)，CMV即啟動(dòng)子增強(qiáng)子在5'LTR上游的獨(dú)特SacII位點(diǎn)處克隆至該質(zhì)粒中。去除487bp殘留gag序列以降低RCR的可能性，并在dnGl上游加入97bp剪接受體位點(diǎn)(ESA)。dnGl編碼序歹U(核苷酸472-1098加終止密碼子=1101)經(jīng)PCR制備，包含NotI和SalI突出端。neo基因由具有嵌套o(hù)ri的SV40e.p.驅(qū)動(dòng)。pdnGl/UBER-REX質(zhì)粒被設(shè)計(jì)用于在293T細(xì)胞中產(chǎn)生高滴度的載體。圖21B展示pdnGl/UBER-REX的限制性酶切結(jié)果。圖22A展示野生型莫洛尼小鼠白血病病毒(MoMLV)包膜剪接受體位點(diǎn)(ESA)的圖譜。圖22B展示pUBER-REX的包膜剪接受體位點(diǎn)(ESA)的圖譜。圖23A表示C-REX質(zhì)粒的圖示。圖23B表示UBER-REX質(zhì)粒的圖示。圖24表明從IV期胰腺癌患者(A3號(hào)患者)的手術(shù)切除肝切片觀察，靜脈注射Rexin-GTM誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)移性腫瘤節(jié)結(jié)的壞死和纖維化。(A)代表性的肝活檢腫瘤節(jié)結(jié)組織切片的蘇木精伊紅染色圖；t^腫瘤細(xì)胞；n=壞死；f二纖維化。(B)相同胂瘤節(jié)結(jié)組織切片的三色染色圖。藍(lán)色染色物質(zhì)表明纖維化區(qū)域中存在膠原蛋白。圖25表明從胰腺癌患者(A3號(hào)患者)的結(jié)果看出，靜脈注射26Rexin-GTM誘導(dǎo)了在轉(zhuǎn)移性腫瘤節(jié)結(jié)中出現(xiàn)明顯細(xì)胞凋亡。(A-D)代表性的免疫染色的肝活檢腫瘤節(jié)結(jié)組織切片，表明出現(xiàn)可見的Tunel陽性凋亡細(xì)胞核(褐色染色物質(zhì))。圖26顯示從經(jīng)Rexin-GTM治療的胰腺癌患者(A3號(hào)患者)切除的轉(zhuǎn)移腫瘤節(jié)結(jié)中腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)的免疫組織化學(xué)特征。肝活檢中殘留腫瘤節(jié)結(jié)的典型組織切片顯示明顯的TIL浸潤伴有免疫反應(yīng)性T和B細(xì)胞的功能性補(bǔ)體。從左上方按順時(shí)針方向依次為輔助T細(xì)胞(cd4+)、殺傷性T細(xì)胞(cd8+)、B細(xì)胞(cd20+)、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞(cd45+)、樹突狀細(xì)胞(cd35+)和自然殺傷細(xì)胞(cd56+)。注意出現(xiàn)(即遷移)在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫和體液免疫情形中具有功能的TIL結(jié)構(gòu)，提示在免疫活性宿主中具備癌癥免疫的可能性。圖27表明靜脈注射Rexin-GTM誘導(dǎo)了惡性黑素瘤患者(B4號(hào)患者)的癌淋巴結(jié)中出現(xiàn)壞死、凋亡和纖維化。(A)腹股溝淋巴結(jié)組織切片的H&E染色顯示廣泛的癌細(xì)胞壞死(n)、凋亡(箭頭指示)和纖維化(f),四周邊緣為活腫瘤細(xì)胞(t);(B)A切片的高倍放大(100x)顯示具有固縮或破碎的細(xì)胞核的小細(xì)胞，表明大量細(xì)胞正在發(fā)生凋亡；(C)A切片的高倍放大(lOOx)顯示金黃色的充滿含鐵血黃素的巨噬細(xì)胞；(D)代表性的腹股溝淋巴結(jié)組織切片顯示明顯的免疫反應(yīng)性CD35+樹突狀細(xì)胞、(E)CD68十巨噬細(xì)胞和(F)CD8+殺傷性T細(xì)胞的浸洞。圖28顯示喉鱗狀細(xì)胞癌患者(B6號(hào)患者)出現(xiàn)腫瘤退縮的跡象。在Rexin-GTM治療前(上圖)、后(下圖)取得頸部MRI影像。對(duì)一系列上呼吸道切片直徑的測(cè)定顯示，與治療前獲得的切片相比，重復(fù)輸注Rexin-GTM后上呼吸道的直徑顯著增大(約300%)(白色箭頭所示)。呼吸道暢通的增加與周圍肺瘤塊的消退和發(fā)聲能力的恢復(fù)相符。圖29顯示在具有大塊腫瘤負(fù)荷的胰腺癌患者(C1號(hào)患者)中觀察到的RexinGTM輸注對(duì)轉(zhuǎn)移性肝損傷的數(shù)量和性質(zhì)的影響。在用計(jì)算(等價(jià)計(jì)算(Calculusofparity))的劑量輸注Rexin-GTM進(jìn)行治療前(A)和治療后(B)取得腹部MRI。注意在圖像左上四分之一中有大量小的致密腫瘤節(jié)結(jié)完全消除(括號(hào)括出)，以及已建立的肝節(jié)結(jié)出現(xiàn)嚢樣轉(zhuǎn)變(黑色箭頭指示)。此后吸取增大的肝嚢腫(白色箭頭指示)進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢測(cè)證實(shí)治療后吸取物中的癌細(xì)胞完全消失。圖30展示化療難治性骨肉瘤患者的連續(xù)CT-PET影像。治療后1個(gè)月病變部位的，DG攝取減少以及治療后2個(gè)月病變部位的鈣化增加證明了Rexin-G的抗肺瘤活性。圖31表明經(jīng)Rexin-G治療的化療難治性轉(zhuǎn)移骨肉瘤患者的腫瘤發(fā)展速度降低，其證據(jù)是在第二輪治療周期之后沒有出現(xiàn)新的病變。圖32表明經(jīng)Rexin-G治療的化療難治性轉(zhuǎn)移骨肉瘤患者目標(biāo)病變部位的，DG攝取最大SUV值呈進(jìn)行性降低。圖33表明經(jīng)Rexin-G治療的化療難治性轉(zhuǎn)移骨肉瘤患者的癌性病變部位釣化增加，其證據(jù)是亨斯菲爾德(Hounsfield)單位增加。圖34顯示難治性IV期胰腺癌患者的原發(fā)胰腺胂瘤中的廣泛細(xì)胞壞死和局部GM-CSF產(chǎn)生。(A)原發(fā)胰腺腫瘤的組織切片的H&E染色表明癌細(xì)胞廣泛(約95。/。)壞死(n),伴有部分反應(yīng)性纖維化(f),周圍可見活腫瘤細(xì)胞的退化(deg)邊緣和細(xì)胞器結(jié)構(gòu)。(B&C)(A)中所見切片的纖維化、壞死和退化區(qū)域的高倍放大圖。(D)GM-CSF轉(zhuǎn)基因的免疫染色證實(shí)有小簇免疫反應(yīng)性分泌GM-CSF的腫瘤細(xì)胞(箭頭所示)保留在這個(gè)不能手術(shù)治療的原發(fā)腫瘤中。(E)D的高倍放大顯示殘留的活腫瘤細(xì)胞中的免疫反應(yīng)性GM-CSF蛋白(深染色物質(zhì)指示)；(F)對(duì)明顯免疫浸潤區(qū)域的近距離檢查表明在壞死的腫瘤細(xì)胞(箭頭所示)中和在伴有單核細(xì)胞浸潤(im)的腫瘤細(xì)胞碎片的片段中存在GM-CSF陽性。發(fā)明詳述本文展示和說明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)清楚這些實(shí)施方式僅作為實(shí)例提供。在不背離本發(fā)明的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)想到大量變更、改進(jìn)和替換。應(yīng)理解可應(yīng)用本文所述的本發(fā)明實(shí)施方式的各種備選方案來實(shí)施本發(fā)明。后面的權(quán)利要求限定了本發(fā)明的范圍，從而覆蓋了這些權(quán)利要求范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)及其等同方案。靶向遞送系統(tǒng)在體內(nèi)將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或任何其他的病毒或非病毒載體、蛋白質(zhì)或藥物選擇性地高效靶向至病理性區(qū)域(即親病灶性耙向)，使得優(yōu)先遞送基因至血管(Hall等人，HumGeneTher,8:2183-92,1997;Hall等人，HumGeneTher,11:983-93，2000)或癌性病變部位(Gordon等人，HumGeneTher12:193-204,2001;Gordon等人，Cm.ielDT,DouglasJT,eds.7brgW"g5Vrafeg7.es/or77zera/ew//cZ)e/zVer乂NewYork,NY:Wiley-Liss,Inc.293-320,2002)、血管發(fā)生活躍區(qū)域和組織損傷或炎癥區(qū)域。定義.除非另作定義，否則本文使用的所有科技術(shù)語的意義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員通常理解的相同。除非另外注明，否則本公開內(nèi)容通篇涉及到的所有專利、專利申請(qǐng)、公開申請(qǐng)和出版物、Genbank序列、互聯(lián)網(wǎng)站點(diǎn)和其他公開材料的全部?jī)?nèi)容均以51用方式并入本文。如果本文的術(shù)語有多個(gè)定義，則取其在本節(jié)中的定義。如果提到的是URL或其他類似標(biāo)識(shí)符或地址，應(yīng)理解這類標(biāo)識(shí)符可能改變，并且互聯(lián)網(wǎng)上的特定信息會(huì)時(shí)有時(shí)無，然而其等效信息應(yīng)能通過互聯(lián)網(wǎng)搜索而查到。其參考表明了這類信息的可獲得性及公眾傳播性。本文使用的"核酸"是指含有至少兩個(gè)經(jīng)共價(jià)鍵連接的核苷酸或核苷酸類似物亞單位的多核苷酸。核酸可為脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或者DNA或RNA類似物。核苷酸類似物可作為商品獲得，制備含有這些核苷酸類似物的多核苷酸的方法為已知方法(Lin等人(1994)Nucl.AcidsRes.22:5220-5234;Jellinek等人(1995)Biochemistry34:11363-11372;Pagratis等人(1997)NatureBiotechnol.15:68-73)。核酸可為單鏈、雙鏈或它們的混合物。對(duì)于本文來說，除非有其他特殊說明，核酸是雙鏈的，或者能從上下文中明確獲知。本文使用的DNA意欲包括所有類型和大小的DNA分子，包括cDNA、質(zhì)粒和包括修飾核苷酸和核苷酸類似物的DNA。本文使用的核苷酸包括核苷的單、二和三磷酸鹽。核苷酸還包括修飾核苷酸，例如但不限于硫代磷酸核苷酸和脫氮噤呤核苦酸及其他核香酸類似物。本文使用的術(shù)語"受試對(duì)象"是指可向其引入大DNA分子的動(dòng)物、植物、昆蟲和鳥類。包括高等生物，例如哺乳動(dòng)物和鳥類，包括人、靈長類、嚙齒類、牛、豬、兔、山羊、綿羊、小鼠、大鼠、豚鼠、貓、狗、馬和雞等。本文使用的"向受試對(duì)象施用"是向受試對(duì)象同時(shí)或分別s1入或施用一種或多種遞送藥劑和/或大核酸分子的操作，以使存在于受試對(duì)象體內(nèi)的靶細(xì)胞最終能與所述藥劑和/或大核酸分子接觸。本文使用的"耙向遞送載體"或"靶向遞送媒介物"是指攜帶外源核酸分子并將其轉(zhuǎn)運(yùn)至靶細(xì)胞或靶組織的病毒和非病毒顆粒。病毒載體包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒。非病毒載體包括但不限于微粒、納米顆粒、病毒體和脂質(zhì)體。本文使用的"靶向"是指利用與遞送載體結(jié)合的配體將載體導(dǎo)向至細(xì)胞或組織。配體包括但不限于抗體、受體和膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本文使用的"遞送，，可與"轉(zhuǎn)導(dǎo)"交換使用，是指將外源核酸分子轉(zhuǎn)移至細(xì)胞以使其位于細(xì)胞內(nèi)部的過程。核酸遞送是不同于核酸表達(dá)的一個(gè)過程。本文使用的"多克隆位點(diǎn)(MCS)"是質(zhì)粒中含有多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)的核酸區(qū)域，每個(gè)位點(diǎn)都可與標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)結(jié)合使用，以消化該載體。"限制性酶切"是指用僅在核酸分子的特定部位處起作用的酶催化切割核酸分子。許多限制性酶都可作為商品獲得。本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍掌握這些酶的使用。通常，用在MCS內(nèi)酶切的限制性酶將載體線性化或片段化，使得外源序列能夠與該載體連接。本文使用的"復(fù)制起點(diǎn)"(常稱作"ori")是一段特殊的核酸序列，復(fù)制從此處起始?？蛇x地，如果宿主細(xì)胞為酵母，則可使用自主復(fù)制序列(ARS)。本文使用的"選擇性標(biāo)記或可篩選標(biāo)記"將可被鑒別的變化賦予細(xì)胞，從而允許容易地鑒別出含有表達(dá)載體的細(xì)胞。通常，選擇性標(biāo)記提供允許進(jìn)行選擇的特性。陽性選擇性標(biāo)記是當(dāng)標(biāo)記存在時(shí)允許其選擇，而陰性選擇性標(biāo)記是當(dāng)標(biāo)記存在時(shí)阻止其選擇。陽性選擇性標(biāo)記的實(shí)例是抗藥性標(biāo)記。通常包含藥物選擇標(biāo)記有助于轉(zhuǎn)化體的克隆和鑒定，例如，提供新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和組氨醇抗性的基因是記以外，也考慮其他類型的標(biāo)記，包括可篩選的標(biāo)記如GFP，其基礎(chǔ)是量熱分析?；蛘撸梢允褂每珊Y選的酶，例如單純皰滲病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還清楚如何使用免疫標(biāo)記，可能需與FACS分析結(jié)合使用。據(jù)認(rèn)為使用的標(biāo)記并不重要，只要能夠與編碼基因產(chǎn)物的核酸同時(shí)表達(dá)即可。更多的選擇性標(biāo)記和可篩選標(biāo)記的實(shí)例為本領(lǐng)域4支術(shù)人員所熟知。術(shù)語"轉(zhuǎn)染"用于表示細(xì)胞吸收外來DNA。當(dāng)外源DNA被引入細(xì)胞膜內(nèi)部時(shí)，該細(xì)胞即被"轉(zhuǎn)染"了。許多轉(zhuǎn)染技術(shù)為本領(lǐng)域所公知。參見，例如Graham等人，Virology52:456(1973);Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual(1989);Davis等人,BasicMethodsinMolecularBiology(1986);Chu等人，Gene13:197(1981)。該技術(shù)可被用于向適合的宿主細(xì)胞中引進(jìn)一個(gè)或多個(gè)外源DNA部分，例如核苷酸整合載體和其他核酸分子。該術(shù)語嚢括化學(xué)的、電學(xué)的和病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染操作。本文使用的"表達(dá)"是指核酸被翻譯為肽或轉(zhuǎn)錄為RNA的過程，例如可被翻譯為肽、多肽或蛋白質(zhì)。如果核酸來源于基因組DNA,則在選擇了合適的真核宿主細(xì)胞或生物的情形下，表達(dá)可包括mRNA剪接。對(duì)于要在宿主細(xì)胞中表達(dá)的異源核酸，它必須首先被運(yùn)送至細(xì)力包中，一旦進(jìn)入細(xì)胞將最終存在于細(xì)胞核中。本文使用的"應(yīng)用于受試對(duì)象"是存在于受試對(duì)象體內(nèi)的靶細(xì)胞最終接觸能量例如超聲波或電能的過程?？赏ㄟ^任意施加能量的過程進(jìn)行應(yīng)用。術(shù)語"宿主細(xì)胞，，表示，例如微生物、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，它們能夠用作或已被用作多重構(gòu)建體的受者以生產(chǎn)輩巴向遞送載體。該術(shù)語包括已被轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞的后代。因此，本文使用的"宿主細(xì)胞"主要是指已用外源DNA序列轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。應(yīng)理解由于天然的、偶然的或有意的突變，單親本細(xì)胞的后代在形態(tài)學(xué)上或其基因組或總DNA補(bǔ)體上不一定與原始親本完全相同。本文使用的"基因治療"涉及將異源DNA轉(zhuǎn)移至患有治療或診斷針對(duì)的病癥或疾病的哺乳動(dòng)物特別是人的部分細(xì)月包、輩巴細(xì)月包。將DNA以某種方式引入所選的靶細(xì)胞中，使得異源DNA表達(dá)，因而產(chǎn)生其編碼的治療性產(chǎn)物。可選地，異源DNA可以以某種方式介導(dǎo)編碼治療性產(chǎn)物的DNA的表達(dá)，它可編碼一種產(chǎn)物，例如肽或RNA,該產(chǎn)物以某種方式直接或間接地介導(dǎo)治療性產(chǎn)物的表達(dá)?；蛑委熞部捎糜谶\(yùn)送編碼基因產(chǎn)物的核酸替換有缺陷的基因或補(bǔ)充由被引入的哺乳動(dòng)物或細(xì)胞產(chǎn)生的基因產(chǎn)物。被引入的核酸可編碼治療性化合物，例如生長因子或其抑制劑，或者腫瘤壞死因子或其抑制劑，如它的受體，正常情況下這些化合物在哺乳動(dòng)物宿主體內(nèi)不產(chǎn)生，或者不能以治療性有效量產(chǎn)生，或不在治療有用的時(shí)間產(chǎn)生。編碼治療性產(chǎn)物的異源DNA可在引入患病宿主的細(xì)胞之前進(jìn)行修飾，以增強(qiáng)或者改變產(chǎn)物或其表達(dá)。本文使用的"異源核酸序列"通常是指這樣的DNA,該DNA編碼通常不能由表達(dá)它們的細(xì)胞在體內(nèi)產(chǎn)生的RNA和蛋白質(zhì)，或者介導(dǎo)或編碼通過影響轉(zhuǎn)錄、翻譯或其他可調(diào)節(jié)的生化過程而改變內(nèi)源DNA表達(dá)的介質(zhì)。異源核酸序列還可稱為外來DNA。本文的異源DNA包括本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為其相對(duì)于表達(dá)該DNA的細(xì)胞為異源或外源的任何DNA。異源DNA的實(shí)例包括但不限于編碼可示蹤標(biāo)記蛋白質(zhì)如提供抗藥性的蛋白質(zhì)的DNA、編碼治療有效性物質(zhì)如抗癌藥、酶和激素的DNA、和編碼其他類型蛋白質(zhì)如抗體的DNA。由異源DNA編碼的抗體可由異源DNA所導(dǎo)入的細(xì)胞分泌或在其表面上表達(dá)。質(zhì)粒本文披露的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染和制備靶向遞送載體供治療和診斷過程使用。一般而言，該質(zhì)粒提供編碼本文披露的靶向載體的病毒或非病毒元件的核酸序列。該質(zhì)粒包括編碼例如經(jīng)修飾包含膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的4070A雙嗜性包膜蛋白的核酸序列。其他質(zhì)粒可包括與啟動(dòng)子有效連接的核酸序列。該序列通常編碼病毒gag-pol多肽。質(zhì)粒還包括與啟動(dòng)子有效連接的核酸序列，以及編碼給生產(chǎn)細(xì)胞提供抗藥性的多肽的序列。也包括復(fù)制起點(diǎn)。其他質(zhì)粒可包括編碼診斷性或治療性多肽的異源核酸序列、5'和3'長末端重復(fù)序列；\]/逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝序列、位于5'LTR上游的CMV啟動(dòng)子、與啟動(dòng)子有效連接的核酸序列和SV40復(fù)制起點(diǎn)。異源核酸序列通常編碼診斷性或治療性多肽。在特定實(shí)施方式中，治療性多肽或蛋白質(zhì)是一種"自殺蛋白"，可通過其自身或在其他化合物存在下引起細(xì)胞死亡。這種自殺蛋白的一個(gè)代表性實(shí)例是單純皰滲病毒胸香激酶。其他實(shí)例包括水痘-帶狀皰滲病毒胸普激酶、細(xì)菌基因胞嘧啶脫氨酶(將5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為高毒性化合物5-氟尿嘧啶)、p450氧化還原酶、羧肽酶G2、(3-葡糖醛酸糖苷酶、青霉素-V-酰胺酶、青霉素-G-酰胺酶、p-內(nèi)酰胺酶、硝基還原酶、羧肽酶A、亞麻苦苷酶(也稱作卩-葡萄糖苷酶)、大腸桿菌gpt基因和大腸桿菌Deo基因，但是其他實(shí)例也是本領(lǐng)域所公知的。在部分實(shí)施方式中，自殺蛋白將前藥轉(zhuǎn)化為毒性化合物。本文使用的"前藥，，意指在本發(fā)明方法中有用的、能被轉(zhuǎn)化為毒性產(chǎn)物(即對(duì)腫瘤細(xì)胞具有毒性)的任意化合物。前藥被自殺蛋白轉(zhuǎn)化為毒性產(chǎn)物。該前藥的代表性實(shí)例包括針對(duì)胸苷激酶的更昔洛韋、阿昔洛韋和FIAU(1-(2-脫氧-2-氟-P-D-阿糖呋喃糖基)-S-碘尿嘧啶)；針對(duì)氧化還原酶的異環(huán)磷酰胺；針對(duì)VZV-TK的6-曱氧嘌呤阿糖胞苷；針對(duì)胞嘧啶脫氨酶的5-氟胞嘧啶；針對(duì)(3-葡糖醛酸糖苷酶的多柔比星；針對(duì)硝基還原酶的CB1954和呋喃西林；和針對(duì)羧肽酶A的N-(氰基乙?；?-L-苯丙氨酸或N-(3-氯丙酰基)-L-苯丙氨酸。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易地進(jìn)行前藥給藥。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還能容易地確定前藥的最佳給藥劑量和途徑。在部分實(shí)施方式中，治療性蛋白質(zhì)或多肽是癌癥抑制劑，例如p53或Rb,或編碼該蛋白質(zhì)或多肽的核酸。當(dāng)然，技術(shù)人員了解大批這樣的癌癥抑制劑，并且知道如何獲得它們和/或其編碼核酸。治療性蛋白質(zhì)或多肽的其他實(shí)例包括促凋亡的治療性蛋白質(zhì)和多肽，例如pl5、pl6或p21戰(zhàn)F—1。細(xì)胞因子和編碼它的核酸也可用作治療性蛋白質(zhì)和多肽。其實(shí)例包括GM-CSF(粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子)；TNF-a(胂瘤壞死因子a);干擾素，包括但不限于IFN-a和IFN-y;以及白介素，包括但不限于白介素l(ILl)、白介素P(IL-P)、白介素2(IL2)、白介素4(IL4)、白介素5(IL5)、白介素6(IL6)、白介素8(IL8)、白介素10(ILIO)、白介素12(IL12)、白介素13(IL13)、白介素14(IL14)、白介素15(IL15)、白介素16(IU6)、白介素18(IL18)、白介素23(IL23)、白介素24(IL24)，但是本領(lǐng)域中也了解其他實(shí)施方案。殺細(xì)胞基因的其他實(shí)例包括但不限于突變細(xì)胞周期蛋白Gl基因。舉例來說，殺細(xì)胞基因可以是細(xì)胞周期蛋白Gl的顯性陰性突變體(如WO/01/64870所述)。在以前，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(RV)構(gòu)建體一般是通過將兩個(gè)獨(dú)立的逆轉(zhuǎn)錄病毒(RV)質(zhì)?？寺〔⑷诤隙苽涞囊粋€(gè)包含逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR、包裝序列和相應(yīng)的目的基因；另一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包含強(qiáng)啟動(dòng)子(如CMV)以及一組外來的功能性序列。本文披露的pC-REXII(e-REX)載體是指一種改良質(zhì)粒，其包含在原始質(zhì)粒中插入的一組獨(dú)特克隆位點(diǎn)，以促進(jìn)試驗(yàn)基因的定向克隆。在質(zhì)粒骨架中使用強(qiáng)啟動(dòng)子(如CMV)，以增加在受者生產(chǎn)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的信使RNA的量，但其自身不被包裝到逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中，而是位于基因側(cè)翼的逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR之外。因此，改良質(zhì)粒:沒計(jì)為將強(qiáng)CMV啟動(dòng)子(通過PCR獲得)包括在GlxSvNa載體(該載體以前被FDA批準(zhǔn)用于人體)中的關(guān)4建部位內(nèi)，從而消除了對(duì)已報(bào)道的載體的質(zhì)粒大小和序列方面的擔(dān)心。該改良構(gòu)建體被命名為pC-REX。PC-REX再經(jīng)進(jìn)一步修飾，引入一系列獨(dú)特克隆位點(diǎn)(見圖14,pC-REXII中的MCS),以^便能夠定向克隆和/或插入多基因及輔助功能性結(jié)構(gòu)域。因此，新質(zhì)粒被命名為pC-REX和pC-REXII(EPEIUS-REX或eREX)。pC-REX質(zhì)粒設(shè)計(jì)(見圖11A)在直接并列對(duì)比中勝過pHIT-l12/pREX。新質(zhì)粒還經(jīng)進(jìn)一步^f'務(wù)飾以包括各種治療活性多肽的編碼序列。在一個(gè)實(shí)施例中，包含顯性陰性細(xì)胞周期蛋白Gl(dnGl)(見圖IIB)作為治療基因。三重病毒顆粒(env、gag-pol和dnGl載體構(gòu)建體)在臨床試驗(yàn)的公開報(bào)道中統(tǒng)稱為REXIN-GTM。REXIN-G表示已^皮包裝、包殼和包膜在可注射靶向病毒顆粒中的耙向遞送載體dnGl/C-REX。有復(fù)制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒不太可能出現(xiàn)在瞬時(shí)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，例如用于Rexin-G制備的系統(tǒng)中，因?yàn)槭笤茨孓D(zhuǎn)錄病毒包膜構(gòu)建體、包裝構(gòu)建體gagpol和逆轉(zhuǎn)錄載體是在獨(dú)立的質(zhì)粒中表達(dá)，各由自身的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。此外，人生產(chǎn)細(xì)胞也被用于生產(chǎn)病毒體。人細(xì)胞不含能與Rexin-G中使用的鼠源逆轉(zhuǎn)錄載體重組的內(nèi)源性鼠序列。近期對(duì)REX1N-G制備做了一些改進(jìn)，目的是進(jìn)一步減少產(chǎn)生有復(fù)制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒的可能性。質(zhì)粒dnGl/C-REX包含殘留的gag-pol序列，這些序列可能與各gag-pol構(gòu)建體中含有的5'DNA序列重疊。因此，從親本dnGl/C-REX質(zhì)粒中去除487個(gè)堿基對(duì)，再插入97個(gè)堿基對(duì)的剪接受體位點(diǎn)，得到pdnGl/UBER-REX(圖21A)。本文披露的質(zhì)粒中包括靶向配體。通常，該配體被插入由質(zhì)粒核酸序列編碼的逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜的天然(即未修飾的)受體結(jié)合區(qū)域的兩個(gè)連續(xù)編號(hào)氨基酸殘基之間，例如修飾的雙嗜性CAE包膜多肽中，其中輩巴向多肽被插入氨基酸殘基6和7之間。該多肽是被稱作gp70的蛋白質(zhì)的一部分，后者包含于莫洛尼鼠白血病病毒的雙嗜性包膜中。一般而言，耙向多肽包括結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)成分的結(jié)合部位，該成分包括但不限于膠原(包括I型膠原和IV型膠原)、層粘連蛋白、纖連蛋白、彈性蛋白、糖胺聚糖、蛋白聚糖及結(jié)合纖連蛋白的序列，如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸或RGD序列?？砂诎邢蚨嚯闹械慕Y(jié)合區(qū)域包括但不限于屬于馮維勒布蘭德因子及其衍生物內(nèi)的功能性結(jié)構(gòu)域的多肽結(jié)構(gòu)域，其中該多肽結(jié)構(gòu)域可與膠原結(jié)合。在一種實(shí)施方式中，該結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榫哂幸韵陆Y(jié)構(gòu)式的多肽Trp-Arg-Glu-Pro-Ser-Phe-Met-Ala-Leu-Ser。制備靶向載體的方法本公開內(nèi)容涉及病毒和非病毒載體顆粒的制備，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒、腺病毒載體顆粒、腺相關(guān)病毒載體顆粒、皰滲病毒載體顆粒、假型病毒，以及具有修飾的或靶向的病毒表面蛋白的非病毒載體，例如靶向病毒包膜多肽，其中該修飾病毒表面蛋白，如修飾病毒包膜多肽，包括靶向多肽，該多肽包含結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)成分如膠原的結(jié)合區(qū)域。輩巴向多肽可被置于病毒表面蛋白的兩個(gè)連續(xù)氨基酸殘基之間，或者可以替換已從病毒表面蛋白中去除的氨基酸殘基。進(jìn)行基因治療的最常用的遞送系統(tǒng)之一包括病毒載體，最為常用的是腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體?；诓《镜妮d體的例子包括但不限于重組逆轉(zhuǎn)錄病毒(參見，例如WO90/07936;WO94/03622;WO93/25698;WO93/25234;美國專利No.5,219,740;WO93/11230;WQ93/10218;美國專利No.4,777,127;英國專利No.2,200,651;EP0345242;和WO91/02805)、基于a病毒的載體(例如辛德畢斯病毒載體、塞姆利基森林病毒(ATCCVR-67;ATCCVR-1247)、羅斯河病毒(ATCCVR-373;ATCCVR-1246)和委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(ATCCVR-923;ATCCVR-1250;ATCCVR1249;ATCCVR-532))和腺相關(guān)病毒(AAV)載體(參見，例如WO94/12649,WO93/03769;WO93/19191;WO94/28938;WO95/11984和WO95/00655)。還可4吏用Curiel,Hum.GeneTher.(1992)3:147中描述的與殺死的腺病毒相連的DNA。為達(dá)到基因遞送目的，病毒顆?？捎商烊会槍?duì)靶細(xì)胞的病毒或非天然針對(duì)靶細(xì)胞的病毒發(fā)展而來。通常，與天然病毒載體相比，更希望采用非天然病毒載體。盡管天然病毒載體可能具有對(duì)靶細(xì)胞的天然親和力，然而由于其更有可能在靶細(xì)胞中增殖，因此這種病毒會(huì)帶來較大風(fēng)險(xiǎn)。在這點(diǎn)上，并非天然設(shè)計(jì)為在人細(xì)胞中增殖的動(dòng)物病毒載體可用于針對(duì)人細(xì)胞進(jìn)行基因遞送。然而為了獲得足夠產(chǎn)量的這種動(dòng)物病毒載體用于基因遞送，需要在天然的動(dòng)物包裝細(xì)胞中進(jìn)行生產(chǎn)。這樣產(chǎn)生的病毒載體常常缺乏任何作為包膜部分或衣殼部分的成分，這些成分能提供對(duì)人細(xì)胞的趨向性。例如，非人類病毒載體，如親嗜性小鼠(鼠)逆轉(zhuǎn)錄病毒，像MMLV，當(dāng)前是在小鼠包裝細(xì)胞系中制備的。必須提供另一36種人細(xì)胞趨向性所需的成分。一般而言，病毒載體的增殖(無輔助病毒)在包裝細(xì)胞中進(jìn)行，其中包裝成分的核酸序列被穩(wěn)定整合到細(xì)胞基因組中，編碼病毒核酸的核酸也被引入該細(xì)胞系中。現(xiàn)有的包裝系生產(chǎn)的生產(chǎn)克隆滴度足夠轉(zhuǎn)導(dǎo)人細(xì)胞供基因治療應(yīng)用，并已開始進(jìn)行人體臨床試驗(yàn)。然而這些包裝系仍有兩方面的不足。首先，設(shè)計(jì)用于特定用途的合適的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體需要構(gòu)建并試驗(yàn)數(shù)個(gè)載體配置。例如，Belmont等人Molec.andCell.Biol.8(12):5116-5125(1988),為了鑒定既能夠產(chǎn)生最高滴度生產(chǎn)細(xì)胞又能夠獲得最佳表達(dá)的載體，由16個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建了穩(wěn)定的生產(chǎn)細(xì)胞系。部分檢驗(yàn)過的配置包括(1)LTR驅(qū)動(dòng)的表達(dá)對(duì)比內(nèi)部啟動(dòng)子；(2)選4奪來源于病毒或細(xì)胞基因的內(nèi)部啟動(dòng)子；和(3)選擇性標(biāo)記是否被整合到構(gòu)建體中。提供快速高滴度病毒生產(chǎn)而不需生產(chǎn)穩(wěn)定生產(chǎn)細(xì)胞系的包裝系統(tǒng)將具有明顯優(yōu)勢(shì)，因?yàn)檫@可節(jié)省鑒定來源于多個(gè)構(gòu)建體的高滴度生產(chǎn)細(xì)胞克隆所需的大約兩個(gè)月的時(shí)間。其次，與NIH3T3細(xì)胞相比，高滴度雙嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)載體對(duì)原代培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞的感染效率變化很大。已經(jīng)證實(shí)小鼠肌原細(xì)胞(Dhawan等人，Science254:1509-1512(1991)或大鼠毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(Yao等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8101-8105(1991))與NIH3T3細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率大致相當(dāng)，而犬肝細(xì)胞(Armentano等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6141-6145(199))的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率卻僅為NIH3T3纟田月包的25%。相比NIH3T3細(xì)胞，從外周血淋巴細(xì)胞分離得到的原代人腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞("TIL，，)、人〔04+和〔08+T細(xì)胞以及靈長類長期重建造血干細(xì)胞代表了低轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的極端實(shí)例。曾報(bào)道純化的人CD4+和CD8+T細(xì)胞有時(shí)被穩(wěn)定生產(chǎn)克隆上清液感染的水平為6%-9%(Morecki等人，CancerImmunol.Immunother.32:342-352(1991))。如果逆轉(zhuǎn)錄病毒載體含有neoR基因，經(jīng)G418選擇可得到高度富集的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群。然而發(fā)現(xiàn)選擇性標(biāo)記的表達(dá)對(duì)體內(nèi)造血干細(xì)胞中的長期基因表達(dá)具有不利作用(Apperly等人Blood78:310-317(1991))。為克服這些局限性，提供了用于新型瞬時(shí)轉(zhuǎn)染包裝系統(tǒng)的方法和組合物。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的設(shè)計(jì)改良使得能夠(l)代替現(xiàn)有技術(shù)下繁雜的質(zhì)粒克隆和融合操作，(2)提供單一直線質(zhì)粒構(gòu)建體，避免了可能影響試劑獲得監(jiān)管部門(即FDA)批準(zhǔn)的親本構(gòu)建體的過度融合與突變，(3)除去獲得的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中冗長的、不起作用的和/或不需要的序列，(4)選擇治療性基因構(gòu)建體并將其定向克隆至逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的靈活性增加，(5)簡(jiǎn)化逆轉(zhuǎn)錄病毒載體內(nèi)各種輔助結(jié)構(gòu)域的分子克隆，(6)引入關(guān)鍵性修飾提高親本質(zhì)粒在載體生產(chǎn)細(xì)胞中的性能，從而增加所得逆轉(zhuǎn)錄病毒載體產(chǎn)物的效力，(7)顯著減小逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建體的總尺寸至一定程度，以使質(zhì)粒產(chǎn)量從生物發(fā)酵中的"低拷貝，低產(chǎn)量"反應(yīng)物提高至中等產(chǎn)量?？傊?，這些改良保持了目前使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的優(yōu)點(diǎn)(在載體安全性、基因整合和基因表達(dá)方面)，同時(shí)還對(duì)期望用于人體基因治療的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的結(jié)構(gòu)、確認(rèn)、生產(chǎn)和性能提供了重要改進(jìn)。這代表了第二代TDS組件，包括高效逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體，命名為C-REX載體。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染相比包裝細(xì)胞方法具有許多優(yōu)勢(shì)。在這點(diǎn)上，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染避免了生產(chǎn)穩(wěn)定產(chǎn)載體細(xì)胞系所需的較長時(shí)間，可在載體基因組或逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝組分對(duì)細(xì)胞有毒性作用時(shí)使用。如果載體基因組編碼毒性基因或千擾宿主細(xì)胞復(fù)制的基因，例如細(xì)胞周期抑制基因或誘導(dǎo)凋亡的基因，可能會(huì)難以產(chǎn)生穩(wěn)定的產(chǎn)載體細(xì)胞系，但可采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染在細(xì)胞死亡前產(chǎn)生載體。也利用瞬時(shí)感染開發(fā)了可產(chǎn)生與穩(wěn)定的產(chǎn)載體細(xì)胞系相當(dāng)?shù)牡味人降募?xì)胞系(Pear等人1993,PNAS90:8392-8396)。提供了一種大規(guī)模生產(chǎn)高滴度和高生物活性的帶有殺細(xì)胞基因構(gòu)建體的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體原種的高效生產(chǎn)方法。該生產(chǎn)方法描述了對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的293T生產(chǎn)細(xì)胞的使用；生產(chǎn)細(xì)胞放大的工程方法；和產(chǎn)生保持殺細(xì)胞基因高保真表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染操作。在另一種實(shí)施方式中，提供了一個(gè)用于生產(chǎn)臨床用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的完全驗(yàn)證的293T(用SV40大T轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞)原始細(xì)胞庫。盡管293T細(xì)胞已用于生產(chǎn)少量中、高滴度載體原種供實(shí)驗(yàn)室使用，但尚無報(bào)道該生產(chǎn)細(xì)胞可用于臨床載體原種的大規(guī)模生產(chǎn)。美國FDA嚴(yán)格控制和限制可轉(zhuǎn)移完整癌基因的載體在臨床產(chǎn)品中的應(yīng)用。本生產(chǎn)方法在最終的載體收獲與采集步驟中結(jié)合了一種不會(huì)引起載體效力降低的DNA降解方法。在另一種實(shí)施方式中，提供了一種將用于持續(xù)生產(chǎn)臨床用載體產(chǎn)品的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體原種濃縮到109cfu/ml的方法。臨床產(chǎn)品的最終制劑包括用于收獲、采集和保存高滴度臨床用載體原種的化學(xué)成分確定的無血清溶液。在另一種實(shí)施方式中，提供了一種采集臨床用載體的方法，該方法采用閉環(huán)多管系統(tǒng)保持無菌性、進(jìn)行質(zhì)控樣品采樣并簡(jiǎn)化最終填充步驟。閉環(huán)多管組合裝置(參見圖19A和19B)設(shè)計(jì)為滿足收集臨床用產(chǎn)品所需的規(guī)范要求，即在采樣、采集、濃縮和最終填充過程中保持無菌性，該裝置尚未商品化。本文披露的用于病毒顆粒采集、濃縮和保存的閉環(huán)多管組合裝置包括用Stedim71薄膜制造的flexboy袋和多管系統(tǒng)；由醋酸乙烯乙酯(EVA)液體接觸層、乙基乙烯醇(EVOH)阻氣層和EVA外層組成的3層復(fù)合薄膜。薄膜總厚度為300毫米。EVA是惰性非PVC材質(zhì)薄膜，不需要添加增塑劑，因此可萃取物保持最少。Stem已進(jìn)行了廣泛的生物相容性試驗(yàn)并且FDA建立了該產(chǎn)品的藥品管理檔案。薄膜和進(jìn)料管符合美國藥典VI級(jí)要求。所有袋的定制生產(chǎn)在Stedim的10,000控制級(jí)生產(chǎn)環(huán)境中完成。薄膜、管道和所有使用部件的Y射線相容性達(dá)45kGy。進(jìn)行Y照射，最低照射量為25kGy,最高照射量為45kGy。產(chǎn)品合格證由Stedim及其合同消毒公司提供。將臨床用載體以150ml體積裝入500ml冷凍袋中于-80。C凍存。完全驗(yàn)證的產(chǎn)品的病毒滴度為每毫升3xlO集落形成單位，生物效力為對(duì)人乳腺癌、結(jié)腸癌和胰腺癌細(xì)胞的生長抑制活性達(dá)65-70%,均勻顆粒大小為大約100nm,并且沒有病毒聚集，DNA殘留低于550bp,表明無完整癌基因，無可檢測(cè)到的E1A或SV40大T抗原，在印度侏儒小鼠(nuisDimiii)和人293細(xì)胞中5次傳代中未檢測(cè)到有復(fù)制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒(RCR)。產(chǎn)品為無菌的，其內(nèi)毒素水平〈0.3EU/ml，生產(chǎn)結(jié)束時(shí)細(xì)胞無支原體及其他外來病毒。將采用新pB-RVE和pdnGl/UBER-REX質(zhì)粒生產(chǎn)的Rexin-G以20-40ml體積裝入150ml塑料冷凍袋中于-70士10。C凍存。臨床批次的滴度范圍是0.5-5.0x109單位(U)/ml,每個(gè)批次經(jīng)驗(yàn)證均沒有有復(fù)制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒(RCR),并且具有供人體系統(tǒng)使用所需的純度、生物效力、無菌性和全面安全性。病毒包膜包括靶向配體，后者包括但不限于可與纖連蛋白結(jié)合的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸或RGD序列，以及也可與纖連蛋白結(jié)合的具有Gly-Gly-Trp-Ser-His-Trp序列的多肽。除了結(jié)合區(qū)域以外，靶向多肽還可包括位于結(jié)合區(qū)域N末端和/或C末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的連接序列，該連接體可增加旋轉(zhuǎn)靈活性和/或使修飾包膜多肽的位阻最小化。多核苷酸可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的基因工程技術(shù)進(jìn)行構(gòu)建。因此，依照本發(fā)明制備的靶向遞送載體包含與其相關(guān)的、能夠促進(jìn)載體在耙標(biāo)部位聚集的配體，即靶標(biāo)特異性配體。配體為化學(xué)部分，例如分子、官能團(tuán)及其片段，它對(duì)選擇的靶標(biāo)具有特異性反應(yīng)性，而對(duì)其他輩巴標(biāo)的反應(yīng)性較低，因而使靶向遞送載體具有能夠?qū)⒕幋a治療性或診斷性多肽的核酸選擇性地轉(zhuǎn)移到接近所選靶標(biāo)的細(xì)胞中的優(yōu)點(diǎn)。具有"反應(yīng)性，，是指對(duì)細(xì)胞或組織具有結(jié)合親和力或者能夠被內(nèi)化到細(xì)胞內(nèi)，其中結(jié)合親和力可通過本領(lǐng)域已知的任意方法4全測(cè)，例如通過任意標(biāo)準(zhǔn)體外檢測(cè)法如ELISA、流式細(xì)胞術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)法、表面等離子共振技術(shù)等。通常配體結(jié)合特定分子部分一表位，例如分子、官能團(tuán)或與細(xì)胞或組織結(jié)合的分子復(fù)合物，形成具有兩個(gè)成員的結(jié)合對(duì)。應(yīng)知道在結(jié)合對(duì)中，任一成員可為配體，同時(shí)另一個(gè)為表位。該結(jié)合對(duì)為本領(lǐng)域所公知。結(jié)合對(duì)的例子有抗體-抗原、激素-受體、酶-底物、營養(yǎng)成分(如維生素)-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、生長因子-生長因子受體、碳水化合物-凝集素和具有互補(bǔ)序列的兩個(gè)多肽。配體的片段只要保留結(jié)合適當(dāng)細(xì)胞表面表位的能力，則可被看作是配體并可用于本發(fā)明。優(yōu)選地，配體是包含免疫球蛋白的抗原結(jié)合序列的蛋白質(zhì)和肽類。更為優(yōu)選地，配體是缺乏Fc序列的抗原結(jié)合抗體片段。這樣的優(yōu)選配體有免疫球蛋白Fab片段、免疫球蛋白F(ab)2片段、Fv抗體片段或單鏈Fv抗體片段。這些片段可通過酶法產(chǎn)生或重組制備。在其功能方面，配體優(yōu)選為可內(nèi)化配體，即，例如通過細(xì)胞內(nèi)吞過程可被所選細(xì)胞內(nèi)化的配體。同樣地，發(fā)生替換或其他變化但仍保留表位結(jié)合能力的配體也可使用。優(yōu)先選擇識(shí)別病理性細(xì)胞，例如惡性細(xì)胞或病原體的配體。例如，結(jié)合暴露膠原的配體能夠?qū)⑤d體靶向至受試對(duì)象含惡性組織的區(qū)域。通常，細(xì)胞轉(zhuǎn)移至機(jī)體另一區(qū)域是通過侵襲和破壞健康組織而實(shí)現(xiàn)的。這種侵襲會(huì)導(dǎo)致膠原暴露，暴露的膠原能夠被本文所提供的載體耙向?？捎糜诎邢蜉d體的另一類配體是能夠與在許多腫瘤細(xì)胞表面過度表達(dá)的酪氨酸激酶生長因子受體形成結(jié)合對(duì)的配體。酪氨酸激酶生長因子受體的例子有VEGF受體、FGF受體、PDGF受體、IGF受體、EGF受體、TGF-a受體、TGF-(3受體、HB-EGF受體、ErbB2受體、ErbB3受體和ErbB4受體。EGF受體vIII和ErbB2(HEr2)受體尤其優(yōu)選在采用插入物(INSERTS)治療癌癥的情形下使用，因?yàn)檫@些受體對(duì)于惡性細(xì)胞有更高的特異性，而很少出現(xiàn)于正常細(xì)胞上?？蛇x地，選擇的配體傳缺陷機(jī)體的肝細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞，體外的胚胎細(xì)胞、胚細(xì)胞、干細(xì)胞、生殖細(xì)胞、雜交細(xì)胞、植物細(xì)胞或任何用于工業(yè)過程的細(xì)胞。配體可以在病毒顆粒表面上表達(dá)或通過任意本領(lǐng)域已有的適宜方法附著于非病毒顆粒上。附著可以是共價(jià)的或非共價(jià)的，例如通過吸附或形成復(fù)合物。附著優(yōu)選涉及能夠通過形成共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵與配體偶聯(lián)的親脂性分子部分，其被稱作"錨"。錨對(duì)親脂性環(huán)境具有親和力，例如類脂微泡、雙層和其他濃縮相，因此可將配體附著于脂質(zhì)-核酸微粒上。通過親脂性錨的配體附著方法為本領(lǐng)域所公知。(參見，例如，F(xiàn).Schuber，"ChemistryofHgand-couplingtoliposomes",在LiposomesasToolsforBasicResearchandIndustry中，由J.R.Philippot和F.Schuber編輯，CRCPress,BocaRaton，1995，p.21-37)。應(yīng)認(rèn)識(shí)到本文纟皮露的耙向遞送載體包括病-秦顆粒和非病毒顆粒。非病毒顆粒包括脂雙層中的包封核蛋白，包括全部或部分組裝的病毒顆粒。將病毒包裝進(jìn)脂雙層的方法為本領(lǐng)域所公知。方法包括被動(dòng)捕獲至脂雙層包裹的嚢泡(脂質(zhì)體)中，并將病毒體與脂質(zhì)體孵育(美國專利No.5,962,429;Fasbender等人，J.Biol.Chem.272:6479-6489;Hodgson和Solaiman，NatureBiotechnology14:339-342(1996))。不一皮理i侖所束縛，我們認(rèn)為暴露于病毒體表面的酸性蛋白質(zhì)提供了與耙向遞送載體的陽離子脂質(zhì)/陽離子聚合物成分發(fā)生絡(luò)合的界面，并作為"支架"供中性脂質(zhì)成分形成雙層。病毒的典型類型包括腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰滲病毒、慢病毒和p藍(lán)菌體。非病毒遞送系統(tǒng)，如微?；蚣{米顆粒，包括例如陽離子脂質(zhì)體和聚陽離子，提供了遞送系統(tǒng)的備選方法，也包括在本公開內(nèi)容中。非病毒遞送系統(tǒng)的實(shí)例包括，例如Wheeler等人的美國專利No.5,976,567和5,981,501。這些專利披露了通過將含有陽離子和非陽離子脂質(zhì)的有4幾溶液與質(zhì)粒的水溶液接觸而制備血清穩(wěn)定的質(zhì)粒-脂質(zhì)顆粒。Thierry等人的美國專利No.6,096,335披露了包含整體陰離子生物活性物質(zhì)、陽離子組份和陰離子組份的復(fù)合物的制備。Allen和Stuart的PCT/US98/12937(WO98/58630)披露了在適合陽離子脂質(zhì)溶解的脂溶劑中形成多核苷酸-陽離子脂質(zhì)顆粒、向含顆粒的溶劑中加入中性成嚢泡脂質(zhì)、蒸發(fā)脂溶劑以形成其內(nèi)包埋有多核苷酸的脂質(zhì)體。Allen和Stuart的美國專利No.6,120,798披露了多核苷酸-脂質(zhì)微粒的形成，包括將多核苷酸溶于第一溶劑(如水性溶劑)、將脂質(zhì)溶于不與所述第一溶劑混溶的第二溶劑(如有機(jī)溶劑)、加入第三溶劑形成單一相、再加入一定量的第一和第二溶劑形成兩個(gè)脂質(zhì)相。Bally等人的美國專利No.5，705，385和Zhang等人的美國專利No.6，110，745披露了制備脂質(zhì)-核酸顆粒的方法，包括用含非陽離子脂質(zhì)和陽離子脂質(zhì)的溶液與核酸接觸而形成脂質(zhì)-核酸混合物。Maurer等人的PCT/CA00/00843(WO01/06574)披露了制備帶電荷治療藥劑的全脂質(zhì)包裹治療藥物顆粒的方法，包括在去穩(wěn)定溶劑中將形成的脂嚢泡、帶電荷治療藥劑和去穩(wěn)定劑相混合形成混合物，去穩(wěn)定溶劑使嚢泡去穩(wěn)定，但不會(huì)破壞嚢泡，之后再去除去穩(wěn)定劑。42成顆粒組份("PFC，，)一般包括脂質(zhì)如陽離子脂質(zhì)，任選與除陽離子脂質(zhì)以外的PFC聯(lián)用。陽離子脂質(zhì)是其分子能夠電離產(chǎn)生凈正離子電荷的脂質(zhì)，pH范圍為約3-約10,優(yōu)選約4-約9的生理pH范圍。該陽離子脂質(zhì)包括例如陽離子去污劑，如具有單烴鏈的陽離子兩親化合物。專利和科學(xué)文獻(xiàn)中描大量具備促核酸轉(zhuǎn)染性質(zhì)的陽離子脂質(zhì)。這些促轉(zhuǎn)染的陽離子脂質(zhì)包括但不限于例如1,2-二油基氧-3-(N，N,N-三甲基銨基)氯化丙烷-，DOTMA(美國專利No.4,897,355);DOSPA(參見Hawley-Ndson等人，F(xiàn)ocus15(3):73(1993));N,N-雙十八烷基-N,N-二曱基-溴化4妄或DDAB(美國專利No.5,279,833);1,2-二油基氧-3-(N,N，N-三曱基銨基)氯化丙烷-DOTAP(Stamatatos等人，Biochemistry27:3917-3925(1988);基于甘油的脂質(zhì)(參見Leventis等人，Biochem.Biophys.Acta1023:124(1990);精氨酰-PE(美國專利No.5，980，935);賴氨酰-PE(Puyal等人J.Biochem.228:697(1995))、脂多胺(美國專利No.5,171,678)和基于膽固醇的脂質(zhì)(WO93/05162,美國專利No.5，283，85);CHIM(l-(3-膽固醇基)-氧基羰基-氨曱基咪唑)等等。已有對(duì)轉(zhuǎn)染用陽離子脂質(zhì)的纟宗述，例^口Behr，BioconjugateChemistry,5:382-389(1994)。l尤選的陽離子脂質(zhì)有DDAB、CHIM或二者的聯(lián)用。陽離子脂質(zhì)的實(shí)例有陽離子去污劑，包括(C12-C18)-烷基-和(C12-C18)-烯基-三曱銨鹽、N-(C12--C18)-烷基-和N-(C12-C18)-烯基』比啶鹽等等。根據(jù)本發(fā)明制備的靶向遞送載體的大小在約40nm至約1500nm的范圍內(nèi)，優(yōu)選范圍為約50-500nm,最優(yōu)選為約20-150nm。選擇該尺寸有利于靶向遞送載體在向機(jī)體施用后穿透血管進(jìn)入患病組織如惡性腫瘤，并將治療性核酸轉(zhuǎn)移至此。靶向遞送載體的一個(gè)特有的和有利的性質(zhì)是在細(xì)胞外生物液體如體外細(xì)胞培養(yǎng)基或血漿存在下其大小基本不會(huì)增加(例如經(jīng)動(dòng)態(tài)光散射方法測(cè)定)?？蛇x地，如Culver等人(1992)Science256,1550-1552所述，可將產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞注射到腫瘤中。所引入的產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞構(gòu)建為可活躍地產(chǎn)生靶向遞送載體如病毒載體顆粒，由此在腫瘤塊中原位發(fā)生載體持續(xù)產(chǎn)生。因此，若與產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的細(xì)胞相混合，可在體內(nèi)成功轉(zhuǎn)導(dǎo)增殖的肺瘤細(xì)胞。治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的靶向載體也可作為基因治療方案的一部分用于遞送編碼治療劑如突變細(xì)胞周期蛋白G多肽的核酸。因此，本發(fā)明另一方面提供用于在體內(nèi)或體外將治療劑轉(zhuǎn)染至受試對(duì)象含有轉(zhuǎn)移性腫瘤疾病相關(guān)細(xì)胞型的部位的表達(dá)載體。本文提供的靶向載體意圖用作基因治療的載體?？捎猛蛔兗?xì)胞周期蛋白G多肽和核酸分子代替其他靶向載體中的相應(yīng)基因?？蛇x地，本文披露的靶向載體(如包含膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的輩巴向載體)可包含編碼任意治療劑(如胸苷激酶)的核酸。更希望的是用于治療肺瘤性疾病的治療劑。本研究提供了來自人體內(nèi)臨床試驗(yàn)的數(shù)據(jù)。然而，本文披露的靶向載體的其他毒性和治療有效性可通過標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法由細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)性動(dòng)物來確定，例如確定LDS5。(50%群體致死的劑量)和ED5。(50%群體治療有效的劑量)。治療指數(shù)是毒性與療效的劑量比，可表示為LD5Q/ED5。。優(yōu)選治療指數(shù)大的劑量。在本發(fā)明中，可以采用正常情況下會(huì)表現(xiàn)出毒性副作用的劑量，因?yàn)檫f送系統(tǒng)設(shè)計(jì)為靶向治療部位，以使對(duì)未受處理細(xì)胞的損傷最小化并減少副作用。人體臨床試驗(yàn)(見下)所得數(shù)據(jù)證實(shí)本發(fā)明的靶向載體在體內(nèi)發(fā)揮了抑制腫瘤性疾病進(jìn)展的功能。表l中的數(shù)據(jù)提供了向患者施用該載體的治療方案。此外，采用靶向載體替代形式(如替代的靶向機(jī)制或替代的治療劑)進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)可用于配制一定范圍的劑量供人體使用。劑量?jī)?yōu)選地處于具有極低毒性或無毒性的、包括ED50值的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。在該范圍內(nèi)劑量可根據(jù)使用的劑型及給藥途徑而變化。最初，治療有效劑量可通過細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)加以估計(jì)。劑量可在動(dòng)物模型中試驗(yàn)，以達(dá)到包含IC5Q(即試驗(yàn)化合物達(dá)到半數(shù)最大感染或半數(shù)最大抑制時(shí)的濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍(在細(xì)胞培養(yǎng)物中測(cè)定)。這些信息可用于更加精準(zhǔn)地確定人體使用的有效劑量。血漿水平可通過例如高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。包含靶向遞送載體的藥物組合物可按任意傳統(tǒng)方式將所選數(shù)量的載體與一種或多種生理可接受的載體或賦形劑混合而配制。例如，可將靶向遞送載體混懸于載體如PBS(磷酸鹽緩沖液)中?；钚曰衔锟梢砸后w、半液體或固體形式經(jīng)任意適宜的途徑給藥，例如經(jīng)口、腸胃外、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下或局部給藥，并按適合各給藥途徑的方式進(jìn)行配制。優(yōu)選的給藥方式包括口服和腸胃外給藥方式。靶向遞送載體和生理可接受的鹽和溶劑化物可配制為供吸入或吹入給藥(經(jīng)口或鼻)或者供口服、含服、腸胃外或直腸給藥。對(duì)于吸入給藥，靶向遞送載體可借助適合的噴射劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟曱烷、氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適的氣體，從加壓包或噴霧器中以噴霧劑形式遞送。對(duì)于加壓氣霧劑，可通過設(shè)置閥門按量遞送來確定劑量單位。例如供吸入器或吹入器使用的明膠的膠嚢和盒可以配制為包含治療性化合物與適宜粉末基質(zhì)如乳糖或淀粉的混合粉末。對(duì)于口服給藥，藥物組合物可采用以下劑型例如用藥學(xué)可接受的-賦形劑通過常規(guī)方法制備的片劑或膠嚢劑，所述賦形劑如粘合劑(例如預(yù)膠化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；充填劑(例如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鉤)；潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石粉或二氧化硅)；崩解劑(例如土豆淀粉或羥乙酸淀粉鈉)；或濕潤劑(例如十二烷基硫酸鈉)?？刹捎帽绢I(lǐng)域熟知的方法對(duì)片劑進(jìn)行包衣。供口服給藥的液體制劑可采用的形式有例如溶液劑、糖漿劑或混懸劑，或者可以干產(chǎn)品提供，在臨用前與水或其他適合的溶媒配制。該液體制劑可采用藥學(xué)可接受的添加劑經(jīng)常規(guī)方法制備，所述添加劑如混懸劑(例如山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂)；乳化劑(例如卵磷脂或阿拉伯膠)；非水性溶媒(例如杏仁油、油酯、乙醇或分餾植物油)；以及防腐劑(例如曱基或丙基-對(duì)羥基苯曱酸酯或山梨酸)。制劑必要時(shí)還可包含緩沖鹽、調(diào)味劑、著色劑和甜味劑?？诜o藥制劑可經(jīng)適當(dāng)配制以實(shí)現(xiàn)活性化合物的控制釋放。含服給藥的組合物可采用按常規(guī)方式配制的片劑或錠劑的形式。靶向遞送載體可制備為用于通過注射例如通過推注或持續(xù)輸注進(jìn)行腸胃外給藥。注射制劑可提供為單元?jiǎng)┝啃问剑缪b于安瓿或多劑量容器中，并加入防腐劑。組合物可采用在油或水性載體中的混懸劑、溶液劑或乳劑的形式，并且可包含配制試劑如混懸劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?？蛇x地，活性成分可以是凍干粉形式，臨用前用適當(dāng)?shù)娜苊嚼鐭o菌無熱原水配制。除上述制劑外，靶向遞送載體還可制成儲(chǔ)庫型(depot)制劑。該長效制劑可通過植入(例如經(jīng)皮下或肌內(nèi))或肌內(nèi)注射給藥。因此，例如，治療性化合物可采用適宜的聚合物或疏水性材料(例如作為在可接受的油中的乳劑)或離子交換樹脂制備，或制備為微溶性衍生物如微溶性鹽?；钚詣┛芍苽錇槟z劑、乳膏劑和洗劑形式，供局部或表面應(yīng)用，例如供皮膚和粘膜(如眼內(nèi))表面使用，以及供眼部應(yīng)用或者供腦池內(nèi)或脊柱內(nèi)應(yīng)用。這種溶液，特別是打算供眼部使用的溶液，可采用適宜的鹽配制為pH約5-7的0.01%-10%等滲溶液?；衔锟芍瞥蓺忪F劑供局部應(yīng)用，例如吸入。排泄速度、劑量日程和給藥量以及本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其他因素。例如，纟會(huì)藥量應(yīng)足以治療高血壓癥狀。組合物可根據(jù)需要裝入包裝或分配裝置中，其中可包含有一個(gè)或多個(gè)含活性成分的單元?jiǎng)┝啃问健０b包括例如金屬的或塑料薄膜，例如泡包裝(blisterpack)。包裝或分配裝置可附給藥說明書。活性劑可以包裝為一種產(chǎn)品，該產(chǎn)品包含包裝材料、其中提供的藥劑以及標(biāo)明該藥劑的適應(yīng)癥的標(biāo)簽。包含細(xì)胞因子基因的靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒可單獨(dú)給藥或與其他治療性處置或活性劑聯(lián)用。例如，包含細(xì)胞因子基因的靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒可與包含殺細(xì)胞基因的靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒聯(lián)合給藥。包含殺細(xì)胞基因的耙向逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的給藥量將根據(jù)本文上述的病毒顆粒滴度而定。例如，如果包含細(xì)胞因子基因的靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒與包含殺細(xì)胞基因的耙向逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒聯(lián)合給藥，則每個(gè)載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒滴度應(yīng)低于各載體單獨(dú)使用時(shí)的滴度。包含細(xì)胞因子基因的靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒顆?？膳c包含殺細(xì)胞基因的靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒同時(shí)給藥或分開給藥。本發(fā)明方法還涉及通過施用靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒(例如，表達(dá)細(xì)胞因子的靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其單獨(dú)使用或與表達(dá)殺細(xì)胞基因的耙向逆轉(zhuǎn)錄病毒載體聯(lián)用)與一種或多種其他活性劑治療癌癥的方法?？赡苁褂玫钠渌钚詣┑膶?shí)例包括但不限于化療藥劑、抗炎癥藥劑、蛋白酶抑制劑如HIV蛋白酶抑制劑、核苷酸類似物如AZT。一種或多種活性劑可與另外一種或多種活性劑同時(shí)或分開給藥(例如，在施用靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒之前或之后)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解耙向逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒給藥途徑可與一種或多種藥劑給藥途徑相同(例如，耙向逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒與藥劑均采取靜脈內(nèi)給藥)或不同(例如，靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒為靜脈內(nèi)給藥，而一種或多種藥劑則為口服給藥)。有多種方法可確定向需要治療的受試對(duì)象施用的靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的有效量或治療有效量。例如，可根據(jù)病毒滴度或在動(dòng)物模型中的效力確定用量?？蛇x地，臨床試驗(yàn)所用的劑量方案可作為一般指導(dǎo)原則。每日劑量可以單劑量給藥或在一天中不同時(shí)間分次給藥。開始時(shí)可能需要較高劑量，一段時(shí)間后當(dāng)達(dá)到最佳初始反應(yīng)時(shí)則可降低劑量。例如，治療可連續(xù)數(shù)天、數(shù)周或數(shù)年，或者可以間隔進(jìn)行，其中插入休息期。根據(jù)個(gè)體可能接受的其他治療，其劑量可作相應(yīng)修改。然而，治療方法絕不限于靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的特定濃度或范圍，可根據(jù)治療的每個(gè)個(gè)體及所使用的各種衍生物而變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，針對(duì)給定個(gè)體可能需要將劑量個(gè)體化，以獲得最佳療效。本領(lǐng)域技術(shù)人員還會(huì)了解施用于受治個(gè)體的劑量會(huì)根據(jù)個(gè)體的年齡、疾病嚴(yán)重程度或分期以及對(duì)治療過程的反應(yīng)而不同。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道為通過本文所述方法治療的個(gè)體評(píng)價(jià)和確定適當(dāng)劑量的臨床參數(shù)?？捎糜谠u(píng)價(jià)并確定劑量的臨床參數(shù)包括但不限于腫瘤大小、用于臨床檢測(cè)特定惡性肺瘤的胂瘤標(biāo)志物水平改變。根據(jù)這些參數(shù)，治療醫(yī)師將確定用于給定個(gè)體的治療有效劑量。經(jīng)治療醫(yī)師判斷，這種治療可以必要地經(jīng)常進(jìn)行，并且持續(xù)必要的一段時(shí)間。在本研究中，示例性方案針對(duì)癌癥患者而設(shè)計(jì)。靜脈輸注Rexin-G的患者內(nèi)劑量遞增方案每天進(jìn)行一次，連續(xù)8-10天。該治療方案結(jié)束后休息一周時(shí)間，進(jìn)行毒性評(píng)估；此后，靜脈內(nèi)施用最大耐受劑量的Rexin-G,持續(xù)8-10天。如果在治療期間患者未出現(xiàn)Rexin-G相關(guān)的3級(jí)或4級(jí)不良事件，則Rexin^G劑量如下遞增表l:治療方案<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>根據(jù)對(duì)前兩名患者所觀察到的安全性，第三名患IVB期胰腺癌伴多處肝轉(zhuǎn)移患者采用靜脈注射Rexin-G進(jìn)行一線治療6天，隨后進(jìn)入經(jīng)菲律賓食品藥物管理局批準(zhǔn)的第二個(gè)臨床治療方案，施用吉西他濱周劑量1000mg/m2連續(xù)8周。采用改良pB-RVE和pdnGl/UBER-REX質(zhì)粒得以生產(chǎn)Rexin-GTM高效制劑(1-5x109U/ml)。它克服了現(xiàn)有產(chǎn)品輸注體積大而致用量限制的問題，并得以發(fā)展了重要的如等價(jià)計(jì)算定義的劑量密集方案。在癌癥治療中，影響試驗(yàn)藥物有效性的關(guān)鍵因素是腫瘤負(fù)荷的程度。試驗(yàn)藥物的安全范圍非常窄，因?yàn)槌３Ｔ谶_(dá)到腫瘤控制之前就已出現(xiàn)劑量限制性毒性。因此，發(fā)展能夠?qū)嶋H定位于腫瘤負(fù)荷而不引起劑量限制性副作用或器官損害的抗癌藥物代表了癌癥治療的重要里程碑和進(jìn)步。另一個(gè)重要問題是癌癥生長的天然動(dòng)力學(xué)，這要求給出適宜的動(dòng)力學(xué)方案。歷史上的腫瘤生長模型現(xiàn)已被認(rèn)為過度簡(jiǎn)單化(Hekjan.(1991)Stat.Med.10:1075-1088,Norton.(2005)Oncologist10:370-381),時(shí)至今日這些簡(jiǎn)單化的模型極大地影響著今天仍在實(shí)施的癌癥治療標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)展；即，聯(lián)合使用藥物，以及在相等間隔周期中以相等密度用藥。盡管對(duì)腫瘤皺縮與預(yù)后良好相關(guān)的預(yù)測(cè)是正確的，然而給予傳統(tǒng)藥物足夠長的時(shí)間即可根除腫瘤的預(yù)測(cè)則被證明是錯(cuò)誤的(Norton.(2006)Oncol.4:3637)。對(duì)更加復(fù)雜動(dòng)力學(xué)的理解，如BenjaminGompertz所述并以Norton-Simon才莫型使之形式化，考慮了轉(zhuǎn)移動(dòng)力學(xué)及腫瘤負(fù)荷與預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移能力之間的數(shù)量關(guān)系。因此，出現(xiàn)了劑量密集化學(xué)療法的概念，該療法強(qiáng)調(diào)能在較短的時(shí)間間隔中引起腫瘤退縮的最佳藥物劑量，并且偏重于序貫方法而非聯(lián)用法((Norton.(2006)Oncol.4:36畫37;Fomier和Norton,(2005)BreastCancerRes.7:64-69)。此后，大量臨床試驗(yàn)提供了支持證據(jù)，證明更加密集地給藥在優(yōu)化殺死癌細(xì)胞方面具有顯著性差異。的方式開辟了一種全新的治療轉(zhuǎn)移性癌癥的定量方法。本文描述的等價(jià)計(jì)算表示在高度壓縮的時(shí)間段內(nèi)尋求滿足并匹配給定腫瘤負(fù)荷的新標(biāo)準(zhǔn)；換句話說，在量上基于對(duì)總腫瘤負(fù)荷的最準(zhǔn)確估計(jì)的劑量密集誘導(dǎo)方案。等價(jià)計(jì)算從開始就假定(i)治療藥劑(本文中為Rexin-GTM)充分定向，足以抵抗生理屏障包括稀釋、湍流、流動(dòng)、擴(kuò)散屏障、濾過、滅活和清除的影響，因而能夠計(jì)算生理性能系數(shù)((J))或生理感染復(fù)數(shù)(P-MOI),(ii)藥劑在不引起限定的劑量限制性毒性的水平時(shí)是有效的；以及(iii)能獲得足夠高濃度的藥劑，以允許按個(gè)體化劑量經(jīng)靜脈給藥而不引起容量過度負(fù)荷。殺細(xì)胞性細(xì)胞周期蛋白Gl構(gòu)建體的生理性能系數(shù)從4至250變化，并部分取決于藥物的滴度(Gordon等人(2000)CancerRes.60:3343-3347)。為計(jì)算Rexin-G了M每日給藥的最佳劑量，需要考慮以下因素(1)基于放射影像分析的總腫瘤負(fù)荷，(2)系統(tǒng)的生理性能系數(shù)(4〕)，該系數(shù)決定了每個(gè)靶標(biāo)癌細(xì)胞所需的可誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移單位復(fù)數(shù)，以及(3)以載體滴度定義的精確藥物效力，以集落形成單位(U)/ml表示。一個(gè)基因轉(zhuǎn)移單位與一個(gè)集落形成單位相當(dāng)。等價(jià)計(jì)算預(yù)測(cè)，如果耙向載體給藥劑量與新出現(xiàn)的腫瘤負(fù)荷相當(dāng)，則可實(shí)現(xiàn)腫瘤控制；然而總劑量給藥應(yīng)考慮在安全范圍內(nèi)于盡可能短的時(shí)間內(nèi)完成，目的是在留出時(shí)間供網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除產(chǎn)生的腫瘤碎片的同時(shí)可防止腫瘤繼續(xù)生長(Gordon等人(2000)CancerRes.60:3343-3347)。等價(jià)計(jì)算公式初期肺瘤控制所需的基因治療藥物劑量=腫瘤負(fù)荷xpMOI藥物效力應(yīng)用于Rexin-G治療的等價(jià)計(jì)算其中腫瘤負(fù)荷由公式[目標(biāo)病變最長直徑之和(cm)]x[lxl(f癌細(xì)胞/cm]算出其中$或pMOI為由臨床前和臨床研究估計(jì)的經(jīng)驗(yàn)數(shù)值對(duì)于Rexin-G,pMOI是100其中效力是每ml藥物溶液的集落形成單位(U)數(shù)值。.對(duì)于新構(gòu)建體pB-RVE和pdnGl/EREX產(chǎn)生的Rexin-G,效力范圍是5x108-5x109單位/ml實(shí)施例對(duì)于轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者的Rexin-G劑量計(jì)算其中患者有一個(gè)尺寸為2cmx2cm的局部晚期腫瘤，4個(gè)肝病變，其中3個(gè)的尺寸為1cmx1cm，第4個(gè)的尺寸為2cmx2cm腫瘤負(fù)荷(胰腺、肝)=(4cm+(2cm+2cm+2cm+4cm))xlxio9細(xì)胞/cm二14x109癌細(xì)胞其中特定批次的Rexin-G的效力為1x109U/mlRexin-G劑量(^1)=14x109細(xì)月包x100U/細(xì)胞1xi09U/ml=14x1011U=1400ml1x109U/ml實(shí)施例施用所需的Rexin-G冷凍袋數(shù)量的計(jì)算為確定輸注所需的Rexin-G冷凍袋的數(shù)量，用所用批次冷凍袋包含的Rexin-G標(biāo)準(zhǔn)體積除Rexin-G劑量總體積。冷凍袋提供的Rexin-G體積為20ml或40ml。所需Rexin-G袋的數(shù)量=Rexin-G劑量體積每個(gè)冷凍袋所含體積對(duì)于以40ml等份提供的Rexin-G，所需袋數(shù)是:1400ml=35個(gè)冷凍袋40ml釆用等價(jià)計(jì)算得到針對(duì)不同腫瘤負(fù)荷的三種給藥方案(見上)<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>我們利用該算法進(jìn)行的初步臨床實(shí)驗(yàn)(參見研究c)限于三名患者，每人均具有相對(duì)高的腫瘤負(fù)荷；然而，從兩名標(biāo)準(zhǔn)化療失敗的患者及一名拒絕標(biāo)準(zhǔn)化療的患者身上觀察到了非常顯著的應(yīng)答(100%應(yīng)答率)，該結(jié)果凸顯了其應(yīng)用潛力及深入研究該定量方法的迫切需要。靶向治療包括靶向基因治療的出現(xiàn)，正在改變腫瘤對(duì)受試抗癌藥物的應(yīng)答方式。癌癥治療的指導(dǎo)原則曾經(jīng)是從有應(yīng)用前景的化療藥獲得的治療益處必須超過候選藥物可能引起嚴(yán)重或致死性系統(tǒng)毒性的風(fēng)險(xiǎn)。為此目的，美國國立癌癥研究所(NCI,BethesdaMaryland,USA)制定了實(shí)體瘤反應(yīng)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(RECIST),曾經(jīng)被絕大多數(shù)(如果不是全部的話)學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)用作腫瘤反應(yīng)評(píng)價(jià)的通用標(biāo)準(zhǔn)(Therasse等人，(2000)J.Nat'l.CancerInst.92:205-216)。特別地，客觀腫瘤反應(yīng)(OTR)曾經(jīng)甚至近期還被考慮作為評(píng)價(jià)實(shí)體瘤癌癥治療成功的黃金標(biāo)準(zhǔn)。OTR包括目標(biāo)病變大小至少減少30%和/或轉(zhuǎn)移病灶或非目標(biāo)病變完全消失。然而，許多癌癥的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑事實(shí)上并不引起肺瘤皺縮，但卻顯示能延長無進(jìn)展存活期(PFS)及總存活期(OS)(Abeloff,(2006)Oncol.NewsInt'l，15:2-16)。因此，，對(duì)有效生物制劑的反應(yīng)通常是生理性的，RECIST可能不再是評(píng)價(jià)腫瘤對(duì)生物療法應(yīng)答的恰當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)了。因此，呼吁采用備選的替代終點(diǎn)，例如測(cè)定胂瘤密度(壞死的指標(biāo))、胂瘤內(nèi)的血流和葡萄糖利用以及其他成像方法，來評(píng)價(jià)腫瘤反應(yīng)的機(jī)理。因此，了解疾病過程以及推薦干預(yù)措施的可能作用機(jī)制在預(yù)測(cè)對(duì)給定臨床終點(diǎn)的治療效果時(shí)尤為重要。關(guān)于胂瘤Rexin-GTM的反應(yīng)，其主要作用才幾制是誘導(dǎo)增殖紳瘤細(xì)胞及輔助的生血管脈管系統(tǒng)中的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肺瘤內(nèi)部發(fā)生壞死及嚢性變。這是由于靶向破壞了腫瘤血供使腫瘤饑餓，從而導(dǎo)致腫瘤內(nèi)部發(fā)生壞死。在Rexin-GTM治療患者的腫瘤中，細(xì)胞凋亡是最主要特征，在隨后的影像檢查中可見腫瘤出現(xiàn)皺縮并消失。然而在壞死為主要特征的腫瘤中，腫瘤大小在經(jīng)Rexin-GTM治療后實(shí)際上可能變大，這是由于壞死腫瘤和腫瘤的嚢性轉(zhuǎn)化激發(fā)了炎癥反應(yīng)。在此情形中，CT掃描、PET掃描或MRI顯示的腫瘤結(jié)節(jié)大小增加并不必然指示疾病進(jìn)展。因此，需要有另一些能反映受治腫瘤組織學(xué)性質(zhì)的輔助評(píng)價(jià)來更加精準(zhǔn)地確定由Rexin-GTM治療引起的壞死或嚢性變的程度。對(duì)于CT掃描，腫瘤密度測(cè)定(表示為亨斯菲爾德單位(HU))是一項(xiàng)準(zhǔn)確并可重復(fù)的反映胂瘤壞死程度的指標(biāo)。目標(biāo)病變密度進(jìn)行性降低(HU降低)指示陽性治療效果。對(duì)于PET掃描，目標(biāo)病變的標(biāo)準(zhǔn)攝取值(SUV)呈進(jìn)行性下降指示腫瘤活性降低和陽性治療效果。對(duì)于腫瘤活檢，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡、壞死、反應(yīng)性纖維化和腫瘤浸潤淋巴纟田胞(TIL)指示陽性治療效果。在骨肉瘤中，通過連續(xù)CT掃描證實(shí)肺瘤壞死和病變部位4丐化增加，以及通過連續(xù)PET掃描出現(xiàn)18FDG的SUV進(jìn)行性下降證實(shí)病變部位的葡萄糖利用降低，可指示有利的胂瘤反應(yīng)。觀察到病變部位的4丐化增加至少10%、25%、50%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%或1000%是陽性殺肺瘤反應(yīng)的證據(jù)，可用于評(píng)^^、臺(tái)療結(jié)果并計(jì)劃下一步治療方案。病變部位的，DG利用降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%是陽性殺腫瘤反應(yīng)的證據(jù)，也可用于評(píng)價(jià)治療結(jié)果并計(jì)劃下一步治療方案。通過適應(yīng)性治療設(shè)計(jì)的臨床試驗(yàn)可加速確定劑量限制性毒性(DLT)和最大耐受劑量(MTD)的進(jìn)程，由此如果已觀測(cè)到臨床有效并且所有治療相關(guān)毒性確定^1級(jí)，那么患者可采用相同的治療周期進(jìn)行治療?？蛇x地，若未見客觀治療反應(yīng)，而所有治療相關(guān)毒性確定￡1級(jí),，則患者可應(yīng)用下一個(gè)更高的劑量水平。兩個(gè)機(jī)制均增加了獲得腫瘤控制的機(jī)會(huì)，而不會(huì)危及患者安全，同時(shí)可減少招募患者的時(shí)間和花費(fèi)。為進(jìn)一步促進(jìn)胂瘤消除并延長癌癥存活期，發(fā)展了一種輔助基因轉(zhuǎn)移策略，其特別設(shè)計(jì)為將腫瘤靶向殺細(xì)胞基因表達(dá)載體定位于病變部位或其周圍區(qū)域。利用帶有細(xì)胞因子基因的腫瘤靶向表達(dá)定位于病變部位或其周圍區(qū)域可以誘導(dǎo)局部而不是全身暴露于表達(dá)的細(xì)胞因子。這種定位的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答不僅促進(jìn)急性腫瘤破壞，還可提供原位癌癥接種，致使免疫監(jiān)督增強(qiáng)并降低癌癥復(fù)發(fā)的發(fā)生率。這種腫瘤接種方法有助于靶向休眠的脫落細(xì)胞和轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞，以及原發(fā)腫瘤和腫瘤引流淋巴結(jié)中殘留的活癌細(xì)胞。一種正在研發(fā)用于靶向遞送的細(xì)胞因子基因是粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF),在被包裝為與Rexin-G相同的親病灶性納米顆粒后被稱作Reximmune-C。另一些可使用的細(xì)胞因子包括TNF-oi(腫瘤壞死因子a);干擾素，包括但不限于IFN-a和IFN-r,以及白介素，包括但不限于白介素l(ILl)、白介素，(IL-卩)、白介素2(IL2)、白介素4(IL4)、白介素5(IL5)、白介素6(IL6)、白介素8(IL8)、白介素10(ILIO)、白介素12(IL12)、白介素13(IL13)、白介素14(IL14)、白介素15(IL15)、白介素16(IL16)、白介素18(IL18)、白介素23(IL23)、白介素24(IL24)。此外，腫瘤靶向表達(dá)載體可運(yùn)送一個(gè)以上的細(xì)胞因子基因。例如GM-CSF可與IL1共同表達(dá)。帶有細(xì)胞因子基因的腫瘤靶向表達(dá)載體可在施用殺細(xì)胞親病灶性納米顆粒之前、同時(shí)或之后施用。最佳方案可能是直到患者經(jīng)Rexin-G.作為單藥或聯(lián)合治療后表現(xiàn)出明顯腫瘤縮小(且生命延長)的時(shí)候再施用Reximmne-C,并主要依靠Reximmune-C來抑制復(fù)發(fā)。在另一方面，需要Rexin-G與Reximmune-C的協(xié)同作用直接作用于腫瘤負(fù)荷。在此情形中，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)預(yù)期終點(diǎn)的組織學(xué)評(píng)價(jià)需采用增加的組織學(xué)和放射成像的混合評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。表達(dá)殺細(xì)胞和細(xì)胞因子基因的親病灶性納米顆?？梢圆煌樞蚨啻问┯谩＠?，首先施用表達(dá)殺細(xì)胞基因的親病灶性納米顆粒，再施用表達(dá)細(xì)胞因子基因的親病灶性納米顆粒，接著再施用表達(dá)殺細(xì)胞基因的親病灶性納米顆粒。該聯(lián)合施用可作為交替的個(gè)別給藥、交替的治療周期或其組合來執(zhí)行。首先施用Rexin-G,接著是Reximmune-C，再后來是Rexin-G,這被稱為3-Rex方案。對(duì)于一名乳腺癌伴廣泛淋巴結(jié)、肝臟、肺和骨轉(zhuǎn)移的患者，3-Rex方案完全根除了腫瘤活檢組織內(nèi)的所有癌細(xì)胞。其累積劑量是，第一個(gè)Rexin-G治療周期為6xl011cfu,Reximmime-C治療周期為lx10]Gcfu,第二個(gè)Rexin-G治療周期為4x10"cfu。該治療方案導(dǎo)致腫瘤結(jié)節(jié)全面壞死，壞死區(qū)域廣泛，具有明顯的宿主單核細(xì)胞浸潤，沒有殘留或者只有極少的腫瘤細(xì)胞。免疫細(xì)胞浸潤顯示了大量補(bǔ)充的CD35+樹突細(xì)胞、CD8+殺傷性T細(xì)胞和CD138+漿B細(xì)胞，提供了活躍的原位免疫的證據(jù)。使用表達(dá)殺細(xì)胞和細(xì)胞因子基因的親病灶性納米顆粒的聯(lián)合治療方案，可制定靈活的治療計(jì)劃，以考慮所觀察到的臨床、放射學(xué)、組織病理學(xué)、免疫組織化學(xué)和臨床化學(xué)結(jié)果。例如，如果患者根據(jù)一條、數(shù)條或所有的不同檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)均未見客觀的、有意義的腫瘤應(yīng)答，而醫(yī)師認(rèn)為需要更高的表達(dá)殺細(xì)胞基因的親病灶性納米顆粒累積劑量將腫瘤抗原充分暴露于活化的免疫細(xì)胞，則采用更高的表達(dá)殺細(xì)胞基因的親病灶性納米顆粒的累積劑量進(jìn)行另一個(gè)治療周期，但是表達(dá)細(xì)胞因子基因的親病灶性納米顆?？梢跃S持相同的累積劑量。時(shí)，表達(dá)殺細(xì)胞基因的親病灶性納米顆粒的個(gè)別施用、多重施用或治療周期的效果的組織病理學(xué)指標(biāo)包括病灶部位的明顯血管生成抑制伴隨腫瘤細(xì)胞退化、大范圍的壞死與反應(yīng)性纖維化以及凋亡結(jié)構(gòu)的TUNEL染色陽性。治療效果的免疫組織化學(xué)指標(biāo)包括出現(xiàn)腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞，例如CD4+(Th)、CD8+(TC)、CD68+(巨噬細(xì)胞)、CD138+(漿B細(xì)胞)、〔035+(樹突狀細(xì)胞)、CD20+(B細(xì)胞)和CD45+(單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞)細(xì)胞。鑒定到細(xì)胞因子(如GM-CSF)轉(zhuǎn)基因表達(dá)陽性細(xì)胞也是有效性的標(biāo)志。臨床化學(xué)結(jié)果包括觀察到可溶的、分泌的或脫落的腫瘤標(biāo)志物/抗原減少，例如前列腺特異性抗原(PSA)或HER2/neu脫落抗原的血清水平降低。進(jìn)行組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)評(píng)價(jià)的樣本來源包括腫瘤、淋巴結(jié)和器官活檢或針活檢，以及切除的腫瘤、淋巴結(jié)或器官。通過將自殺基因整合到質(zhì)粒構(gòu)建中能夠更好地控制細(xì)胞因子表達(dá)，因而通過使用口服前藥如更昔洛韋等可獲得臨床轉(zhuǎn)換，該前藥可立即除去所有細(xì)胞因子轉(zhuǎn)基因分泌腫瘤細(xì)胞。為實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)，近期研制了包括單純皰疹病毒(HSV)胸苷激酶基因的第二代Reximmune-C,被稱作Reximmune-C-TNT。用治療性病毒顆粒如Rexin-G預(yù)治療還可用于術(shù)前減小肺瘤體積及存活性。這對(duì)于先前不可切除的腫瘤特別有益，能夠?qū)⑵滢D(zhuǎn)化為可被手術(shù)切除的腫瘤，并且還可減少脫落的活癌細(xì)胞進(jìn)入手術(shù)切緣的情況發(fā)生。對(duì)于具有癌癥家族史或已知遺傳異常/突變?nèi)鏐RACI基因突變而增加了罹患癌癥風(fēng)險(xiǎn)的患者，可采用Rexin-G、Reximimme-C或二者聯(lián)用的預(yù)防療法來防止已知疾病的發(fā)生。實(shí)現(xiàn)該作用是通過石皮壞已開始補(bǔ)充持續(xù)長大所需新血管系統(tǒng)的微小癌細(xì)胞簇，或者通過吸引淋巴細(xì)胞至微J、癌細(xì)胞簇而對(duì)免疫系統(tǒng)進(jìn)行訓(xùn)練，或者依靠這兩方面的組合。施用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可能會(huì)引起受者體內(nèi)產(chǎn)生載體中和抗體，從而阻止進(jìn)一步的治療(Halbert等人(2006)Hum.GeneTher.17(4):440-447)。然而本領(lǐng)域公知，在施用載體的時(shí)間前后進(jìn)行免疫抑制處理即可阻斷中和抗體產(chǎn)生的誘導(dǎo)。該免疫抑制處理包括藥物(環(huán)磷酰胺、FK506)、細(xì)胞因子(干擾素Y、白介素12)和單克隆抗體(抗-CD4、抗-pgp39、CTLA4-Ig)(Potter和Chang，(1999)Ann.N.Y.Acad.Sci.875:159-174)。此外，中和抗體可在體外通過免疫吸附除去(Nilsson等人(1990)Clin.Exp.Immunol.82(3)440-444)。還可通過施用較高劑量的載體在體內(nèi)減少中和抗體。Rexin-G載體具有低免疫原性，并且至今仍未在6個(gè)月隨訪期的患者血清中;^企測(cè)到載體中和抗體。試劑盒還提供了包含用于本文所述方法的組合物的試劑盒或給藥系統(tǒng)。施用靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒所需的全部必要材料和試劑可以組合在一個(gè)試劑盒中(例如包裝細(xì)胞構(gòu)建體或細(xì)胞系、細(xì)胞因子表達(dá)載體)。試劑盒的各成分可以上述多種形式提供。一種或多種靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒顆?？膳c一種或多種藥劑(例如化療藥)配制為單一的藥學(xué)可接受的組合物或獨(dú)立的藥學(xué)可接受的組合物。試劑盒或給藥系統(tǒng)的成分還可以干燥或凍干形式提供。當(dāng)試劑或成分以干燥形式提供時(shí)，通常需加入適宜的溶劑進(jìn)行配制，該溶劑也可裝于另一個(gè)容器中提供。本發(fā)明的試劑盒還可包括關(guān)于靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的劑量和/或給藥信息的說明書。本發(fā)明的試劑盒或給藥系統(tǒng)通常還可包括將小瓶裝入封閉裝置中供商品銷售的工具，例如容納所需小瓶的注射或吹塑成型的塑料容器。不論容器的數(shù)量或類型如何，試劑盒還可包括輔助注射/給藥或?qū)⒆罱K復(fù)合組合物置于受試對(duì)象身體中的裝置或與該裝置一起包裝。該裝置可以是涂藥器、吸入器、注射器、吸管、鑷子、測(cè)量匙、滴眼器或任何批準(zhǔn)的醫(yī)學(xué)遞送工具。在另一種實(shí)施方式中，提供了一種進(jìn)行基因治療商業(yè)活動(dòng)的方法。該方法包括生產(chǎn)靶向遞送載體，和通過收集載體顆粒、將其混懸于適宜的基質(zhì)溶液中并保存混懸液而建立載體庫。該方法還包括向醫(yī)師或保健提供者提供顆粒和使用顆粒的說明書，以施用于需要的受試對(duì)象(患者)。載體的使用說明書還可包括表1列出的示例性治療方案。該方法任選地包括給患者或者患者的保險(xiǎn)提供者開賬單。在另一種實(shí)施方式中，提供了一種進(jìn)行基因治療商業(yè)活動(dòng)的方法，包括向醫(yī)師或保健提供者提供本文所公開的試劑盒。以下的實(shí)施例僅用于說明目的，而不是限定本發(fā)明的范圍。所例舉的具體方法可施用于其他物種。這些實(shí)施例旨在舉例說明一^L方法。實(shí)施例胰腺癌是美國癌癥死亡的排第四位的原因，而且是所有癌癥中致死性最強(qiáng)的。完全手術(shù)切除胰腺腫瘤是該疾病的唯一有效的治療方法。遺憾的是，這種"治療性"手術(shù)僅在10-15%的胰腺癌患者中是可能的，一般是表現(xiàn)癥狀為黃疸的個(gè)體。不可切除胰腺癌患者的存活時(shí)間中值為3-6個(gè)月。因此，晚期胰腺癌患者的控制通常涉及癥狀的緩解。外線束照射看來不能延長存活期，盡管足夠的腫瘤大小縮小可能導(dǎo)致疼痛的緩解。外線束照射加使用氟尿嘧啶(5-FU)的化學(xué)治療延長了這些患者的存活時(shí)間(18)。最近證明，吉西他濱，一種脫氧胞苷酸類似物，可改善晚期胰腺癌患者的生活質(zhì)量，盡管存活期只延長了8-10周。手術(shù)切除也是對(duì)結(jié)腸直腸癌患者的主要的治療手段，結(jié)腸直腸癌是美國居第二位的癌癥死亡原因。附加的化學(xué)治療和放射治療有助于減少早期疾病患者的結(jié)腸直腸癌復(fù)發(fā)(7)。然而，這些治療對(duì)于局部晚期胂瘤的效果不太令人滿意(8)。當(dāng)前，通過手術(shù)切除治療的結(jié)腸直腸癌患者的5年存活率如下1期約為90%,11期約為70%，II期約為50%,IV期低于5。/。。盡管化學(xué)治療對(duì)于結(jié)腸癌仍然是一種有用的治療選擇，甚至擴(kuò)展到病變降期(down-stagh]g)，但是大多數(shù)結(jié)腸癌患者在18個(gè)月內(nèi)從標(biāo)準(zhǔn)治療中獲得的益處已經(jīng)消失。而且，似乎一流的臨床腫瘤學(xué)家一致認(rèn)為靶向"生物治療，，在胰A泉癌和結(jié)腸癌未來臨床發(fā)展方面具有遠(yuǎn)大的前景。實(shí)施例1:構(gòu)建體質(zhì)粒pBvl/CAEP含有4070A雙嗜性包膜蛋白的編碼序列(GenBank登錄號(hào)M33469),它已經(jīng)通過修飾引入了膠原結(jié)合功能(Hall等人.，HumanGeneTherapy,8:2183-2192,1997)。親代表達(dá)質(zhì)粒pCAE(Morgan等人.，JournalofVirology,67:4712-4721,1967)由USCGeneTherapyLaboratories提供。該pCAE質(zhì)粒通過靠近成熟蛋白質(zhì)的N末端在編碼序列的氨基酸6和7之間插入PstI位點(diǎn)(gctgcagga,編碼氨基酸AAG)而修飾(pCAEP)。將合成寡核苷酸雙鏈體(ggacatgtaggatggagagaaccateattcatggetctgteagetgca,編碼氨基酸GHVGWREPSFMALSAA，最小膠原結(jié)合十肽(粗體)，來源于牛馮維勒布蘭德因子的D2結(jié)構(gòu)域(Hall等人.，HumanGeneTherapy,11:983-993，2000),側(cè)翼為關(guān)鍵連接體(以下劃線標(biāo)出))克隆到該獨(dú)特Pstl位點(diǎn)內(nèi)，產(chǎn)生pBvl/CAEP。嵌合包膜蛋白在293T生產(chǎn)細(xì)胞中的表達(dá)由強(qiáng)CMV(即啟動(dòng)子)驅(qū)動(dòng)。嵌合包膜正確加工，并且穩(wěn)定導(dǎo)入逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒內(nèi)，該逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒顯示功能增加表型，而感染滴度沒有明顯損失。膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的正確方向通過DNA序列分析進(jìn)行驗(yàn)證，質(zhì)粒質(zhì)量控制通過Pstl限制酶消化進(jìn)行驗(yàn)證，Pstl將質(zhì)粒線性化，并且釋放膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。進(jìn)一步改善原質(zhì)粒pBvl/CAEP，以減少在Rexin-GTM生產(chǎn)過程中產(chǎn)生有復(fù)制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒(RCR)的潛力。載體pBv1/CAEP在莫洛尼(Moloney)包膜ATG起始密碼子上游含有38個(gè)堿基對(duì)的非翻譯序列。該載體在莫洛尼包膜終止密碼子下游也含有76個(gè)堿基對(duì)的非翻譯序列。利用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)除去這兩個(gè)非翻譯序列(38+76=114堿基對(duì))，僅擴(kuò)增從ATG起始密碼子到TGA終止密碼子的莫洛尼包膜開放閱讀框序列。使用以下引物組NewEnvFlCTCAAGATA3'NewEnvRl5'用pBvl/CAEP作為PCR反應(yīng)的模板，以確保將獨(dú)特的馮維勒布蘭德膠原結(jié)合位點(diǎn)(GHVGWREPSFMALSAA)正確拷貝到僅有新的開放閱讀框的包膜PCR產(chǎn)物內(nèi)。產(chǎn)生正確的2037個(gè)堿基對(duì)的PCR產(chǎn)物，使其連接到pCR2克隆載體內(nèi)，測(cè)序，確保與預(yù)期序列具有100°/。的序列一致性。從pCR2質(zhì)粒骨架上切下這一正確測(cè)序的僅有莫洛尼包膜開放閱讀框的基因，將其亞克隆到來自Gendantis(以前稱為GeneTherapySystems)的超高表達(dá)質(zhì)粒pHCMV中，產(chǎn)生新的質(zhì)粒pB-RVE。該質(zhì)粒在大量不同的滴度測(cè)定中進(jìn)行;f企測(cè)，發(fā)現(xiàn)它的強(qiáng)度增加，使得現(xiàn)在在轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞時(shí)最好使用少3-5倍的量，與pCgpn和pE-REX達(dá)到類似的滴度。這暗示pB-RVE質(zhì)粒比相應(yīng)的pBVl/CAEP質(zhì)粒在生產(chǎn)功能性包膜蛋白方面強(qiáng)3-5倍。然而，如果使用相同量的pB-RVE質(zhì)粒作為正常量的pBvl/CAEP，將產(chǎn)生低的多的滴度。該結(jié)果強(qiáng)調(diào)了進(jìn)行一整套質(zhì)粒比例研究對(duì)于獲得產(chǎn)生最高滴度的最佳比例的重要性。在某些情況下，三種質(zhì)粒成分基因中任一個(gè)的過量表達(dá)可以在裝配和加工過程中破壞病毒部分的精細(xì)平tf,并且可以導(dǎo)致如在較低滴度時(shí)發(fā)現(xiàn)的抑制效果。我們選用比pBVl/CAEP少3-5倍的pB-RVE獲得類似高的滴度，并利用該質(zhì)粒獲得了使用相當(dāng)?shù)偷牧窟M(jìn)行GMP逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。這種高水平表達(dá)的效果最可能是由于包膜基因從與CMV內(nèi)含子串聯(lián)的CMV啟動(dòng)子增強(qiáng)子表達(dá)。這種組合比從CMV啟動(dòng)子表達(dá)(如pBVl/CAEP質(zhì)粒)強(qiáng)3-5倍。質(zhì)粒pCgpn含有MoMuLVgag-pol編碼序列(GenBank登錄號(hào)331934)，該序列最初來源于原病毒克隆3P0,為pGag-pol-gpt，(Markowitz等人.，JournalofVirology,62:1120-1124,1988),顯示^包裝信號(hào)的134個(gè)堿基對(duì)的缺失和env編碼序列的截短。該構(gòu)建體作為pCgp中的EcoRl片段提供，其中5'EcoRI位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于位于Gag上游的Xmain位點(diǎn)，3'EcoRI位點(diǎn)添加到env中Scal位點(diǎn)的附近。從pCgp上切下EcoRI片段，連接到pcDNA3.1+表達(dá)載體(Invitrogen)的獨(dú)特EcoRl克隆位點(diǎn)內(nèi)。通過用Sail進(jìn)行限制酶消化來證實(shí)正確的方向，并且通過用EcoRI和HindIII進(jìn)行消化進(jìn)一步表征插入片段。分別利用T7啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)引物(S1)和pcDNA3.1/BGH反向引物位點(diǎn)(ASl),通過DNA序列分析證實(shí)gag-pol插入片段的5'和3'序列。獲得的質(zhì)粒命名為pCgpn,它編碼由強(qiáng)CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的gag-pol多蛋白質(zhì)和由SV40早期啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的新霉素抗性基因。該質(zhì)粒中SV40ori的存在使得在表達(dá)SV40大T抗原的細(xì)胞系(即293T生產(chǎn)細(xì)胞)中能夠進(jìn)行游離型復(fù)制。下面描述了攜帶pdnGl/C-REX逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的質(zhì)粒的構(gòu)建，其含有顯性陰性細(xì)胞周期Gl構(gòu)建體(dnGl)。通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方案，該質(zhì)粒在生產(chǎn)高感染滴度載體方面增強(qiáng)。通過PCR，由全長細(xì)胞周期蛋白Gl模板產(chǎn)生編碼人細(xì)胞周期蛋白Gl的氨基酸41-249的cDNA序列(472-1098+終止密碼子)(CYCG1,Wu等人，OncologyReports,1:705-11，1994;登錄號(hào)U47413),引入NotI/SalI突出端。開始時(shí)將N末端缺失突變體構(gòu)建體克隆到TA克隆載體(Invitrogen)內(nèi)，然后進(jìn)行NotI/SalI消化，并將純化的插入片段連接到NotI/SalI消化的pGlXSvNa逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體(GeneticTherapy,Inc.)內(nèi)，產(chǎn)生具有5'和3'長末端重復(fù)(LTR)序列和^逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝序列的pdnGlSvNa載體。CMV，即啟動(dòng)子-增強(qiáng)子，通過PCR由CMV驅(qū)動(dòng)的pIRES模板(Clontech)制備，引入SacII突出端，并且克隆到位于5'LTR上游的pdnGlSvNa的獨(dú)特SacII位點(diǎn)內(nèi)。有利于測(cè)定載體滴度的新霉素抗性基因由具有嵌套o(hù)ri的Sv40e.p.驅(qū)動(dòng)。除了Sv40ori以外還包含強(qiáng)病毒載體(Soneoka等人.，NucleicAcidResearch,23:628-633,1995)。CMV啟動(dòng)子的正確的方向和序列通過限制性消化和DNA序列分析加以驗(yàn)證，dnGl編碼序列也是如此。質(zhì)粒身份和質(zhì)量控制通過用SacII(其釋放乃ObpCMV啟動(dòng)子)和BglII(其在dnGl構(gòu)建體內(nèi)的獨(dú)特位點(diǎn)進(jìn)行切割)進(jìn)行消化來驗(yàn)證。已經(jīng)證明使用pdnGl/C-REX和pBvl-CAEP進(jìn)行多GMP逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)是安全的并且不含RCR。第4代和第5代基于MLV的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和載體生產(chǎn)方法，即斷裂(split)基因組設(shè)計(jì)，在標(biāo)準(zhǔn)GMP條件下已經(jīng)產(chǎn)生了一致的生產(chǎn)質(zhì)量，而不產(chǎn)生RCR(Sheridan等人.，2000;Merten,2004)。然而，我們以及其他人已經(jīng)看出所有可以獲得的載體構(gòu)建體含有顯著量的殘余gag-pol序列，該序列可能與相應(yīng)gag-pol質(zhì)粒構(gòu)建體中所含的5'DNA序列重疊(Yu等人.，2000》當(dāng)載體生產(chǎn)最終放大到使用較大細(xì)胞數(shù)和相應(yīng)質(zhì)粒濃度的商業(yè)規(guī)模時(shí)，這些顯著的重疊區(qū)域可能成為問題?？紤]到這些，我們選擇通過限制性消化和PCR克隆從親本pdnGl/C-REX載體中除去487個(gè)堿基對(duì)的殘余gag-pol序列(pdnGl/C-AREX)，接著插入合成的97bp包膜剪接受體位點(diǎn)(ESA)(Lazo等人.，(1987)J.Virol.61(6):2038-41)，該位點(diǎn)用來抵消包裝(滴度)和基因表達(dá)(效能)方面的損害(圖22)。pdnGl/C-REX的這些產(chǎn)生的安全性改變導(dǎo)致產(chǎn)生pdnGl/UBER-REX，它編碼并且表達(dá)完全相同的轉(zhuǎn)基因(dnGl和neo),不含487個(gè)石咸基對(duì)的GAG,現(xiàn)在代替以前的質(zhì)粒產(chǎn)生Rexin-G。圖23顯示了C-REX和C-REXII質(zhì)粒和UBER-REX質(zhì)粒之間的示意性比較。在高度控制和優(yōu)化的生產(chǎn)條件下pB-RVE、pCgpn、pdnGl/UBER質(zhì)粒以確定比例的組合產(chǎn)生了不含RCR的臨床載體產(chǎn)物，報(bào)告的最高非濃縮GMP終產(chǎn)物逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度〉5x109Cfu/mL。實(shí)施例2:REXIN-G終產(chǎn)物Mx-dnGl(REXIN-GTM)是基質(zhì)(膠原)靶向的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其編碼N末端缺失突變?nèi)思?xì)胞周期蛋白Gl構(gòu)建體，在雜合LTR7CMV啟動(dòng)子的控制之下。該載體也含有由SV40早期啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的新霉素抗性基因。Mx-dnGl載體通過用3種質(zhì)粒瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染從完全驗(yàn)證的原始細(xì)胞庫中獲得的293T(用SV40大T抗原轉(zhuǎn)化的人胚腎293細(xì)胞)細(xì)胞而《曰狄付。轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的成分包括pdnGl/C-REX治療性質(zhì)粒構(gòu)建體，其含有由CMV立即早期啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的編碼氨基酸41-249的人細(xì)胞周期蛋白Gl基因的缺失突變體、包裝序列和在內(nèi)部SV40早期啟動(dòng)子控制下驅(qū)動(dòng)的細(xì)菌新霉素抗性基因。開始時(shí)將截短的細(xì)胞周期Gl基因克隆到TA克隆載體(Invitrogen)內(nèi)，接著進(jìn)行NotI/SalI消化，將純化的插入片段連接到NotI/SalI消化的pGlXSvNa逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體(GeneticTherapy,Inc.，Gaithersburg,MD提供)中，產(chǎn)生包含5'和3'LTR序列和vj;序列的pdnGlSvNa載體。CMV，即啟動(dòng)子-增強(qiáng)子，通過PCR由CMV驅(qū)動(dòng)的pIRES模板(Clontech)制備，引入SacII突出端，并且克隆到位于5'LTR上游的pdnGlSvNa的獨(dú)特SacII位點(diǎn)內(nèi)。用pdnGl/UBER-REX代替質(zhì)粒pdnGl/C-REX，它是下一代質(zhì)粒，編碼并且表達(dá)完全相同的轉(zhuǎn)基因(dnGl和neo)，而不含在原pdnGl/C-REX中發(fā)現(xiàn)的487個(gè)堿基對(duì)的GAG。該系統(tǒng)進(jìn)一步包括Mx(Bvl/pCAEP)包膜質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有CMV驅(qū)動(dòng)的修飾的雙嗜性4070A包膜蛋白，其中膠原結(jié)合肽插入位于4070A包膜N末端區(qū)氨基酸6和7之間的工程化的Pstl位點(diǎn)中。用pB-RVE代替Mx(Bvl/pCAEP)包膜質(zhì)粒，pB-RVE是一種改善的質(zhì)粒，其中取消了可能與天然非翻譯(UTR)序列重疊的114bp的外來逆轉(zhuǎn)錄病毒序列。該系統(tǒng)還包括pCgpn質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有由CMV立即早期啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的MLVgag-pol元件。它作為pGag-pol-gpt來源于克隆3PO。載體骨架是來自Invitrogen的pcDNA3.1+。來自牛生長激素的聚腺苷酸化信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止序列4是高了RNA穩(wěn)定性。SV40ori與e.p.—起'用于在表達(dá)SV40靶T抗原的細(xì)胞系中進(jìn)行游離型復(fù)制和載體拯救。通過限制性內(nèi)切核酸酶消化分析了這些質(zhì)粒，細(xì)胞培養(yǎng)基由添加了每升4克葡萄糖、每升3克碳酸氫鈉、10%Y射線照射的胎牛血清(Biowhittaker)的DMEM培養(yǎng)基組成。血清從USA來源獲得，經(jīng)檢測(cè)不含牛病毒，符合USDA的規(guī)定。用丁酸鈉誘導(dǎo)增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的芽殖。使上清液通過0.45微米濾器，或者利用切向流/滲濾法濃縮，處理得到的病毒顆粒。病毒顆粒從外觀上看是C型逆轉(zhuǎn)錄病毒。收獲逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，著、浮在95。/。DMEM培養(yǎng)基和1.2%人血清白蛋白的溶液中。該制劑以150ml等份貯存在500ml冷凍袋中，凍存于-70至-86。C直到使用。對(duì)于使用改良的pB-RVE和pdnGl/UBER-REX質(zhì)粒產(chǎn)生的Rexin-G,治療性納米顆粒的生產(chǎn)、懸浮和收集在培養(yǎng)基最終配方中不含牛血清的情況下進(jìn)行，該培養(yǎng)基在無菌閉環(huán)系統(tǒng)中通過連續(xù)的澄清、過濾和最終裝入冷凍袋中來處理。得到的C型逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，平均直徑為IOO納米，缺乏所有病毒基因，并且是完全復(fù)制缺陷的。臨床用批次的滴度范圍為3x107至5x1(^集落形成單位(U)/ml，驗(yàn)證每一批的必需純度和生物學(xué)效能。給患者施用的Mx-dnGl載體的準(zhǔn)備包括在37。C80%乙醇浴中在載體袋中融化該載體。每個(gè)載體袋在給患者輸注前1小時(shí)融化，用阿法鏈道酶(10U/ml)處理，在l-3小時(shí)內(nèi)立即輸注。用改良的pB-RVE和pdnGl/UBER-REX質(zhì)粒產(chǎn)生的經(jīng)處理的臨床級(jí)Rexin-GTM密封在冷凍袋中，在運(yùn)輸前貯存在-70±10。C冰箱中。每批經(jīng)驗(yàn)證和發(fā)出的含有Rexin-GTM載體的冷凍袋在干冰上運(yùn)輸至臨床地點(diǎn)，在該地點(diǎn)載體保存在-70±10。C冰箱中直到使用。在靜脈內(nèi)輸注前15分鐘，將載體在32-37。C水浴中快速融化，立即輸注，或者在專用盤或冷卻器中在冰上運(yùn)輸?shù)交颊叻块g或臨床地點(diǎn)立即使用?；颊呓?jīng)周圍靜脈、中心IV線或肝動(dòng)脈接受Rexin-GTM輸注。使用各種給藥方案，如臨床研究A、B和C所述(下文)；然而，8ml/kg/劑的最大體積每天給予一次。每袋Rexin-G"4ml/min的速度在10-30分鐘內(nèi)輸注。實(shí)施例3:Mx-dnGl載體的治療有效性檢驗(yàn)了Mx-dnGl在體外抑制癌細(xì)胞增殖、在肝轉(zhuǎn)移棵鼠模型體內(nèi)阻止腫瘤生長的有效性。選擇胰腺來源的未分化的人癌細(xì)胞系作為轉(zhuǎn)移性癌的原型。逆轉(zhuǎn)錄病毒在這些癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率是極佳的，范圍為26%至85%，取決于感染復(fù)數(shù)(分別為4和250)。為了篩選治療性基因，在使用攜帶各種細(xì)胞周期蛋白Gl構(gòu)建體的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中進(jìn)行細(xì)胞增殖研究。在標(biāo)準(zhǔn)條件下，Mx-dnGl載體一致性地表現(xiàn)出最大的抗增殖效果，伴隨著在20kDa區(qū)域處出現(xiàn)免疫反應(yīng)性細(xì)胞周期Gl,代表dnGl蛋白?；谶@些結(jié)果，選擇Mx-dnGl載體進(jìn)行隨后的體內(nèi)有效性研究。為了評(píng)價(jià)Mx-dnGl在體內(nèi)的表現(xiàn)，通過保持14天的留置導(dǎo)管將7x105人胰腺癌細(xì)胞輸入門靜脈內(nèi)建立了肝轉(zhuǎn)移棵鼠模型。在三天后開始載體輸注，包括200ml/天的Mx-dnGl(REXIN-GTM;滴度9.5x108cfu/ml)或PBS鹽水對(duì)照，總共9天。載體輸注結(jié)束1天后處死小鼠。對(duì)來自用PBS或低劑量Mx-dnGl治療的小鼠的轉(zhuǎn)移性腫瘤灶進(jìn)行了組織學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)評(píng)價(jià)，并用Optimas成像系統(tǒng)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。人細(xì)胞周期蛋白Gl蛋白在轉(zhuǎn)移性腫瘤灶中高度表達(dá)，證據(jù)是在PBS治療的動(dòng)物中以及在Mx-dnGl載體治療的動(dòng)物的剩余腫瘤灶中周期蛋白Gl的核免疫反應(yīng)性(椋色染色物質(zhì))提高。對(duì)來自對(duì)照動(dòng)物的肝切片的組織學(xué)檢查顯示了具有血管生成和基質(zhì)形成區(qū)域的腫瘤灶；上皮成分為細(xì)胞角蛋白染色陽性，相關(guān)的腫瘤基質(zhì)細(xì)胞/內(nèi)皮細(xì)胞為波形蛋白和FLK受體染色陽性。相比之下，低劑量Mx-dnGl治療的動(dòng)物中腫瘤灶的平均大小顯著低于PBS對(duì)照(p-0.001),同時(shí)顯示凋亡細(xì)胞核密度比PBS對(duì)照組局灶性增加。此外，在Mx-dnGl治療的動(dòng)物的殘留腫瘤灶中觀察到PAS+,CD68+和帶有含鐵血黃素的巨噬細(xì)胞的浸潤，提示退化的腫瘤細(xì)胞和腫瘤碎片被肝臟網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)主動(dòng)清除?？傊@些發(fā)現(xiàn)證明了帶有殺細(xì)胞細(xì)胞周期控制基因的耙向可注射逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的體內(nèi)抗腫瘤效果，并且代表了用于轉(zhuǎn)移癌的耙向可注射載體的發(fā)展中的重要進(jìn)展。在棵鼠的皮下人胰腺癌模型中，我們證明了與非耙向的CAE-dnGl載體(p=0.014)、帶有標(biāo)記基因的對(duì)照基質(zhì)靶向載體(Mx-nBg;p=.004)和PBS對(duì)照(p=.OOl)相比，靜脈內(nèi)(IV)輸注Mx-dnGl增強(qiáng)了基因遞送，并且阻止了皮下腫瘤的生長。增強(qiáng)的腫瘤結(jié)節(jié)的載體滲透和轉(zhuǎn)導(dǎo)(35.7+S.D.1.4%)與療效有關(guān)，而沒有相關(guān)的全身毒性。也在用PBS安慰劑、非靶向CAE-dnGl載體和Mx-dnGl載體處理的小鼠中進(jìn)行了Kaplan-Meier生存研究。使用Tarone對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)，用于同時(shí)比較所有三個(gè)組的總p值為.0.003，趨勢(shì)顯著性水平為0.004,表明使用靶向Mx-dnGl載體長期控制腫瘤生長的可能性顯著大于使用非靶向CAE-dnGl載體或PBS安慰劑?？傊?，本研究證實(shí)通過外周靜脈注射^f吏用的Mx-dnGl(i)在一'j、時(shí)內(nèi)在生成血管的腫瘤血管系統(tǒng)中積累，(ii)高效率地轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤細(xì)胞，和(iii)增強(qiáng)治療性基因遞送和長期有效性，而不引發(fā)可檢測(cè)到的毒性。實(shí)施例4:藥理學(xué)/毒理學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)整合了靶向胞外基質(zhì)成分(例如膠原)的肽的基質(zhì)靶向可注射逆轉(zhuǎn)錄病毒載體增強(qiáng)了體內(nèi)治療性基因的遞送。使用兩個(gè)小鼠體的基質(zhì)靶向的基于MLV的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(命名為Mx-dnGl和MxV-dnGl),獲得了另外的數(shù)據(jù)。Mx-dnGl和MxV-dnGl都是基于4070AMLV的雙嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，顯示基質(zhì)(膠原)靶向的基序，用于耙向至病變區(qū)域。這兩種載體的唯一區(qū)別是MxV-dnGl是假型，具有水皰性口炎病毒G蛋白。在皮下人癌異種移植模型中，將1x10人MiaPaca2胰腺癌細(xì)胞(轉(zhuǎn)移性胃腸癌的原型)皮下植入棵鼠的側(cè)腹部。6天后，每天向尾靜脈內(nèi)直接注射200ialMx-dnGl載體，持續(xù)一個(gè)或兩個(gè)IO天的治療周期(總載體劑量分別為5.6x107[11=6]或1.6x108cfu[n=4])。在肝轉(zhuǎn)移棵鼠模型中，經(jīng)由保持10-14天的留置導(dǎo)管通過門靜脈注射7x105MiaPaca2細(xì)胞。從輸入肺瘤細(xì)胞三天后開始，每天在10分鐘內(nèi)輸注200mlMxV-dnGl載體，持續(xù)6天或9天(總載體劑量分別為4.8x106[11=3]或1.1x1()9cfu劑量[n-4])。對(duì)于生物分布研究，開發(fā)了基于T叫ManTM的試驗(yàn)來檢測(cè)在小鼠基因組DNA背景中含有SV40和新霉素(Neo)基因序列的基于GlXSvNa的載體(AltheaTechnologies,SanDiego,CA，USA)。該試驗(yàn)檢測(cè)95個(gè)核苷酸的擴(kuò)增子(GlXSvNa質(zhì)粒載體的核苷酸1779-1874),其中熒光標(biāo)記的纟罙針與SV40基因的3'部分和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶抗性(Neor)基因的5'部分重疊。對(duì)于Mx-dnGl或MxV-dnGl載體，沒有觀察到與載體相關(guān)的死亡率或發(fā)病率。在用低劑量和高劑量載體治療的動(dòng)物的肝臟、肺和脾臟中檢測(cè)到低水平陽性信號(hào)。在用載體治療的動(dòng)物的睪丸、腦或心臟中沒有檢測(cè)到PCR信號(hào)。在兩只具有留置導(dǎo)管而沒有抗生素預(yù)防的動(dòng)物中，組織病理學(xué)檢查顯示門靜脈靜脈炎、腎盂腎炎伴有局灶性心肌炎。在Mx-dnGl-或MxV-dnGl治療的小鼠的非靶器官中沒有注意到其他病理學(xué)狀況。血清化學(xué)譜顯示Mx-dnGl治療的動(dòng)物比PBS對(duì)照的ALT和AST溫和升高。然而，其水平仍然處于小鼠的正常限度內(nèi)。在7周隨訪期，在載體治療的動(dòng)物的血清中沒有檢測(cè)到載體中和抗體。上述臨床前發(fā)現(xiàn)證實(shí)了在兩個(gè)人胰腺癌棵鼠模型中靜脈內(nèi)輸注Mx-dnGl顯示沒有可檢測(cè)到的相鄰正常組織的損傷，也沒有全身副作用。通過靜脈內(nèi)輸注的靶向基因遞送方法具有幾個(gè)臨床相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。向靜脈系統(tǒng)內(nèi)輸注允許治療腫瘤以及潛伏的腫瘤灶。一般認(rèn)為在分裂的腫瘤細(xì)胞中觀察到的較高的有絲分裂速度將導(dǎo)致較高的腫瘤轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，而節(jié)約肝細(xì)胞和其他正常組織。因此，我們提出使用靜脈內(nèi)施用Mx-dnGl載體治療局部晚期或轉(zhuǎn)移性胰腺癌和其他標(biāo)準(zhǔn)化療難治性實(shí)體瘤的人臨床研究方案。實(shí)施例5:臨床研究本研究的目標(biāo)是(1)確定連續(xù)靜脈內(nèi)輸注Rexin-G的劑量限制性毒性和最大耐受劑量(安全性)，和(2)評(píng)價(jià)潛在的抗胂瘤應(yīng)答。該方案是為估計(jì)存活期至少為3個(gè)月的末期癌癥患者而設(shè)計(jì)的。邀請(qǐng)胂瘤科醫(yī)生認(rèn)為難以用標(biāo)準(zhǔn)化療治療的三名IV期胰腺癌患者參加由菲律賓食品藥物管理局批準(zhǔn)的使用Rexin-G的同情使用方案，。通過每天靜脈內(nèi)輸注Rexin-G,持續(xù)8-10天，給予患者內(nèi)劑量遞增方案。該方案結(jié)束后，為一周的劑量限制性毒性評(píng)價(jià)期；之后，施用最大耐受劑量的Rexin-G,再持續(xù)8-10天。如果患者在觀察期內(nèi)沒有發(fā)生與Rexin-G有關(guān)的3或4級(jí)不良事件，則如表l(見上)所示增加Rexin-G的劑量。用測(cè)徑器或通過放射成像技術(shù)(MRI或CT掃描)測(cè)量，按照公式寬度、長度x0.52連續(xù)確定腫瘤體積，以此評(píng)價(jià)腫瘤應(yīng)答。1號(hào)患者是一名47歲的菲律賓女性，通過活檢腫瘤組織的組織學(xué)檢查和分期研究診斷為在胰頭具有局限性腺癌。她接受了Whipples外科手術(shù)，包括完全切除了原發(fā)肺瘤。然后每周使用單藥吉西他濱，共7次劑量，但是由于難以承受的毒性而中斷了化療。幾個(gè)月后，后續(xù)MRI顯示原發(fā)腫瘤復(fù)發(fā)，轉(zhuǎn)移擴(kuò)散到鎖骨上和腹部淋巴結(jié)。按照臨床方案，該名患者在28天內(nèi)接受了兩次治療周期為10天的Rexin-G,累積劑量為2.1x1011單位，中間休息期為l周。在沒有全身毒性的情況下，該患者接受了另外10天的治療周期，總累積劑量為3xIO"單位。使用測(cè)徑器手工測(cè)量?jī)蓚€(gè)淺表鎖骨上淋巴結(jié)的尺寸。觀察到鎖骨上淋巴結(jié)的胂瘤體積進(jìn)行性縮小，到第28天第2治療周期結(jié)束時(shí)腫瘤尺寸分別縮小了33%和62%(表2)。表2:1號(hào)患者的鎖骨上淋巴結(jié)的測(cè)徑器測(cè)量值<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>后續(xù)腹部MRI顯示(i)沒有新的腫瘤轉(zhuǎn)移區(qū)，(ii)可以辨別的中心性壞死區(qū)，涉及40-50%的原發(fā)肝瘤，和(iii)主動(dòng)脈旁腹部淋巴結(jié)的大小顯著縮小(圖1A-B)。在第54天，后續(xù)MRI顯示原發(fā)腫瘤的大小沒有間隔改變。與這些發(fā)現(xiàn)一致，觀察到CA19-9血清水平進(jìn)行性降低(從峰值1200U/ml降至低值584U/ml),在第54天CA19-9水平達(dá)到50%的降低(圖1C)。然而，第IOI天的后續(xù)CT掃描顯示原發(fā)腫瘤和鎖骨上淋巴結(jié)的大小明顯增大?；颊呔芙^進(jìn)一步化療，直到第175天，該患者同意每周接受吉西他濱1000mg/m2。根據(jù)RECIST標(biāo)準(zhǔn)，l號(hào)患者在第189天存活，疾病進(jìn)展，距開始Rexin-G輸注6.75個(gè)月，距肝瘤復(fù)發(fā)ll個(gè)月，距最初診斷時(shí)20個(gè)月。2號(hào)患者是一名56歲的菲律賓女性，根據(jù)膽道清洗液的細(xì)胞學(xué)檢查，她被診斷為IVA期局部晚期和不可手術(shù)切除的胰頭癌。剖腹探查術(shù)顯示胂瘤環(huán)繞在門靜脈周圍，密切靠近地侵入腸系膜上動(dòng)脈和靜脈。她曾經(jīng)接受了外線束放射治療以及5-氟尿嘧啶，并進(jìn)一步接受了單藥吉西他濱，每周一次，共8次，然后每月維持劑量。然而，觀察到CA19-9血清水平進(jìn)行性升高，后續(xù)CT掃描顯示腫瘤大小增大(圖2A)?；颊呓邮軆蓚€(gè)治療周期的Rexin-G,每天靜脈內(nèi)輸注，總累積劑量為1.8xl0"單位。結(jié)果連續(xù)腹部CT掃描顯示腫瘤體積明顯縮小，從開始Rexin-G輸注時(shí)的6.0cn降至治療結(jié)束時(shí)的3.2cm3，在第28天腫瘤大小縮小47%(圖2A-C)。在第103天的后續(xù)CT掃描顯示腫瘤大小沒有間隔改變，之后患者保持每月吉西他濱給藥。根據(jù)RECIST標(biāo)準(zhǔn)，2號(hào)患者在第154天隨訪時(shí)存活，無癥狀，疾病穩(wěn)定，距開始Rexin-G輸注5.5個(gè)月，最初診斷后14個(gè)月。3號(hào)患者是一名47歲的中國糖尿病男性，診斷為患有IVB期胰體和胰尾腺癌，肝臟和肝門淋巴結(jié)廣泛轉(zhuǎn)移，通過CT引導(dǎo)的肝活檢得到證實(shí)。基于IVB期胰腺腺癌的快速致命性后果，邀請(qǐng)?jiān)摶颊邊⑴c第二臨床方案，使用前線Rexin-G,然后每周吉西他濱給藥。施用致敏劑量的Rexin-G，以使腫瘤對(duì)吉西他濱化療敏感，以具有更好的殺細(xì)胞效果。該患者每天接受靜脈內(nèi)輸注劑量為4.5x109單位/劑的Rexin-G,共6天，總累積劑量為2.7x101Q單位，然后8.次每周吉西他濱給藥(1000mg/m2)。第62天，后續(xù)腹部CT掃描顯示原發(fā)腫瘤的大小/人7.0x4.2cm(胂瘤體積64.2cm3)基線測(cè)量值縮小到6.0x3.8cm(腫瘤體積45cm3)(圖3A)。進(jìn)一步地，在第62天，肝結(jié)節(jié)數(shù)也從18個(gè)結(jié)節(jié)(基線)顯著減少為5個(gè)結(jié)節(jié)(圖3C)，最大的肝臟結(jié)節(jié)從基線2.2x2cm(胂瘤體積4.6cm3)消退至1x1cm(月中瘤體積0.52cm3)(圖3B)。根據(jù)RECIST標(biāo)準(zhǔn)，3號(hào)患者在第133天仍然存活，疾病穩(wěn)定，距開始Rexin-G輸注4.7個(gè)月，距診斷時(shí)約5個(gè)月。表3顯示3名患者中總胂瘤反應(yīng)的對(duì)比評(píng)價(jià)。使用RECIST標(biāo)準(zhǔn)，Rexin-G在全部3名患者中都導(dǎo)致腫瘤生長穩(wěn)定。表3:根據(jù)RECIST對(duì)總腫瘤反應(yīng)的評(píng)價(jià)患者編號(hào)123疾病分期復(fù)發(fā)IVBIVAIVB以前的RxWhipples手術(shù)外線束力t射治療無外線束放射治療5-氟尿嘧啶吉西他濱吉西他濱、、000Kamofsky評(píng)分69<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>在本研究中，使用兩種方法評(píng)價(jià)腫瘤對(duì)l爭(zhēng)脈內(nèi)輸注Rexin-G的應(yīng)答。使用測(cè)量大于2cm的目標(biāo)病變最長直徑總和的NCI-RECIST標(biāo)準(zhǔn)，以及作為對(duì)比點(diǎn)的所有非目標(biāo)病變的消失及持續(xù)存在，3名用Rexin-G治療的患者全部(100%)月中瘤生長穩(wěn)定超過100天(3個(gè)月)(表3)。通過腫瘤體積測(cè)定(公式寬度、長度x0.52)(16)對(duì)應(yīng)答的評(píng)價(jià)顯示，在全部3名(100%)患者中Rexin-G均誘導(dǎo)腫瘤消退，即，1號(hào)患者的轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)病有33-62%的消退(表2)，2號(hào)患者的原發(fā)腫瘤有47%的消退(圖2C)，3號(hào)患者的原發(fā)腫瘤有30%的消退，72%(13/18)的轉(zhuǎn)移性肝病灶消除，轉(zhuǎn)移性肝門結(jié)節(jié)89%消退，這通過影像學(xué)研究(MRI或CT掃描)和測(cè)徑器測(cè)量得到證明(圖3)。進(jìn)一步地，安全性評(píng)價(jià)顯示直到累積載體劑量為3xIO"單位時(shí)沒有發(fā)生劑量限制性毒素，表明可以給予更多的載體，以達(dá)到更大的治療效果。Rexin-G載體輸注與惡心或嘔吐、腹瀉、神經(jīng)病、脫發(fā)、血液動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定、骨髓抑制、肝或腎損傷無關(guān)。實(shí)施例6:臨床試驗(yàn)A,1/n期，Rexin-GTM，局部晚期或轉(zhuǎn)移性胰腺癌臨床研究A包括I/II期或單用方案，用于研究靜脈內(nèi)輸注Rexin-GTM對(duì)于局部晚期或轉(zhuǎn)移性胰腺癌的效果，由菲律賓食品藥品管理局(BFAD)或美國食品藥品管理局(FDA)和機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)或醫(yī)院倫理委員會(huì)(InstitutionalReviewBoardorHospitalEthicsCommittee)批準(zhǔn)(Gordon等人.(2004)Int'l.J.Oncol.24:177-185)。本研究的目標(biāo)是(l)確定每日靜脈內(nèi)輸注Rexin-GTM的安全性/毒性，和(2)評(píng)價(jià)靜脈內(nèi)輸注較高劑量水平的Rexin-GTM的潛在抗腫瘤反應(yīng)。該方案是為估計(jì)存活期至少為3個(gè)月的患者而設(shè)計(jì)的。在獲得知情同意后，6名不可手術(shù)切除的局部晚期或轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者通過重復(fù)輸注Rexin-GTM進(jìn)行治療。6名患者中有5名的標(biāo)準(zhǔn)化療失??；這些患者在菲律賓馬尼*扭和/或美國紐約Brooklyn完成如下的患者內(nèi)劑量遞增方案第1-2天3.8x109單位；第3-4天7.5x109單位；第5-6天1.1x1010單位；第7-10天1.5xl0"單位；休息一周；第18-27天:1.5x1010單位。.兩名患者接受另外一個(gè)治療周期，一名患者接受另外7個(gè)治療周期。患有不可手術(shù)切除的IV期胰腺癌的第六名患者接受聯(lián)合治療作為一線治療，包括6天的靜脈內(nèi)Rexin-GTM(3.8x109單位/天)，然后是每周一次吉西他濱(1000mg/m2)，共8周。對(duì)于臨床研究A，Rexin-GTM制劑的效能為3x10單位/ml。不良事件按照NIH普通毒性標(biāo)準(zhǔn)(CTCAE版本2或"(CommonToxicityCriteriaVersion2.0.CancerTherapyEvaluationProgram.DCTD，NCI,NIH,DHHS，March,1998.)分級(jí)。為了評(píng)價(jià)Rexin-GTM的臨床有效性，我們考慮藥物的總體殺細(xì)胞活性和抗血管生成活性(Gordon等人.(2000)CancerRes.60:3343-3347，Gordon等人.(2001)Hum.GeneTher.12:193-204)，以及親病灶性納米顆粒向轉(zhuǎn)移病變中的動(dòng)態(tài)攝取(Gordon等人.(2001)Hum.GeneTher.12:193-204),這將影響治療過程中靶向納米顆粒的生物分布或生物利用性。由于載體更容易在某些癌性病變內(nèi)積累一這取決于腫瘤侵占和血管生成的程度，預(yù)期不會(huì)均勻分布到其佘的腫瘤結(jié)節(jié)，特別是在具有高腫瘤負(fù)荷的患者中。這將可預(yù)測(cè)地誘導(dǎo)混合腫瘤反應(yīng)，其中部分腫瘤的大小可能縮小，而其他腫瘤結(jié)節(jié)可能變得更大，和/或新病變可能出現(xiàn)。之后，隨著總腫瘤負(fù)荷的正?；蛳陆?，親病灶性監(jiān)視功能將略微更均勻地分布循環(huán)納米顆粒。另外，；坡治療的病變?cè)陂_始時(shí)由于壞死性腫瘤誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)或嚢性變而可能變得尺寸較大。因此，在對(duì)Rexin-GTM治療的客觀腫瘤反應(yīng)的評(píng)價(jià)中，除了實(shí)體瘤標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(RECIST;Therasse等人.(2000)J.Nat'l.CancerInst.92:205-216)以外,還使用另外兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，即(1)用于估計(jì)腫瘤體積的O'Reilly公式LxW2x0.52(O'Reilly等人.(1997)Cell88:277-285),和(2)在治療期間肺瘤壞死或嚢性變的誘導(dǎo)。因此，目標(biāo)病變腫瘤體積縮小30%或更多或者誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)的壞死或嚢性變被認(rèn)為是部分反應(yīng)(PR)或陽性治療效果。利用單側(cè)精確檢驗(yàn)(one-sidedexacttest)確定用Rexin-GTM治療的患者的PR和歷史對(duì)照之間差異的顯著性，預(yù)期為5。/。PR。這一最初的I/II期研究檢查了患者內(nèi)劑量遞增方案的安全性和潛在有效性。如表4所示，在6名用Rexin-GTM治療的患者中有5名表現(xiàn)不同程度的部分反應(yīng)(PR)，而在其余患者中觀察到疾病穩(wěn)定。根據(jù)RECIST或者通過胂瘤體積測(cè)量，6名患者中有3名(50%)的腫瘤尺寸縮小30%或更多，通過活檢和/或后續(xù)MRI/CAT掃描，發(fā)現(xiàn)6名患者中有2名(33°/。)的原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)出現(xiàn)壞死。利用肝活檢對(duì)一名特殊患者(A3)進(jìn)一步分析，CT掃描可見該患者的8個(gè)腫瘤結(jié)節(jié)中有6個(gè)消失，這表明腫瘤結(jié)節(jié)內(nèi)的凋亡、壞死和纖維化的發(fā)生率提高，這與臨床前研究中的發(fā)現(xiàn)(18，19)類似，并且在肝活檢物的殘余肝臟腫瘤中觀察到大量腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(圖20-22)。浸潤剩余肝臟腫瘤的免疫反應(yīng)性T和B淋巴細(xì)胞的存在(圖22)表明Rexin-GTM不抑制局部免疫應(yīng)答。6名患者中有4名(67%)的無進(jìn)展存活期長于3個(gè)月。耐受化療的患者在Rexin-GTM治療后的存活期中值為10個(gè)月，診斷后的存活期中值為25個(gè)月。相比之下報(bào)道的接受吉西他濱或5-FU(標(biāo)準(zhǔn)治療)作為一線藥物的胰腺癌患者的存活期中值分別為診斷后5.65和4.41個(gè)月(Burris等人.(1997)J.Clin.Oncol.15:2403-2413)。利用單側(cè)精確檢驗(yàn)，與歷史對(duì)照的PR率相比，Rexin-GTM-治療的患者中部分反應(yīng)的顯著性水平<0.025。這些最初的發(fā)現(xiàn)，盡管只在較少的患者中得到證實(shí)，但是足以表明Rexin-GTM在臨床上是有效的，甚至在適中的劑量時(shí)，顯然優(yōu)于沒有藥物治療，并且在作為單藥治療晚期或轉(zhuǎn)移胰腺癌患者時(shí)，可能優(yōu)于吉西他濱。表4:臨床研究A參與者的客觀腫瘤反應(yīng)、無進(jìn)展存活期和總存活期<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>全部6名患者良好地耐受Rexin-GTM輸注，沒有相關(guān)的惡心和嘔吐、腹瀉、粘膜炎、脫發(fā)或神經(jīng)病。6名患者中有3名(50%)的疼痛癥狀緩解。沒有與研究藥物相關(guān)的血液動(dòng)力學(xué)功能的顯著改變、骨髓抑制、肝臟、腎臟或任何器官的功能障礙。明確與研究藥物有關(guān)的唯一的不良事件是在6名患者的2名中出現(xiàn)全身皮瘆和蕁麻滲(1-2級(jí))，可能相關(guān)的不良事件是在6名患者的2名中出現(xiàn)間歇熱(I級(jí))。在該研究中觀察到有限數(shù)量的治療引起的不良事件，提示以遞增劑量靜脈內(nèi)施用的Rexin-GTM是相對(duì)安全的治療。實(shí)施例7:在各種晚期或轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤中的臨床研究B，I/II期臨床研究B代表臨床研究A的擴(kuò)展。基于最初使用Rexin-GTM獲得的臨床經(jīng)驗(yàn)的令人鼓舞的結(jié)果，擴(kuò)展了I/II期研究，以進(jìn)一步確定較高劑量Rexin-GTM的安全性和潛在有效性，以將臨床適應(yīng)癥擴(kuò)大到所有難以用標(biāo)準(zhǔn)化療治療的晚期或轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤，并且調(diào)整治療日程和方案以允許門診治療。該研究的目的是(l)確定每日靜脈內(nèi)輸注Rexin-Gtm的安全性/毒性，和(2)評(píng)價(jià)靜脈內(nèi)輸注較高劑量水平的Rexin-GTM的潛在抗腫瘤反應(yīng)。該方案是為估計(jì)存活期至少為3個(gè)月的患者而設(shè)計(jì)的。在獲得知情同意后，IO名患有起源于外胚層(黑素瘤，1;喉鱗狀細(xì)胞癌，1)、中胚層(平滑肌肉瘤，l)或內(nèi)胚層(胰腺癌，2;乳腺癌，2;子宮癌，1;結(jié)腸癌，2)的轉(zhuǎn)移癌的患者，和一名以前未接受治療并且拒絕進(jìn)行化療的新診斷的轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者(患者總數(shù)為11),按照以下治療方案靜脈內(nèi)接受劑量為每天3.0x1010的作為單一藥物的Rexin-G:第1-5、8-12、15-19和22-26天；周一到周五，周末為休息期。改良的GMP生產(chǎn)和生物加工方案允許生產(chǎn)實(shí)質(zhì)更高滴度的Rexin-GTM,因此用于臨床研究B的制品顯示出7x1()8單位/ml的載體效價(jià)。不良事件按照NIH普通毒性標(biāo)準(zhǔn)(CTCAE版本2或3)(CommonToxicityCriteriaVersion2.0.CancerTherapyEvaluationProgram.DCTD,NCI，NIH,DHHS，March,1998.)分級(jí)。為了評(píng)價(jià)Rexin-GTM的臨床有效性，我們考慮藥物的總體殺細(xì)胞活性和抗血管生成活性(Gordon等人.(2000)CancerRes.60:3343-3347,Gordon等人.(2001)Hum.GeneTher.12:193-204)，以及親病灶性納米顆粒向轉(zhuǎn)移病變中的動(dòng)態(tài)攝取(Gordon等人.(2001)Hum.GeneTher.12:193-204),這將影響治療過程中靶向納米顆粒的生物分布或生物利用性。由于載體更容易在某些癌性病變內(nèi)積累一這取決于胂瘤侵占和血管生成的程度，預(yù)期不會(huì)均勻分布到其余的胂瘤結(jié)節(jié)，特別是在具有高腫瘤負(fù)荷的患者中。這將可預(yù)測(cè)地誘導(dǎo)混合肺瘤反應(yīng)，其中部分胂瘤的大小可能縮小，而其他胂瘤結(jié)節(jié)可能變得更大，和/或新病變可能出現(xiàn)。之后，隨著總腫瘤負(fù)荷的正常化或下降，親病灶性監(jiān)視功能將略微更均勻地分布循環(huán)納米顆粒。另外，被治療的病變?cè)陂_始時(shí)由于壞死性肺瘤誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)或嚢性變而可能變得尺寸較大。因此，在對(duì)Rexin-GTM治療的客觀胂瘤反應(yīng)的評(píng)價(jià)中，除了實(shí)體瘤標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(RECIST;Therasse等人.(2000)J.Nat'l.CancerInst.92:205-216)以外，還使用另外兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，即(l)用于估計(jì)腫瘤體積的O'Reilly公式LxW2x0.52(O'Reilly等人.(1997)Cell88:277-285)，和(2)在治療期間腫瘤壞死或嚢性變的誘導(dǎo)。因此，目標(biāo)病變肺瘤體積縮小30%或更多或者誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)的壞死或嚢性變被認(rèn)為是部分反應(yīng)(PR)或陽性治療效果。本研究通過劑量增加擴(kuò)展了最初的1/1I期胰腺癌方案，并且將其臨床應(yīng)用擴(kuò)大到所有實(shí)體瘤。如表5所示，在11名患者中的7人中(64%)觀察到不同程度的原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)的部分反應(yīng)。通過活檢或CT掃描確定，11名患者中有5人(45%)發(fā)生原發(fā)腫瘤和/或轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)壞死或凋亡，根據(jù)RECIST或腫瘤體積測(cè)量確定，ll名患者中有5人(45。/。)的原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)的尺寸縮小了30%以上。11名患者中有2人的疾病穩(wěn)定，一名具有大腫瘤負(fù)荷的患者發(fā)生混合胂瘤反應(yīng)，一名具有高肺瘤負(fù)荷(約50個(gè)肝臟結(jié)節(jié))的患者的疾病進(jìn)展。表5:臨床研究B的參與者的客觀腫瘤反應(yīng)、無進(jìn)展存活期和總存活<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>在胰腺癌患者中，以及在子宮癌、結(jié)腸癌、乳腺癌和惡性黑素瘤患者中，一致性地觀察到重復(fù)輸注Rexin-GTM引起的癌性淋巴結(jié)的進(jìn)行性縮小，這在理解有關(guān)藥效學(xué)方面是顯著的和有意義的。眾所周知前哨淋巴結(jié)一癌可能從原發(fā)腫瘤擴(kuò)散到的第一個(gè)淋巴結(jié)一對(duì)于我們理解轉(zhuǎn)移疾病的發(fā)病機(jī)理、診斷和預(yù)期治療來說相當(dāng)重要，Rexin-GTM向局部和遠(yuǎn)處淋巴結(jié)的明顯滲透是明顯的和順利的(表4和表5)。Rexin-G中的親病灶性納米顆粒在體內(nèi)循環(huán)時(shí)保持其生物活性的發(fā)現(xiàn)的臨床意義無需夸大，不僅在原發(fā)和轉(zhuǎn)移病變中積累，而且到達(dá)治療影響的淋巴結(jié)中。如圖23所示，來自惡性黑素瘤患者腹股溝區(qū)的癌、淋巴結(jié)的手術(shù)活4企顯示實(shí)質(zhì)壞死(23-A)、大面積的明顯凋亡(23-B)和充滿含鐵血黃素的巨噬細(xì)胞(23-C)排出腫瘤碎片的區(qū)域。而且，免疫組化染色顯示明顯的CD35+樹突細(xì)胞(23-D)、CD68+巨嗟纟田胞(23-E)、CD8+殺傷T細(xì)胞(23-F)和CD4+輔助T細(xì)胞(未示出)的單核細(xì)胞浸潤。親病灶性納米顆粒在滲入前p肖淋巴結(jié)內(nèi)轉(zhuǎn)移病變時(shí)其基因遞送功能(既殺細(xì)胞活性)保持活性，并且不破壞免疫系統(tǒng)而是與免疫系統(tǒng)協(xié)同作用，這再次證實(shí)了未來使用這種攜帶細(xì)胞因子基因的靶向基因遞送系統(tǒng)進(jìn)行原位癌癥接種的潛力。在另夕l、一名喉鱗狀細(xì)胞癌患者中，頸部MRI證實(shí)了上呼吸道明顯再開放(圖24)，這與患者聲音的恢復(fù)相關(guān)。無進(jìn)展存活期的范圍從1個(gè)月到大于5個(gè)月。存活時(shí)間中值大于從開始Rexin-GTM治療起6個(gè)月，超過距診斷24個(gè)月。11名患者中有8人(72%)存活/存活超過Rexin-GTM治療后6-13個(gè)月?？傊?，Rexin-GTM在廣泛的抗性腫瘤類型范圍中可能具有單藥活性。此外，注意到在大多數(shù)患者中觀察到持久的療效，盡管治療比較簡(jiǎn)短。全部11名患者良好耐受載體輸注，沒有相關(guān)的惡心或嘔吐、腹瀉、粘膜炎、脫發(fā)或神經(jīng)病。11人有8人(73%)的疼痛、胃氣脹、搏動(dòng)、聲音嘶啞和疲勞癥狀緩解。沒有與研究藥物相關(guān)的血液動(dòng)力學(xué)功能的顯著改變、骨髓抑制、肝臟、腎臟或任何器官的功能障礙。沒有與治療相關(guān)的不良事件進(jìn)一步提示甚至在提高載體劑量時(shí)，Rexin-G頂仍然是相對(duì)安全的治療。在這點(diǎn)上，沒有劑量限制性毒性，以及令人注意的在多種不同肺瘤類型中具有單藥有效性的跡象，和最近可以獲得較高效能的Rexin-GTM制劑，這些結(jié)合起來促進(jìn)了為提高臨床有效性和優(yōu)化治療方案而設(shè)計(jì)的臨床試驗(yàn)的進(jìn)展和批準(zhǔn)實(shí)施例8:臨床研究C,Rexin-GTM在轉(zhuǎn)移性胰腺癌和結(jié)腸癌中的擴(kuò)展應(yīng)用和"等價(jià)計(jì)算"臨床研究C涉及一小組患者,他們參與Rexin-GTM對(duì)于所有實(shí)體瘤的擴(kuò)展應(yīng)用計(jì)劃(五x;^wafed爿cce^),這是最近菲律賓BFAD批準(zhǔn)的一項(xiàng)臨時(shí)計(jì)劃。設(shè)計(jì)這一創(chuàng)新性的方案來盡可能快速且安全地解決(即減少或根除)特定患者的總腫瘤負(fù)荷，以防止或阻止"追趕性的"腫瘤生長，由此使這一混合參數(shù)最小化。估計(jì)的總應(yīng)用劑量通過經(jīng)驗(yàn)計(jì)算來確定，在此稱為"等價(jià)計(jì)算"(稱為一種在量上相等的方法，或功能等價(jià))?；竟娇紤]根據(jù)影像研究估計(jì)的總肺瘤負(fù)荷(1cm=大約1x109癌細(xì)胞)、對(duì)于靶向載體系統(tǒng)的經(jīng)驗(yàn)表現(xiàn)系數(shù)((j))或生理感染復(fù)數(shù)(P-MOI，病毒學(xué))(非靶向載體系統(tǒng)的P-MOI基本上是無限的)、和臨床級(jí)制劑的效能(單位/ml)。腫瘤負(fù)荷通過將以厘米為單位的腫瘤結(jié)節(jié)最長直徑之和乘以1x109確定，表示為癌細(xì)胞總數(shù)。"運(yùn)算定義的"表現(xiàn)系數(shù)((())或生理感染復(fù)數(shù)MOI(P-MOI)對(duì)于Rexin-GTM為100,基于在多項(xiàng)臨床前研究中證實(shí)的靶向基因遞送系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率提高的定量證明，并且基于在最初臨床試驗(yàn)中觀察到的Rexin-GTM的劑量依賴性表現(xiàn)。重要的是，高效Rexin-GTM產(chǎn)物(1.0x109單位/ml)的產(chǎn)生允許靜脈內(nèi)施用計(jì)算的Rexin-GTM最適劑量，而沒有體積過載的風(fēng)險(xiǎn)。開創(chuàng)性研究在前20天的Rexin-GTM輸注結(jié)束后，兩名轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者和一名轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者(取得知情同意)分別在6周(l名患者)和16周(2名患者)內(nèi)繼續(xù)接受靜脈內(nèi)Rexin-GTM輸注，可達(dá)大約2.5x1012單位的總劑量。這提供了等價(jià)計(jì)算，與基于CT掃描或MRI估計(jì)的患者腫瘤負(fù)荷大致平行。不良事件按照NIH普通毒性標(biāo)準(zhǔn)(CTCAE版本2或3)(CommonToxicityCriteriaVersion2.0.CancerTherapyEvaluationProgram.DCTD,NCI,NIH，DHHS，March,1998.)分級(jí)。為了評(píng)價(jià)Rexin-G丁M的臨床有效性，我們考慮藥物的總體殺細(xì)胞活性和抗血管生成活性(Gordon等人.(2000)CancerRes.60:3343-3347,Gordon等人.(2001)Hum.GeneTher.12:193-204)，以及親病灶性納米顆粒向轉(zhuǎn)移病變中的動(dòng)態(tài)攝取(Gordon等人.(2001)Hum.GeneTher.]2:193-204),這將容易在某些癌性病變內(nèi)積累一這取決于肺瘤侵占和血管生成的程度，預(yù)期不會(huì)均勻分布到其余的腫瘤結(jié)節(jié)，特別是在具有高腫瘤負(fù)荷的患者中。這將可預(yù)測(cè)地誘導(dǎo)混合腫瘤反應(yīng)，其中部分肺瘤的大小可能縮小，而其他腫瘤結(jié)節(jié)可能變得更大，和/或新病變可能出現(xiàn)。之后，隨著總腫瘤負(fù)荷的正?；蛳陆?，親病灶性監(jiān)視功能將略微更均勻地分布循環(huán)納米顆粒。另外，被治療的病變?cè)陂_始時(shí)由于壞死性胂瘤誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)或嚢性變而可能變得尺寸較大。因此，在對(duì)Rexin-GTM治療的客觀腫瘤反應(yīng)的評(píng)價(jià)中，除了實(shí)體瘤標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(RECIST;Therasse等人.(2000)J.Nat'l.CancerInst.92:205-216)以外，還使用另外兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，即(1)用于估計(jì)腫瘤體積的O'Reilly公式LxW2x0.52(O'Reilly等人.(1997)Cell88:277-285),和(2)在治療期間肺瘤壞死或嚢性變的i秀導(dǎo)。因此，目標(biāo)病變腫瘤體積縮小30%或更多或者誘導(dǎo)肺瘤內(nèi)的壞死或嚢性變被認(rèn)為是部分反應(yīng)(PR)或陽性治療效果。本研究是Rexin-GTM治療所有實(shí)體瘤的擴(kuò)散應(yīng)用計(jì)劃中的臨床經(jīng)歷首次報(bào)告，引入了被稱為等價(jià)計(jì)算的創(chuàng)新的個(gè)體化劑量密集方案。在這個(gè)初步但是重要的間斷分析中，在全部3名具有廣泛腫瘤負(fù)荷的患者中都觀察到顯著反應(yīng)。對(duì)于一名患者(Cl)，等價(jià)計(jì)算(或功能等同的方案)估計(jì)了累積劑量，后續(xù)MRI顯示，該累積劑量導(dǎo)致不可切除的胰腺胂瘤液化性壞死和嚢性轉(zhuǎn)變，以及所有轉(zhuǎn)移性肝結(jié)節(jié)的嚢性轉(zhuǎn)變或消失(圖25)。一個(gè)嚢性腫瘤結(jié)節(jié)的吸出物為惡性細(xì)胞陰性。對(duì)于患有IV期結(jié)腸癌的第二名患者(C2)，接近預(yù)定等價(jià)計(jì)算的累積劑量有效地減少轉(zhuǎn)移性病變的大小影像分析證實(shí)在肝腫瘤結(jié)節(jié)中觀察到84%的壞死。對(duì)于第三名患者(C3),CT掃描可見原發(fā)性胰腺腫瘤以及肺結(jié)節(jié)的數(shù)目(從28個(gè)肺結(jié)節(jié)降至12個(gè))和大小顯著降低。兩名患者在Rexin-GTM治療后的無進(jìn)展存活期和總存活期超過6個(gè)月。這些結(jié)果提供了初步證據(jù)，支持等價(jià)計(jì)算可以用來確定解決特定患者腫瘤負(fù)荷的Rexin-GTM總累積劑量的假設(shè)，因此包括最佳誘導(dǎo)方案。全部三名患者都良好地耐受載體輸注，沒有相關(guān)的惡心或嘔吐、腹瀉、粘膜炎、脫發(fā)或神經(jīng)病。沒有與研究藥物相關(guān)的血液動(dòng)力學(xué)功能急性改變、骨髓抑制、肝臟、腎臟或任何器官的功能障礙。兩名患者發(fā)生需要紅細(xì)胞輸入的貧血(3級(jí))，這可能與后來的壞死肺瘤內(nèi)出血有關(guān)。一名患者發(fā)生散發(fā)的血小板減少(l-2級(jí))，這可能與研究藥物有關(guān)。一名患者在Rexin-GTM治療3個(gè)月后死于急性暴發(fā)的葡萄球菌表皮炎敗血病，這不是研究藥物引起的。這名患者的尸檢結(jié)果顯示殘余的胰腺腫瘤幾乎完全壞死，肝臟和腹部腸系膜中剩余的轉(zhuǎn)移,f生肺瘤75-95%壞死，而在骨髓、心臟和腦中為正常組織學(xué)。Rexin-GTM施用不引起全身毒性強(qiáng)調(diào)了Rexin-GTM相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)化療在控制轉(zhuǎn)移癌以及其他生活質(zhì)量方面的潛在優(yōu)點(diǎn)。這各種情況下，總體肺瘤破壞程度是明顯的。證明了特別是為克服患者的胂瘤負(fù)荷而設(shè)計(jì)的Rexin-G劑量密集方案能夠達(dá)到這些有效性水平，這強(qiáng)調(diào)了需要進(jìn)一步精練等價(jià)計(jì)算，以確定最佳腫瘤消除率，并且確定用于經(jīng)歷殺肺瘤后創(chuàng)傷愈合的患者的最佳支持療法。實(shí)施例9:臨床研究D,Rexin-G用于標(biāo)準(zhǔn)化療難治性局部晚期或轉(zhuǎn)移性胰腺癌的I期臨床試驗(yàn)在臨床研究D中，12名局部晚期或轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者接受靜脈內(nèi)輸注Rexin-G治療，以證實(shí)在以上臨床研究A的6名患者中觀察到的初步臨床結(jié)果。這些最初的患者接受重復(fù)Rexin-G輸注，累積劑量可達(dá)10"cfu,而不顯示骨髓抑制或器官損傷。設(shè)計(jì)該研究用來按照劑量遞增方案基于觀察到的劑量限制性毒性(DLT)評(píng)價(jià)最大耐受劑量(MTD),其中MTD被定義為6名患者中最多有1人發(fā)生DLT、而下一較高劑量水平時(shí)6名患者中至少2人發(fā)生DLT的最高安全耐受劑量。血液學(xué)不良事件定義為根據(jù)NCI不良事件普通術(shù)語標(biāo)準(zhǔn)v3.0,任何23級(jí)的至少可能與Rexin-G相關(guān)的事件。3級(jí)ANC持續(xù)<72小時(shí)。非血液學(xué)不良事件定義為根據(jù)NCI不良事件普通術(shù)語標(biāo)準(zhǔn)v3.0，任何23級(jí)的至少可能與Rexin-G相關(guān)的事件。只有患者已經(jīng)接受最大支持治療時(shí)，才認(rèn)為23級(jí)的惡心、嘔吐或腹瀉是劑量限制性的。不認(rèn)為脫發(fā)是劑量限制性的?；颊呓邮苋齻€(gè)不同劑量水平的Rexin-G。對(duì)于劑量水平1,有3名患者在第1-7和15-21天時(shí)接受7.5x109cfu的治療。對(duì)于劑量水平2,有6名患者在第1-7和15-21天時(shí)接受1.1x101Gcfu的治療。對(duì)于劑量水平3，有3名患者在第l-5、8-12、15-19和22-26天時(shí)接受3.0x101Gcfu的治療。所有患者都接受每次每千克體重8ml的最大體積。對(duì)于劑量水平1,所有3名患者都完成療程，并且接受100%的劑量。沒有患者在治療過程中或在1周的觀察期內(nèi)發(fā)生DLT。對(duì)于劑量水平2,4名患者接受完全劑量的Rexin-G。在2名沒有接受完全劑量的患者中，一名患者由于可能與治療有關(guān)的3級(jí)AST和ALT升高而調(diào)整了劑量。然而，該患者還每日施用1000mg醋氨酚。在中斷Rexin-G和醋氨酚后72小時(shí)內(nèi)，所述升高降至I級(jí)。另一名患者由于發(fā)生2級(jí)堿性磷酸酶不利事件而堅(jiān)持了一天的治療。對(duì)于劑量水平3,至今還沒有毒性總結(jié)報(bào)告，但是沒有患者發(fā)生SAE或DLT。證實(shí)了Rexin-G在測(cè)試劑量水平的安全性后，研究了病毒顆粒在靜脈輸注后的藥代動(dòng)力學(xué)和它們引起免疫應(yīng)答、發(fā)生重組事件(產(chǎn)生有復(fù)制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒)和載體整合到非靶器官中的能力。對(duì)于病毒顆粒的藥代動(dòng)力學(xué)，在第1天載體輸注后0、5、30、60、HOmin和24小時(shí)時(shí)獲得全部12名患者的血樣?；谛旅顾乜剐?neor)基因產(chǎn)物的表達(dá)確定并定量Rexin-G載體濃度(病毒滴度)。簡(jiǎn)要地說，在轉(zhuǎn)導(dǎo)前一天，將1.5x104HT1080(人纖維肉瘤細(xì)胞)細(xì)胞接種在12孔板上。培養(yǎng)基與0.5ml連續(xù)稀釋的含有8jag/ml聚凝胺(polybrene)的病毒上清液一起在32°C、5%C02條件下輕搖孵育3.5小時(shí)。向培養(yǎng)物中加入0.5ml新鮮培養(yǎng)基，然后在37。C、5%C02條件下保持過夜。對(duì)于neor基因產(chǎn)物的表達(dá)，從轉(zhuǎn)導(dǎo)24小時(shí)后開始，通過用G418藥物(500)Lig/ml)處理篩選G418抗性集落。在G418藥物中孵育13天后通過限制稀釋定量用亞曱藍(lán)染色的GW8抗性集落數(shù)。病毒滴度表示為每毫升血清的集落形成單位數(shù)(cfu/ml)。結(jié)果證明，在接受劑量水平1的全部3名患者、接受劑量水平2的6名患者中的2人、接受劑量水平3的3名患者中的2人在Rexin-G輸注5分鐘后獲得的血樣中，neor選擇性Rexin-G載體含量極低(<1x102cfu/ml),但是可以檢測(cè)到。在30分鐘以外的時(shí)間點(diǎn)沒有回收到載體。最低的載體回收可能是由于許多因素，這一發(fā)現(xiàn)最可能表明載體向腫瘤內(nèi)的生物分布，已知其在輸注數(shù)分鐘內(nèi)發(fā)生。這符合臨床前研究結(jié)果，其中發(fā)現(xiàn)在靜脈內(nèi)輸注后數(shù)分鐘內(nèi)，顯著量的免疫反應(yīng)性Rexin-G在癌異種移植物中積累(Gordon等人.，2001)。循環(huán)載體向腫瘤內(nèi)的這種快速分配是由于親病灶性(尋找病變的)載體對(duì)于在活躍血管生成和/或肺瘤侵占區(qū)域特征性暴露的膠原蛋白微陣列的特定親和力和粘附性(例如在血小板粘附中)。因此，Rexin-G在受治療患者循環(huán)中的短生物半衰期可能是由于向原發(fā)和轉(zhuǎn)移病變內(nèi)的快速生物分布。無論有關(guān)的機(jī)制如何，在輸注后，極少的(如果有的話)循環(huán)Rexin-G在系統(tǒng)循環(huán)中保留超過30分鐘。在輸注前和治療4周(劑量水平l、2)后和6周(劑量水平3)后從全部12名患者獲得血清樣品，用來檢測(cè)抗載體抗體的存在。用載體中和試驗(yàn)和Western狹縫印跡分析結(jié)合4企測(cè)抗載體抗體的存在。在用劑量水平I-m的Rexin-G治療的患者的血清中未檢測(cè)到載體中和抗體和抗gp70env蛋白抗體。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了在小鼠中的臨床前結(jié)果，其中在重復(fù)輸注Rexin-G后沒有檢測(cè)到載體中和抗體。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了Rexin-G的低免疫原性，這允許重復(fù)靜脈內(nèi)施用，而不會(huì)喪失潛在的臨床有效性。在時(shí)間0(載體輸注前)和開始載體輸注4周(劑量水平2)后或6周(劑量水平3)后從7名患者獲得外周血淋巴細(xì)胞，從中提取DNA進(jìn)行RCR檢測(cè)。該試驗(yàn)設(shè)計(jì)用來通過PCR檢測(cè)Rexin-G逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中存在的2001bp莫洛尼鼠白血病病毒包膜(MoMLVEnv)基因一小部分(來自411-574bp的164bp片段)的存在。發(fā)現(xiàn)檢測(cè)的所有輸注后樣品都是RCR陰性的。在輸注前、治療后1周、4周(劑量水平1、2)、第5天和6周(劑量水平3)后從9名患者獲得外周血淋巴細(xì)胞，從中提取DNA檢測(cè)是否存在載體DNA整合。對(duì)外周血淋巴細(xì)胞中載體DNA整合的斗企測(cè)如下進(jìn)行離心患者的血樣，從RBC和血清中分離白細(xì)胞。使用Neo引物，對(duì)分離的白細(xì)胞DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR,以擴(kuò)增dnGl-Erex逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中存在的795bp新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPT)基因的一小部分(來自382-456bp的75bp片段)。在外周血淋巴細(xì)胞DNA中沒有4企測(cè)到載體DNA序列，證實(shí)了臨床前數(shù)據(jù)，其中除了Rexin-G治療的小鼠、大鼠和兔子的肝臟和脾臟(病毒清除器官)以外，在非靶器官中沒有檢測(cè)到載體DNA。靜脈內(nèi)施用Rexin-G后的抗腫瘤活性利用RECIST進(jìn)行評(píng)價(jià)。接受劑量水平1的所有3名患者都在第28天前后進(jìn)展。接受劑量水平2的6名患者中有5名在治療開始大約1個(gè)月內(nèi)進(jìn)展。其他患者按照RECIST被認(rèn)為疾病穩(wěn)定，但確實(shí)遭受癥狀惡化。接受劑量水平3的全部3名患者在第42天評(píng)價(jià)時(shí)進(jìn)展。利用測(cè)量的以Hounsfield單位表示的腫瘤密度來評(píng)價(jià)Rexin-G的生物學(xué)活性。對(duì)于接受劑量水平1的3名患者和接受劑量水平2的6名患者中的每一名，以Hounsfield單位表示的基線處和第28天時(shí)的腫瘤密度數(shù)據(jù)由多處病變獲得(7名患者中的5處病變，一名患者的3處病變，和一名患者的2處病變)。這些數(shù)據(jù)以兩種方式進(jìn)行總結(jié)。表6顯示了每名患者中，腫瘤密度任意降低的病變的比例，以及至少降低10%、15%和20%的病變的比例。病變顯然傾向于密度降低全部9名患者所測(cè)的病變的Hounsfield單位均為凈減少，其顯著性高于單獨(dú)偶然的預(yù)期(雙側(cè)p值=0.004)。然而，劑量水平?jīng)]有強(qiáng)烈的差異指示；例如，在針對(duì)顯示至少降低20%的病變比例比較劑量水平時(shí)，雙側(cè)p值為0.43(連續(xù)校正的Wilcoxon秩和檢驗(yàn))。表6:滿足肺瘤密度降低的各患者的病變比例<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>表7按照劑量水平總結(jié)了腫瘤密度降低滿足各種標(biāo)準(zhǔn)的患者的比例，例如，至少50%的病變的密度任意降低。另外，沒有清楚的證據(jù)表明劑量水平之間的差異。表7:根據(jù)幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，具有有效治療的患者的比例<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>這些lt據(jù)證實(shí)與基線測(cè)定值相比，在Rexin-G治療后目標(biāo)病變的腫瘤密度顯著降低，表明癌細(xì)胞數(shù)減少和/或腫瘤結(jié)節(jié)內(nèi)的壞死或嚢性轉(zhuǎn)化，這滿足CHOI的部分反應(yīng)(PR)標(biāo)準(zhǔn)，因此證實(shí)了Rexin-G生物學(xué)活性。接受劑量水平1的患者均具有導(dǎo)致死亡的疾病進(jìn)展，存活期中值為3.5個(gè)月。接受劑量水平2的所有患者具有導(dǎo)致死亡的疾病進(jìn)展，存活期中值為2.5個(gè)月。對(duì)于劑量水平3,—名患者在治療后存活4個(gè)月后死于疾病進(jìn)展，在最后一次隨訪時(shí)另外兩名患者仍然存活。本研究證實(shí)了在最初臨床研究A中獲得的結(jié)果，證明了Rexin-G在劑量水平1、2和3時(shí)的安全性。進(jìn)一步地，靜脈輸注后病毒顆粒的藥代動(dòng)力學(xué)指示快速胂瘤靶向，施用5分鐘后在血液中檢測(cè)到極少的病毒顆粒。在6周的隨訪期內(nèi)沒有觀察到誘發(fā)的針對(duì)病毒顆粒的免疫應(yīng)答，表明載體具有低免疫原性，因此允許重復(fù)治療周期。沒有發(fā)現(xiàn)重組事件，證實(shí)了3-質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)顯著降低這些事件的風(fēng)險(xiǎn)的能力。也沒有發(fā)現(xiàn)載體在非靶器官中的整合。接受劑量水平1和2的所有9名患者證實(shí)都有腫瘤密度降低，表明Rexin-G的生物學(xué)活性，但是在兩個(gè)劑量水平之間沒有觀察到腫瘤應(yīng)答的差異。實(shí)施例10:單藥Rexin-G對(duì)于轉(zhuǎn)移性骨肉瘤的有效性的病例研究于2003年12月診斷為右脛骨骨肉瘤的17歲的男性接受手術(shù)前順鉑、阿霉素和高劑量氨曱喋呤化療，然后行四肢救助術(shù)。對(duì)腫瘤的組織病理學(xué)檢查顯示手術(shù)前化療只引起50%的壞死。手術(shù)后，他接受兩次順鉑和阿霉素，兩次阿霉素和異環(huán)磷酰胺，使阿霉素的累積劑量達(dá)到400mg/m2?；熢?005年2月結(jié)束。2006年3月，后續(xù)CT掃描顯示有兩個(gè)左側(cè)肺轉(zhuǎn)移，通過VATS胸腔鏡手術(shù)切除。CT掃描和PET掃描顯示在手術(shù)區(qū)存在持久的病變。從2006年6月至11月，他接受了高劑量的氨曱喋呤和異環(huán)磷酰胺，然后在2006年11月接受了開胸手術(shù)。2006年12月的重復(fù)CT掃描顯示肺轉(zhuǎn)移進(jìn)展，證實(shí)標(biāo)準(zhǔn)化療失敗。2007年1月開始使用泰素帝(taxotere)、健擇(gemzar)和阿霉素進(jìn)行挽救治療，但是連續(xù)影像學(xué)檢查證明他的肺腫瘤在尺寸和數(shù)量上都增長，到2007年4月，從大小為1cm的一個(gè)肺結(jié)節(jié)生長為超過10個(gè)肺結(jié)節(jié)，最大病變的大小為4.2cm。在獲得正式知情同意后，患者加入Rexin-G單用方案。在開始Rexin-G治療之前,使用以前Gordon等人.(2006)描述的等價(jià)計(jì)算確定累積載體劑量將估計(jì)的腫瘤負(fù)荷(定義為1X109個(gè)癌細(xì)胞的所有病變最長直徑之和)乘以經(jīng)驗(yàn)靶向或生理系數(shù)100(生理感染復(fù)數(shù)，pMOI)。累積載體劑量確定為1.8x102cfuRexin-G載體，預(yù)測(cè)該患者需要18-20次Rexin-G輸注(每次1x1011cfu)才能終止疾病進(jìn)展并且誘導(dǎo)客觀腫瘤反應(yīng)。Rexin-G的第一治療周期為每周靜脈內(nèi)施用兩次1x1011cfu,持續(xù)4周，然后是2周的休息期，導(dǎo)致累積劑量為8x1011cfu。在連續(xù)治療周期^^前和之后進(jìn)行連續(xù)PET-CT掃描(圖30)。第一周期結(jié)束后一周獲得的PET-CT掃描顯示目標(biāo)病變的總大小增加28%，目標(biāo)病變的總腫瘤密度減少6%,4個(gè)目標(biāo)病變的SUV最大值之和降低33。/0，注意到3個(gè)新的小肺病變。由于替代治療選擇極少，并且沒有觀察到對(duì)Rexin-G輸注的毒性，F(xiàn)DA批準(zhǔn)另外的Rexin-G治療周期靜脈內(nèi)施用1x10"cfu，每周兩次，共4周，使累積劑量達(dá)到1.6xlO"cfu,這接近基于最初腫瘤負(fù)荷預(yù)測(cè)的Rexin-G總劑量。值得注意的是，在完成第二周期2周后進(jìn)行的PET-CT掃描顯示沒有新的病變，腫瘤密度之和增加539%,表明目標(biāo)病變鈣化，4個(gè)目標(biāo)病變的SUV最大值之和減少48%(圖31-33)。主要研究人員認(rèn)為這是對(duì)治療的陽性部分反應(yīng)，盡管腫瘤直徑之和增加。基于陽性腫瘤反應(yīng)，開始了對(duì)化療難治性復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性骨肉瘤的II期臨床試驗(yàn)。由于PET成〗象是測(cè)定腫瘤反應(yīng)的最有效的成像方法，并且因?yàn)镽ECIST標(biāo)準(zhǔn)由于腫瘤結(jié)節(jié)持續(xù)修補(bǔ)鈣化而不能準(zhǔn)確反映腫瘤反應(yīng)，F(xiàn)DA不使用標(biāo)準(zhǔn)RECIST標(biāo)準(zhǔn)而代之以國際PET標(biāo)準(zhǔn)，來監(jiān)視和報(bào)告肺瘤反應(yīng)。實(shí)施例11:使用適應(yīng)性試驗(yàn)設(shè)計(jì)的晚期I/II期臨床試驗(yàn)在美國對(duì)復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性肉瘤、乳腺癌或胰腺癌患者同時(shí)進(jìn)行三個(gè)具有適應(yīng)性試驗(yàn)設(shè)計(jì)的晚期I/II期臨床試驗(yàn)。這些研究的目標(biāo)有三方面。1)確定通過靜脈內(nèi)(IV)輸注施用的Rexin-G的劑量限制性毒性和最大耐受劑量。2)評(píng)價(jià)靜脈內(nèi)Rexin-G引起免疫應(yīng)答、重組事件和不希望的載體在非靶器官中整合的能力。3)鑒定靜脈內(nèi)施用的Rexin-G的抗胂瘤反應(yīng)。每項(xiàng)研究有總共有15-24名患者加入。表8示出了5個(gè)計(jì)劃的劑量水平，已經(jīng)以劑量水平0進(jìn)行治療。表8:Rexin-G的計(jì)劃劑量水平治療周期*(4周)劑量水平載體劑量/天每周兩次0起始劑量每周三次I每周三次II每周三次III每周三次IV4.0x10"cfu*每個(gè)治療周期均為6周(4周治療，兩周休息)。毒性<1級(jí)的患者可以進(jìn)行重復(fù)治療周期。1.0xl()Ucfu1.0x1011cfu2.0x1011cfu3.0x1011cfu最大體積/劑量200ml200ml200.ml200ml200ml三名采用肉瘤方案的患者以劑量水平O(lxlO11cfu，每周兩次)治療，觀察42天，沒有DLT。如果觀察到臨床效果并且所有治療相關(guān)毒性S1級(jí)，適應(yīng)性試驗(yàn)設(shè)計(jì)允許患者用相同治療周期治療。此外，如果毒性<l級(jí)，則患者也可以繼續(xù)接受下一個(gè)較高的劑量水平。劑量水平0的肉瘤患者目前加入劑量水平1。這將增加獲得腫瘤生長控制并且誘導(dǎo)客觀腫瘤反應(yīng)的機(jī)會(huì)，而不會(huì)影響安全性。適應(yīng)性試驗(yàn)設(shè)計(jì)也使主要研究者能夠在第一個(gè)治療周期結(jié)束后推薦手術(shù)斑塊切除或手術(shù)切除剩余的腫瘤。如果通過PET-CT掃描在組織病理學(xué)標(biāo)本中檢測(cè)到殘余腫瘤，并且該患者具有1級(jí)或更低的毒性，則重新開始治療周期。對(duì)于全部三項(xiàng)臨床試驗(yàn)，三名患者將加入劑量水平1。如果接受劑量水平1的3名患者中有一人發(fā)生3或4級(jí)與Rexin-G相關(guān)或可能相關(guān)的不良事件(CTCAE版本3.0),則另外3名患者加入同一劑量水平。如果接受劑量水平1的前3名患者中至少有兩人或者6名患者中有3人發(fā)生3至4級(jí)與Rexin-G相關(guān)或可能相關(guān)的不良事件，則向該研究中繼續(xù)增加，直到食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)討論這些數(shù)據(jù)，并作出是繼續(xù)還是終止研究的決定。這些劑量限制性毒素原則適用于所有劑量水平。直到3名患者已經(jīng)用前一劑量水平治療，并且觀察了42天(6周)，才將劑量升高到下一劑量水平'。沒有組內(nèi)劑量遞增。在任意劑量水平時(shí)，如果在前3名患者中證明有生物學(xué)活性，則可以加入最多6名患者。如果存在生物學(xué)活性的明顯證據(jù)，則可以終止劑量遞增。進(jìn)行一次修改，以允許基于明顯的生物學(xué)活性進(jìn)一步擴(kuò)大劑量水平。研究的主要終點(diǎn)是根據(jù)患者機(jī)體狀態(tài)、毒性評(píng)價(jià)評(píng)分、血液學(xué)和代謝語確定的、通過DLT和MTD證實(shí)的臨床毒性。次要終點(diǎn)是Rexin-G引起免疫應(yīng)答、重組事件或不希望的載體在非靶器官中整合的潛力。才艮據(jù)RECIST、CHOI和PET標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定對(duì)Rexin-G的客觀腫瘤反應(yīng)。迄今為止，IO名患者已經(jīng)用lxlO"cfu的第一劑量水平治療，每周兩次，共4周(肉瘤，n=6;乳腺癌，n=l;胰腺癌，n=3)。對(duì)4名患者進(jìn)行4周的腫瘤反應(yīng)評(píng)價(jià)，在表9中列出。表9:4名用劑量水平1的Rexin-G治療的患者的肺瘤反應(yīng)<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>表9顯示在Rexin-G治療4周后，三名接受肉瘤方案的患者中的兩人，和一名接受胰腺癌方案的患者，根據(jù)RECIST顯示疾病穩(wěn)定，4名患者根據(jù)PET顯示疾病穩(wěn)定。全部4名Rexin-G治療的患者在進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化療時(shí)經(jīng)CT掃描均證明有腫瘤進(jìn)展。這些數(shù)據(jù)表明，根據(jù)RECIST,Rexin-G終止了4名患者中的3人(75%)的肺瘤進(jìn)展，根據(jù)CHOI標(biāo)準(zhǔn)，終止了4名患者中的3人(75%)的腫瘤進(jìn)展，根據(jù)PET，終止了全部4名患者(100%)的腫瘤進(jìn)展，表明PET掃描成像結(jié)果可以用作腫瘤對(duì)Rexin-G治療的反應(yīng)的早期指示。按照FDA批準(zhǔn)的I/II期方案，另外3名患者加入第一劑量水平的肉瘤方案，因?yàn)轱@示Rexin-G在該劑量水平時(shí)具有生物學(xué)活性。進(jìn)一步地，肉瘤和胰腺癌方案中每一方案的6名患者都以每個(gè)劑量水平加入，以評(píng)價(jià)劑量應(yīng)答，并確定Rexin-G對(duì)于每個(gè)臨床適應(yīng)癥的最佳生物學(xué)劑量和治療方案。實(shí)施例12:49名用Rexin-G治療的患者的有效性和安全性數(shù)據(jù)的總結(jié)積累的臨床證據(jù)表明，與傳統(tǒng)化學(xué)治療相比，Rexin-G具有獨(dú)特的安全性分布。觀察到客觀腫瘤反應(yīng)(表IO),而沒有明顯發(fā)生不良事件或毒性(表11)。表10:施用的Rexin-G劑量和腫瘤應(yīng)答的總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table>表11:報(bào)告的副作用的總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>實(shí)施例13,Rexin-G在化療難治性復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者中的II期臨床研究利用PET-CT成像研究的結(jié)果計(jì)算估計(jì)的胂瘤負(fù)荷，據(jù)此將20-30名化療難治性復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者分入兩個(gè)不同的Rexin-G劑量水平。估計(jì)的腫瘤負(fù)荷的計(jì)算是將單位為cm的目標(biāo)病變最長直徑之和乘以109癌細(xì)胞。如果腫瘤負(fù)荷小于IOO億個(gè)細(xì)胞，則患者歸入劑量水平1,如果腫瘤負(fù)荷大于IOO億個(gè)細(xì)胞，則患者歸入劑量水平2(表12)。表12:難治性復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性骨肉瘤的Rexin-G治療的劑量水平和治療周期治療周期劑量水平載體劑量/天最大體積/劑量每周兩次11.Oxl0"cfu200ml每周三次21.Oxl0"cfu200ml治療周期為6周，包括4周的治療，然后是兩周的休息期。毒性<1級(jí)的患者可以進(jìn)行重復(fù)周期。對(duì)于前4個(gè)周期，每6周進(jìn)行一次PET-CT,然后每12周進(jìn)行一次。一或兩個(gè)治療周期后，主要研究人員可以推薦手術(shù)斑塊切除或者完全手術(shù)切除。如果通過組織病理學(xué)枱二查或者通過PET-CT掃描發(fā)現(xiàn)存在殘余的病變，如果手術(shù)切口愈合并且患者具有<1級(jí)的毒性，則可以在手術(shù)4周后給予重復(fù)治療周期。臨床研究的目標(biāo)是評(píng)價(jià)靜脈內(nèi)(IV)Rexin-G的臨床有效性和總體安全性。臨床有效性包括腫瘤反應(yīng)率、無進(jìn)展存活期和總存活期。利用國際PET標(biāo)準(zhǔn)將腫瘤反應(yīng)率評(píng)價(jià)為CR、PR或SD。無進(jìn)展存活期是超過一個(gè)月的存活期，總存活期定義為6個(gè)月或更長的存活期。靜脈內(nèi)施用的Rexin-G的總體安全性根據(jù)機(jī)體狀態(tài)、毒性評(píng)分、血液學(xué)、代謝譜、免疫應(yīng)答、載體向PBL中的整合和重組事件來確定。實(shí)施例14,用Rexin-G治療然后用Reximmune-C治療的晚期轉(zhuǎn)移'性胰腺癌患者的病例研究當(dāng)放射和化學(xué)治療不能控制轉(zhuǎn)移性胰腺癌向肝臟及在肝臟內(nèi)的擴(kuò)散時(shí)，這一重要器官中的腫瘤負(fù)荷可能生長到巨大的比例，從而以大量形成的腫瘤代替正常的肝實(shí)質(zhì)。這時(shí)，同情使用和知情同意結(jié)合起來支持應(yīng)用更具攻擊性的方案來減少致命腫瘤的負(fù)荷。圖34顯示了一組切片，這些切片顯示了從通過28天連續(xù)輸注Rexin-G(累積劑量2xl012cfu)然后6天Reximmune-C(累積劑量3xl0。cfu)治療的難治性轉(zhuǎn)移'性胰腺癌患者中獲得的尸檢腫瘤標(biāo)本中原發(fā)腫瘤的廣泛壞死。盡管這組輸注是良好耐受的，并且總體腫瘤負(fù)荷顯著減少，但是患者不能正常生長以及容易地消退大的病變，需要支持治療。遺憾的是，患者在治療3個(gè)月后死于暴發(fā)性大腸桿菌細(xì)菌膿毒癥，這被認(rèn)為與Rexin-G干預(yù)無關(guān)，而在更廣的意義上可能涉及燒傷后創(chuàng)傷愈合的問題。從圖34的A圖中可以看出，在圖B和C中放大，尸4企所見指示大量的壞死(n)，涉及該胰腺腫瘤的大約95%，具有多個(gè)纖維化區(qū)域(f)，側(cè)面為退化(deg)和細(xì)胞器結(jié)構(gòu)。針對(duì)GM-CSF的免疫組化染色鑒定了幾個(gè)區(qū)域，其中表達(dá)GM-CSF的腫瘤纟田胞(圖E和F)在小島中是明顯的(箭頭所示)(框入的區(qū)域，在E圖中放大)，在看起來象GM-CSF分泌細(xì)胞壞死片段的附近可見明顯的免疫浸潤(im)(圖F)。這一臨床病例研究強(qiáng)調(diào)了三個(gè)重要的問題(i)在癌癥產(chǎn)生無法挽救的器官損傷之前早期治療患者具有總體的重要性，(ii)Rexin-G具有滿足并適合極大腫瘤負(fù)荷的潛力，和(iii)具有免疫刺激負(fù)載的Reximmune-C具有參與腫瘤破壞過程的潛力。-除非另外說明，本發(fā)明的實(shí)施使用常規(guī)細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)技術(shù)，它們都是本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中均有描述。參見，例如，MolecularCloningALaboratoryManual,2ndEd.,ed.bySambrook,FritschandManiatis(ColdSpringHarborLaboratoryPress:1989);DNACloning,VolumesIandII(D.N.Glovered.，1985);OligonucleotideSynthesis(M.J.Gaited"1984);Mullis等人.美國專利No.4,683,195;NucleicAcidHybridization(B.D.Hames和S.J.Higginseds.1984);TranscriptionAndTranslation(B.D.Hames和S.J.Higginseds.1984);CultureOfAnimalCells(R.I.Freshney,AlanR.Liss，Inc.,1987);ImmobilizedCellsAndEnzymes(IRLPress,1986);B.Perbal，APracticalGuideToMolecularCloning(1984);thetreatise,MethodsInEnzymology(AcademicPress,Inc.,N,Y.);GeneTransferVectorsForMammalianCells(J.H.Miller和M.P.Cabseds.,1987,ColdSpringHarborLaboratory);MethodsInEnzyn，oogy，Vols.54and55(Wu等人.eds.),ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology(Mayer和Walker，eds.,AcademicPress,London,1987);HandbookOfExperimentalImmunology,VolumesI-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell,eds"1986);ManipulatingtheMouseEmbryo,(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor.N.Y.,1986)。權(quán)利要求1.一種對(duì)受試對(duì)象預(yù)防發(fā)生、治療或防止復(fù)發(fā)/再發(fā)與暴露的細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)的疾病或病癥的方法，包括向受試對(duì)象施用治療有效量的滴度至少為每毫升2×109集落形成單位(cfu/ml)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中該逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包含一種包含受體結(jié)合區(qū)的修飾的病毒包膜蛋白，其中該受體結(jié)合區(qū)修飾為包含具有可結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)成分的結(jié)合區(qū)的靶向多肽。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述疾病或病癥是癌癥、腫瘤、心血管疾病、慢性炎癥、自身免疫性疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、狼瘡、糖尿病、銀屑病、子宮內(nèi)膜異位癥、新生血管性青光眼、肥胖癥、肝硬化、結(jié)締組織病、與膠原暴露相關(guān)的血管病、新內(nèi)膜形成、血管損傷、再狹窄、纖維化、潰瘍性病變、炎癥、激光損傷、角膜渾濁、手術(shù)損傷、關(guān)節(jié)炎性關(guān)節(jié)、傷疤或瘢痕疙瘩。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述疾病或病癥是癌癥或腫瘤的轉(zhuǎn)移。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述疾病或病癥選自乳腺癌、皮膚癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、腦癌、子宮癌、喉癌、膽嚢癌、胰腺癌、直腸癌、曱狀旁腺癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、神經(jīng)組織癌、頭頸癌、結(jié)腸癌、胃癌、支氣管癌、腎癌、基底細(xì)胞癌、潰瘍型和乳頭樣鱗狀細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)移性皮膚癌、骨肉瘤、尤因肉瘤、網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤、骨髓瘤、巨細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺腫瘤、月旦結(jié)石、胰島細(xì)胞瘤、原發(fā)性腦腫瘤、急性和慢性淋巴細(xì)胞瘤和粒細(xì)胞瘤、毛細(xì)胞瘤、腺瘤、增生、髓樣癌、嗜鉻細(xì)胞瘤、粘膜神經(jīng)瘤、腸神經(jīng)節(jié)瘤、增生性角膜神經(jīng)瘤、馬方綜合征樣體質(zhì)胂瘤、腎母細(xì)胞瘤、精原細(xì)胞瘤、卵巢腫瘤、平滑肌腫瘤、宮頸發(fā)育異常和原位癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、S見網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、軟組織肉瘤、纖維肉瘤、惡性類癌瘤、局部皮膚損傷、蕈樣肉芽腫、橫紋肌肉瘤、卡波西肉瘤、成骨肉瘤和其他肉瘤、惡性高鈣血癥、腎細(xì)胞瘤、真性紅細(xì)胞增多癥、腺癌、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、白血病、淋巴瘤、惡性黑素瘤、表皮樣癌和其他癌和肉瘤。5.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述疾病或病癥是骨肉瘤、肉瘤、胰腺癌、乳腺癌或結(jié)腸癌。6.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括向受試對(duì)象施用不同的治療劑。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述不同的治療劑是不同于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的化療藥劑或生物制劑。8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述受試對(duì)象是人。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，在施用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體后，該人遭受的不良副作用相比他或她接受不同于所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的化療藥劑或生物制劑時(shí)減少。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述不良副作用選自脫發(fā)、毛發(fā)減少、毛發(fā)變細(xì)或微小化、骨髓抑制、肝功能和腎功能的實(shí)質(zhì)性不良改變、惡心、嘔吐、粘膜炎、皮滲和便秘。11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中治療有效量的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體經(jīng)局部、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、結(jié)腸內(nèi)、氣管內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、血管內(nèi)、鞘內(nèi)、顱內(nèi)、骨髓內(nèi)、胸膜內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、眼內(nèi)、骨內(nèi)和/或滑膜腔內(nèi)給藥。12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中通過靜脈內(nèi)輸注向受試對(duì)象施用治療有效量的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。13.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述靶向多肽是膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括馮維勒布蘭德因子D2結(jié)構(gòu)域衍生的肽。15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述馮維勒布蘭德因子是牛馮維勒布蘭德因子。16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中肽包含氨基酸序列Gly-His-Val-Trp-Arg-Glu-Pro畫Ser-Phe-Met-Ala陽Lys-Ser-Ala-Ala(SEQIDNO:l)。17.如權(quán)利要求15所述的方法，其中肽包含氨基酸序列Gly-His-Val-Gly-Trp-Arg-Gu-Pro-Ser-Phe-Met-Ala-Lys-Ser-Ala-Ala(SEQIDNO:2)。18.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述修飾的病毒包膜蛋白是雙嗜性的。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述修飾的雙嗜性病毒包膜是4070A雙嗜性包膜蛋白。■20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述4070A雙嗜性包膜蛋白包括含有膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的靶向多肽。21.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述輩巴向多肽包含于4070A雙嗜性包膜蛋白的gp70部分中。22.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包含與啟動(dòng)子有效連接的異源核酸序列，其中該序列編碼診斷性或治療性多肽。23.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述治療性多肽選自抑癌多肽、促凋亡多肽、胸苷激酶、細(xì)胞因子和殺細(xì)胞多肽。24.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述殺細(xì)胞多肽是細(xì)胞周期蛋白Gl的N末端缺失突變體。25.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述細(xì)胞周期蛋白Gl的N末端缺失突變體包含人細(xì)胞周期蛋白Gl的大約氨基酸41至249。26.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述細(xì)胞因子是粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。27.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述胸苷激酶是單純皰疹病毒胸苷激酶。28.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以1.0xl010cfu-1.0xl012cfu的每日劑量給藥。29.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述每日劑量連續(xù)給藥五天。30.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述每日劑量一周兩次給藥。31.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述每日劑量一周三次給藥。32.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以約1-500ml的體積給藥。32.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以lxio11cfu-lxlO"cfu的每周劑量給藥。33.如權(quán)利要求l所述的方法，其中治療有效量的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體按包括治療四周接著休息兩周的治療周期給藥。34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中如果受試對(duì)象表現(xiàn)出客觀反應(yīng)則再給予另一個(gè)治療周期。35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述疾病是癌癥并且其中客觀反應(yīng)包括臨床觀察、放射檢查結(jié)果、組織病理學(xué)結(jié)果、免疫組織化學(xué)結(jié)果和臨床化學(xué)結(jié)果。36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述臨床觀察包括通過測(cè)徑器或觸診檢測(cè)到肺瘤大小縮小，機(jī)體狀態(tài)改善，包括食欲增加、活動(dòng)性增強(qiáng)、疼痛減少，或?qū)χС中葬t(yī)護(hù)的需要減少，包括麻醉藥或氧氣的使用減少。37.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述放射檢查結(jié)果包括MRI、x射線、CT、PET、SPECT或超聲檢查結(jié)果。38.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述組織病理學(xué)結(jié)果包括與以前的結(jié)果或歷史對(duì)照相比凋亡的腫瘤或新血管系統(tǒng)細(xì)胞的百分比增加、壞死的腫瘤或新血管系統(tǒng)細(xì)胞的百分比增加、反應(yīng)性纖維化的百分t匕i曾力口。39.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述免疫組織化學(xué)結(jié)果包括腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的百分比增加或者表達(dá)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)基因的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)或百分比增加。40.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括給予治療有效量的包含與啟動(dòng)子有效連接的異源核酸序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中該序列編碼不同的治療性多肽。41.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述不同的治療性多肽是GM-CSF。42.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述病毒顆粒在受試對(duì)象的膠原暴露區(qū)域聚集。43.如權(quán)利要求42所述的方法，其中膠原暴露區(qū)域包括腫瘤病變部位、血管生成活躍區(qū)域、腫瘤病變部位、血管損傷部位、手術(shù)部位、炎癥部位和組織石皮壞區(qū)域。44.一種采用治療性病毒顆粒治療具有一個(gè)或多個(gè)胂瘤(含有癌細(xì)胞的腫瘤的受試對(duì)象的方法，該方法包括a)通過以下步驟確定治療性病毒顆粒的劑量i)按受試對(duì)象腫瘤內(nèi)存在的癌細(xì)胞數(shù)或胂瘤內(nèi)的肺瘤細(xì)胞總數(shù)來確定受試對(duì)象的腫瘤負(fù)荷；ii)用治療性病毒顆粒的生理感染復(fù)數(shù)(pMOI)乘以胂瘤負(fù)荷；和iii)將得到的數(shù)值除以治療性病毒顆粒的滴度，得到向受試對(duì)象施用治療性病毒顆粒的體積；b)向受試對(duì)象施用已確定的治療性病毒顆粒的劑量；c)監(jiān)測(cè)該一個(gè)或多個(gè)腫瘤對(duì)治療的應(yīng)答；和d)按腫瘤控制的需要重復(fù)步驟a)-c)。45.如權(quán)利要求44所述的方法，其中逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以1.0xl01Gcfu-1.0xl012cfu的每日劑量給藥。46.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述每日劑量連續(xù)給藥五天。47.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述每日劑量一周兩次給藥。48.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述每日劑量一周三次給藥。49.如;f又利要求44所述的方法，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以約為1-500ml的體積給藥。50.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以lxl011cfu-1x1014cfu的每周劑量給藥。51.如權(quán)利要求44所述的方法，其中治療有效量的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體按包括治療四周接著休息兩周的治療周期給藥。52.如權(quán)利要求44所述的方法，其中按以下公式計(jì)算以毫升為單位的治療性病毒顆粒的劑量腫瘤負(fù)荷(癌細(xì)胞數(shù))XpMOI病毒滴度(集落形成單位(C.RU.)/ml)其中pMOI是4-250。53.如權(quán)利要求52所述的方法，其中pMOI是大約100。54.如權(quán)利要求44所述的方法，其中按以下公式確定肺瘤負(fù)荷(目標(biāo)病變或腫瘤的最長直徑之和(cm))xlxi(f癌細(xì)胞/cm。55.如權(quán)利要求54所述的方法，其中通過測(cè)徑器或放射成像技術(shù)測(cè)量目標(biāo)病變或腫瘤。56.如權(quán)利要求55所述的方法，其中所述放射成像技術(shù)是MRI、CT、PET或SPECT掃描。57.如權(quán)利要求44所述的方法，其中治療性病毒顆粒.經(jīng)局部、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、結(jié)腸內(nèi)、氣管內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、血管內(nèi)、鞘內(nèi)、顱內(nèi)、骨髓內(nèi)、胸膜內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、目艮內(nèi)、骨內(nèi)和/或滑膜腔內(nèi)給藥。58.如權(quán)利要求57所述的方法，其中通過靜脈內(nèi)輸注向受試對(duì)象施用治療性病毒顆粒。59.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述受試對(duì)象是人。60.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述癌癥選自乳腺癌、皮膚癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、腦癌、子宮癌、喉癌、膽嚢癌、胰腺癌、直腸癌、甲狀旁腺癌、曱狀腺癌、腎上腺癌、神經(jīng)組織癌、頭頸癌、結(jié)腸癌、胃癌、支氣管癌、腎癌、基底細(xì)胞癌、潰瘍型和乳頭樣鱗狀細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)移性皮膚癌、骨肉瘤、尤因肉瘤、網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤、骨髓瘤、巨細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺肺瘤、膽結(jié)石、胰島細(xì)胞瘤、原發(fā)性腦腫瘤、急性和慢性淋巴細(xì)胞瘤和粒細(xì)胞瘤、毛細(xì)胞瘤、腺瘤、增生、髓樣癌、嗜鉻細(xì)胞瘤、粘膜神經(jīng)瘤、腸神經(jīng)節(jié)瘤、增生性角膜神經(jīng)瘤、馬方綜合征樣體質(zhì)胂瘤、腎母細(xì)胞瘤、精原細(xì)胞瘤、卵巢腫瘤、平滑肌腫瘤、宮頸發(fā)育異常和原位癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、軟組織肉瘤、纖維肉瘤、惡性類癌瘤、局部皮膚損傷、蕈樣肉芽腫、橫紋肌肉瘤、卡波西肉瘤、成骨肉瘤和其他肉瘤、惡性高鈣血癥、腎細(xì)胞瘤、真性紅細(xì)胞增多癥、腺癌、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、白血病、淋巴瘤、惡性黑素瘤和表皮樣癌。60.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述癌癥是是骨肉瘤、肉瘤、月夷^^癌、乳腺癌或結(jié)腸癌。61.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述病毒顆粒在受試對(duì)象的膠原暴露區(qū)域聚集。62.如權(quán)利要求61所述的方法，其中所述膠原暴露區(qū)域包括胂瘤病變部位、血管生成活3夭區(qū)域、腫瘤病變部位、血管損傷部位、手術(shù)部位、炎癥部位和組織破壞區(qū)域。63.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述治療性病毒顆粒是具有經(jīng)修飾后包含膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的包膜蛋白的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，并且編碼只于抗癌癥的治療劑。64.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述監(jiān)測(cè)方式選自臨床觀察、放射檢查結(jié)果、組織病理學(xué)結(jié)果、免疫組織化學(xué)結(jié)果和臨床化學(xué)結(jié)果。65.如權(quán)利要求64所述的方法，其中所述臨床觀察包括通過測(cè)徑器或觸診檢測(cè)到胂瘤大小縮小，機(jī)體狀態(tài)改善，包括食欲增加、活動(dòng)性增強(qiáng)、疼痛減少，或?qū)χС中葬t(yī)護(hù)的需要減少，包括麻醉藥或氧氣的使用減少。66.如權(quán)利要求64所述的方法，其中所述放射檢查包括MRI、x射線、CT、PET、SPECT或超聲檢查。67.如權(quán)利要求64所述的方法，其中所述組織病理學(xué)結(jié)果包括與以前的結(jié)果或歷史對(duì)照相比凋亡的腫瘤或新血管系統(tǒng)細(xì)胞的百分比增加、壞死的腫瘤或新血管系統(tǒng)細(xì)胞的百分比增加、反應(yīng)性纖維化的百分t匕i曾力口。68.如權(quán)利要求64所述的方法，其中所述免疫組織化學(xué)結(jié)果包括胂瘤浸潤淋巴細(xì)胞的百分比增加或者表達(dá)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)基因的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)或百分比增加。69.如權(quán)利要求63所述的方法，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是雙嗜性的。70.如權(quán)利要求63所述的方法，其中所述治療劑是細(xì)胞周期蛋白Gl突變體。71.如權(quán)利要求63所述的方法，其中所述治療劑是GM-CSF。72.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述肺瘤控制包括肺瘤根除、完全腫瘤應(yīng)答、部分腫瘤應(yīng)答、疾病穩(wěn)定和預(yù)防復(fù)發(fā)。73.如權(quán)利要求44所述的方法，還包括在施用治療性病毒顆粒之前、同時(shí)或之后向受試對(duì)象施用化療藥、生物制劑或》文射治療。74.如4又利要求44所述的方法，還包括施用另外的編碼不同的抗癌治療劑的治療性病毒顆粒。75.如權(quán)利要求74所述的方法，其中所述另外的病毒顆粒在施用其他病毒顆粒之前、同時(shí)或之后施用。76.如權(quán)利要求74所述的方法，其中所述不同的治療劑是細(xì)胞因子或胸普激酶。77.如權(quán)利要求76所述的方法，其中所述細(xì)胞因子選自GM-CSF、TNF-a、IFN-a、IFN畫y;白介素l(ILl)、白介素卩(IL-(3)、白介素2(IL2)、白介素4(IL4)、白介素5(IL5)、白介素6(IL6)、白介素8(IL8)、白介素IO(ILIO)、白介素12(IL12)、白介素13(IL13)、白介素14(IL14)、白介素15(IL15)、白介素16(IL16)、白介素18(IL18)、白介素23(IL23)、白介素24(IL24)。78.—種通過包括以下步驟的方法制備的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體a)用以下物質(zhì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染生產(chǎn)細(xì)胞i)第一質(zhì)粒，其包含編碼修飾為含有膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的4070A雙嗜性包膜蛋白的核酸序列，其中該核酸序列與啟動(dòng)子有效連接；ii)第二質(zhì)粒，其包含與啟動(dòng)子有效連4妄的核酸序列，其中該序列編碼病毒gag-pol多肽，與啟動(dòng)子有效連接的核酸序列，其中該序列編碼能將抗藥性賦予生產(chǎn)細(xì)胞的多肽，SV40復(fù)制起點(diǎn)；iii)第三質(zhì)粒，其包含與啟動(dòng)子有效連接的異源核酸序列，其中該序列編碼診斷性或治療性多肽，5'和3'長末端重復(fù)序列(LTR),\(/逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝序列，位于5'LTR上游的CMV啟動(dòng)子，與啟動(dòng)子有效連接的核酸序列，其中該序列編碼能將抗藥性賦予生產(chǎn)細(xì)胞的多肽，SV40復(fù)制起點(diǎn)，b)在允許產(chǎn)生靶向遞送載體并釋放至培養(yǎng)上清液中的條件下，培養(yǎng)a)的生產(chǎn)細(xì)胞；c)分離上清液并將其引入閉環(huán)多管系統(tǒng)中以收集病毒顆粒；和d)收集逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。79.如權(quán)利要求78所述的載體，其中所述第一質(zhì)粒是Bvl/pCAEP質(zhì)粒。80.如權(quán)利要求78所述的載體，其中所述第一質(zhì)粒是pB-RVE質(zhì)粒o81.如權(quán)利要求78所述的載體，其中所述第二質(zhì)粒是pCgpn質(zhì)粒。82.如權(quán)利要求78所述的載體，其中所述第三質(zhì)粒是pdnGl/UBER-REX質(zhì)粒。83.如權(quán)利要求78所述的載體，其中所收集的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的病毒滴度約為1xl09-1xl0"集落形成單位/毫升。84.如權(quán)利要求78所述的載體，其中所收集的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的病毒滴度至少為2><109集落形成單位/毫升。85.如權(quán)利要求78所述的載體，其中所收集的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的病毒滴度至少為5xl(^集落形成單位/毫升。86.如權(quán)利要求78所述的載體，其中所收集的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的病毒滴度為2xl09-lxl()M集落形成單位/毫升。87.如權(quán)利要求78所述的載體，其中所收集的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的病毒滴度為2xl09-lx]0"集落形成單位/毫升。88.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的直徑為50nm-150nm。全文摘要提供了親病灶性的(尋找病變的)靶向基因遞送系統(tǒng)，包括具有極高滴度的病毒顆粒。特別地，病毒顆粒經(jīng)過工程化可特異性地將治療性或診斷性藥劑遞送至病變部位，如癌癥轉(zhuǎn)移部位。還提供個(gè)性化的給藥方案以有效地治療疾病如癌癥，并且可減少不良副作用。文檔編號(hào)C12N15/867GK101495156SQ200780001607公開日2009年7月29日申請(qǐng)日期2007年11月5日優(yōu)先權(quán)日2006年11月3日發(fā)明者E·M·戈登,F·L·霍爾,J·P·利維,R·A·里德申請(qǐng)人:伊佩尤斯生物技術(shù)公司