來自秋葉氏芽孢桿菌的密碼子改性淀粉酶的制作方法
【專利說明】來自秋葉氏芽抱桿菌的密碼子改性淀粉酶
[0001] 對(duì)序列表的引用
[0002] 本申請(qǐng)包含計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表。該計(jì)算機(jī)可讀形式通過引用結(jié)合在此。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明設(shè)及編碼成熟淀粉酶的分離的合成多核巧酸、包括該多核巧酸的多核巧酸 構(gòu)建體、用所述多核巧酸或多核巧酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的或包括所述多核巧酸或多核巧酸構(gòu)建體 的重組宿主細(xì)胞，W及用于生產(chǎn)成熟淀粉酶的方法，所述方法包括如在有助于表達(dá)該淀粉 酶的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞的步驟。
[0004] 發(fā)明背景 陽(yáng)〇化]在酶的高度競(jìng)爭(zhēng)性工業(yè)制造中，不斷地改進(jìn)產(chǎn)率或產(chǎn)量是至關(guān)重要的。出于此目 的，已經(jīng)將基因操作或基因工程化投入使用多年，其中已經(jīng)將編碼感興趣的多膚的基因置 于異源的或合成的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下，已經(jīng)在不同宿主細(xì)胞中用異源信號(hào)膚表達(dá)它們， 并且已經(jīng)W多個(gè)拷貝將它們整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中，W便達(dá)到所謂的mRNA飽和。
[0006] 已經(jīng)基于旨在其表達(dá)的宿主細(xì)胞的情況，并且基于不同理論mRNA烙點(diǎn)或Ξ級(jí)結(jié) 構(gòu)計(jì)算，將用來增加酶產(chǎn)量的另一熟知技術(shù)用于優(yōu)化酶編碼DNA序列中的密碼子使用。
[0007] 雖然如此，仍對(duì)鑒別新方式W便改進(jìn)感興趣的酶的表達(dá)具有顯著的興趣。由于酶 制造業(yè)中高度競(jìng)爭(zhēng)性的環(huán)境，即使微小的改進(jìn)也是希望的。 陽(yáng)00引發(fā)明概述
[0009] 我們構(gòu)建了地衣芽抱桿菌親本宿主菌株，用于編碼與來自AmyL淀粉酶的異源信 號(hào)膚融合的、感興趣的成熟淀粉酶多膚的多核巧酸的Ξ個(gè)相同的拷貝的位點(diǎn)特異性整合。
[0010] 然后通過將天然秋葉氏芽抱桿菌度acillusakibai)AX856成熟淀粉酶編碼基因 (SEQIDN0:1)的Ξ個(gè)相同拷貝連同AX856淀粉酶編碼基因的Ξ個(gè)不同的合成密碼子優(yōu)化 版本（分別是SynUSEQIDN0:2)、Syn2(SEQIDN0:3)和Syn3(SEQIDN0:4))引入親本 菌株，構(gòu)建四種子代菌株。令我們驚訝的是，合成基因之一，Syn3(SEQIDN0:4)，表現(xiàn)極大 地優(yōu)于另兩種合成基因幾乎兩倍的一個(gè)因子。
[0011] 相應(yīng)地，在一個(gè)第一方面，本發(fā)明提供了編碼成熟淀粉酶的分離的合成多核巧酸， 所述多核巧酸包括SEQIDN0:4中示出的核巧酸序列。
[0012] 在一個(gè)第二方面，本發(fā)明設(shè)及一種核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包括如在第一方面 中限定的多核巧酸，該多核巧酸可操作地連接至提供該多核巧酸在所選擇的宿主細(xì)胞中的 表達(dá)的控制序列。
[0013] 在一個(gè)第Ξ方面，本發(fā)明設(shè)及用如在第一方面中限定的多核巧酸或如在第二方面 中限定的多核巧酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的或包括該多核巧酸或該多核巧酸構(gòu)建體的一種重組宿主 細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞生產(chǎn)該成熟淀粉酶。
[0014] 在最后一個(gè)方面，本發(fā)明設(shè)及用于生產(chǎn)成熟淀粉酶的方法，所述方法包括W下步 驟：
[0015]a)在有助于表達(dá)該淀粉酶的條件下培養(yǎng)如在第Ξ方面中限定的宿主細(xì)胞；W及 任選地
[0016] b)回收淀粉酶。
[0017] 定義
[0018] 編碼序列：術(shù)語(yǔ)"編碼序列"是指直接指定多膚氨基酸序列的多核巧酸。編碼序列 的邊界一般由一個(gè)開放閱讀框架決定，該開放閱讀框架從一個(gè)起始密碼子（如ATG、GTG或 TTG)開始并且W-個(gè)終止密碼子（如TAA、TAG或TGA)結(jié)束。編碼序列可W是一種基因組 DNA、cDNA、合成DNA或其組合。
[0019] 控制序列：術(shù)語(yǔ)"控制序列"意指對(duì)于表達(dá)編碼本發(fā)明的成熟多膚的多核巧酸所必 需的核酸序列。每個(gè)控制序列對(duì)于編碼該多膚的多核巧酸來說可W是天然的（即，來自相 同基因）或外源的（即，來自不同基因），或相對(duì)于彼此是天然的或外源的。此類控制序列 包括但不限于前導(dǎo)子、聚腺巧酸化序列、前膚序列、啟動(dòng)子、信號(hào)膚序列、W及轉(zhuǎn)錄終止子。 至少，控制序列包括啟動(dòng)子，W及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。出于引入有利于將運(yùn)些控制序列與 編碼一種多膚的多核巧酸的編碼區(qū)連接的特異性限制酶切位點(diǎn)的目的，運(yùn)些控制序列可W 提供有多個(gè)接頭。
[0020] 表達(dá)：術(shù)語(yǔ)"表達(dá)"包括設(shè)及多膚產(chǎn)生的任何步驟，包括但不限于，轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修 飾、翻譯、翻譯后修飾、W及分泌。
[0021] 表達(dá)載體：術(shù)語(yǔ)"表達(dá)載體"意指線性或環(huán)狀DNA分子，該分子包括編碼多膚的多 核巧酸并且該多核巧酸可操作地與提供用于其表達(dá)的控制序列相連接。
[0022] 宿主細(xì)胞：術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"意指易于用包含本發(fā)明的多核巧酸的核酸構(gòu)建體或表 達(dá)載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的任何細(xì)胞類型。術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"涵蓋由于復(fù)制期間發(fā)生的突 變而與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。
[0023] 分離的：術(shù)語(yǔ)"分離的"意指處于自然界中不出現(xiàn)的形式或環(huán)境中的物質(zhì)。分離的 物質(zhì)的非限制性實(shí)例包括（1)任何非天然發(fā)生的物質(zhì)，（2)包括但不限于任何酶、變體、核 酸、蛋白質(zhì)、膚或輔因子的任何物質(zhì)，該物質(zhì)至少部分地從與其本質(zhì)相關(guān)的一種或多種或所 有天然發(fā)生的成分中去除；（3)相對(duì)于天然發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)通過人工修飾的任何物質(zhì)；或（4)通 過相對(duì)于與其天然相關(guān)的其他組分，增加物質(zhì)的量而修飾的任何物質(zhì)（例如宿主細(xì)胞中的 重組產(chǎn)生；編碼該物質(zhì)的基因的多個(gè)拷貝；W及使用比與編碼該物質(zhì)的基因天然相關(guān)的啟 動(dòng)子更強(qiáng)的啟動(dòng)子）。
[0024] 成熟多膚：術(shù)語(yǔ)"成熟多膚"意指在翻譯和任何翻譯后修飾如N-末端加工、C-末 端截短、糖基化作用、憐酸化作用等之后處于其最終形式的多膚。在一個(gè)方面中，該成熟多 膚是由具有SEQIDN0:4中示出的DNA序列的多核巧酸編碼的。本領(lǐng)域中已知的是，一個(gè) 宿主細(xì)胞可W產(chǎn)生由同一多核巧酸表達(dá)的兩種或更多種不同成熟多膚（即，具有不同C-末 端和/或N-末端氨基酸）的混合物。本領(lǐng)域還已知，不同的宿主細(xì)胞不同地加工多膚，并 且因此一個(gè)表達(dá)一種多核巧酸的宿主細(xì)胞當(dāng)與另一個(gè)表達(dá)相同多核巧酸的宿主細(xì)胞相比 時(shí)可W產(chǎn)生一種不同的成熟多膚（例如，具有一個(gè)不同的C-末端和/或N-末端氨基酸）。 [00巧]成熟多膚編碼序列：術(shù)語(yǔ)"成熟多膚編碼序列"意指編碼成熟多膚的一種多核巧 酸。在一方面，成熟多膚編碼序列是SEQIDN0:4。
[00%] 核酸構(gòu)建體：術(shù)語(yǔ)"核酸構(gòu)建體"意指單鏈或雙鏈的一種核酸分子，該核酸分子是 從天然存在的基因中分離的，或W-種本來不存在于自然界中的方式被修飾成含有核酸的 區(qū)段，或是合成的，該核酸分子包括一個(gè)或多個(gè)控制序列。
[0027] 可操作地連接：術(shù)語(yǔ)"可操作地連接"意指如下的構(gòu)造，其中，控制序列相對(duì)于多核 巧酸的編碼序列安置在適當(dāng)位置，從而使得該控制序列指導(dǎo)該編碼序列的表達(dá)。
[0028] 序列一致性：兩個(gè)氨基酸序列之間或者兩個(gè)核巧酸序列之間的關(guān)聯(lián)度通過參數(shù) "序列一致性"來描述。出于本發(fā)明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS:歐洲分子生物學(xué) 開放軟件套件（TheliuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite),賴斯巧ice) 等人，2000,遺傳學(xué)趨勢(shì)燈rendsGenet.) 16:276-277)(優(yōu)選5. 0. 0版或更新版本）的尼 德爾（Needle)程序中所實(shí)施的尼德爾曼-翁施（Needleman-Wunsch)算法（尼德爾曼 (化edleman)和翁施（Wunsch)，1970,分子生物學(xué)雜志（J.Mol.Biol. )48:443-453)來確定 兩個(gè)氨基酸序列之間的序列一致性。所使用的參數(shù)是空位開放罰分10,空位延伸罰分0. 5， W及邸L0SUM62度L0SUM62的EMBOSS版本）取代矩陣。尼德爾標(biāo)注的"最長(zhǎng)的一致性"的 輸出（使用-非簡(jiǎn)化選項(xiàng)獲得）被用作百分比一致性，并且計(jì)算如下：
[0029](一致的殘基X 100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中的空位總數(shù)）
[0030] 出于本發(fā)明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS:歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件， 賴斯巧ice)等人，2000,見上文）（優(yōu)選5. 0. 0版或更新版本）的尼德爾程序中所實(shí)施的尼 德爾曼-翁施算法（尼德爾曼（Needleman)和翁施（Wunsch)，1970,見上文）來確定兩個(gè) 脫氧核糖核巧酸序列之間的序列一致性。所使用的參數(shù)是空位開放罰分10,空位延伸罰分 0. 5,和邸NA即化(NCBINUC4. 4的EMBOSS版）取代矩陣。尼德爾標(biāo)注的"最長(zhǎng)的一致性"的 輸出（使用-非簡(jiǎn)化選項(xiàng)獲得）被用作百分比一致性，并且計(jì)算如下：
[0031] (一致的脫氧核糖核巧酸X100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中的空位總數(shù)） 陽(yáng)〇巧發(fā)明的詳細(xì)說明 陽(yáng)〇3引多核巧酸
[0034] 本發(fā)明還設(shè)及