產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌及其分離方法和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于芽孢桿菌分離方法領域，具體涉及一種產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌及其分離方法和應用。
【背景技術】
[0002]石油是一種天然的油狀粘稠物質，原油主要由95%?99.5%的烴類(正烷烴、支鏈烷烴、芳烴、脂環(huán)烴)及少量其它有機物(硫化物、氮化物、環(huán)烷酸類等)組成，有些石油樣品可含200?300種烴類，分子量從16 (甲烷)至1000左右，其物理狀態(tài)包括氣體、揮發(fā)性液體、高沸點液體以及固體。
[0003]石油污染泛指原油和石油初加工產品(汽油、煤油、柴油、重油、潤滑油、瀝青等)及各類油的分解產物所引起的污染。近年來，隨著石油工業(yè)的迅猛發(fā)展，在石油的生產、貯運、煉制加工及使用的過程中，由于各種原因的泄漏造成石油烴類的溢出和排放，形成落地石油污染，這是土壤石油污染的主要途徑之一。全世界大規(guī)模開采石油是從20世紀初開始的，1900年全世界消費量約2000萬噸，100年來，這一數量已增長百余倍，現在每年世界石油的總產量30多億噸，在國民經濟中占有十分重要的地位，有現代工業(yè)血液之稱。
[0004]我國自1978年石油產量突破I億t而成為世界十大產油國之一以來，目前已開發(fā)勘探的油氣田和油氣藏有400多個。1998年各石油、煉化企業(yè)工業(yè)固體廢棄物產生量為428.98萬t，利用率不到50%，工業(yè)固體廢棄物排放量為15.61萬t ;截止2003年底，工業(yè)固體廢棄物累計堆存量1884.5萬t，占地181.7萬m2，年平均產生石油污染土壤近10萬t，累計堆放量近50萬t。以上污染物排放統計，只是局限于對國有石油企業(yè)的調查，若考慮到地方油田企業(yè)排污量以及突發(fā)事故造成的污染和泄露，污染情況將更加嚴重。有研宄表明，位于中國內蒙古的阿爾善油田，每口油井年平均落地原油為0.16?2t，污染草原植被面積為100X 150m2;我國大慶、遼河油田的重污染區(qū)的表層土壤(O?20cm)的含油量高達30%?50% ;我國吉林省境內的莫莫格自然保護區(qū)，受污染局部表層土壤中總石油烴含量已經達到50000mg.kg—1以上。石油污染場地，大面積植被遭到破壞，甚至退化為沙地、裸地，嚴重破壞了當地的農業(yè)生態(tài)環(huán)境。目前，石油污染問題已成為世界各國普遍關注的問題。
[0005]表面活性劑是一種能夠顯著降低溶劑表面張力的物質，是一種化學合成的產物，它可以改變有機污染物的某些性質，增加污染物與微生物細胞的接觸幾率，從而顯著提高微生物的降解能力。生物表面活性劑是微生物代謝活動的產物，它除具有化學表面活性劑所具有的作用外，還具有無毒、無污染、良好的選擇性、專一性和生物相容性好等優(yōu)點。在增強土壤有機污染修復效率方面，有重要意義。通常采用微生物發(fā)酵法生產生物表面活性劑。細菌是生物表面活性劑的主要生產者之一，目前已報道過的能利用烴類的細菌及相對應的生物表面活性劑如假單胞菌屬Pseudomonas sp.產生的鼠李糖脂，紅球菌屬Rhodococcussp.和節(jié)桿菌屬Arthrobacter sp.產生的海藻糖脂，芽胞桿菌屬Bacillus sp.產生的脂肽，氣單胞菌屬Aeromonas sp.產生的糖脂，以及黃質菌屬Flavobacterium sp.，不動桿菌屬 Acinetobacter sp.，棒桿菌 Corynebacterium sp.和葡萄球菌屬 Staphylococcussp.等。國內目前關于表面活性劑產生菌的研宄主要以假單胞菌屬和鼠李糖脂的研宄居多，此外還包括地衣芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌產生的脂肽類，氣單胞菌產生的糖脂和根癌土壤桿菌產生的表面活性物質，研宄內容與國外相似。在國內對于堀越氏芽孢桿菌的研宄僅見于堀越氏芽孢桿菌S184產河豚毒素的發(fā)酵條件優(yōu)化方面的研宄。國外對于堀越氏芽孢桿菌的研宄也僅見于堀越氏芽孢桿菌產細胞外堿性蛋白酶條件優(yōu)化方面的研宄(Joo etal., 2002) ο國內外對于芽孢桿菌屬中堀越氏芽孢桿菌(Bacillus horikoshii)在利用石油烴類產生生物表面活性劑方面的研宄還未見報道。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的是為了提供一種產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌及其分離方法和應用，該堀越氏芽孢桿菌產生的表面活性劑能降解石油烴類有機污染物。
[0007]本發(fā)明首先提供一種產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌，命名為堀越氏芽孢桿菌(Bacillus horikoshii) H_6，菌種已于2015年I月19日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，(地址為北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研宄所，郵政編碼為100101)登記入冊編號為CGMCC N0.10372。
[0008]本發(fā)明還提供一種產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌的分離方法，該方法包括:
[0009]步驟一:在無菌條件下，將油水淹地污染土壤樣品加入到含油濃度為0.1%的無機鹽液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)，得到富集培養(yǎng)液；
[0010]步驟二:將步驟一得到的富集培養(yǎng)液依次加入到含油濃度分別為0.3%,0.5%,1%和2%的無機鹽液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)，得到富集培養(yǎng)液；
[0011]步驟三:將步驟二得到的富集培養(yǎng)液用無菌水稀釋后進行分離純化，待生長出單一菌落為止，然后對單一菌落進行篩選，得到產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌。
[0012]優(yōu)選的是，所述的油水淹地污染土壤樣品為在油水淹地污場地采集后于4°C下冷藏的新鮮土壤。
[0013]優(yōu)選的是，所述的步驟一和步驟二的培養(yǎng)溫度為28?35°C，培養(yǎng)時間為7天。
[0014]優(yōu)選的是，所述的步驟一和步驟二的無機培養(yǎng)基組成為:K2HP046g、KH2P046g、(NH4) 2S046g、MgSO4.7Η202.6g、NaCl 12g、CaCl2.H2O 0.16g、蒸餾水 1L、pH 7.5±0.2。
[0015]本發(fā)明還提供上述產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌在降解石油烴類有機污染物上的應用。
[0016]優(yōu)選的是，所述的產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌用于降解石油烴類有機污染物，具體步驟為:
[0017]將產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌單菌株從平板挑取單菌落一環(huán)接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，在160r.min^,28?35°C震蕩培養(yǎng)18h，得到種子培養(yǎng)液，以石油為唯一碳源，按體積百分比為I %接種量將種子培養(yǎng)液接種至含油濃度為2%的無機鹽液體培養(yǎng)基中，在160r.min-1, 28?35°C震蕩培養(yǎng)7天，測定石油的殘余濃度。
[0018]優(yōu)選的是，所述的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基組成為:牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl25g、瓊脂 15 ?20g、水 1L，pH 7.2±0.2。
[0019]本發(fā)明的有益效果
[0020]本發(fā)明從油水淹地污染土壤中分離出產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌，分離效果好，分離方法簡單，得到的菌株首次應用于降解石油烴類有機污染物，具有良好的降解效果，具有無毒、無二次污染、環(huán)境友好的特點。
【附圖說明】
[0021]圖1為不加菌劑和本發(fā)明產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌的石油降解率對比結果圖。
【具體實施方式】
[0022]本發(fā)明首先提供一種產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌，命名為堀越氏芽孢桿菌(Bacillus horikoshii) H_6，菌種已于2015年I月19日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，(地址為北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研宄所，郵政編碼為100101)登記入冊編號為CGMCC N0.10372。
[0023]本發(fā)明所述產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌(Bacillus horikoshii)從油水淹地污染土壤中分離得到，其在細菌固體培養(yǎng)基上呈圓形、奶白微黃色菌落，邊緣整齊，表面光滑濕潤；將菌株H-6的部分16S rDNA序列，與GeneBank中的相關菌株Blastn比較，結果顯示菌株H-6與堀越氏芽孢桿菌Bacillus horikoshii (WST 2_2)的同源性最高，達到98.4% ο
[0024]本發(fā)明還提供一種產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌的分離方法，該方法包括:
[0025]步驟一:在無菌條件下，將油水淹地污染土壤樣品加入到含油濃度為0.1%的無機鹽液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)，得到富集培養(yǎng)液；
[0026]步驟二:將步驟一得到的富集培養(yǎng)液依次加入到含油濃度分別為0.3%、0.5%、1%和2%的無機鹽液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)，得到富集培養(yǎng)液；
[0027]步驟三:將步驟二得到的富集培養(yǎng)液用無菌水稀釋后進行分離純化，待生長出單一菌落為止，然后對單一菌落進行篩選，得到產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌。
[0028]按照本發(fā)明，先在無菌條件下，將油水淹地污染土壤樣品加入到含油濃度為0.1%的無機鹽液體培養(yǎng)基中，優(yōu)選是將1g油水淹地污染土壤樣品加入到10mL含油濃度為0.1 %的無機鹽液體培養(yǎng)基的無菌三角瓶中，優(yōu)選在160r ^mirT1JS?35°C搖床培養(yǎng)7天，得到富集培養(yǎng)液；所述的油水淹地污染土壤樣品優(yōu)選為在油水淹地污場地采集后于4°C下冷藏的新鮮土壤。
[0029]按照本發(fā)明，在無菌條件下，將上述富集培養(yǎng)液加入到10mL含油濃度為0.3%的無機鹽液體培養(yǎng)基的無菌三角瓶中，優(yōu)選在160r.min-1, 28?35°C搖床培養(yǎng)7天，然后再連續(xù)富集培養(yǎng)3次，每次無機鹽液體培養(yǎng)基中原油濃度依次遞增，分別為0.5%、I %和2%。
[0030]按照本發(fā)明，將得到的富集培養(yǎng)液用無菌水稀釋后進行分離純化，優(yōu)選采用稀釋平板法和平板畫線法進行分離純化，具體是取富集培養(yǎng)液ImL用無菌水以10倍稀釋法進行稀釋，再取ImL涂布于含油濃度為2%的無機鹽培養(yǎng)基平板上，分離得到能夠以原油為唯一碳源的單一菌落，將分離到的單菌落接種到無機鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)并保存，然后對分離到的單菌落進行篩選，具體為將分離得到的單菌株接種到血平板培養(yǎng)基上，篩選得到產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌菌株H-6。所述的血平板培養(yǎng)基為一次性成品培養(yǎng)基。