一株能夠高效降解DMP的芽孢桿菌屬菌株、培養(yǎng)方法及其在修復(fù)土壤PAEs污染中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株P(guān)AEs降解菌及其用途，特別涉及一株能夠高效降解DMP的芽孢桿 菌屬菌株及其在降解PAEs以及修復(fù)土壤PAEs污染中的用途，本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 鄰苯二甲酸酯（PAEs)作為一種有機化合物被廣泛用于塑料加工和許多其它工業(yè) 消費品中。鄰苯二甲酸酯的廣泛使用導(dǎo)致了越來越多的鄰苯二甲酸鹽進入到我們的生態(tài) 系統(tǒng)中。PAEs污染所造成的環(huán)境和人類健康問題已經(jīng)引起了人們的普遍關(guān)注。由于PAEs 具有致癌、致畸、致突變作用（宋嬌艷，劉大軍，萬洋，等.腐殖酸吸附鄰苯二甲酸二丁 酯動力學(xué)及紅外光譜特征研宄[J].西南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2014,3:022.)，美國環(huán) 境保護局已將6種PAEs列為優(yōu)先控制污染物中國國家環(huán)境監(jiān)測中心也將DEP、DMP和DnOP 這3 種PAEs確定為環(huán)境優(yōu)先控制污染物（Jin DC，Kong X，Cui BJ，et al.Biodegradation of di-n-butyI phthalate by a newly isolated Halotolerant Sphingobium sp.International Journal of Molecular Sciences, 2013, 14:24046-24054. Jin D,Bai Z, Chang D, et al.Biodegradation of di-n-butyl phthalate by an isolated Gordonia sp.strain QH-Il:Genetic identification and degradation kinetics[J]. Journal of hazardous materials, 2012, 221:80-85.)〇
[0003] 在我國，土壤中的PAEs通常來自農(nóng)田塑料薄膜、塑料廢品、垃圾和污水灌溉，其中 PAEs進入農(nóng)田的主要途徑是農(nóng)膜的使用。而在東北黑土區(qū)，由于我國黑土區(qū)氣溫低、農(nóng)膜使 用量大和黑土有機質(zhì)含量高等原因造成黑土 PAEs污染較為嚴重。PAEs的水解和光解速率 都非常緩慢，生物降解是這類物質(zhì)在環(huán)境中分解的主要途徑（Yang C F，Wang C C，Chen C H. Di-n-butyl phthalate removal by strain Deinococcus sp. R5in batch reactors[J]. International Biodeterioration&Biodegradation, 2014.)。所以獲得 PAEs 高效降解菌 是提高其生物降解效率的重要環(huán)節(jié)。
[0004] 鄰苯二甲酸二甲醋（Dimethyl phthalate, DMP)是PAEs類污染物之一，主要用作 塑料產(chǎn)品的成型劑。全球每年都有大量DMP被使用，因其與塑料的結(jié)合是非共價鍵結(jié)合，所 以DMP容易進入生態(tài)環(huán)境中，因此，DMP已經(jīng)成為遍及全球的合成有機污染物質(zhì)。有研宄結(jié) 果表明DMP污染可改變黑土呼吸和酶學(xué)活性的代謝特征，影響了黑土的生態(tài)系統(tǒng)功能，進 而威脅黑土土壤肥力和糧食生產(chǎn)。
[0005] 因此，本發(fā)明針對東北黑土區(qū)土壤中的PAEs降解菌進行研宄，旨在為修復(fù)黑土區(qū) PAEs污染提供理論基礎(chǔ)和建立菌種資源平臺。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的之一是提供一株能夠高效降解DMP的菌株，該細菌具有較高的降解 DMP的能力，同時也可以利用其他常見PAEs，在降解PAEs污染物，特別是DMP和修復(fù)土壤 PAEs污染方面有一定的應(yīng)用前景。
[0007] 本發(fā)明的目的之二是提供一種培養(yǎng)所述芽孢桿菌屬菌株的方法。
[0008] 本發(fā)明的目的之三是提供所述的芽孢桿菌屬菌株在降解PAEs以及修復(fù)土壤PAEs 污染中的應(yīng)用。
[0009] 為了達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：
[0010] 本發(fā)明的一株能夠高效降解DMP的芽孢桿菌屬菌株，命名為枯草芽孢桿菌 QD-9-10,分類命名為Bacillus subtilis QD-9-10,保藏中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址在 武漢大學(xué)，保藏編號為：CCTCC NO :M 2015199,保藏日期為2015年4月6日。
[0011] 本發(fā)明從長期覆蓋農(nóng)膜的黑土土壤中分離鑒定了一株以DMP為唯一碳源生長的 菌株：Bacillus subtilis QD-9-10。正交實驗結(jié)果表明菌株QD-9-10在無機鹽培養(yǎng)基中進 行生長的最優(yōu)生長條件為：pH 8. 0,溫度35°C，搖床轉(zhuǎn)速150rpm，DMP初始濃度IOOmg · L' DMP的初始濃度對菌生長的影響較大，生物量在32h時達到最大并可將IOOmg七1的DMP完 全降解。
[0012] 其中，所述的無機鹽培養(yǎng)基按照以下方法制備！K2HPO4 · 12H20 I. 0g、KH2PO4L 0g、 NH4Cl 0.8g、NaCl 1.0g、MgS04.7H20 0.5g、CaCl20.006g、FeS04.7H20 0.02g、微量元素儲備 液2mL、蒸餾水補足至1000ml，pH 7· 0 ;
[0013] 其中，所述的微量元素儲備液按照以下方法制備：MnSO4 · H2O 0. lg、ZnSO4 · 7H20 0· 12g、H3BO30.0 7g、Na2MoO4 · H2O 0· 04g、CuSO4 · 5H20 0· 02g、CoCl20.0 4g，蒸餾水補足至 1000 ml0
[0014] 同時，底物利用測試表明菌種QD-9-10也可以利用其他常見PAEs。
[0015] 因此，進一步的，本發(fā)明還提出了所述的芽孢桿菌屬菌株在降解PAEs以及修復(fù)土 壤PAEs污染中的應(yīng)用。
[0016] 其中，所述的PAEs包括鄰苯二甲酸二甲酯（DMP)，鄰苯二甲酸二乙酯（DEP)，鄰苯 二甲酸二丁酯（DBP)，鄰苯二甲酸二正辛酯（DOP)，鄰苯二甲酸二異辛酯（DEHP)和鄰苯二甲 酸二異辛酯（DIOP)。
[0017] 優(yōu)選的，所述的PAEs為鄰苯二甲酸二甲酯（DMP)。
[0018] 綜上，本發(fā)明分離得到的一株DMP降解菌Bacillus subtilis QD-9-10具有降解 DMP以及其它常見PAEs的能力，在降解PAEs污染物和修復(fù)土壤PAEs污染方面有一定應(yīng)用 前景。
【附圖說明】
[0019] 圖1為本發(fā)明菌株QD-9-10的進化樹分析；
[0020] 圖2為菌株QD-9-10的生長曲線與DMP濃度曲線。
[0021] 其中，豎條表示標準偏差（N = 3)。
【具體實施方式】
[0022] 下面結(jié)合具體實施例和附圖來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著 描述而更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技 術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形 式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0023] 實施例1菌株QD-9-10的分離及其在降解PAEs中的應(yīng)用
[0024] 1材料與方法
[0025] I. 1供試材料與培養(yǎng)基
[0026] 鄰苯二甲酸二甲酯（DMP)，鄰苯二甲酸二乙酯（DEP)，鄰苯二甲酸二丁酯（DBP)，鄰 苯二甲酸二正辛酯（DOP)，鄰苯二甲酸二異辛酯（DEHP)，和鄰苯二甲酸二異辛酯（DIOP)， 甲醇，乙酸乙酯和己烷，所有化學(xué)品和溶劑均為分析純試劑，購于天津市光復(fù)精細化工研宄 所。
[0027] 基礎(chǔ)無機鹽（MSM)培養(yǎng)基！K2HPO4 · 12H20 L 0g、KH2PO4 L 0g、NH4Cl 0· 8g、NaCl 1. 0g、MgSO4 · 7H20 0· 5g、CaCl2 0· 006g、FeSO4 · 7H20 0· 02g、微量元素儲備液（MnSO4 · H2O 0· lg、ZnSO4 · 7H20 0· 12g、H3BO3 0· 07g、Na2MoO4 · H2O 0· 04g、CuSO4 · 5H20 0· 02g、CoCl2〇. 〇4g，蒸餾水補足至1000ml) 2mL、蒸餾水補足至1000ml，pH 7. 0。
[0028] LB培養(yǎng)基：蛋白胨10. 0g、酵母粉5. 0g、氯化鈉10. 0g、蒸餾水補足至1000ml，pH 7. 0〇
[0029] I. 2混合培養(yǎng)物的來源和馴化
[0030] 采集黑土區(qū)長期覆蓋農(nóng)膜的土壤樣品，從樣品中稱IOmg的土樣于含200mg · L-1鄰苯二甲酸酯（DMP、DEP、DBP、DOP各為50mg · L-1)的IOOmL無機鹽培養(yǎng)液中，采用梯度壓 力法馴化，30°C振蕩培養(yǎng)7d，逐步轉(zhuǎn)接至含250mg · L'300mg · L'350mg · L'400mg · L' 450mg · L'SOOmg · Γ1鄰苯二甲酸酯（DMP、DEP、DBP、DOP等量）的無機鹽培養(yǎng)液后，用接 種針蘸取少量菌液，重新接到MSM培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)。
[0031] 1. 3降解菌株的分離純化與鑒定
[0032] 混合培養(yǎng)物經(jīng)梯度稀釋后，采用無機鹽培養(yǎng)基分離DMP降解菌，選擇長勢良好的 菌株進行形態(tài)學(xué)和16S rDNA序列分析對菌株進行鑒定（參考文獻：林先貴.土壤微生物 研宄原理與方法[M].北京：高等教育出版社，2010:123-186 ;唐亮，張進忠，于萍萍，孫 萍.硅酸鹽細菌的分離、純化、鑒定及生物學(xué)特性研宄[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008(1) :71-73 ; Clarridge J E. Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases[J] · Clinical microbiology reviews, 2004, 17(4) :840-862)。菌株的重組克隆由上海美吉生物醫(yī)藥科 技有限公司測序。包括細菌基因組DNA的抽提、電泳檢測、PCR擴增、PCR產(chǎn)物的電泳檢測、 測序切膠純化測序、分析結(jié)果和拼接序列。PCR試劑：EX Taq酶（TaKaRa)，dNTP(TaKaRa)， 引物（Invitrogen 合成），Marker :DL2000。PCR 反應(yīng)體系：（IOXEx Taq buffer 2.0 μ 1、 2. 5mM dNTP Mix I. 6 μ l、5p PrimerlO. 8 μ l、5p Primer20. 8 μ 1、Template 0· 5 μ l、5u Ex Taq 0· 2 μ 1、ddH20 14. 1