將編碼AX856淀粉酶的第一合成密碼子優(yōu)化基因（Synl)克隆進(jìn)隧菌體整合載體 中，在下游側(cè)翼插入attP位點(diǎn)用于整合，并且在上游側(cè)翼插入cry3A區(qū)，后者旨在用于通過(guò) 完整構(gòu)建體整合后的同源重組進(jìn)行載體唯一性刪除。在SEQIDN0:2中示出了編碼淀粉酶 的成熟部分的DNA序列。淀粉酶的成熟部分被表達(dá)為具有AmyL信號(hào)膚的融合多膚。所得 質(zhì)粒PJA3691用于將淀粉酶基因插入至在親本地衣芽抱桿菌染色體上的Ξ個(gè)attB位點(diǎn)的 Ξ串聯(lián)啟動(dòng)子之后。所得3拷貝淀粉酶菌株被表示為JA3718。 陽(yáng)113] JA3718菌株具有在染色體中的Ξ個(gè)不同位置的、編碼成熟淀粉酶AX856的SEQ ID NO:2的合成多核巧酸的Ξ個(gè)拷貝。
[0114] 地衣芽抱桿菌JA3720 :
[0115] 將編碼AX856淀粉酶的第二合成密碼子優(yōu)化基因（Syn2)克隆進(jìn)隧菌體整合載體 中，在下游側(cè)翼插入attP位點(diǎn)用于整合，并且在上游側(cè)翼插入cry3A區(qū)，后者旨在用于通過(guò) 完整構(gòu)建體的整合后的同源重組進(jìn)行載體唯一性刪除。在SEQIDN0:3中示出了編碼淀粉 酶的成熟部分的DNA序列。淀粉酶的成熟部分被表達(dá)為具有AmyL信號(hào)膚的融合多膚。所 得質(zhì)粒PJA3692用于將淀粉酶基因插入至在親本地衣芽抱桿菌染色體上的Ξ個(gè)attB位點(diǎn) 的Ξ串聯(lián)啟動(dòng)子之后。所得3拷貝淀粉酶菌株被表示為JA3720。
[0116] JA3720菌株具有在染色體中的Ξ個(gè)不同位置的、編碼成熟淀粉酶AX856的SEQID NO:3的合成多核巧酸的Ξ個(gè)拷貝。
[0117] 地衣芽抱桿菌JA3722 :
[0118] 將編碼AX856淀粉酶的第Ξ合成密碼子優(yōu)化基因（Syn3)克隆進(jìn)隧菌體整合載體 中，在下游側(cè)翼插入attP位點(diǎn)用于整合，并且在上游側(cè)翼插入cry3A區(qū)，后者旨在用于通過(guò) 完整構(gòu)建體的整合后的同源重組進(jìn)行載體唯一性刪除。在SEQIDN0:4中示出了編碼淀粉 酶的成熟部分的DNA序列。淀粉酶的成熟部分被表達(dá)為具有AmyL信號(hào)膚的融合多膚。所 得質(zhì)粒PJA3694用于將淀粉酶基因插入至在親本地衣芽抱桿菌染色體上的Ξ個(gè)attB位點(diǎn) 的Ξ串聯(lián)啟動(dòng)子之后。所得3拷貝淀粉酶菌株被表示為JA3722。
[0119] JA3722菌株具有在染色體中的Ξ個(gè)不同位置的、編碼成熟淀粉酶AX856的SEQID N0:4的合成多核巧酸的Ξ個(gè)拷貝。
[0120] 發(fā)酵：如^下所述用地衣芽抱桿菌進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵。所有生長(zhǎng)培養(yǎng)基通過(guò)本領(lǐng) 域中已知的方法進(jìn)行滅菌。除非另外描述，使用自來(lái)水。在下面的配方中提及的成分濃度 是任何接種之前的濃度。 陽(yáng)12U 第一接種物培養(yǎng)基：SSB4瓊脂：大豆蛋白腺SE50MK(DMV)lOg^ ;薦糖lOg/1 ;憐酸 氨二鋼，2肥0 5g/l;憐酸二氨鐘2g/l;巧樣酸0,2g/l;維生素（硫胺鹽酸鹽ll，4mg/l;核 黃素0, 95mg/l;煙酷胺7, 8mg/l;泛酸巧9, 5mg/l;鹽酸化唉醒1，9mg/l;D-生物素0, 38mg/ 1 ;葉酸 2. 9mg/l);痕量金屬（MnS04,肥0 9. 8mg/l;FeS04,7 肥0 39, 3mg/l;CuS04,甜 20 3,9111旨/1;2記04,7肥0 8,2111旨/1);瓊脂25旨/1。使用去離子水。使用化地將抑調(diào)節(jié)至抑 7. 3 至 7. 4。
[0122] 轉(zhuǎn)移緩沖液:M-9緩沖液（使用去離子水）：憐酸氨二鋼，2肥0 8. 8g/l;憐酸二氨 鐘3g/l;氯化鋼4g/l;硫酸儀，7肥0 0. 2g/l。
[0123] 接種物搖瓶培養(yǎng)基（濃度是接種之前的濃度）：P服-50 :1lOg^大豆粗磨粉；憐酸 氨二鋼，2肥0 5g/l;在滅菌之前，使用化0H/冊(cè)P04將抑調(diào)節(jié)至8. 0。
[0124] 組成培養(yǎng)基（濃度是接種之前的濃度）：膜蛋白腺（來(lái)自Difco的酪蛋白水解 物）30g/l;屯水硫酸儀，7肥0 4g/l;憐酸氨二鐘7g/l;憐酸氨二鋼，2肥0 7g/l;硫酸二錠 4g/l;硫酸鐘5g/l;巧樣酸0. 78g/L;維生素（硫胺鹽酸鹽34, 2mg/l;核黃素2, 8mg/l;煙 酷胺23, 3mg/l;泛酸巧28, 4mg/l;鹽酸化唉醒5. 7mg/l;D-生物素1.lmg/1 ;葉酸2. 5mg/ 1);痕量金屬（MnS04,肥0 39. 2mg/l;FeS04,7肥0 157mg/l;CuS04,甜20 15. 6mg/l;aiS04， 7肥0 32,8mg^);消泡劑（SB2121)1.25mVl;在滅菌之前，使用化OH/冊(cè)PCM將抑調(diào)節(jié)至 6. 0。 陽(yáng)1巧]補(bǔ)料培養(yǎng)基：薦糖708g^ ; 陽(yáng)1%]接種巧驟：首先，在37°C下，值蔭株在SSB-4諒脂斜面上牛長(zhǎng)1天。然后，使用M-9 緩沖液洗涂瓊脂，并且在650nm處測(cè)量所得細(xì)胞懸浮液的光密度（OD)。使用OD化50nm)Xml細(xì)胞懸浮液=0. 1的接種物來(lái)接種接種物搖瓶（P服-50)。將搖瓶在37°C下、在30化pm處 培養(yǎng)20虹。通過(guò)用來(lái)自該搖瓶的生長(zhǎng)培養(yǎng)物接種主發(fā)酵罐來(lái)開(kāi)始主發(fā)酵罐（發(fā)酵器）中的 發(fā)酵。接種體積是組成培養(yǎng)基的11% (對(duì)于720ml組成培養(yǎng)基而言，是80ml)。
[0127] 發(fā)酵備設(shè)備：值用配備W下巧的標(biāo)準(zhǔn)連驗(yàn)牽發(fā)酵備:溫度控制系統(tǒng)，使用氨水和 憐酸的抑控制，用于貫穿整個(gè)發(fā)酵過(guò)程測(cè)量氧飽和度的溶氧電極。 陽(yáng)12引 發(fā)酵參撒： 陽(yáng)129] 溫度：38°C
[0130] 使用氨水和憐酸將抑保持在6. 8與7. 2之間
[0131] 對(duì)照：6.8(氨水）；7. 2憐酸
[0132] 通氣：1. 5升/min/kg培養(yǎng)液重量 陽(yáng)133] 攬拌：1500巧m 陽(yáng)。4]補(bǔ)料策略:
[0135] 0虹。接種之后，0.05g/min/kg初始培養(yǎng)液
[0136] 化r。接種之后，0. 156g/min/kg初始培養(yǎng)液 陽(yáng)137] 結(jié)束：接種之后，0. 156g/min/kg初始培養(yǎng)液 。。引連輪裝晉：
[0139] 在恒定攬拌下將培養(yǎng)運(yùn)行兩天，并且在此時(shí)期，在線跟蹤氧張力。并排比較不同菌 株。
[0140]結(jié)果: 陽(yáng)141 ] 下表列出了相對(duì)于來(lái)自天然編碼序列的產(chǎn)率，來(lái)自Ξ個(gè)合成編碼序列的淀粉酶產(chǎn) 率。 陽(yáng) 142]
陽(yáng)143] 表中的產(chǎn)率清晰地示出合成淀粉酶編碼序列令人驚訝地比另兩個(gè)表現(xiàn)更好。與天 然編碼基因相比，"syn3"淀粉酶基因提供了遠(yuǎn)遠(yuǎn)更高的淀粉酶產(chǎn)率，并且?guī)缀跏橇韮蓚€(gè)合 成基因的兩倍之多。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種編碼成熟淀粉酶的分離的合成多核苷酸，所述多核苷酸包括SEQIDN0:4中示 出的核苷酸序列。2. 如權(quán)利要求1所述的分離的合成多核苷酸，所述多核苷酸由SEQIDN0:4中示出的 核苷酸序列組成。3. -種多核苷酸構(gòu)建體，包括如在權(quán)利要求1或2中限定的多核苷酸，該多核苷酸可操 作地連接至提供該多核苷酸在所選定的宿主細(xì)胞中的表達(dá)的控制序列上。4. 如權(quán)利要求3所述的多核苷酸構(gòu)建體，其中這些控制序列包括三串聯(lián)啟動(dòng)子。5. 如權(quán)利要求3或4所述的多核苷酸構(gòu)建體，其中這些控制序列包括編碼與指導(dǎo)淀粉 酶進(jìn)入宿主細(xì)胞分泌通路的淀粉酶N末端融合的信號(hào)肽的多核苷酸區(qū)；優(yōu)選地，該信號(hào)肽 是amyLfg號(hào)肽。6. 用如在權(quán)利要求1-2中限定的多核苷酸或如在權(quán)利要求3-5中限定的多核苷酸構(gòu)建 體轉(zhuǎn)化的或包括該多核苷酸或該多核苷酸構(gòu)建體的一種重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞 生產(chǎn)該成熟淀粉酶。7. 如權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞是芽孢桿菌屬細(xì)胞；優(yōu)選是嗜堿芽孢桿 菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)硬芽 孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱 脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、或蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。8. -種用于生產(chǎn)成熟淀粉酶的方法，所述方法包括以下步驟： a) 在有助于表達(dá)該淀粉酶的條件下培養(yǎng)如在權(quán)利要求6或7中限定的宿主細(xì)胞；以及 任選地 b) 回收淀粉酶。
【專利摘要】本發(fā)明涉及使用用于表達(dá)來(lái)自秋葉氏芽孢桿菌成熟淀粉酶AX856的密碼子改性多核苷酸構(gòu)建體，對(duì)該淀粉酶進(jìn)行編碼的一種分離的合成多核苷酸。
【IPC分類】C12N9/28
【公開(kāi)號(hào)】CN105339493
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201480035615
【發(fā)明人】J·T·安諾生, N·班克
【申請(qǐng)人】諾維信公司
【公開(kāi)日】2016年2月17日
【申請(qǐng)日】2014年6月17日
【公告號(hào)】EP3013949A1, US20160115463, WO2014206806A1