化R0)E3)大腸桿菌；從美國(guó)Novagen公司引進(jìn)，本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0039] 4.P化uttle-CMV載體；從美國(guó)Stratagene公司引進(jìn)，本實(shí)驗(yàn)室保存。文獻(xiàn)； BenihoudK,YehP,Perricaudet,M.Adenovirusvectorsforgenedelivery.Current OpinioninBiotechnology, 1999, 10巧）：440-447.
[0040] 5.pEGFP-Nl載體；從美國(guó)抓BiosciencesClontech公司引進(jìn)。文獻(xiàn)；Prasher DC,EckenrodeVK,WardWW,etal.Primarystructureoftheaequoreavictoriagreen fluorescentprotein.Gene, 1992, 111(2):229-233.
[0041] 6.祀T/EI-GFP載體；從美國(guó)普林斯頓大學(xué)引進(jìn)，本實(shí)驗(yàn)室保存。文獻(xiàn)；Fong BA,WoodDW.ExpressionandpurificationofELP-intein-taggedtargetproteinsin highcelldensityE.colifermentation.MicrobialCellFactories, 2010, 9:77.
[0042] 7.pUC57載體；從美國(guó)GeneScript公司引進(jìn)，本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0043]8.PK-15細(xì)胞；從美國(guó)ATCC引進(jìn)（ATCCC化-33)，本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0044] 9.NIH3T3細(xì)胞；從美國(guó)ATCC(CRL1658)引進(jìn)，本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0045] 10. CH0-K1細(xì)胞；從美國(guó)ATCC(C化-61)引進(jìn)，本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0046] 11.AAV-293細(xì)胞；從美國(guó)Stratagene公司引進(jìn)，本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0047] 具體操作步驟如下：
[0048] 1.ELP-CAR融合表達(dá)載體構(gòu)建
[0049] (1)利用在線軟件JAVACodonAdaptionTool(文獻(xiàn)；GroteA,HillerK，Scheer M,MilnchR,N6rtcmannB,HempelDC,JahnD.JCat:anoveltooltoadaptcodonusage ofatargetgenetoitspotentialexpressionhost.NucleicAcidsRes. 2005,1 ;33)， 將CARD1結(jié)構(gòu)域編碼序列（GenBankAccessionN〇:NM_001207066)優(yōu)化成大腸桿菌化12 株）偏愛(ài)密碼子序列，由南京金斯瑞生物有限公司合成，克隆在pUC57質(zhì)粒載體中。
[0050] 似設(shè)計(jì)下列1對(duì)引物，正向引物引入EcoRI酶切位點(diǎn)和CARD1與D2結(jié)構(gòu)域間隔 序列（GenBankAccessionN〇:NM_001207066)，反向引物引入甜al酶切位點(diǎn)；
[0化1] 正向引物；
[0052] 5-GGTGAATTCCTGGTTAAACCGTCTGGTGCTCGTTGCTACGTTGACGGTTCTGAAGAAATCGGTTCT GACTTCTCTATCACCACCCCG-3(SEQIDNO. 1)；
[0化引 反向引物；5-ggti￡1mattaaccagacggtttaaccagaa-3(seqidno. 2)。
[0054] W含CA畑1結(jié)構(gòu)域序列的pUC57質(zhì)粒為模板，按照Ex"TagiMpoiymerase(Ka^TaRa公 司）說(shuō)明書(shū)，用PCR擴(kuò)增帶有間隔序列的CARDl結(jié)構(gòu)域序列，用限制酶EcoRI和甜al消化 后備用。
[0化5] (3)用限制酶EcoRI和甜al消化祀T/EI-GFP載體，電泳分離后膠回收切除GFP 序列的載體片段，與上述CARD1結(jié)構(gòu)域序列連接，獲得重組載體祀T-ELP-CAR (圖1)。
[0056] (4)用限制酶EcoRI和甜al對(duì)重組載體祀T-ELP-CAR進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果能釋放 出預(yù)期大小的插入片段；將重組質(zhì)粒送南京金斯瑞生物有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果顯示 插入序列無(wú)突變。
[0057] 2. ELP-CAR融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化
[0化引 （1)將重組質(zhì)粒祀T-ELP-CAR轉(zhuǎn)化化R0)E3)大腸桿菌，在氨節(jié)青霉素（100yg/ mL)LB平板培養(yǎng)過(guò)夜；挑取單菌落接種5mL氨節(jié)青霉素LB，37°C搖床培養(yǎng)過(guò)夜，4°C、8000g離屯、lOmin;沉淀菌體W等體積LB重懸，W1:100比例接種500血氨節(jié)青霉素2XYT培 養(yǎng)液（Tiyptone16g，YeastExtractlOg，化(31 5g)，37°C、230巧m培養(yǎng)至孤日00= 0.8; 加入0. 5mmol/LIPTG，20 °C、150巧111誘導(dǎo)表達(dá)2化；4 °C、4000g離屯、lOmin，沉淀菌體用 PBS(抑7. 4)離屯、洗漆3次；將少量重組菌體用PBS懸浮，用超聲波儀裂解后離屯、，分別收集 上清和沉淀進(jìn)行電泳分析，結(jié)果顯示重組菌能表達(dá)預(yù)期的62kDaELP-CAR融合蛋白，表達(dá)產(chǎn) 物存在于裂解菌體的離屯、上清中（圖2)。
[0化9] (2)用50mLPBS(pH7. 4)重懸其余菌體，按照細(xì)胞破碎儀（廣州聚能生物科技有限 公司）在4°C裂解2次（ISOObar) ;4°C、16000g離屯、20min，收集上清液；用Super-Bra壯ord蛋白定量試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）測(cè)定菌體裂解液蛋白濃度，用PBS調(diào) 整蛋白濃度為5mg/mL。
[0060] 做ELP-CAR融合蛋白的相變溫度測(cè)定參考文獻(xiàn)化ang町，Kim化化ang WJ.Heterologousexpressionandoptimizedone-stepseparationoflevansucrase viaelastin-likepolypeptidestaggingsystem.MicrobiologyandBiotechnolo gy，2007, 17(11) : 1751-1757)進(jìn)行，所用氯化鋼濃度為1. 5mol/l，測(cè)得的ELP-CAR融合蛋 白的相變溫度為26 °C。
[0061] (4)純化ELP-CAR融合蛋白的溫度敏感相變循環(huán)參考文獻(xiàn)（ShenY，Ai HX,SongR,etal.ExpressionandpurificationofmoricinCM4andhuman beta-defensins4inEscherichiacoliusinganewtechnology.Microbiological Research，2010, 101:229-240)進(jìn)行，所用氯化鋼終濃度為1. 5mol/l，解育條件為26°C、 lOmin，離屯、條件為室溫、14000g、5min，收集的沉淀即為初步純化的ELP-CAR融合蛋白；在 相同條件下重復(fù)相變循環(huán)1次，取部分純化產(chǎn)物進(jìn)行12%SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示純化的 ELP-CAR融合蛋白為單一條帶（圖2)。
[0062] (5)按照與純化ELP-CAR融合蛋白同樣的方法，從祀T-ELP重組大腸桿菌純化 HiS-ELP融合蛋白；取HiS-ELP和ELP-CAR融合蛋白各 10yL(0. 5mg/mL)進(jìn)行SDS-PAGE 分離，按照蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)炬io-Rad公司）說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)印巧0V，2h)硝酸纖維素膜，用常規(guī) Western-blotting對(duì)ELP-CAR融合蛋白進(jìn)行鑒定，一抗為1 ;500CAR特異抗體（上海圣克魯 斯生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品），二抗為1 ;1〇〇〇〇稀釋Dyli曲t?800 1油eledGoatanti-Mouse IgG(K化公司），雜交信號(hào)用Odyssey紅外巧光掃描成像系統(tǒng)（美國(guó)LI-COR公司）掃描成 像。結(jié)果顯示；CAR特異抗體與ELP-CAR融合反應(yīng)陽(yáng)性，與His-ELP融合蛋白反應(yīng)陰性（圖 3) 〇
[0063] 3.重組腺病毒的構(gòu)建
[0064] (1)根據(jù)祀GFP-N1載體中GFP基因序列設(shè)計(jì)下列引物；
[00化]正向引物：5-ATCTCGAGATGGTGAGCAAGGGCGAG-3 (引入化〇1 位點(diǎn)）（SEQIDNO. 3);
[0066] 反向引物：5-CGAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCC-3 (引入 Hindlll 位點(diǎn)）（SEQID NO. 4) 〇
[0067] W祀GFP-Nl載體為模板，按照ExhgTipoiymerase(KahRa公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物為預(yù)期的73化P;將PCR產(chǎn)物插入 pamttle-CMV的化oI/Hindlll位點(diǎn)，獲得重組載體pShuttle-GFP。
[0068] (2)按照A祀asy?AdenoviralVectorSystem(AgilentTechnologies)說(shuō)明書(shū) 和文獻(xiàn)炬enihoudK,YehP,Perricaudet,M.Adenovirusvectorsforgenedelivery. QirrentOpinioninBiotechnology, 1999, 10 巧）：440-447)制備重組腺病毒rAd-GF