一種柯薩奇病毒ca6型熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及核酸熒光PCR檢測(cè)試劑盒，尤其涉及薩奇病毒CA6型熒光定量PCR檢 測(cè)試劑盒，屬于手足口病的體外診斷領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 手足口病（hand,foot-mouthdisease)是世界范圍內(nèi)流行的兒童常見病，主要發(fā) 生于3歲以下兒童，但偶有成人發(fā)病的報(bào)告，是由多種腸道病毒引起的，以發(fā)熱和手、足、口 腔等部位出現(xiàn)皰疹為主要特征的疾病，少數(shù)患病兒童可出現(xiàn)腦炎，急性弛緩性麻痹，心肌 炎，腦水腫等嚴(yán)重并發(fā)癥，病情進(jìn)展快，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。近些年來(lái)，手足口病在許多國(guó) 家，特別是亞太地區(qū)發(fā)生過(guò)多次的爆發(fā)或流行，越來(lái)越受到各國(guó)的關(guān)注。引起手足口病的病 原體多樣，但都為單股正鏈RNA病毒，屬于小RNA病毒科的腸道病毒。到目前為止，有文獻(xiàn) 報(bào)道的20多個(gè)血清型可引起手足口病，主要有CA16、CA6、CA7、CA9、CA10、CB2、CB5、CB13、 ECH019以及EV71型等。最近，由于在世界范圍的不同國(guó)家，CA6已經(jīng)逐漸成為導(dǎo)致手足口 病的主要致病原，該病毒受到了越來(lái)越多的關(guān)注。
[0003] 在2013年夏天，中國(guó)長(zhǎng)春市爆發(fā)了手足口病，總共有1125例病人確診為手足 口病患者，大部分均為5歲以下，總共220份手足口病樣本被收集并進(jìn)行檢測(cè)，有101份 (66. 9 % )為CA6 感染，其他感染的腸道病毒包括CA2 (1. 3 % )，CA10 (1. 9 % )，CA14 (0· 6 % )， CA16(5.9%)，CB4(1.3% )，EV71(19.2%)和EC30(0.6%)。在2012 年，該城市的EV71 陽(yáng) 性率占檢測(cè)樣本的25. 5%，CA16則占到55. 5%，但是在2013年，長(zhǎng)春市CA6已經(jīng)取代EV71 和CVA16成為新的手足口病主要致病原。同樣在2013年，中國(guó)的深圳也爆發(fā)了手足口病， 在201份腸道病毒陽(yáng)性標(biāo)本中，CA6感染率變成第一（47.8% )，其次是EV71 (18.9% )，再 次是CA16(i. 5% )。其他的腸道病毒也被檢測(cè)到。在2013年，深圳市CA6取代TEV71成為 手足口病的主要致病原。
[0004] 柯薩奇病毒CA6型與其他柯薩奇病毒一樣，屬于小RNA病毒科，腸道病毒屬 (Enterovirus)，致病譜廣，是多種人類疾病的致病原。CA6病毒現(xiàn)在已經(jīng)成為引起兒童 HFMD的主要病原之一。CA6病毒顆粒為二十面體對(duì)稱球形，由核酸和蛋白質(zhì)組成，無(wú)包膜和 突起。病毒顆粒核心含一開放閱讀框架，編碼的多聚蛋白經(jīng)過(guò)自身蛋白酶水解，分為P1、P2 和P3三種前體蛋白。P1區(qū)前體蛋白又可編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白P1~VP4,組成病毒衣殼。目 前常用的診斷方法為：病毒分離方法、血清學(xué)方法、PCR方法。
[0005] 其中，病毒分離方法利用組織培養(yǎng)、分離腸道病毒是目前診斷手足口病病原的金 標(biāo)準(zhǔn)，但是由于任何一種細(xì)胞都不可能對(duì)引起手足口病所有腸道病毒進(jìn)行培養(yǎng)，所以，雖然 病毒培養(yǎng)技術(shù)是檢測(cè)診斷腸道病毒的金標(biāo)準(zhǔn)，但此方法操作繁瑣，分離率不高，在手足口病 的流行爆發(fā)期間，難以推廣應(yīng)用；血清學(xué)方法最常用的方法是酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA)， 這種方法可以對(duì)單份血清或急性期和恢復(fù)期的雙份血清進(jìn)行檢測(cè)，簡(jiǎn)單、快速，不需要特別 的儀器，非常適合基層醫(yī)療單位，但由于腸道病毒共同抗原表位的存在，所以均有不同程度 的交叉反應(yīng)性；PCR(polymerasechainfaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)），是一種分子生物學(xué)技 術(shù)，用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制，即使采集的標(biāo)本中含 有微量的病毒RNA或是失活病毒，也能經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后檢測(cè)出來(lái)。與病毒分離以及血清學(xué) 檢測(cè)相比，RT-PCR具有特異、簡(jiǎn)單、快速、敏感等優(yōu)點(diǎn)，并且，擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過(guò)測(cè)序之后用 于分子流行病學(xué)分析。但是PCR也存在許多不足之處，PCR消耗試劑大、操作步驟多、容易 造成PCR污染，并且，PCR-次性檢測(cè)的樣本數(shù)有限，大規(guī)模檢測(cè)時(shí)耗時(shí)耗力。
[0006]結(jié)合國(guó)內(nèi)情況，在臨床HFM診斷中，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)憑借著快速、敏感、特異等優(yōu) 點(diǎn)顯示出了其臨床診斷的優(yōu)越性，目前只有極少量熒光PCR診斷試劑盒在CA6診斷中使用， 缺乏完善的質(zhì)控體系，操作比較繁瑣，靈敏度不高，還需要進(jìn)一步完善和提高技術(shù)水平，使 此類產(chǎn)品更加滿足臨床準(zhǔn)確快速診斷的需要。
[0007] 臨床上檢測(cè)CA6-RNA的方法目前主要是基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的技術(shù)及其改進(jìn)， 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展迅速的一種核酸檢測(cè)技術(shù)，使用一種帶有熒光檢測(cè)裝 置的PCR擴(kuò)增儀，熒光檢測(cè)裝置能夠按照一定的程序周期性地發(fā)出特定波長(zhǎng)的激發(fā)光，收 集檢測(cè)熒光信號(hào)，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化實(shí)時(shí)反映PCR的每個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增水平，試 驗(yàn)結(jié)束后可通過(guò)軟件自動(dòng)分析獲得擴(kuò)增曲線，根據(jù)擴(kuò)增曲線與熒光閾值線的交點(diǎn)（即Ct 值）以及擴(kuò)增曲線的形狀，可以判斷陰陽(yáng)性結(jié)果；如果同一反應(yīng)中有已知濃度的定量參考 品或標(biāo)準(zhǔn)品，則可以通過(guò)軟件自動(dòng)分析獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此實(shí)現(xiàn)對(duì)未知樣本的定值（即定 量檢測(cè)）。與傳統(tǒng)的PCR相對(duì)比，其在反應(yīng)體系中增加了一條兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和 淬滅基團(tuán)的探針。探針結(jié)構(gòu)完整時(shí)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，呈現(xiàn)淬 滅效應(yīng)；如果擴(kuò)增過(guò)程中有靶序列的存在，隨著目標(biāo)片段的延伸，探針?lè)肿又饾u被Taq酶水 解切斷，熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)相互解離，阻斷了二者間熒光能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，熒光報(bào)告基 團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被熒光檢測(cè)裝置收集。隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，熒光信號(hào)隨著目的片段的擴(kuò)增 而呈現(xiàn)線性增強(qiáng)。試驗(yàn)結(jié)束后，可以通過(guò)熒光PCR儀自帶的軟件自動(dòng)分析數(shù)據(jù)，可以獲得陰 陽(yáng)性結(jié)果和樣本濃度的定值結(jié)果，因此，該技術(shù)在靶多核苷酸樣品的檢測(cè)和定量分析中，已 逐漸取代傳統(tǒng)的PCR方法，得到十分廣泛的應(yīng)用。
[0008] 國(guó)內(nèi)已有多種基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量檢測(cè)柯薩奇病毒CA6型的方法，這 些試劑盒所提供的CA6-RNA提取方法主要是酸-氯仿法和柱提取法，但是，有以下不足之 處：（1)酚-氯仿法雖然是最經(jīng)典的RNA提取方法，但是操作繁瑣，對(duì)于設(shè)備和人員操作要 求高，低病毒載量的標(biāo)本檢出率低，且所用試劑具有一定的毒性；柱提取方法雖然無(wú)需高速 離心，但是需頻繁更換離心管，用時(shí)長(zhǎng)，特異性較差；(2)無(wú)法有效去除樣本中的PCR抑制 物；（3)沒(méi)有設(shè)置陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照（即內(nèi)標(biāo)），無(wú)法監(jiān)控假陰性；(4) 一般沒(méi)有預(yù)防PCR產(chǎn)物污染 的措施；（5)現(xiàn)有方法檢測(cè)靈敏度欠佳，可能出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有柯薩奇病毒CA6型核酸熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒的缺 陷，提供一種具有操作快速、方法簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)范圍寬而準(zhǔn)確的柯薩奇病毒CA6 型核酸熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，本試劑盒可以柯薩奇病毒CA6型RNA核酸片段進(jìn)行快速 熒光PCR檢測(cè)，并且可以對(duì)人血清或咽拭子或皰疹滲出液等標(biāo)本中的柯薩奇病毒CA6型進(jìn) 行定量分析，檢測(cè)結(jié)果可用于柯薩奇病毒CA10型感染的輔助診斷和疾病監(jiān)控。
[0010] 本發(fā)明實(shí)施例中提供了一種柯薩奇病毒CA6型熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其包括 以下各組分：RNA提取溶液、RNA洗脫液、RT-PCR增強(qiáng)劑、內(nèi)標(biāo)、PCR反應(yīng)液、CA6陽(yáng)性對(duì)照品、CA6陰性對(duì)照品，其中，所述PCR反應(yīng)液包括0· 2μmol/L~0· 4μmol/L用于靶多核苷酸擴(kuò) 增的上游引物以及下游引物，0·2μπι〇1/1~0·4μπι〇1/1用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針，所述 用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上下游引物及用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針，其堿基對(duì)序列分別為：
[0011] 上游引物：5' -CTGCAGAAACGGGAGCAAG-3' ；
[0012] 下游引物：5'-GAGTAAAAGTGTTCCACACTCGC-3' ；
[0013] 探針 1 :5'FAM-ACCCCGTTTCGATTCATCACACA-BHQ13'。
[0014] 優(yōu)選的，上述檢測(cè)試劑盒，其中，所述內(nèi)標(biāo)為插入PUC18T載體的長(zhǎng)為128堿基對(duì) 的人工合成DNA序列的重組體，其濃度為1. 00E+04copies/ml~5. 00E+04copies/ml;所述 128堿基對(duì)的序列如下所示：
[0015] 5'-GTCCAGTACTTTCAAAGCTCGATCCCGGTAACTACCAAATCGGTACGTACCGGTTTAAAACCACCG ATCGCCTCTTCCCAACCTGTACGTACGTACGTACGTCCAAAAGTTTCCACGTACGATCGATC-3' 。
[0016] 優(yōu)選的，上述檢測(cè)試劑盒，其中，所述RNA提取溶液包括如下組分：
[0017] RNA提取溶液I:十二烷基硫