一種柯薩奇病毒a16型、腸道病毒71型核酸熒光pcr檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及核酸巧光PCR檢測(cè)試劑盒，尤其設(shè)及柯薩奇病毒A16型/腸道病毒71 型核酸巧光PCR檢測(cè)試劑盒，屬于手足口病的體外診斷領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 手足口病（Hand-化ot-mouthdisease，HFMD)又名發(fā)疹性水瘤口腔炎，是由一組腸 道病毒引起的常見(jiàn)傳染病，臨床表現(xiàn)W發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹為主要臨床特征的 一種急性傳染病。絕大多數(shù)HFMD患者預(yù)后良好，一般可在5~7天痊愈，屬于自限性疾病。 病毒還可W侵犯呼吸系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等引起腦炎、肺水腫、弛緩性麻搏、屯、肌炎等癥狀， 個(gè)別危重患兒可因多種原因?qū)е滤劳?。該病全年均可發(fā)病，好發(fā)于夏秋季，常見(jiàn)于5歲W下 的兒童。HFMD的主要傳播途徑是糞-口途徑，亦可通過(guò)呼吸道傳播。HFMD傳染性強(qiáng)，易導(dǎo) 致流行或暴發(fā)。HFMD分布極廣泛，無(wú)嚴(yán)格地區(qū)性。HFMD全年均可發(fā)病，有明顯的季節(jié)特點(diǎn)， W夏秋季多見(jiàn)。
[0003] 引起HFMD的主要為小核糖核酸病毒科（Picornaviridae)腸道病毒屬的柯薩奇病 毒（Coxsackievirus)A組的4型、5型、7型、9型、10型、16型；柯薩奇病毒B組的2型、5型； 部分?？刹《厩蒀HO-viruses)和腸道病毒71型。最常見(jiàn)為柯薩奇病毒A組16型（CoxAie) 及腸道病毒71型巧V71)。人對(duì)引起HFMD的腸道病毒普遍易感，各年齡組均可感染發(fā)病，但 W隱性感染為主，隱性感染與顯性感染之比約為100 : 1。由于機(jī)體受病毒感染后，產(chǎn)生的 中和抗體可在體內(nèi)存留較長(zhǎng)時(shí)間，對(duì)同型病毒感染產(chǎn)生牢固的免疫力，因此，HFMD的患者主 要為學(xué)齡前兒童，尤其是5歲W下兒童，占發(fā)病數(shù)90%W上。而大多數(shù)成人可攜帶病毒但不 發(fā)病。1歲W內(nèi)的兒童發(fā)生屯、肌炎、腦炎等重癥的比例較1歲W上兒童高。
[0004] 中國(guó)手足口病流行，1981年上海首次報(bào)道手足口??；1983年天津發(fā)生CoxAie引起 的手足口病暴發(fā)；1995年武漢病毒研究所從手足口病人中分離出EV71 ;1998年中國(guó)臺(tái)灣地 區(qū)129106例HFMD，其中405例為嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，78例死亡；1999年W來(lái)，中國(guó) 廣東、福建、上海、重慶等地區(qū)報(bào)告局部流行EV71感染；2007年山東臨巧流行WEV71為主 的手足口病；2008~2009年安徽阜陽(yáng)、河南、山東等地大規(guī)模流行。主要為CoxAie和EV71 共循環(huán)引起手足口病發(fā)，EV71在大部分省市為優(yōu)勢(shì)病毒。
[0005] 國(guó)內(nèi)已有多種基于實(shí)時(shí)巧光定量PCR技術(shù)定量檢測(cè)CA16、EV71RNA的試劑盒應(yīng)用 于臨床檢測(cè)中，運(yùn)些試劑盒所提供的RNA提取方法主要是酪-氯仿法和柱提取法。該類(lèi)試 劑盒存在很多不足之處：1)檢測(cè)靈敏度低，約在lOOOcopie/ml左右；檢測(cè)范圍窄，一般在 1. 00E+03copie/ml~1. 00E+07copie/ml之間，對(duì)于臨床高值（大于 5. 00E+07copie/ml) 和低值（小于1.00E+03copie/ml)的樣本無(wú)法檢測(cè)；2)對(duì)于CA16\EV71的不同亞型存在一 定的漏檢現(xiàn)象；3)酪-氯仿法是最經(jīng)典的RNA提取方法，但是操作繁瑣，對(duì)于設(shè)備和人員操 作要求高，低病毒載量的標(biāo)本檢出率低，且所用試劑具有一定的毒性；柱提取方法無(wú)需高速 離屯、，但是需頻繁更換離屯、管，用時(shí)長(zhǎng)，特異性較差；4)無(wú)法有效去除樣本中的PCR抑制物 (如：全血、疲液等），體系中一般沒(méi)有陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照（即內(nèi)標(biāo)），無(wú)法預(yù)防假陰性；5)國(guó)外試 劑成本和耗材成本太高，很難在臨床廣泛開(kāi)展。6)國(guó)內(nèi)大部分試劑只能做單管檢測(cè)，檢測(cè)2 個(gè)型需要用兩管反應(yīng)液。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有柯薩奇病毒A16型（CA16)、腸道病毒71型巧V71)巧 光定量PCR檢測(cè)試劑盒的缺陷，提供一種RNA提取得率高、檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)范圍寬而準(zhǔn) 確的CA16/EV71核酸巧光PCR檢測(cè)試劑盒，可W對(duì)咽拭子等未知樣本中的CA16\EV71-RNA 在一管反應(yīng)液中進(jìn)行快速、準(zhǔn)確檢測(cè)，并且可W區(qū)分CA16和EV71基因型，檢測(cè)結(jié)果可用于 CA16/EV71感染的輔助診斷。
[0007] 本發(fā)明實(shí)施例中提供了一種柯薩奇病毒A16型、腸道病毒71型核酸巧光PCR檢 測(cè)試劑盒，包括W下各組分：RNA提取溶液、RNA洗脫液、內(nèi)標(biāo)、PCR反應(yīng)液、CA16/EV71酶 混合液、CA16/EV71陽(yáng)性對(duì)照、CA16/EV71陰性對(duì)照，其中，所述內(nèi)標(biāo)為插入PUC18T載體 的一段長(zhǎng)為90堿基對(duì)的人工合成DNA序列的重組體，其濃度為1. 00E+03copies/ml~ 1. 00E+06copies/ml;所述90堿基對(duì)的序列為：
[0008] 日'-CAGCTTGTTGTAACAAAGCATCCGCTCCCCCATTCATGTTGCTGGGTACAGACAGTTACCTCTCCA CTAGGCAAATCTCAACAGGATCAG-3' 。
[0009] 優(yōu)選的，上述的檢測(cè)試劑盒，其中，所述RNA提取溶液包括如下組分：
[0010] RNA提取溶液I:十二烷基硫酸鋼，質(zhì)量/體積0. 3 %~1. 2 %、曲拉通，體積/體積 1. 0 % ~5. 0 %，異硫氯酸脈 0.Imol/L~1. 2mol/l、50μg/ml~350μg/ml的磁珠；
[0011] RNA提取溶液II:4-?乙基贓嗦乙橫酸150mmol/L~350mmol/L、p冊(cè).5 + 0. 2,氯 化鋼 150mmol/L~400mmol/L;
[0012] RNA提取溶液III:曲拉通，體積/體積0. 5 %~3. 0 %、氯化鋼lOOmmol/L~ 400mmol/L；
[001引 RNA提取溶液IV:礦物油。
[0014] 優(yōu)選的，上述的檢測(cè)試劑盒，其中，所述RNA洗脫液為T(mén)ris-HCl0. 5mol/L~ 1. 5mol/L、EDTA0. 2mol/L~1. 5mol/L。
[0015] 優(yōu)選的，上述的檢測(cè)試劑盒，其中，所述PCR反應(yīng)液為5XPCR反應(yīng)緩沖液10μ1， 2mmol/L脫氧核糖核巧Ξ憐酸，0. 1ymol/L~0. 5ymol/L用于祀多核巧酸擴(kuò)增的上下游引 物CA16-F、EV71-F與CA16-R、EV71-R，0. 1μmol/L~0. 5μmol/L用于祀多核巧酸檢測(cè)的探 針CA16-P、EV71-P，0.lymol/L~0. 4ymol/L用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的上下游引物IC-F與IC-R， 0. 1ymol/L~0. 4ymol/L用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的探針I(yè)C-P。
[0016] 優(yōu)選的，上述的檢測(cè)試劑盒，其中，所述用于祀多核巧酸擴(kuò)增的上下游引物W及用 于祀多核巧酸檢測(cè)的探針，其堿基對(duì)序列分別為：
[0017] CA16 上游引物CA16-F:5' -TATGTTAATTGGGACATTGATTTGA-3' ；
[0018] 〔416下游引物〔416-尺：5'-40：4176661'1766(：了4〔6-3'；
[0019] CA16 探針CA16-P:5' -FAM-ATATGCTCAGCTGCGGCGG-B冊(cè) 1-3' ；
[0020] EV71 上游引物EV71-F:5' -TCCCACATTCGGAGAACACA-3' ；
[0021] EV71 下游引物EV71-R:5' -AAGGGTACTTGGACTTGGAGGT-3' ；
[0022] EV71 探針EV71-P:5' -肥X-AGGAGAAAGATCTTGAATACGGGGC-B冊(cè) 1-3'。
[0023] 優(yōu)選的，上述的檢測(cè)試劑盒，其中，所述用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的上下游引物W及用于檢測(cè) 內(nèi)標(biāo)的探針I(yè)C-P，其堿基對(duì)序列分別為：
[0024] 內(nèi)標(biāo)上游引物IC-F:5' -CAGCTTGTTGTAACAAAGCA-3' ；
[00巧]內(nèi)標(biāo)下游引物IC-R:5' -CTGATCCTGTTGAGATTTGCC-3' ；
[0026] 內(nèi)標(biāo)探針I(yè)C-P:5'ROX-CTCCCCCATTCATGTTGCTGGG-B冊(cè) 13'。
[0027] 優(yōu)選的，上述的檢測(cè)試劑盒，其中，所述CA16/EV71酶混合液為mMLV酶10U/μ1~ 150U/μ1，H-TaqDNA聚合酶 1U/μ1 ~10U/μ1。
[002引優(yōu)選的，上述的檢測(cè)試劑盒，其中，所述CA16/EV71陽(yáng)性對(duì)