一種類彈性蛋白多肽與柯薩奇腺病毒受體融合蛋白及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及生物技術研究領域，具體設及一種類彈性蛋白多膚與柯薩奇腺病毒受 體融合蛋白的制備方法及其在重組腺病毒濃縮和純化中的應用。 技術背景
[0002] 作為基因轉移載體，腺病毒與其他病毒相比具有許多優(yōu)點，包括容易制備高滴度 的重組病毒、能轉導多種分裂和靜止期細胞、基因導入效率高、外源基因能有效表達和插入 宿主基因組引起突變的風險小等，因此重組腺病毒在人和動物基因治療和基因工程疫苗研 究中已得到廣泛應用。
[0003] 重組腺病毒的廣泛使用需要快速、經濟、大量制備高質量的重組病毒，現(xiàn)有的重組 腺病毒濃縮與純化方法主要有化學沉淀法、超速離屯、法和層析法。其中，聚己二醇沉淀法是 經典的重組病毒濃縮方法，但需要離屯、大量的細胞培養(yǎng)液；硫酸錠沉淀法兼有濃縮和純化 重組腺病毒的作用，但通常需與其他純化方法相結合才能達到純化目的；氯化飽密度梯度 離屯、法是制備高質量重組腺病毒的經典方法，但因難W規(guī)?；荒軡M足臨床應用需要； 雖然許多層析法也可用于重組腺病毒的純化，但該些方法最初為純化蛋白而設計，純化重 組腺病毒的效果往往不佳。另外，上述重組腺病毒濃縮與純化方法都有費力、費時、成本高 和需要?？谠O備等缺點。
[0004] 腺病毒W受體參與的胞吞機制進入祀細胞。參與不同血清型腺病毒感染的受體有 多個，其中柯薩奇腺病毒受體（Coxsackievirusandadenovirusrec巧tor,CAR)是柯薩奇 病毒BW及人腺病毒血清型2和5的高親和力吸附受體，而目前用于人和動物基因工程疫 苗的重組腺病毒多為血清2和5型。CAR是一種46kDa跨膜糖蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞 漿內尾部=部分組成。其中，胞外區(qū)由D1和D2兩個免疫球蛋白樣結構域組成，兩者之間為 間隔序列?，F(xiàn)有的研究資料顯示，重組大腸桿菌表達的CAR-D1區(qū)即可與腺病毒結合，提示 可W作為捕捉和濃縮腺病毒的誘巧蛋白。
[0005] 類彈性蛋白多膚巧lastin-1化epolyp巧tide,ELP)是根據彈性蛋白相關序列合 成的五膚（鄉(xiāng)氨酸-脯氨酸-甘氨酸-任何氨基酸-甘氨酸）聚合物，具有溫度敏感的可 逆相變特性，在低于相變溫度溶液中呈溶解狀態(tài)，在高于相變溫度溶液中呈凝聚狀態(tài)，因此 可用簡單的離屯、或過濾法與細胞蛋白分離。已經表達的ELP融合蛋白能保持ELP的可逆相 變特性，因此ELP已被用作純化重組蛋白的標簽蛋白，但ELP與腺病毒受體的融合蛋白能否 保持可逆相變特性，并進一步用于重組腺病毒的濃縮與純化，尚有待研究。
[0006] 本發(fā)明將ELP的溫度敏感相變特性與腺病毒受體的結合特異性相結合，將重組大 腸桿菌表達的ELP與CAR-D1融合蛋白巧LP-CAR)用于重組腺病毒的濃縮與純化。盡管該 種策略是容易想到的，但在具體設計時卻面臨W下技術問題；天然CAR-D1序列是否適合 在大腸桿菌中高水平表達、CAR-D1區(qū)與ELP融合后能否正確折疊、在什么條件下ELP-CAR 融合蛋白能保持溶解狀態(tài)、如何洗脫釋放與ELP-CAR融合蛋白結合的腺病毒并不被滅活、 結合融合蛋白的腺病毒是否能感染敏感細胞。為此，本發(fā)明在已知ELP序列能在重組大腸 桿菌中有效表達基礎上，將CAR-D1區(qū)序列優(yōu)化成大腸桿菌偏愛密碼子序列，W便兩者融合 蛋白能在重組大腸桿菌中高水平表達；利用CAR蛋白兩個胞外區(qū)之間的間隔序列作為ELP 與CAR-D1區(qū)的彈性間隔序列，W便CAR-D1區(qū)能在融合蛋白表面自由折疊和展示；在測得 ELP-CAR融合蛋白相變溫度基礎上，在低于相變溫度下進行融合蛋白表達和與腺病毒結合， W確保其可溶性；通過對腺病毒洗脫條件的系統(tǒng)優(yōu)化，使腺病毒能從融合蛋白上有效洗脫 并不被滅活。與現(xiàn)有的其他方法相比，用本發(fā)明的ELP-CAR融合蛋白不僅能從感染細胞中 濃縮和純化重組腺病毒，而且能從水等環(huán)境樣品中濃縮人和動物腺病毒，純化的重組腺病 毒不僅可用于動物實驗研究，還可作為基因工程疫苗。

【發(fā)明內容】

[0007] 為了解決現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明提供了一種類彈性蛋白多膚巧L巧與柯薩 奇腺病毒覺體（CAR)融合蛋白及其制備方法和應用。
[000引本發(fā)明的類彈性蛋白多膚與柯薩奇腺病毒受體融合蛋白，由ELP、間隔區(qū)和CARD1 區(qū)組成。經病毒純化試驗證明，利用該融合蛋白能從重組腺病毒感染細胞及其培養(yǎng)上清中 有效濃縮與純化重組腺病毒。
[0009] 本發(fā)明所述融合蛋白用下列方法制備：
[0010] (1)依次將ELP、間隔區(qū)和CA畑1區(qū)編碼序列插入原核表達載體祀T-30a，獲得重組 載體祀T-ELP-CAR;
[0011] (2)用重組載體祀T-ELP-CAR轉化大腸桿菌，在20°C條件下進行ELP-CAR融合蛋 白誘導表達；
[0012] (3)用1. 5M氯化鋼和26 °C離屯、沉淀ELP-CAR融合蛋白。
[0013] 其中步驟（1)是；CARD1編碼序列為利用生物信息學軟件優(yōu)化和化學合成的大腸 桿菌偏愛密碼子序列，W便在重組大腸桿菌中高水平表達；用CAR蛋白兩個胞外區(qū)之間的 間隔序列作為CARD1與ELP之間的彈性間隔序列，W便CARD1在融合蛋白上自由折疊和展 /J、- 〇
[0014] 本發(fā)明還公開了所述的ELP-CAR融合蛋白在重組腺病毒濃縮和純化中的應用，其 具體方法如下：
[0015] (1)將120yg/mlELP-CAR融合蛋白與重組腺病毒感染細胞裂解物或培養(yǎng)上清混 合；
[0016] (2)用確1. 5M氯化鋼和26°C離屯、沉淀重組腺病毒；
[0017] (3)用pH9. 0緩沖液洗脫重組腺病毒；
[0018] (4)用1. 5M氯化鋼和26°C離屯、去除ELP-CAR融合蛋白。
[0019] 進一步地，公開了上述融合蛋白在濃縮與純化表達綠色巧光蛋白重組腺病毒中的 應用。本發(fā)明采用了W下方法對融合蛋白進行驗證：
[0020] (1)用聚合酶鏈式反應（PCR)擴增綠色巧光蛋白（GFP)編碼序列，插入腺病毒載體 P化uttle-CMV,獲得重組載體pShuttle-GFP;
[0021] (2)按照常規(guī)方法用AAV-293細胞制備重組腺病毒rAd-GFP;
[0022] (3)將120yg/mlELP-CAR融合蛋白與重組腺病毒感染細胞裂解物或培養(yǎng)上清混 合；
[0023] (5)用1. 5M氯化鋼和26°C離屯、沉淀重組腺病毒；
[0024] (6)用pH9. 0緩沖液洗脫重組腺病毒；
[0025] (7)用1. 5M氯化鋼和26°C離屯、去除ELP-CAR融合蛋白。
[0026] 與現(xiàn)有的其他方法相比，用本發(fā)明的類彈性蛋白多膚與柯薩奇腺病毒受體融合蛋 白濃縮和純化重組腺病毒具有簡單、快速和經濟等優(yōu)點，制備的重組腺病毒可W用于動物 實驗研究和基因工程疫苗。
【附圖說明】：
[0027] 圖1ELP-CAR融合表達載體的結構示意圖。PT7為T7啟動子，ELP為類彈性蛋白多 膚編碼序列，Spacer為CARD1與D2結構域間隔序列，CARD1為CARD1結構域編碼序列。
[002引圖2ELP-CAR融合蛋白的表達與純化及電泳分析。1是空載體轉化菌裂解液，2為IPTG誘導祀T-ELP-CAR重組菌裂解液離屯、上清，3為IPTG誘導祀T-ELP-CAR重組菌裂解液 離屯、沉淀，4為第一輪相變循環(huán)后的ELP-CAR，5為第二輪相變循環(huán)后的ELP-CAR。
[0029] 圖3ELP-CAR融合蛋白的免疫轉印鑒定。1為His-ELP融合蛋白，2為ELP-CAR融 合蛋白。
[0030] 圖4ELP-CAR融合蛋白與重組腺病毒的吸附。1為rAd-GFP陽性對照，2為His-ELP 融合蛋白與rAd-GFP結合的罔心扣紅,3為His-ELP融合蛋白與rAd-GFP結合的罔心上清， 4為ELP-CAR融合蛋白與rAd-GFP結合的離屯、沉淀，3為ELP-CAR融合蛋白與rAd-GFP結合 的離屯、上清。
[0031] 圖5重組腺病毒的洗脫。橫坐標為洗脫時間，縱坐標為洗脫重組腺病毒的病毒回 收率。
[0032] 圖6純化重組腺病毒感染細胞的巧光顯微鏡觀察。PK-15 (CAR+)表示CAR表達陽性 豬腎PK-15細胞，CH〇-Kl(CARi?)表示CAR低水平表達倉鼠卵巢細胞，NIH3T3(CAIT)為CAR 表達陰性小鼠胚胎成纖維細胞，rAd-GFP表示洗脫重組腺病毒感染細胞，ELP-CAR/rAd-GFP 表示未洗脫重組腺病毒感染細胞。
[0033] 圖7純化重組腺病毒的細胞感染效率。橫坐標為用于感染的洗脫和未洗脫重組腺 病毒，縱坐標為感染效率，+FBS代表細胞培養(yǎng)液含轄牛血清，-FBS代表細胞培養(yǎng)液不含轄 牛血清。
[0034] 具體實施步驟
[0035] 生物材料來源；
[0036] l.pET-30a載體；從美國Novagen公司引進，本實驗室保存。
[0037] 2.D冊a大腸桿菌；從美國抓Biosciences Clontech公司引進，本實驗室保存。
[003引 3.