一種柯薩奇病毒ca10型熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及核酸巧光PCR檢測(cè)試劑盒，尤其設(shè)及薩奇病毒CA10型巧光定量PCR檢 測(cè)試劑盒，屬于手足口病的體外診斷領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 手足口病化and.化ot-mouthdisease)是世界范圍內(nèi)流行的兒童常見(jiàn)病，主要發(fā) 生于3歲W下兒童，但偶有成人發(fā)病的報(bào)告，是由多種腸道病毒引起的，W發(fā)熱和手、足、口 腔等部位出現(xiàn)瘤疹為主要特征的疾病，少數(shù)患病兒童可出現(xiàn)腦炎，急性弛緩性麻搏，屯、肌 炎，腦水腫等嚴(yán)重并發(fā)癥，病情進(jìn)展快，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。近些年來(lái)，手足口病在許多國(guó) 家，特別是亞太地區(qū)發(fā)生過(guò)多次的爆發(fā)或流行，越來(lái)越受到各國(guó)的關(guān)注。引起手足口病的病 原體多樣，但都為單股正鏈RNA病毒，屬于小RNA病毒科的腸道病毒。到目前為止，有文獻(xiàn) 報(bào)道的20多個(gè)血清型可引起手足口病，主要有CA16、CA6、CA7、CA9、CA10、CB2、CB5、CB13、 ECH019W及EV71 型等。
[0003] 在日本和中國(guó)臺(tái)灣，CA10與瘤疹性咽峽炎的爆發(fā)相關(guān)，部分感染CA10病人出現(xiàn)神 經(jīng)系統(tǒng)癥狀，最近新加坡的報(bào)告指出，CA10和CA6在引起手足口病中的病原中與CA16和 EV71同等重要。2007-2008年，山東地區(qū)分離的330例HFM病毒株中有17例為CA10型。 2013年西安地區(qū)共報(bào)告手足口病臨床診斷病例16964例中，柯薩奇病毒A6型（CA6)陽(yáng)性 率為51. 12%，柯薩奇病毒A16型（CA16)陽(yáng)性率為22. 1%，腸道病毒71型巧V71)陽(yáng)性率 為11. 2%，柯薩奇病毒A10型（CA10)陽(yáng)性率為4. 4%，其它腸道病毒陽(yáng)性率為11.2%。在 2013年夏天，中國(guó)長(zhǎng)春市爆發(fā)了手足口病，總共有1125例病人確診為手足口病患者，大部 分均為5歲W下，總共220份手足口病樣本被收集并進(jìn)行檢測(cè)，有101份化6. 9% )為CA6 感染，其他感染的腸道病毒包括CA2(1.3% )，CA10(1.9% )，CA14(0.6% )，CA16巧.9% )， CB4(1.3% )，EV71(19. 2% )和EC30(0.6% )。
[0004] 柯薩奇病毒CAIO型與其他柯薩奇病毒一樣，屬于小RNA病毒科，腸道病毒屬 巧nterovirus)，致病譜廣，是多種人類(lèi)疾病的致病原。CA10病毒現(xiàn)在已經(jīng)成為引起兒童 HFMD的主要病原之一。CA10病毒顆粒為二十面體對(duì)稱(chēng)球形，由核酸和蛋白質(zhì)組成，無(wú)包膜 和突起。病毒顆粒核屯、含一開(kāi)放閱讀框架，編碼的多聚蛋白經(jīng)過(guò)自身蛋白酶水解，分為P1、 P2和Ρ3Ξ種前體蛋白。P1區(qū)前體蛋白又可編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白P1~VP4,組成病毒衣殼。 目前常用的診斷方法為：病毒分離方法、血清學(xué)方法、PCR方法。 陽(yáng)0化]其中，病毒分離方法利用組織培養(yǎng)、分離腸道病毒是目前診斷手足口病病原的金 標(biāo)準(zhǔn)，但是由于任何一種細(xì)胞都不可能對(duì)引起手足口病所有腸道病毒進(jìn)行培養(yǎng)，所W，雖 然病毒培養(yǎng)技術(shù)是檢測(cè)診斷腸道病毒的金標(biāo)準(zhǔn)，但此方法操作繁瑣，分離率不高，在手 足口病的流行爆發(fā)期間，難W推廣應(yīng)用；血清學(xué)方法最常用的方法是酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) 巧LISA)，運(yùn)種方法可W對(duì)單份血清或急性期和恢復(fù)期的雙份血清進(jìn)行檢測(cè)，簡(jiǎn)單、快速，不 需要特別的儀器，非常適合基層醫(yī)療單位，但由于腸道病毒共同抗原表位的存在，所W均有 不同程度的交叉反應(yīng)性；PCR(polymerasechain化ction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)），是一種分子 生物學(xué)技術(shù)，用于放大擴(kuò)增特定的DM片段，可看作生物體外的特殊DM復(fù)制，即使采集的 標(biāo)本中含有微量的病毒RNA或是失活病毒，也能經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后檢測(cè)出來(lái)。與病毒分離W 及血清學(xué)檢測(cè)相比，RT-PCR具有特異、簡(jiǎn)單、快速、敏感等優(yōu)點(diǎn)，并且，擴(kuò)增產(chǎn)物可W通過(guò)測(cè) 序之后用于分子流行病學(xué)分析。但是PCR也存在許多不足之處，PCR消耗試劑大、操作步驟 多、容易造成PCR污染，并且，PCR-次性檢測(cè)的樣本數(shù)有限，大規(guī)模檢測(cè)時(shí)耗時(shí)耗力。
[0006] 結(jié)合國(guó)內(nèi)情況，在臨床HFM診斷中，實(shí)時(shí)巧光PCR技術(shù)憑借著快速、敏感、特異等 優(yōu)點(diǎn)顯示出了其臨床診斷的優(yōu)越性，目前只有極少量巧光PCR診斷試劑盒在CA6診斷中使 用，但是缺乏完善的質(zhì)控體系，操作比較繁瑣，靈敏度不高，還需要進(jìn)一步完善和提高技術(shù) 水平，使此類(lèi)產(chǎn)品更加滿足臨床準(zhǔn)確快速診斷的需要。 陽(yáng)007] 臨床上檢測(cè)CA10-RNA的方法目前主要是基于實(shí)時(shí)巧光定量PCR的技術(shù)及其改進(jìn)， 實(shí)時(shí)巧光定量PCR技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展迅速的一種核酸檢測(cè)技術(shù)，使用一種帶有巧光檢測(cè)裝 置的PCR擴(kuò)增儀，巧光檢測(cè)裝置能夠按照一定的程序周期性地發(fā)出特定波長(zhǎng)的激發(fā)光，收 集檢測(cè)巧光信號(hào)，通過(guò)檢測(cè)巧光信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化實(shí)時(shí)反映PCR的每個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增水平，試 驗(yàn)結(jié)束后可通過(guò)軟件自動(dòng)分析獲得擴(kuò)增曲線，根據(jù)擴(kuò)增曲線與巧光闊值線的交點(diǎn)（即Ct 值）W及擴(kuò)增曲線的形狀，可W判斷陰陽(yáng)性結(jié)果；如果同一反應(yīng)中有已知濃度的定量參考 品或標(biāo)準(zhǔn)品，則可W通過(guò)軟件自動(dòng)分析獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此實(shí)現(xiàn)對(duì)未知樣本的定值（即定 量檢測(cè)）。與傳統(tǒng)的PCR相對(duì)比，其在反應(yīng)體系中增加了一條兩端分別標(biāo)記巧光報(bào)告基團(tuán)和 澤滅基團(tuán)的探針。探針結(jié)構(gòu)完整時(shí)，巧光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的巧光能量被澤滅基團(tuán)吸收，呈現(xiàn)澤 滅效應(yīng)；如果擴(kuò)增過(guò)程中有祀序列的存在，隨著目標(biāo)片段的延伸，探針?lè)肿又饾u被Taq酶水 解切斷，巧光報(bào)告基團(tuán)與澤滅基團(tuán)相互解離，阻斷了二者間巧光能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，巧光報(bào)告基 團(tuán)發(fā)出的巧光信號(hào)被巧光檢測(cè)裝置收集。隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，巧光信號(hào)隨著目的片段的擴(kuò)增 而呈現(xiàn)線性增強(qiáng)。試驗(yàn)結(jié)束后，可W通過(guò)巧光PCR儀自帶的軟件自動(dòng)分析數(shù)據(jù)，可W獲得陰 陽(yáng)性結(jié)果和樣本濃度的定值結(jié)果，因此，該技術(shù)在祀多核巧酸樣品的檢測(cè)和定量分析中，已 逐漸取代傳統(tǒng)的PCR方法，得到十分廣泛的應(yīng)用。
[0008] 國(guó)內(nèi)已有多種基于實(shí)時(shí)巧光定量PCR技術(shù)定量檢測(cè)柯薩奇病毒CA10型的方法，運(yùn) 些試劑盒所提供的CA10-RNA提取方法主要是Trizol法和柱提取法，但是，有W下不足之 處：（1)Trizol法雖然是最經(jīng)典的RNA提取方法，但是操作繁瑣，對(duì)于設(shè)備和人員操作要求 高，低病毒載量的標(biāo)本檢出率低，且所用試劑具有一定的毒性；柱提取方法雖然無(wú)需高速離 屯、，但是需頻繁更換離屯、管，用時(shí)長(zhǎng)，特異性較差；（2)無(wú)法有效去除樣本中的PCR抑制物； (3)沒(méi)有設(shè)置陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照（即內(nèi)標(biāo)），無(wú)法監(jiān)控假陰性；(4) 一般沒(méi)有預(yù)防PCR產(chǎn)物污染的 措施；（5)現(xiàn)有方法檢測(cè)靈敏度欠佳，可能出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有柯薩奇病毒CA10型核酸巧光定量PCR檢測(cè)試劑盒 的缺陷，提供一種具有操作快速、方法簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)范圍寬而準(zhǔn)確柯薩奇病毒 CA10型核酸巧光定量PCR檢測(cè)試劑盒，可W對(duì)人血清或咽拭子或瘤疹滲出液等標(biāo)本中的柯 薩奇病毒CA10型進(jìn)行定量分析，檢測(cè)結(jié)果可用于柯薩奇病毒CA10型感染的輔助診斷和疾 病監(jiān)控。
[0010] 本發(fā)明實(shí)施例中提供了一種柯薩奇病毒CA10型巧光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其包括 W下各組分：RNA提取溶液、RNA洗脫液、RT-PCR增強(qiáng)劑、內(nèi)標(biāo)、PCR反應(yīng)液、CAIO陽(yáng)性對(duì)照 品、CA10陰性對(duì)照品，其中，所述內(nèi)標(biāo)為插入PUC18T載體的一段長(zhǎng)為128堿基對(duì)的人工合 成DNA序列的重組體，濃度為1. 00E+04copies/ml~5. 00E+04copies/ml;128堿基對(duì)的序 列如下所示：
[0011] 5'-GTCCAGTACTTTCAAAGCTCGATCCCGGTAACTACCAAATCGGTACGTACCGGTTTAAAACCACCG ATCGCCTCTTCCCAACCTGTACGTACGTACGTACGTCCAAAAGTTTCCACGTACGATCGATC-3' 〇
[0012] 優(yōu)選的，上述檢測(cè)試劑盒，其中，所述RNA提取溶液包括如下組分： 陽(yáng)01引 RNA提取溶液I:十二烷基硫酸鋼，質(zhì)量/體積0. 2 %~1. 0 %、曲拉通，體積/體積 1. 0%~4. 0%，異硫氯酸脈 0. 2mol/L~1.Omol/L、100μg/ml~400μg/ml的磁珠；
[0014] RNA提取溶液II:4-徑乙基贓嗦乙橫酸lOOmmol/L~300mmol/l、抑6. 5 + 0. 2,氯 化鋼lOOmmol/L~300mmol/L；
[0015] RNA提取溶液III:曲拉通，體積/體積0. 1 %~1. 0 %、氯化鋼lOOmmol/L~ 300mmol/L；
[0016] RNA提取溶液IV:礦物油。
[0017] 優(yōu)選的，上述檢測(cè)試劑盒，其中，所述RNA洗脫液為T(mén)ris-肥1 0.8