專利名稱：腸道病毒71型、柯薩奇病毒a16型和腸道病毒其它各亞型三色熒光rt-pcr聯(lián)合檢測方法及 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本試發(fā)明屬于病毒核酸檢測領(lǐng)域，涉及腸道病毒71型、柯薩奇病毒A16型和腸 道病毒其它各亞型病毒RNA的檢測方法，特別是涉及使用三色熒光探針定量PCR技術(shù) (PCR-三色熒光探針法)快速準(zhǔn)確的檢測出樣品(糞便、咽拭子標(biāo)本、皰疹液、腦脊液或病毒 分離培養(yǎng)物標(biāo)本等)中腸道病毒71型、柯薩奇病毒A16型和腸道病毒其它各亞型的方法。 本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于該病毒臨床檢測的試劑盒，適用于人腸道病毒感染的實(shí)驗(yàn)室快速檢 測。
背景技術(shù)：
手足口病(Hand，foot and mouth disease, HFMD)是由腸道病毒引起的急性傳染 病，病毒以腸道病毒71型(EV71)、柯薩奇病毒A16型(CAV16)多見，多發(fā)生于學(xué)齡前兒童， 尤以3歲以下年齡組發(fā)病率最高。主要癥狀表現(xiàn)為手、足、口腔等部位的斑丘疹、皰疹，少數(shù) 重癥病例可出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀等，多由EV71感染引起，致死原因主要為重癥腦干腦炎及神 經(jīng)源性肺水腫。病人和隱性感染者均為傳染源，主要通過消化道、呼吸道和密切接觸等途徑 傳播。人類腸道病毒(Enterovirus，EV)為顆粒較小的RNA病毒，呈20面體，直徑24 30nm,不合類脂體，核心有單鏈核糖核酸，耐乙醚和其它脂溶劑，耐酸，對各種抗生素、抗病 毒藥、去污劑有抵抗作用。多數(shù)病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生細(xì)胞病變。自1959年首次報(bào)道由人 類腸道病毒(Enterovirus, EV)導(dǎo)致手足口病(Hand, foot and mouth disease, HFMD) 艮 道以來，HFMD已經(jīng)在全球多次暴發(fā)。1974年美國發(fā)現(xiàn)腸道病毒71型(EV71)也常致HFMD 流行，同時柯薩奇A組(CAV16、CAV9、CAV5等)致HFMD也有報(bào)道。1997年馬來西亞發(fā)生了 主要由EV71引起的手足口病流行，僅4 6月就有29例病人死亡。1998年EV71感染在我 國臺灣省引發(fā)大量手足口病和皰疹性咽峽炎并有大量兒童因病致死。HFMD常由多種腸道病毒共同引起，而EV71和CAV16往往是手足口病暴發(fā)流行的 最主要病原，二者在遺傳學(xué)上密切相關(guān)，常為混合感染和交替感染。我國手足口病流行，其 病原亦主要為EV71型和CAV16。通常情況下，EV71與CAV16引起的HFMD在臨床癥狀上難 以區(qū)別。本病急性起病，發(fā)熱，口腔粘膜出現(xiàn)散在皰疹，手、足和臀部出現(xiàn)斑丘疹、皰疹，皰疹 周圍可有炎性紅暈，皰內(nèi)液體較少?？砂橛锌人?、流涕、食欲不振等癥狀。部分病例僅表現(xiàn) 為皮疹或皰疹性咽峽炎。預(yù)后良好。少數(shù)急性病例可出現(xiàn)腦膜炎、腦炎、腦脊髓炎、肺水腫、 循環(huán)障礙等，病情兇險(xiǎn)，可致死亡或留有后遺癥。臨床診斷病例具有下列之一者即可確診 1.腸道病毒(EV71、CAV16等)特異性核酸檢測陽性；2.分離出腸道病毒，并鑒定為EV71、 CAV16或其它可引起手足口病的腸道病毒；3.急性期與恢復(fù)期血清EV71、CAV16或其它可引 起手足口病的腸道病毒中和抗體有4倍以上的升高。
發(fā)明內(nèi)容
目前對于該種腸道病毒感染的實(shí)驗(yàn)室檢查主要包括以下方面1.病毒感染常規(guī) 檢查包括細(xì)胞和生化檢查。2.病原學(xué)檢查，腸道病毒(EV71、CAV16等)特異性核酸陽性或分 離到腸道病毒。3.血清學(xué)檢查，ELISA方法檢測急性期與恢復(fù)期血清EV71、CAV16或其它腸 道病毒中和抗體有4倍以上的升高。血清學(xué)檢查必須是建立在已經(jīng)發(fā)生病毒感染并產(chǎn)生抗 體的基礎(chǔ)上，而且鑒于流感病的的高度變異性以及與其他病毒血清學(xué)的交叉性，其特異性 難以保證，容易出現(xiàn)假陽性和假陰性，也無法進(jìn)行快速檢測。從標(biāo)本中分離豬流感病毒，進(jìn) 行雞胚接種和細(xì)胞培養(yǎng)可能會比較敏感，但是這種方法需要幾天的時間。腸道病毒(EV71、 CAV16等)特異性核酸檢測需要進(jìn)行RT-PCR試驗(yàn)，并需要測序證實(shí)。雖然具靈敏度比上述方 法略有提高，但是這種方法僅是基于一對核酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增， 甚至?xí)驗(yàn)椴僮鞯脑虺霈F(xiàn)假陽性，而且普通PCR擴(kuò)增法其結(jié)果的判斷需要對產(chǎn)物進(jìn)行凝 膠電泳分析，操作繁瑣。三色熒光定量PCR技術(shù)原理是基于單色熒光定量PCR技術(shù)，是指在同一個熒光定 量PCR擴(kuò)增試驗(yàn)中同時擴(kuò)增三個目的基因，探針為多種熒光標(biāo)記比如FAM、VIC、JOE、NED、 HEX等，每種熒光標(biāo)記的探針在PCR擴(kuò)增過程中所產(chǎn)生的熒光信號不同。利用該原理發(fā)明的 試劑盒在同一個標(biāo)本的檢測中，可以同時檢測出腸道病毒71型、柯薩奇病毒A16型和腸道 病毒其它各亞型，實(shí)現(xiàn)了一個標(biāo)本中同時檢測多種腸道病毒，并對病毒進(jìn)行分型的目的，應(yīng) 用極為方便。由于該方法引入了特異性擴(kuò)增引物和熒光探針，使得檢測的靈敏度和特異性 得到很大程度的增強(qiáng)，從而避免了其他檢測方法特異性不高且容易漏檢的問題?；谌珶晒舛縋CR技術(shù)原理，為了克服現(xiàn)有檢測技術(shù)中的缺陷和不足，本發(fā) 明提供了一種使用三色熒光定量PCR技術(shù)(PCR-三色熒光探針法)快速準(zhǔn)確檢測出樣品 (疑似病人糞便、咽拭子標(biāo)本、皰疹液、腦脊液或病毒分離培養(yǎng)物標(biāo)本等)中腸道病毒71型、 柯薩奇病毒A16型和腸道病毒其它各亞型病毒的RNA的方法。該方法包括(1)采集和運(yùn) 送感染或疑似病人樣本(疑似病人糞便、咽拭子標(biāo)本、皰疹液、腦脊液或病毒分離培養(yǎng)物標(biāo) 本等)；(2)樣本預(yù)處理和提取RNA ； (3) 一步PCR-三色熒光探針體外擴(kuò)增法對樣本進(jìn)行檢 測合成特定引物和熒光探針，用三色熒光定量PCR反應(yīng)技術(shù)并用三色熒光PCR反應(yīng)液(PCR MIX)對樣本進(jìn)行擴(kuò)增檢測；(4)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)每個擴(kuò)增反應(yīng)的熒光強(qiáng)度對相應(yīng)樣本 進(jìn)行分析，從而判斷所采集的樣本中道病毒71型、柯薩奇病毒A16型和腸道病毒其它各亞 型的存在并根據(jù)質(zhì)控品對標(biāo)本中的病毒進(jìn)行精確定量。從Genbank下載所有腸道病毒的基因序列，經(jīng)過生物信息學(xué)分析反復(fù)比對，選擇 如下區(qū)域作為擴(kuò)增腸道病毒71型(EV71)、柯薩奇病毒A16型(CAV19)和腸道病毒其它各亞 型(EV-U)的特異性目標(biāo)區(qū)域(1)腸道病毒71型(EV71)上游引物5，-GCGTTTTGACGCAGAGTTCA-3，(SEQ ID NO. 1)(2)腸道病毒71型(EV71)下游引物5，-GGAGCAATTGCGGGACAA-3，(SEQ ID NO. 2)(3)腸道病毒71型(EV71)熒光探針FAM-5’ CTTTGTTGCATGCACCCCTACCGG—3，TAMRA (SEQ ID NO. 3)(4)柯薩奇病毒A16型(CAV16)上游引物
5，-GGGACCGGGAATGAAAATTC-3，(SEQ ID NO. 4)(5)柯薩奇病毒A16型(CAV16)下游引物5，-ATGCGTCAGAA/GCTGCACCA/G-3，(SEQ ID NO. 5)(6)柯薩奇病毒A16型(CAV16)熒光探針J0E-5，TCCTCCCTACGCCACTACACAGCCTG-3，TAMRA (SEQ ID NO. 6)(7)腸道病毒各亞型(EV-U)上游引物5，-AGC/TGGGTA/GGIGIGICGTAACG-3，(SEQ ID NO. 7)(8)腸道病毒各亞型(EV-U)下游引物5，-TCACCATAAGCAGCCAA/GTATAA/T-3，(SEQ ID NO. 8)(9)腸道病毒各亞型(EV-U)熒光探針VIC-5，TAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTT-3，TAMRA (SEQ ID N0. 9)根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的檢測腸道病毒71型、柯薩奇病毒 A16型和腸道病毒其它各亞型病毒的熒光標(biāo)記分別為FAM、JOE和VIC，所以稱為三色熒光檢 測。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，首先用普通RT-PCR定性擴(kuò)增陽性標(biāo)本，陽性樣 品的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，可見與目的片段一致的的特征條帶，而陰性樣品都無該特征 條帶，圖1，證明引物正確。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說試劑盒是一種用于快速實(shí)時定量檢測 腸道病毒EV71型、柯薩奇病毒A16型以及腸道病毒各亞型的試劑盒，該試劑盒包括(1)病 毒核酸提取試劑；(2)逆轉(zhuǎn)錄酶系和Taq酶系；(3)三色熒光PCR反應(yīng)體系(PCRMIX) ； (4)陽 性和陰性質(zhì)控品等。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的檢測腸道病毒71型、柯薩奇病毒 A16型和腸道病毒其它各亞型三色熒光定量PCR反應(yīng)體系(PCR MIX)是由腸道病毒71型 (EV-71)特異性上游和下游引物、一條特異性熒光探針(Fam熒光標(biāo)記)、柯薩奇病毒A16型 (CAV-16)的特異性上游和下游引物、一條特異性熒光探針(J0E熒光標(biāo)記)、腸道病毒各亞 型(EV-U)特異性上游和下游引物、一條特異性熒光探針(VIC熒光標(biāo)記)、PCR反應(yīng)緩沖液 (FQ-Buffer,內(nèi)含鎂離子、Tris-HCl等)、四種核苷酸單體(dNTPs)、PCR擴(kuò)增增強(qiáng)劑和去離 子水等成分構(gòu)成的反應(yīng)體系。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的PCR反應(yīng)體系(PCR MIX)的按照如 下方式配制每份反應(yīng)液(PCR MIX)各引物(50ρπιο1/μ1)各 0·2μ1各熒光探針(30pmol/μ 1)各 0· 1 μ 1dNTPs (各 2. 5mM)2 μ 1PCR 反應(yīng)緩沖液(FQ-Buffer)16. 5 μ 1_Total20. 0μ 1以上體系配制后需要放在-20 °C保存，其中PCR反應(yīng)緩沖液組成 50mMTri s-HCl (pH8. 0)、3. 5mM MgC12、50mM KCl、25mmol/L(NH4) 2S04 組成。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的陽性質(zhì)控品是EV71的特異性目的 片段擴(kuò)增后經(jīng)過克隆的質(zhì)粒，其精確的拷貝數(shù)為107ml，陰性質(zhì)控品為經(jīng)DEPC處理和高壓 滅菌的PCR緩沖液。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所采用的熒光定量PCR擴(kuò)增條 件為ABI PRISM 7700、ABI PRISM5700、ABI GeneAmp 7000 (需要剪掉反應(yīng)蓋)， ABIPRISM7300/7500(使用8聯(lián)管)、MJ Opticon (使用8聯(lián)管)等使用薄壁管的儀器，循 環(huán)條件為42 20分鐘，然后93°C — 2分鐘，然后93°C 30秒一55°C 45秒，40個循環(huán)； LightCycler等使用毛細(xì)管的儀器，循環(huán)條件為42°C— 20分鐘，93°C— 2分鐘，然后93°C 5 秒一550C 45秒，共40個循環(huán)。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，反應(yīng)結(jié)束后，使用手動調(diào)整閾值使陰性質(zhì)控品 Ct值在40以上，Ct值小于35個循環(huán)的為陽性；Ct值在35-40個循環(huán)之間，為灰區(qū)，需要進(jìn) 行重復(fù)試驗(yàn)。重復(fù)試驗(yàn)之后，如果Ct值仍然在35-40個循環(huán)之間，判斷為陽性，沒有熒光值 增長為陰性，擴(kuò)增動力曲線見圖2。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，試劑盒的定量檢測的上下限度測定方法如下用TE buffer制成稀釋陽性標(biāo)準(zhǔn)品(107COpieS/ml)，分別作為線性及靈敏度 參考品，標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為為 1. OX 107/mlU. OX 106/mlU. OX 105/mlU. OX 104/ml、 1.0X107ml、1.0X107ml、1.0X107ml。每個稀釋度作3份重復(fù)測定。分析|r|值， 均可達(dá)到|r|彡0.99，結(jié)果證實(shí)本試劑盒檢定線性上下限度為1.0X102COpieS/ml 1. 0X107copies/ml。電泳圖如圖 3。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，試劑盒的定量檢測準(zhǔn)確度測定方法如下用連 續(xù)生產(chǎn)的三批本試劑盒和對照公司的同類試劑盒在同一臺PCR擴(kuò)增儀上檢測觀察其|r|值 和檢測靈敏度的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)論為Ir I彡0.97，定量準(zhǔn)確度CV <30%。本試劑盒的定量檢測下限為1. OX IO2Copies ；靈敏度為1. 0X 102copies。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，試劑盒的定量檢測特異性測定方法如下用本 試劑盒在對500例疑似病人進(jìn)行常規(guī)檢測，其中檢測出EV71陽性76例，CAV1634例，腸道 病毒通用型43例，后經(jīng)測序鑒定證實(shí)，吻合率為100%，未出現(xiàn)假陽性和假陰性。本發(fā)明的試劑盒經(jīng)過多次不同的重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證證實(shí)，具有良好的重復(fù)性好和穩(wěn)定 好的性能。在-20°C條件下試劑盒可有效期可以達(dá)12個月。針對腸道病毒71型、柯薩奇病毒A16型和腸道病毒其它各亞型核酸序列所設(shè)計(jì)的 引物和三色熒光探針擴(kuò)增特異性基因片段，不但可以檢測腸道病毒71型，同時還可以檢測 柯薩奇病毒A16型和腸道病毒其它各亞型核酸，從而實(shí)現(xiàn)了一個標(biāo)本中同時檢測三種病毒 的目的，應(yīng)用極為方便。由于該方法引入了特異性擴(kuò)增引物和三色熒光探針，使得檢測具有 更好的靈敏度和特異性，從而避免了其他檢測方法特異性不高的問題。同時本發(fā)明引入了 陽性質(zhì)控品作為實(shí)驗(yàn)的對照和定量標(biāo)準(zhǔn)，對感染的腸道病毒RNA進(jìn)行快速檢測并定量。另 外一個方面，本發(fā)明使用了一步法熒光定量PCR擴(kuò)增技術(shù)，簡化了試驗(yàn)過程提高了檢測效 率。一般來說，從處理樣本到結(jié)果的判斷僅需要2小時左右。所以與傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明 具還具有有操作簡單、快速方便的優(yōu)點(diǎn)。因此，本發(fā)明的試劑盒為臨床標(biāo)本的快速檢測和大 樣本普查提供了新的方法，并為疑似病人的篩查使用提供了可靠的方法學(xué)依據(jù)。四

圖1顯示根據(jù)常規(guī)的的普通RT-PCR定性擴(kuò)增陽性標(biāo)本，陽性樣品的PCR產(chǎn)物 經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示可見到與目的片段一致的的特征條帶，而陰性樣品都無 該特征條帶，證明引物正確。其中樣本編號1-3為腸道病毒71 (EV71)，4-6為柯薩奇病毒 A16(CAV16)、7-10為腸道病毒通用型(EV-U)。圖2，為陽性質(zhì)控品的梯度稀釋的擴(kuò)增結(jié)果， 顯示標(biāo)準(zhǔn)的擴(kuò)增結(jié)果動力學(xué)曲線，呈S型，擴(kuò)增效果較好。圖3試劑盒檢測限度測試電泳圖 譜，其中1 5為梯度稀釋的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品PCR反應(yīng)產(chǎn)物，2%瓊脂瓊脂糖凝膠，樣品濃度分別 為 1. 0X106/ml、1. OX 105/ml、l. 0 XioVml、1. 0 X103/ml、1. OX 102/ml)。
五具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 標(biāo)本的采集和運(yùn)送適用標(biāo)本類型包括疑似病人糞便、咽拭子標(biāo)本、皰疹液、腦脊液或病毒分離培養(yǎng)物 標(biāo)本等。咽拭子標(biāo)本采集病人發(fā)病3日內(nèi)的咽拭子標(biāo)本，用專用采樣棉簽，適度用力拭 抹咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位，應(yīng)避免觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有1 2ml保存液(維 持液或生理鹽水)的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密閉送檢。皰疹液 用75%的酒精對皰疹周圍的皮膚進(jìn)行消毒，然后用消毒針將皰疹挑破用棉簽蘸取皰疹液， 迅速將棉簽放入內(nèi)裝有1 2ml保存液(維持液或生理鹽水)的采樣管中，在靠近頂端處 折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封。腦脊液標(biāo)本出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀后3天內(nèi)，采集量為1. 0 2.0ml。采集后立即裝入無菌帶墊圈的凍存管中。密閉送檢測。糞便用滅菌捻拭子拭取糞 便或腹瀉物置入無菌玻璃管(含0. 4ml滅菌生理鹽水)，用無菌棉球?qū)⒃嚬苋o后，密閉送 檢。上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20°C，長期保存可置-70°C，但不能超過6個月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng) 采用0°C冰壺，采集標(biāo)本應(yīng)立即(12h內(nèi))送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。實(shí)施例2 腸道病毒RNA的提取樣品處理取500 μ 1樣品液加入500 μ 1病毒濃縮液充分震蕩，4 V冷凍 離心機(jī)13，OOOrpm離心lOmin，去上清，保留50 μ 1左右的樣品液體，加入150ul Triz0lreagents(RNA提取液)充分震蕩，室溫放置5min。加入IOOul氯仿，用力震蕩15s, 室溫靜置5min，4°C 13，OOOrpm離心lOmin。小心將上層水相轉(zhuǎn)移到干凈離心管中，加等體 積異丙醇，充分混勻，13，OOOrpm離心lOmin。棄上清，加入500 μ 1 75%的DEPC乙醇，充分 混勻，13，OOOrpm離心lOmin，小心吸去大部分乙醇。將提取管敞口在室溫空氣中干燥5min 待乙醇揮發(fā)干凈，用20μ1 DEPC Η20溶解沉淀。陰性質(zhì)控品取50 μ 1陰性質(zhì)控品加入 150 μ 1 Trizol reagents (RNA提取液)充分震蕩，室溫放置lOmin。后按上述操作，EV71陽 性質(zhì)控品直接取3 μ 1進(jìn)行PCR擴(kuò)增。實(shí)施例3 本檢測方法和試劑盒適用的儀器適用儀器主要包括ABI GeneAmp PCR System7700、ABI GeneAmp PCRSystem7500, ABI PRISM 7300, LightCycler 等，LightCycler 等毛細(xì)管的儀器，MJOpticon 系列或取得資 格認(rèn)證的定量PCR儀。實(shí)施例4 三色熒光PCR方法對腸道病毒RNA進(jìn)行檢測從試劑盒中取出PCRMIX、Taq酶系，逆轉(zhuǎn)錄酶系，室溫融化并振蕩混勻后， 10，OOOrpm離心10s。設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N =樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈0.2ml離心管中，充分混勻， 10，OOOrpm離心10s，向設(shè)定的N個PCR反應(yīng)管中分別加入22 μ 1，向每管中加入處理后樣 品(提取RNA)或陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品3 μ 1，10，OOOrpm瞬時離心10秒。將各反應(yīng)管 放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，按對應(yīng)順序設(shè)置陰性質(zhì)控品，陽性質(zhì)控品以及未知標(biāo)本，并 設(shè)置樣品名稱、標(biāo)記熒光基團(tuán)種類(報(bào)告基團(tuán)FAM、猝滅基團(tuán)TAMRA)和循環(huán)條件ABI PRISM 7700、ABI PRISM5700、ABI GeneAmp 7000 (需要剪掉反應(yīng)蓋)，ABI PRISM7300/7500(使用8聯(lián)管)、MJ Opticon (使用8聯(lián)管)等使用薄壁管的儀器，循環(huán)條件 42°C— 20 分鐘，然后 93°C— 2 分鐘，然后 93°C 30 秒一55°C 45 秒，40 個循環(huán)。LightCycler 等使用毛細(xì)管的儀器，循環(huán)條件42°C— 20分鐘，93°C— 2分鐘，后93°C 5秒一55°C 45秒， 共40個循環(huán)。實(shí)施例5 結(jié)果分析和判定反應(yīng)結(jié)束后，首先選擇一種熒光(AM對應(yīng)EV71、JOE對應(yīng)CAV、16VIC對應(yīng)EV-U)， 使用手動調(diào)整閾值使陰性質(zhì)控品Ct值在40以上，Ct值小于35個循環(huán)的為陽性；Ct值在 35-40個循環(huán)之間，為灰區(qū)，需要進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。重復(fù)試驗(yàn)之后，如果Ct值仍然在35-40個 循環(huán)之間，判斷為陽性，沒有熒光值增長為陰性。需要滿足陰性質(zhì)控品應(yīng)為全部陰性；陽 性質(zhì)控品的Ct值均應(yīng)小于30，且呈標(biāo)準(zhǔn)S型擴(kuò)增曲線。以上條件應(yīng)同時滿足，否則此次試 驗(yàn)視為無效，全部試驗(yàn)應(yīng)重新進(jìn)行。本試劑盒將逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR檢測的過程放在一起，無需兩步發(fā)來檢測，大大簡 化了檢測流程節(jié)省了檢測時間。用本試劑盒可以在2小時內(nèi)快速檢測某標(biāo)本是否感染有腸 道病毒71型、柯薩奇病毒CAV16和腸道病毒其它各亞型，以及是哪一種型腸道病毒。也就 是說本試劑盒的每份試劑一次檢測就同時具有檢測三種病毒的能力。實(shí)施例6 本發(fā)明方法的臨床應(yīng)用使用本發(fā)明的方法和試劑盒，對大量標(biāo)本進(jìn)行定量PCR檢測，并最終經(jīng)測序?qū)嶒?yàn) 驗(yàn)證。結(jié)果顯示本發(fā)明方法的試劑盒，靈敏度為102COpieS，準(zhǔn)確性和特異性達(dá)100%，重 復(fù)性和穩(wěn)定性較好，本試劑盒的保存條件和有效期為-20°C，12個月。本方法的發(fā)明為增 腸道病毒71型(EV71)、柯薩奇病毒A16型(CAV19)和腸道病毒其它各亞型(EV-U)的檢測 和疫情的預(yù)防控制方案的制定提供科學(xué)的、個體化的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為病人的診斷 提供可靠的分子病毒學(xué)證據(jù)。如果病樣品中出現(xiàn)上述病毒的存在，就提示可能為相應(yīng)病毒 的感染，則需要立即采取相應(yīng)措施，也避免產(chǎn)生不必要的后果。六、序列表SEQUENCE LISTING<110>北京索奧生物技術(shù)有限公司<120>腸道病毒71型、柯薩奇病毒A16型和腸道病毒其它各亞型三色熒光RT-PCR 聯(lián)合檢測方法及其試劑盒
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<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>7agctgggtag gtgtgtcgta acg23<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>8tcaccataag cagccaagta taat24<210>9<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>9taactctgca gcggaaccga ctactt2權(quán)利要求
一種腸道病毒71型、柯薩奇病毒A16型和腸道病毒其它各亞型三色熒光RT-PCR聯(lián)合檢測方法及其試劑盒，從Genbank下載所有腸道病毒的基因序列，經(jīng)過生物信息學(xué)分析，反復(fù)比對，選擇如下區(qū)域作為擴(kuò)增腸道病毒71型(EV71)、柯薩奇病毒A16型(CAV19)和腸道病毒其它各亞型(EV-U)的特異性目標(biāo)區(qū)域(1)腸道病毒71型(EV71)上游引物5’-GCGTTTTGACGCAGAGTTCA-3’(SEQ ID NO.1)(2)腸道病毒71型(EV71)下游引物5’-GGAGCAATTGCGGGACAA-3’(SEQ ID NO.2)(3)腸道病毒71型(EV71)熒光探針序列5’-CTTTGTTGCATGCACCCCTACCGG--3’(SEQ ID NO.3)(4)柯薩奇病毒A16型(CAV16)上游引物5’-GGGACCGGGAATGAAAATTC-3’(SEQ ID NO.4)(5)柯薩奇病毒A16型(CAV16)下游引物5’-ATGCGTCAGAA/GCTGCACCA/G-3’(SEQ ID NO.5)(6)柯薩奇病毒A16型(CAV16)熒光探針序列5’-TCCTCCCTACGCCACTACACAGCCTG-3’(SEQ ID NO.6)(7)腸道病毒各亞型(EV-U)上游引物5’-AGC/TGGGTA/GGTGTGTCGTAACG-3’(SEQ ID NO.7)(8)腸道病毒各亞型(EV-U)下游引物5’-TCACCATAAGCAGCCAA/GTATAA/T-3’(SEQ ID NO.8)(9)腸道病毒各亞型(EV-U)熒光探針序列5’-TAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTT-3’(SEQ ID NO.9)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種色熒光RT-PCR聯(lián)合檢測方法及其試劑盒，柯薩奇病毒 A16型(CAV16)下游引物(SEQ ID NO. 5)、腸道病毒各亞型(EV-U)上游引物(SEQ ID NO. 7)、 腸道病毒各亞型(EV-U)下游引物(SEQ ID NO. 8)，其中，其中A/G表示此處堿基是A或者 G，C/T表示此處堿基是C或者T，A/T表示此處堿基是A或者T。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述，其中所說的檢測腸道病毒71型(SEQID NO. 3)、柯薩奇病毒 A16型(SEQ ID NO. 6)和腸道病毒其它各亞型病毒(SEQ ID NO. 9)的探針5，熒光標(biāo)記分別 為FAM、JOE和VIC，所以稱作三色熒光檢測，探針3’標(biāo)記為TAMRA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述該試劑盒包括(1)病毒核酸提取試劑；(2)逆轉(zhuǎn)錄酶系和Taq 酶系；(3)三色熒光PCR反應(yīng)體系(PCR MIX) ； (4)陽性和陰性質(zhì)控品等，其中所說的PCR反 應(yīng)體系(PCR MIX)的按照如下方式配制每份反應(yīng)液(PCR MIX)各引物(50pmol/y 1)各 0·2μ1各熒光探針(30ρπιΟ1/μ 1)各0. Ιμ dNTPs (各 2. 5mM)2 μ 1PCR 反應(yīng)緩沖液(FQ-Buffer)16. 5 μ 1Total20. 0μ 1其中所采用的熒光定量PCR擴(kuò)增條件為ABI PRISM 7700、ABI PRISM5700 、ABI GeneAmp 7000 (需要剪掉反應(yīng)蓋)，ABI PRISM7300/7500 (使用 8 聯(lián)管)、MJ Opticon (使用 8 聯(lián)管)等使用薄壁管的儀器，循環(huán)條件為42°C— 20分鐘，然后93°C— 2分鐘，然后93°C 30 秒一550C 45秒，40個循環(huán)；LightCycler等使用毛細(xì)管的儀器，循環(huán)條件為42°C— 20分 鐘，93°C — 2分鐘，然后93°C 5秒一55°C 45秒，共40個循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明提供了腸道病毒71型、柯薩奇病毒A16型和腸道病毒其它各亞型三色熒光RT-PCR聯(lián)合檢測方法及其試劑盒，快速準(zhǔn)確的檢測出樣品中腸道病毒71型、柯薩奇病毒A16型和腸道病毒其它各亞型核酸的方法。該方法包括(1)采集和運(yùn)送感染或疑似病人樣本；(2)樣本預(yù)處理和提取RNA；(3)一步PCR-三色熒光探針體外擴(kuò)增法對樣本進(jìn)行檢測；(4)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)每個擴(kuò)增反應(yīng)的熒光強(qiáng)度對相應(yīng)樣本進(jìn)行分析，從而判斷所采集的樣本中腸道病毒71型、柯薩奇病毒A16型和腸道病毒其它各亞型核酸的存在，并能夠?qū)ζ溥M(jìn)行準(zhǔn)確定量(圖3)，實(shí)現(xiàn)了對該類病毒實(shí)時快速精確聯(lián)合檢測之目的。
文檔編號C12Q1/68GK101886138SQ20091013661
公開日2010年11月17日 申請日期2009年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月11日
發(fā)明者任美峰, 劉健翊, 史成軍, 徐貴峰 申請人:北京索奧生物技術(shù)有限公司