試劑盒未見報(bào)道。
[0013] 本發(fā)明人在對(duì)(老年性癡呆患者、高危人群、正常對(duì)照人）例組，用原位雜交技術(shù) 進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明以上老年性癡呆癥CR-1基因都過度表達(dá)，高危人群有不同程度表達(dá) 15-25%，正常人都是零表達(dá)。表明CR-1基因是老年性癡呆病變前期篩查的重要標(biāo)志物。
[0014] 原位雜交技術(shù)（insituhybridization)是將分子生物學(xué)與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)結(jié)合起 來，以標(biāo)記的核酸分子為探針，在組織細(xì)胞原位檢測(cè)特異性核酸分子的技術(shù)。其原理是使含 有特異序列、經(jīng)過標(biāo)記的核酸單鏈（即探針)，在適宜條件下與組織細(xì)胞中的互補(bǔ)核酸單鏈 即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)標(biāo)記探針進(jìn)行探測(cè)，從而在細(xì) 胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。
[0015] 原位雜交的探針是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子（雖不明確 該分子全部序列，但已知其針對(duì)何靶分子)，探針的種類按核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針、 cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。為了便于示蹤，探針必須用一定的手段加以標(biāo) 記，以利于以后的檢測(cè)。常用的標(biāo)記物包括放射性核素和非放射性標(biāo)記物兩大類。常用的 同位素標(biāo)記物有 3H、35S、125I和32P。同位素標(biāo)記物雖然有靈敏性高、背底較為清晰等優(yōu)點(diǎn)，但 是由于放射性同位素對(duì)人和環(huán)境均會(huì)造成傷害，近來有被非同位素取代的趨勢(shì)。非同位素 標(biāo)記物中目前最常用的有生物素、地高辛和熒光素三種。檢測(cè)這些標(biāo)記物的方法都是極其 靈敏的。
[0016] 根據(jù)所用探針及所要檢測(cè)核酸的不同又可分為DNA-DNA,RNA-DNA,RNA-RNA雜交。 但不論哪一種形式的雜交，都必須經(jīng)過五大過程，即組織細(xì)胞的固定，預(yù)雜交、雜交、沖洗和 顯示。本發(fā)明采用RNA-RNA的雜交方式，合成的探針（mRNA)和檢測(cè)的靶mRNA是采用堿基 互補(bǔ)（雜交互補(bǔ)）的原理，同時(shí)經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間研究和觀察，啟動(dòng)和中止處得殘基對(duì)檢測(cè)的結(jié)果 沒有影響（因?yàn)?，發(fā)明人采用的mRNA序列都超過600bp以上，而對(duì)于較長(zhǎng)的堿基序列，超過 lOOObp以上，我們會(huì)選擇該基因的⑶S來做探針，如果⑶S的堿基序列長(zhǎng)度也超過lOOObp 以上，我們會(huì)選擇其中一段堿基序列來合成探針，但要經(jīng)過Blast分析機(jī)體中是否有相同 堿基序列片段存在)。
[0017] 本發(fā)明的初衷是想改變目前臨床上重大疾病的診治模式，從治已病變成預(yù)防性治 未病，達(dá)到預(yù)防性診治，將目前影像醫(yī)學(xué)手段和眾多生化標(biāo)記物無法檢測(cè)到老年性癡呆病 理演變前期mRNA水平量化改變技術(shù)，做了創(chuàng)新性的技術(shù)突破，提供老年性癡呆前變mRNA水 平篩查技術(shù)。使臨床上有了一項(xiàng)新的老年性癡呆病理演變前期mRNA水平真正早期篩查的 技術(shù)，為臨床老年性癡呆癥的早期預(yù)防和治療爭(zhēng)取時(shí)間和空間。
[0018] 綜上所述，本發(fā)明的目的首先是提供一種原位雜交檢測(cè)試劑盒，其包含原位雜交 檢測(cè)探針和標(biāo)記物。
[0019] 其次，本發(fā)明還要提供上述試劑盒用于與老年性癡呆病理演變前期的CR-1基因 的原位雜交檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0020] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 本發(fā)明首先提供一種原位雜交檢測(cè)試劑盒，其包括雜交探針和標(biāo)記物，其中，所述的雜 交探針序列如SEQIDNO. 1所示，是CR-1基因8268bp中CDS的一個(gè)片段是從601...1200bp， 探針長(zhǎng)度是600bp，CR-1基因位于染色體lq31_42. 3"上。本探針是該基因⑶S中的一段， 與體內(nèi)的靶片段進(jìn)行反向互補(bǔ)雜交。
[0021] 本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是，所述的標(biāo)記物選自放射性物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光或顯 色物質(zhì)、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。
[0022] 本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是還包括雜交液。
[0023] 本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是還包括增強(qiáng)劑。
[0024] 本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是還包括顯色劑。
[0025] 本發(fā)明的老年性癡呆病理演變前期基因篩查試劑盒應(yīng)用價(jià)值在于，能在mRNA水 平，及早對(duì)老年性癡呆病理演變前期的篩查及老年性癡呆癥經(jīng)治療后療效的評(píng)判。CR-1基 因是一種老年性早衰基因，它的表達(dá)變化表明老年性癡呆癥前期病理演變的可能，提示臨 床醫(yī)生及早介入預(yù)防和治療。
[0026] 本發(fā)明還提供一種CR-1基因原位雜交的檢測(cè)方法，包括以下步驟： (1) 在上面所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將底物中待測(cè) RNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體；和 (2) 檢測(cè)所述雜交復(fù)合體。
[0027] 本發(fā)明所述的檢測(cè)方法，其中優(yōu)選地是，所述的可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件為： 核酸雜交的溫度為42°C;核酸雜交的時(shí)間為16 - 24小時(shí)。
[0028] 本發(fā)明所述的檢測(cè)方法，其中優(yōu)選地是，所述的底物選用人的血液白細(xì)胞標(biāo)本或 其它器官組織細(xì)胞、或腦脊液標(biāo)本。更優(yōu)選地是，所述的血液標(biāo)本或其它器官組織細(xì)胞標(biāo)本 來自老年性癡呆患者、高危人群，正常人群。
[0029] 本發(fā)明所述的檢測(cè)方法，其中優(yōu)選地是，所述的高危人群、老年性癡呆癥好發(fā)家 族、經(jīng)治療后老年性癡呆癥病人。
[0030] 本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒是采用核酸雜交技術(shù)和組化免疫方法相結(jié)合，以CR-1基因 為檢測(cè)對(duì)象，合成探針是CR-1基因的RNA序列，檢測(cè)的底物是人體血液標(biāo)本白細(xì)胞或組織 細(xì)胞及腦脊液的RNA的表達(dá)量。原位雜交技術(shù)的顯示方法能提供CR-1基因的半定量或定 量表達(dá)程度判定。根據(jù)雜交后免疫組化顯色判定以上基因的表達(dá)量，正常人CR-1基因表達(dá) 低或不表達(dá)，即不顯色，CR-1基因在老年性癡呆病人和正常人有顯著差異，該基因的表達(dá)量 比正常人表達(dá)量都高，高度顯色。
[0031] 本發(fā)明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試 劑盒的核酸雜交原理是分子生物學(xué)業(yè)內(nèi)人士均熟知，具體操作步驟是標(biāo)本處理、預(yù)雜交、雜 交、免疫組化染色、鏡下進(jìn)行定量分析、結(jié)果報(bào)告，其中雜交的具體步驟包括： 1) .將待測(cè)標(biāo)本放入反應(yīng)槽中； 2) .儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)加消化液； 3) .儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)后固定； 4) .儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)預(yù)雜交（42°C); 5) .儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗； 6) .儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)雜交（42°C); 7) .儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗； 8) .儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)與DIG抗體培養(yǎng)(室溫）； 9) .儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗，顯色； 10) .取出封片鏡檢。
[0032] 本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的方案是：以CR-1基因?yàn)槟康幕蚝铣傻暮怂崽结樣?地高辛標(biāo)記(地高辛標(biāo)記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)， 還克服了生物素標(biāo)記的探針在原位雜交過程中受組織內(nèi)源性生物素干憂等缺點(diǎn))，將該雜 交探針與人體血液白細(xì)胞的待測(cè)RNA核酸進(jìn)行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下 觀察mRNA的存在和定位，根據(jù)染色的細(xì)胞數(shù)，判斷目的基因的表達(dá)量。
[0033] 本發(fā)明方法是目前常用的核酸原位雜交技術(shù)，該方法通過檢測(cè)底物細(xì)胞中的CR-1 基因表達(dá)量，用來確定老年性癡呆病理演變是否已發(fā)生，因?yàn)镃R-1基因在正常人中低表達(dá) 或不表達(dá)，如果CR-1基因表達(dá)高度，說明老年性癡呆發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)非常高，以及治療后病人治 療效果評(píng)判，從而獲得老年性癡呆前期的篩查和診斷信息，幫助臨床醫(yī)生及早介入。一個(gè)試 劑盒可以多人份使用或一人份使用。
[0034] 如上所述，當(dāng)檢測(cè)到CR-1基因的表達(dá)高于正常對(duì)照時(shí)，則可預(yù)測(cè)受試者老年性癡 呆病理演變已發(fā)生。
[0035] 本發(fā)明具有如下有益效果： 本發(fā)明的臨床意義是更早期跟蹤檢測(cè)老年性癡呆病變發(fā)生和病理演變過程中老年性 癡呆癥的發(fā)生、發(fā)展趨勢(shì)。本發(fā)明可以在基因水平上檢測(cè)CR-1基因異常表達(dá)，亦未形成老 年性癡呆之前，能及早做到以上基因表達(dá)異常的信息采集，給臨床老年性癡呆病理演變前 期高風(fēng)