老年性癡呆病變前期MS4A4基因的mRNA水平原位雜交篩查試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測領域，更具體地說，是涉及與老年性癡呆（AD)病變前期mRNA 表達改變（病理演變過程）的相關檢測技術。
【背景技術】
[0002] 阿爾茨海默?。ˋlzheimer' s disease-, AD)是最常見的癡呆類型，占所有癡呆 的609T80%，也是致殘率高和負擔大的疾病之一。到2006年，人類第一殺手心臟病死亡率 比2000年下降了 11. 5%，第二殺手卒中死亡率下降了 18. 1%，但阿爾茨海默病的死亡率卻上 升了 47. 1%，成為老年人的第5位致死原因。隨著全球性人口規(guī)模和預期壽命的增加，阿爾 茨海默病已成為世界衛(wèi)生問題，根據未來的預測，癡呆患病率每二十年增加近一倍，至2030 年將達到6570萬，到2050年將達到1億1540萬。各國阿爾茨海默病患者數(shù)增加不是均衡 的。發(fā)達國家的癡呆人數(shù)預測以100%的比例增長，而中國/印度及其南亞和西太平洋鄰國 等發(fā)展中國家將以超過300%的比例增長，中國的AD人數(shù)則將以336%的比例增長。中國是 世界上人口老化基數(shù)最大國家，截止2008年底，我國60歲以上老年人口已接近1. 69億，占 總人口的12%。根據2005年北京協(xié)和醫(yī)院領導的一項跨省市(北京/上海/成都/西安)流 行病學調查結果估計，65歲以上老年人AD患病率為4.8%，且隨著年齡增長而增加。因此， 中國絕不是一個AD低發(fā)國家，恰恰相反，而是世界上AD人數(shù)最多且增長速度最快的國家。 因此迅猛增加的疾病負擔必將對我國的社會經濟發(fā)展和家庭生活產生重要影響。
[0003] AD是世界上致殘率高且負擔重的疾病。按照2003年度世界衛(wèi)生組織報導的關于 全球疾病負擔的估計，60歲以上老年人中癡呆導致殘疾的占11. 2%，遠高于卒中（9. 5%)、骨 骼肌障礙（8. 9%)、心血管?。?%)及各種類型的癌癥（2. 4%)。據美國一個跨學科專家組的共 識估計，除脊髓損傷和晚期癌癥以外，AD致殘加權顯著高于任何其他健康狀況。在美國，AD 人口已超過500萬，AD的花費已超過1000億美元，估計到2050年AD患者人數(shù)將以幾何級 數(shù)方式增長到1300萬人，經過核算，每年將花費1400億美元。AD已成為重大的公共衛(wèi)生 問題，并確定為未來幾年公共衛(wèi)生問題的研究重點。
[0004]AD是一種常見的神經系統(tǒng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為進行性認知功能減退，典型 病理改變?yōu)槔夏臧撸╯enileplaque,SP)、神經原纖維纏結（neurona1fibrillary tangles,NFT)及神經元丟失，另外伴有顆?？张葑冃裕╣ranulovacuolar degeneration,⑶)，平野小體和腦血管的改變。經過數(shù)十年有關AD的病因和發(fā)病機制的 研究后，雖然對AD的病因還有許多不了解，但是對其病理和生理機制有了肯定和全面的認 識，并從中發(fā)現(xiàn)了一些重要的疾病標志。現(xiàn)代分子遺傳學在幫助人類認識AD的發(fā)病機制方 面意義非凡，發(fā)現(xiàn)常染色體突變能導致A0 42肽的表達增多，參與的基因包括MS4A4基因。 MS4A4基因是最近發(fā)現(xiàn)四個新基因與老年性癡呆發(fā)病有關其中之一。AD的生物標志物能很 好地幫助臨床診斷，與病理發(fā)現(xiàn)有良好的一致性。2010年美國國立老化研究院和阿爾茨海 默病聯(lián)合會推薦新的診斷定義與標準，強調將記憶損害與生物標志物結合。AD是疾病的整 個臨床過程，包括了AD癡呆前期和癡呆期AD。AD的臨床前驅期則指出現(xiàn)早期病理生理學 改變至出現(xiàn)最早的認知癥狀之間漫長的階段。當前，臨床使用的AD治療藥物不少，但均缺 乏有臨床意義的療效。癡呆是嚴重的認知功能損害，呈進展性和不可逆性，要通過藥物干預 實現(xiàn)病情穩(wěn)定或緩解是極其困難的。因此，對癡呆實施預防應該是一個重要的臨床研究方 向。最新AD研究報告表明，作為"嬰兒"這一代，到2050年在美國將有1千3百50萬人成 為AD癡呆患者。如果，假設有一種干預可以是AD癡呆的發(fā)病延遲5-10年或提早5-10預 測和篩查，那么AD癡呆患者人數(shù)將減少80%，用于AD的預計醫(yī)療費用將會大大減少。中國 現(xiàn)有AD患者以超過800多萬，而且，發(fā)病人數(shù)每年在上升。因此，尋找有效AD篩查工具，對 臨床前期AD患者及未發(fā)生AD高危人群的早期篩查，在人群中盡早開展干預治療，減少AD 的最終發(fā)生率有重要的臨床和時代意義。盡早開發(fā)出應用于AD病變前期mRNA水平篩查試 劑盒，這將改變目前臨床上的AD發(fā)生后的診治模式，將AD的診治提高、提前到病變前期，做 到預防性(治未?。┑脑缙诮槿牒椭委煟⑦M一步做到mRNA水平的調控及基因早期治療，將 AD消滅在萌芽狀態(tài)。
[0005] 本發(fā)明人在長期研究中發(fā)現(xiàn)，導致老年性癡呆治療效果不佳的主要原因是不能做 到真正的早期診斷和早期治療。本課題擬采用核酸原位雜交技術，尋找與AD發(fā)病密切相關 的MS4A4基因一級轉錄功能產物-mRNA，觀察其在AD病人、高危人群、正常對照人群表達變 化，統(tǒng)計分析其臨床應用意義和價值，并培養(yǎng)、開發(fā)出可應用于臨床的早期篩查試劑盒，用 于臨床前期AD患者及高危人群的早期篩查，做到預防性診治，盡早開展干預治療，減少AD 的最終發(fā)生率。
[0006] 隨著分子生物技術日益完善，功能基因組學，疾病基因組學等研究的深入展開，為 了尋求更早期的篩查和治療老年性癡呆、以及預防老年性癡呆，已取得長足進步。至今，我 們已有可能在基因的一級轉錄功能產物（mRNA水平)上做更精確的早期篩查和診斷，在老年 性癡呆癥的基因生理病理學演變前期，就可以做到早期預測和篩查。本發(fā)明采用核酸原位 雜交技術，選擇多組臨床標本(老年性癡呆患者、高危人群、正常對照)，對MS4A4基因與老年 性癡呆癥的早期預警進行檢測分析。
[0007]MS4A4基因的mRNA作為早期篩查老年性癡呆病變前期有非常重要的臨床診斷意 義。MS4A4基因的mRNA在老年性癡呆癥前期及病變過程中表達過度。它作于老年性癡呆病 變前期篩查、及老年性癡呆癥早期預防的檢測指標及治療后的復發(fā)預警也有非常重要的臨 床意義。
[0008] 發(fā)明人在長期的研究中，得出了一種新理念，臨床的重大疾病的臨床診治模式一 定要改變，不能只停留現(xiàn)在治已?。òl(fā)病后診治)，要做到預防性診治，做到治已病，只有這 樣才能降低重大疾病的發(fā)病率和死亡率，降低社會成本和醫(yī)療成本。因此，發(fā)明人在開發(fā)和 生產重大疾病的mRNA水平篩查試劑盒及治療藥物中，在理論和技術上都做了大膽創(chuàng)新。特 別是篩選臨床標本(正常人群、高危人群、疾病患者)，突破了正常組織與疾病組織比較的一 貫性研發(fā)思路，來尋找和開發(fā)病變期前mRNA水平，與疾病早期基因病理生理學演變密切相 關，而且臨床意義非常重要靶標，將臨床上疾病形成后診治模式變成疾病的預防性診治，爭 取了疾病診治的時間和空間，達到預防重大疾病。
[0009] 根據現(xiàn)有的文獻資料MS4A4基因mRNA水平的檢測技術及試劑盒未見報道。
[0010] 本發(fā)明人在對(老年性癡呆患者、高危人群、正常對照人）例組，用原位雜交技術 進行檢測，結果表明以上老年性癡呆癥MS4A4基因都過度表達，高危人群有不同程度表達 15-25%，正常人都是零表達。表明MS4A4基因是老年性癡呆病變前期篩查的重要標志物。
[0011] 原位雜交技術（insituhybridization)是將分子生物學與細胞化學技術結合起 來，以標記的核酸分子為探針，在組織細胞原位檢測特異性核酸分子的技術。其原理是使含 有特異序列、經過標記的核酸單鏈（即探針)，在適宜條件下與組織細胞中的互補核酸單鏈 即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細胞