5] 圖1是本發(fā)明MS4A4基因原位雜交實(shí)施流程圖； 圖2是本發(fā)明實(shí)施例老年性癡呆病人MS4A4過量表達(dá)圖片； 圖3是本發(fā)明實(shí)施例中正常人MS4A4表達(dá)圖片； 圖4是本發(fā)明實(shí)施例中高危人群MS4A4表達(dá)圖片。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面結(jié)合實(shí)施例，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)該理解，下面的實(shí)施例用于說明 而非限定本
【發(fā)明內(nèi)容】
，任何形式上的改變或變通將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0037] 實(shí)施例1 按照常規(guī)方法制備本實(shí)施例的原位雜交試劑盒，該試劑盒包括以MS4A4基因?yàn)闄z測目 的基因設(shè)計(jì)的雜交探針、標(biāo)記物、說明書，其中： 本實(shí)施例的探針標(biāo)記物選用地高辛。
[0038] 試劑盒雜交液組成： 消化液 1〇〇UL/管1管/盒無色透明液體 保護(hù)液 1〇〇uL/管1管/盒無色透明液體 預(yù)雜交液1300yL/管2管/盒無色透明液體 正義雜交液10uL/管1管/盒無色透明液體 反義雜交液10yL/管1管/盒無色透明液體 封閉液 1〇〇〇uL/管1管/盒無色透明液體 堿性磷酸酶抗體1uL/管 1管/盒無色透明液體 顯色劑A175yL/管1管/盒黃色液體 顯色劑B320yL/管1管/盒無色透明液體 緩沖液I90mL/瓶1瓶/盒淺黃色或無色透明液體 緩沖液II80mL/瓶1瓶/盒淺黃色或無色透明液體 緩沖液III20mL/瓶3瓶/盒淺黃色或無色透明液體 緩沖液IV90mL/瓶1瓶/盒淺黃色或無色透明液體 固定液 90mL/瓶1瓶/盒無色透明液體 陽性對照標(biāo)本6片/盒。
[0039] 配制試劑使用濃度 1) .將10X緩沖液I用三蒸水按1:10稀釋成1X緩沖液I; 2) .將20X緩沖液II用三蒸水按1:10稀釋成2X緩沖液II; 按1:100稀釋成0. 2X緩沖液II;按1:200稀釋成0. 1X緩沖液II; 3) .將10X緩沖液III用三蒸水按1:10稀釋成IX緩沖液III; 4) . 10X緩沖液IV用三蒸水按1:10稀釋成X緩沖液IV(取1#，2#，3#各10mL，加水 至100mL既可）。
[0040]實(shí)施例2 應(yīng)用核酸原位雜交檢測方法對老年性癡呆患者M(jìn)S4A4基因表達(dá)的實(shí)施過程： 1) .取待測標(biāo)本兩張； 2) .在玻璃缸里加入消化液（消化液100yL加IX緩沖液I99. 9ml，即為使用濃度）50 ml，37°C水浴預(yù)熱10min，放進(jìn)16張玻片，37°C處理12min,再用IX緩沖液I洗5min; 3) ?用0? 2%的保護(hù)液（保護(hù)液lml加1X緩沖液I，99ml即為使用濃度）洗10min， 三蒸水洗5min(以上過程都在玻璃缸進(jìn)行)，取出玻片，讓其自然干燥； 4) .將玻片放入保濕盒內(nèi)，加預(yù)雜交液25iiL/片（加在有細(xì)胞的地方)，蓋上蓋玻片， 蓋緊保濕盒，放在42°C恒溫水浴箱中3h以上； 5) .取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)，用70%、90%、95%的乙醇各洗2min， 取出，自然干燥； 6) .將玻片放入保濕盒內(nèi)，一張加正義雜交液25yL/片，另一張加反義雜交液25yL/ 片，蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42°C恒溫水浴箱中16-24h; 7) .取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)： 在42°C恒溫水浴箱中用2X緩沖液II洗兩次，每次15min; 在42°C恒溫水浴箱中用0. 2X緩沖液II洗一次，每次15min; 在42°C恒溫水浴箱中用0.IX緩沖液II洗兩次，每次15min; 8) .用IX緩沖液III洗30s，取出玻片，自然干燥； 9) .將玻片放入保濕盒內(nèi)，加〇? 5%封閉液（1ml封閉液加5ml1X緩沖液III) 100UL/ 片，蓋緊保濕盒，在室溫下作用30min。（此步驟不需加蓋玻片）； 10) .取出玻片，用IX緩沖液III洗30s，自然干燥； 11) .將玻片放入保濕盒內(nèi)，加X-AP抗體（取一管堿性磷酸酶抗體，向其中加入1. 8ml 1X緩沖液III) 100UL/片，蓋緊保濕盒在室溫下作用30min，時間不能過長，否則會產(chǎn)生假 陽性(此步驟不需加蓋玻片）； 12) .取出玻片，用IX緩沖液III洗3次，每次15min; 13) .用IX緩沖液IV洗2min，加顯色劑（顯色劑A73. 3iiL，顯色劑B157. 5iiL加到 30mL1X緩沖液IV中，混勻），室溫避光16h到18h以上； 14) .用三蒸水洗5min，自然干燥，（用甘油加10%的1X緩沖液I混勻）封片鏡檢。
[0041] 本發(fā)明的核酸原位雜交檢測方法將目的基因用地高辛標(biāo)記，成為RNA核酸探針， 將探針與人體白細(xì)胞的待測RNA核酸進(jìn)行雜交，再用免疫組化的方法顯色，因此在光鏡下 觀察mRNA的存在和定位，根據(jù)染色的細(xì)胞數(shù)，判斷目的基因的表達(dá)量。
[0042] 老年性癡呆病人20名，55歲以上人群20名，正常對照組20名。抽所有待檢人的 外周血3-5毫升(分離白細(xì)胞）做原位雜交。結(jié)果表示，所有老年性癡呆患者M(jìn)S4A4基因有 過度表達(dá)，細(xì)胞染色深；高危人群（55歲以上）有一定量表達(dá)（20%左右）；正常對照人零表 達(dá)，涂片細(xì)胞不染色。結(jié)果見圖2、圖3和圖4。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標(biāo)記物，其特征在于，所述的雜交探針序 列如SEQIDNO. 1所示。
2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的標(biāo)記物選自放射性物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光 或顯色物質(zhì)、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。
3. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括雜交液。
4. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括增效劑。
5. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括顯色劑。
6. -種MS4A4基因原位雜交檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟： (1) 在權(quán)利要求1所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將底物 中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體；和 (2) 檢測所述雜交復(fù)合體。
7. 如權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件 為：核酸雜交的溫度為42°C;核酸雜交的時間為16 - 24小時。
8. 如權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的底物選用人的血液白細(xì)胞和腦 脊液細(xì)胞標(biāo)本。
9. 如權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的標(biāo)本是老年性癡呆患者、高危人 群、正常對照人群。 10. MS4A4基因在制備檢測老年性癡呆病變前期原位雜交試劑盒中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標(biāo)記物。還公開使用本試劑盒原位雜交檢測與老年性癡呆（Alzheimer’sDisease-AD）前期病理演變有密切相關(guān)的MS4A4基因mRNA的方法，包括以下步驟：（1）在雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體；和（2）檢測所述雜交復(fù)合體。本發(fā)明的試劑盒和檢測方法可以在，mRNA水平上檢測MS4A4基因的表達(dá)功能，比現(xiàn)有的臨床生化檢測指標(biāo)和影像醫(yī)學(xué)檢查更早期，能實(shí)現(xiàn)真正的老年性癡呆（AD）病變前期mRNA水平的篩查，做到預(yù)防性診治的目的。同時，本發(fā)明的檢測方法簡單方便，成本低,便于醫(yī)院推廣應(yīng)用。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104711320
【申請?zhí)枴緾N201310669521
【發(fā)明人】張玉麗, 裘建英, 張?jiān)聘? 裘霖
【申請人】芮屈生物技術(shù)（上海）有限公司
【公開日】2015年6月17日
【申請日】2013年12月11日