專利名稱：一種哺乳動(dòng)物核糖核酸小分子復(fù)合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種核酸復(fù)合物，具體涉及一種哺乳動(dòng)物的核糖核酸(RNA)小分子復(fù)合物，及其制備方法和在制備治療腦部疾病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多基因疾病是由多種基因病變引起的疾病，其中的包括癡呆癥在內(nèi)的多種腦部疾病往往沒(méi)有特效藥，不易治愈。癡呆癥(Dementia)，是一種因腦部傷害或疾病所導(dǎo)致的漸進(jìn)性認(rèn)知功能退化，且此退化的幅度遠(yuǎn)高于正常老化的進(jìn)展，特別會(huì)影響到記憶、注意力、語(yǔ)言、解題能力，嚴(yán)重時(shí)會(huì)無(wú)法分辨人事時(shí)地物。只有不到10%的癡呆癥是可逆的。癡呆癥是個(gè)不特定的概括名詞。也稱失智癥。最常見的癡呆癥種類是老人癡呆癥，即阿茲海默氏癥(Alzheimer' s disease，簡(jiǎn)稱AD)又稱老人癡呆癥，特征是多種高級(jí)皮層功能紊亂，涉及記憶、思維、定向、理解、計(jì)算、 判斷、言語(yǔ)和學(xué)習(xí)能力等多方面，是一種持續(xù)性神經(jīng)功能障礙。該疾病的成因未明，目前有人認(rèn)為它是由多種基因病變引起的，沒(méi)有準(zhǔn)確診斷和有效治療的方法。該疾病最顯著的早期癥狀為健忘，通常表現(xiàn)為逐漸增加的短期記憶缺失，而長(zhǎng)期記憶則相對(duì)不受病情的影響。 隨著病情的加重，病人的語(yǔ)言能力，空間辨別能力，認(rèn)知能力會(huì)逐步衰退。國(guó)際上普遍存在的老齡化問(wèn)題使AD患病率呈急劇上升趨勢(shì)，全世界有MOO萬(wàn)病患，我國(guó)早在2000年60歲以上老齡人口已近1. 27億，而目前約500萬(wàn)的AD患者以及隨之產(chǎn)生的巨大家庭和社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)突出體現(xiàn)了這一嚴(yán)重影響人類健康的國(guó)際化難題。自2002年以來(lái)，小分子RNA對(duì)于各種疾病的抑制作用逐漸被人們發(fā)現(xiàn)并重視。已經(jīng)有研究證明了小分子RNA對(duì)腫瘤和多種腦部疾病具有有效的抑制作用，為這些困擾人類的疾病的治療提供了全新的途徑。本發(fā)明在上述技術(shù)背景下，應(yīng)用最新的分子生物學(xué)理論和技術(shù)，提出了一種小分子RNA復(fù)合物，其對(duì)癡呆癥等多種多基因疾病具有更好的治療效果。本發(fā)明還提供了所述小分子RNA復(fù)合物在治療癡呆癥等多種多基因疾病的藥物的制備中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種RNA小分子復(fù)合物，使其對(duì)癡呆癥等腦部疾病具有有效的抑制作用。本發(fā)明的這一目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的提供一種哺乳動(dòng)物RNA小分子復(fù)合物，它是由哺乳動(dòng)物腦組織中提取的大分子 RNA經(jīng)過(guò)分離純化和人工降解后得到的小分子的RNA組成的。所述的哺乳動(dòng)物優(yōu)選非成年哺乳動(dòng)物；進(jìn)一步優(yōu)選哺乳期的幼年哺乳動(dòng)物或哺乳動(dòng)物胚胎。所述分離純化是將從哺乳動(dòng)物腦組織中提取出的RNA盡量純化，使其純度等于或
3大于國(guó)內(nèi)生物技術(shù)藥物質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)值，即經(jīng)分光光度法測(cè)得的在260毫微米波長(zhǎng)下的OD 值與280毫微米波長(zhǎng)下的OD值的比值大于或等于1. 75。所述的分離純化可以通過(guò)酚提取-沉淀法、陰離子吸附法、硫酸鋅沉淀法或聚乙二醇沉淀法中的一種或兩種以上的方法實(shí)現(xiàn)。具體方法可以分別為A.酚提取-沉淀法1.在細(xì)胞裂解后離心分離出的含核酸的水相中加入1/3體積的提取液(pH6. 0的 0.01mol/L Tris平衡過(guò)的苯酚氯仿異戊醇的體積比為1:1: 1/ 的混合液)振蕩提取5 15分鐘，然后5°C下6000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，收集上清液；2.在步驟1所得上清液中加入1/3體積的上述提取液，重復(fù)上述提取和離心過(guò)程， 收集上清液；3.用1/3體積的氯仿對(duì)步驟2所得上清液進(jìn)行提取，并在5°C下6000轉(zhuǎn)/分離心 20分鐘，取上清液再重復(fù)本步驟的提取和離心過(guò)程，收集上清液；4.在步驟3得到的上清液中加入2. 5倍體積的95%的乙醇和1/10體積的3mol/ L乙酸鈉，沉淀過(guò)夜，并5°C下6000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘后收集沉淀，將沉淀溶于pH 6. 0的 0. 01mol/L的1Tris緩沖液和lmmol/L的EDTA的混合溶液中備用。B.陰離子樹脂吸附法將陰離子樹脂201Χ7(ΦΡ < 23mm)用蒸餾水浸泡過(guò)夜，裝入玻璃柱管以0. IN的 NaOH洗至堿性，經(jīng)蒸餾水洗至中性，最后以0. IN HCl洗至酸性。用10倍量的大分子RNA稀溶液緩緩?fù)ㄟ^(guò)柱，3倍體積蒸餾水沖洗柱，以0. lmol/L的Na2HPO4洗下核酸，加入1/10體積的3mol/L乙酸鈉及2. 5倍的酒精沉淀核酸。C.硫酸鋅沉淀法在pH8.0的稀核酸溶液中加入硫酸鋅粉或濃溶液，使硫酸鋅終濃度為1_2%，攪勻并保持pH8 9，靜置2小時(shí)以上或過(guò)夜，虹吸去除上清液，以1 %的硫酸鋅溶液洗沉淀并離心收集。沉淀懸于50mmol/L的pH為7. 0的EDTA溶液中，用10mmol/L的pH為4-6的EDTA 溶液透析去除硫酸鋅，最后加入1/10體積的3mol/L的乙酸鈉溶液及2. 5倍的酒精沉淀得到核酸。D.聚乙二醇沉淀法在溶有含雜質(zhì)的RNA的緩沖液中加入等體積10%的聚乙二醇(PEG 6000)沉淀 30 60分鐘，5°C下6000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘后收集沉淀。上述A-D的4種分離純化方法可以根據(jù)具體情況任意組合使用，也可以在人工降解之后進(jìn)一步使用。所述的人工降解方法可以是以下兩種方法之一1.超聲波降解法將大分子RNA溶于100mmol/L、pH為8. 5 9. 5的NaCl溶液中，將該大分子RNA 溶液分為3等份，均使用IOOOw超聲波處理，每次處理8秒鐘后間歇8秒鐘，如此循環(huán)處理， 3份溶液分別處理20次、30次和40次，然后將得到的溶液合并；或者，2.酸降解法1)將大分子RNA溶于10mmol/L的Tris溶液和lmmol/L的EDTA溶液的混合溶液
4中，保持PH為6. 0，并使大分子RNA在所述混合溶液中的重量百分比為4 6% ；2)在步驟1)的溶有大分子RNA的混合溶液中加入6N的HCl，使HCl終濃度達(dá)到 2. ON ；3)將步驟2、得到的混合溶液分為3等份，室溫下分別放置20分鐘、30分鐘和40 分鐘，放置時(shí)間到立即中和，然后合并3份溶液。以上所述的分離純化和人工降解后得到的小分子RNA復(fù)合物，優(yōu)選再用70%的乙醇洗，然后在5°C下以6000轉(zhuǎn)/分的速度離心20分鐘后收集沉淀，最終得到的即為本發(fā)明所述的小分子RNA復(fù)合物。經(jīng)過(guò)上述分離、純化和人工降解后得到的本發(fā)明的RNA小分子為一系列大小不等的RNA小分子，它們的復(fù)合物為白色或淺黃色粉末，經(jīng)過(guò)電泳結(jié)合分光光度法測(cè)得其純度達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，該復(fù)合物易溶于水、生理鹽水，比較穩(wěn)定，需要低溫保存。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述的RNA小分子復(fù)合物在治療腦部疾病的藥物的制備中的應(yīng)用。所述的腦部疾病優(yōu)選癡呆癥。所述的應(yīng)用可以是將所述RNA小分子復(fù)合物按照常規(guī)方法制備成注射劑；所述的注射劑優(yōu)選水性注射液或注射用無(wú)菌凍干粉末。所述制備注射劑的常規(guī)方法可以是將降解得到的本發(fā)明RNA小分子復(fù)合物溶解于50倍體積的生理鹽水中，制成水性注射液；或者再將所述水性注射液冷凍干燥制成注射用無(wú)菌粉末。本發(fā)明應(yīng)用方法制備的注射劑的使用方法是用于人體注射前，按照％ig/kg體重的劑量標(biāo)準(zhǔn)，用生理鹽水將上述制備好的注射劑進(jìn)行適當(dāng)溶解或稀釋，然后將溶解或稀釋好的注射劑進(jìn)行靜脈注射，可按照1次/日，10日為一個(gè)療程的方案用于臨床治療；用于動(dòng)物體靜脈注射時(shí)，劑量標(biāo)準(zhǔn)是用于人體時(shí)的10倍。目前，學(xué)術(shù)界認(rèn)為小分子的核酸片段對(duì)多基因疾病的治療機(jī)制主要有以下兩方面小分子的核糖核酸可以對(duì)病變基因表達(dá)進(jìn)行干擾，即小分子核酸干擾；小分子的核糖核酸片段可以阻止癌細(xì)胞擴(kuò)散。本發(fā)明人認(rèn)為，除上述治療機(jī)制外，小分子的核酸片段對(duì)多基因疾病的治療機(jī)制還在于外源正常核酸片段可以從分子水平矯正、修復(fù)病區(qū)核酸分子或基團(tuán)的畸變。本發(fā)明的RNA小分子復(fù)合物是RNA大分子經(jīng)人工降解后形成的一系列大小不等的RNA小分子組成的復(fù)合物。經(jīng)過(guò)所述人工降解方法，使原來(lái)隱藏在核酸大分子結(jié)構(gòu)內(nèi)部的不同大小的結(jié)構(gòu)片段暴露出來(lái)?；谏鲜鋈N治療機(jī)制，由這一系列核酸片段組成的復(fù)合物，能夠?qū)Χ喾N多基因疾病實(shí)現(xiàn)更廣泛的治療。目前現(xiàn)有技術(shù)中用于治療多基因疾病的核糖核酸基本上都是大分子物質(zhì)，而本發(fā)明的RNA小分子復(fù)合物是核糖核酸大分子經(jīng)過(guò)人工降解后得到的大量小分子片段組成的； 本發(fā)明的RNA小分子提取自天然的動(dòng)物組織而非化學(xué)合成，因此是單鏈RNA。通過(guò)上述技術(shù)方案獲得的本發(fā)明RNA小分子在抑制癡呆癥等腦部疾病的發(fā)展方面具有顯著效果，有以下動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為證實(shí)驗(yàn)1.本發(fā)明RNA小分子復(fù)合物對(duì)癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響1.實(shí)驗(yàn)材料1. 1實(shí)驗(yàn)藥品本發(fā)明實(shí)施例3制備的RNA小分子復(fù)合物注射液。
1. 2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)用SD大鼠M只，體重200 250g，均由昆明醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。1. 3實(shí)驗(yàn)設(shè)備與器材儀器腦立體定位儀(深圳瑞奧得公司)，小型電鉆，眼鏡螺釘，三線電極插頭，電烙鐵，揚(yáng)聲器，隔音室，恒冷切片機(jī)，冰箱，分析天平，顯微鏡。試劑3. 6%水合氯醛，4%多聚甲醛，75%酒精，醫(yī)用牙托水，醫(yī)用牙托粉。分析軟件:Matlab6. 5，SPSS12. 0 等。2.實(shí)驗(yàn)方法2. IAD動(dòng)物模型的建立用3. 6%水合氯醛溶液(300mg/kg體重)腹腔麻醉上述SD大鼠，麻醉成功后，將大鼠固定在腦立體定位儀上，常規(guī)消毒，剪開頭皮，以前因?yàn)榱泓c(diǎn)，進(jìn)刀坐標(biāo)(參照包新民 《大鼠全腦立體定位圖譜》)前后坐標(biāo)(AP)-2.0mm，中線旁開(L) 1. 0 4. 0mm，腹側(cè)坐標(biāo) (V)4. 0mm。先用牙科鉆在上述坐標(biāo)的周圍鉆孔，去除顱骨，挑開硬腦膜，用雙刃不銹鋼刀片 (寬2. 0mm，厚0. 2mm)按上述坐標(biāo)從腦冠狀面插入腦內(nèi)。然后將到向外移動(dòng)1. 0mm，降刀 1. Omm,并上下抽刀10余次，以完全切斷穹窿海馬傘。最后將刀片退至Li. Omm處抽出刀片。 按上述方法切斷雙側(cè)穹窿海馬傘制備AD大鼠模型。2. 2動(dòng)物分組實(shí)驗(yàn)組8只，按上述方法切斷雙側(cè)穹窿海馬傘；假手術(shù)對(duì)照組(即正常組)8只，開顱并挑開硬腦膜，切斷皮質(zhì)、胼胝體，但不切斷
穹窿海馬傘；用藥組8只，藥物從尾靜脈注射。每天一次，體內(nèi)每次注射劑量為1ml，藥效成分含量為18mg/lml，連續(xù)應(yīng)用1周。2. 3M0RRIS水迷宮行為學(xué)檢測(cè)Morris水迷宮由圓形水池和有機(jī)玻璃站臺(tái)構(gòu)成，水池分為四個(gè)象限(上海吉量科技有限公司)。數(shù)據(jù)采集由迷宮圖像監(jiān)視系統(tǒng)(攝像監(jiān)視器等)完成。先將每只大鼠放于跳臺(tái)，讓其熟悉起始游泳位置。隨后將大鼠推入池內(nèi)，記錄并比較各組大鼠找回跳臺(tái)的時(shí)間。若大鼠有較好的學(xué)習(xí)記憶能力，其找回跳臺(tái)的時(shí)間就較短。2. 4形態(tài)學(xué)檢測(cè)待水迷宮行為學(xué)測(cè)試完畢后，用3. 6%水合氯醛腹腔麻醉動(dòng)物(300mg/kg體重)， 經(jīng)主動(dòng)脈先后灌注生理鹽水200ml和4%多聚甲醛400ml (pH7. 4)。取腦在4%多聚甲醛中固定Mh以上，置入20%的蔗糖，待沉底后再置入30%蔗糖，下沉后行連續(xù)冰凍冠狀切片 (取材范圍為前囟后1.0mm 5. 0mm)，厚20 μ m。用NEUN抗體(chemicon 1 1000)對(duì)海馬組織胺常規(guī)SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，觀察計(jì)數(shù)各組海馬神經(jīng)細(xì)胞染色數(shù)量變化(每張切片取3個(gè)視野)。2. 5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS12. 0軟件包進(jìn)行處理。計(jì)量資料多組間比較用單因素方差分析。P <0.05有顯著性差異。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果3. 1對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響
水迷宮檢測(cè)顯示，正常組(假手術(shù)對(duì)照組)第一次進(jìn)入水迷宮平均找到跳臺(tái)的時(shí)間為94. 4秒，而未用藥物的癡呆組大鼠300秒也不能找到跳臺(tái)。用藥組找到跳臺(tái)的時(shí)間明顯較癡呆組縮短，介于正常和癡呆大鼠之間，且?？拷＝M。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用藥組和癡呆組間比較有明顯差異(P < 0. 05)。說(shuō)明本發(fā)明所述的小分子RNA組合物能夠明顯促進(jìn) AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善，詳細(xì)數(shù)據(jù)見表1。表1.大鼠學(xué)習(xí)記憶能力水迷宮檢測(cè)數(shù)據(jù)

3. 2對(duì)海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)體內(nèi)海馬神經(jīng)元形態(tài)和數(shù)量變化發(fā)現(xiàn)，正常組海馬神經(jīng)元形態(tài)完整，數(shù)量較多；癡呆組大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，用藥組的海馬神經(jīng)元數(shù)量與癡呆組比較又有明顯增多(P < 0. 05)。說(shuō)明本發(fā)明所述的RNA小分子復(fù)合物能有效增加海馬神經(jīng)元存活(見

圖1和表2)。表2.海馬神經(jīng)元存活數(shù)量比較
12345均數(shù)正常組575565524953AD組171921181618用藥組252829262326實(shí)驗(yàn)2.本發(fā)明RNA小分子復(fù)合物對(duì)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)的影響取大鼠孕鼠(E15D)隨機(jī)分為用藥組和未用藥對(duì)照組，均采用脫頸處死后，腹部用 75%的酒精消毒?？v向剪開腹部皮膚向兩側(cè)拉開，利用另一把剪刀打開腹壁暴露子宮，取出含有胎鼠的子宮，置于無(wú)菌的培養(yǎng)皿中。在超凈臺(tái)內(nèi)小心剖開子宮，獲得帶有胎盤和羊膜囊的胎鼠，打開羊膜囊取出胎鼠，剪下胎鼠頭部，移入盛有D-Hanks液的培養(yǎng)皿中。用鑷子夾住胎鼠眼眶以固定頭部，用小剪刀從斷頭處中線將頭皮和顱骨剪至嗅球部，用另一把鑷子向外側(cè)掀開兩邊顱骨，暴露出大小腦，小心將全腦取出放入另一盛有D-Hanks液的培養(yǎng)皿中。在放大的10倍左右顯微鏡下，用2把鑷子從腹部?jī)?nèi)測(cè)向背側(cè)部外側(cè)剝離腦膜，直至剝離干凈(以見不到含有血管的腦膜)沿背側(cè)表面正矢狀位，用鑷子向外側(cè)小心掀開大腦皮質(zhì)表面，即可在正中矢狀位見“C”字型海馬。用鑷子夾住海馬，向邊緣組織分離，即可獲得整個(gè)海馬。將海馬剪成Imm3的組織塊，用玻璃管吸入安瓶中，待組織塊下沉吸去D-Hanks液， 加入培養(yǎng)液吹打40 60次，制成細(xì)胞懸液。取少量細(xì)胞懸液加在計(jì)數(shù)板上，在10倍顯微鏡下計(jì)數(shù)下保密度(1. 5 2. 5) X IO5個(gè)細(xì)胞/孔，接種于M孔培養(yǎng)板(培養(yǎng)液為添加1 % B27的MDEMF12培養(yǎng)液)置于37°C 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組加入本發(fā)明實(shí)施例1制備的 RNA小分子復(fù)合物3mg/ml。細(xì)胞培養(yǎng)一周時(shí)測(cè)定各組海馬細(xì)胞數(shù)量，比較未用藥對(duì)照組和用藥組細(xì)胞存活數(shù)量，結(jié)果見表3和圖2。表3.本發(fā)明RNA小分子復(fù)合物對(duì)體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元存活的影響
權(quán)利要求
1.一種哺乳動(dòng)物RNA小分子復(fù)合物，它是由哺乳動(dòng)物腦組織中提取的大分子RNA經(jīng)過(guò)分離純化和人工降解后得到的小分子的RNA組成的。
2.權(quán)利要求1所述的哺乳動(dòng)物RNA小分子復(fù)合物，其特征在于所述的哺乳動(dòng)物為非成年哺乳動(dòng)物。
3.權(quán)利要求2所述的哺乳動(dòng)物RNA小分子復(fù)合物，其特征在于所述的非成年哺乳動(dòng)物為哺乳期的幼年哺乳動(dòng)物或哺乳動(dòng)物胚胎。
4.權(quán)利要求1所述的哺乳動(dòng)物RNA小分子復(fù)合物，其特征在于所述的分離純化是通過(guò)酚提取-沉淀法、陰離子吸附法、硫酸鋅沉淀法或聚乙二醇沉淀法中的一種方法或兩種以上方法的組合方法實(shí)現(xiàn)。
5.權(quán)利要求1所述的哺乳動(dòng)物RNA小分子復(fù)合物，其特征在于所述的人工降解通過(guò)以下超聲波降解法實(shí)現(xiàn)將大分子RNA溶于100mmol/L、pH為8. 5 9. 5的NaCl溶液中，將該大分子RNA溶液分為3等份，均使用IOOOw超聲波處理，每次處理8秒鐘后間歇8秒鐘，如此循環(huán)處理，3份溶液分別處理20次、30次和40次，然后將得到的溶液合并，即得到所述的小分子RNA復(fù)合物溶液。
6.權(quán)利要求1所述的哺乳動(dòng)物RNA小分子復(fù)合物，其特征在于，所述的人工降解通過(guò)如下的酸降解法實(shí)現(xiàn)1)將大分子RNA溶于lOmmol/L的1Tris溶液和lmmol/L的EDTA溶液的混合溶液中，保持pH為6. 0，并使大分子RNA在所述混合溶液中的重量百分比為4 6% ；2)在步驟1)的溶有大分子RNA的混合溶液中加入6N的HCl，使HCl終濃度達(dá)到2.ON ；3)將步驟2、得到的混合溶液分為3等份，室溫下分別放置20分鐘、30分鐘和40分鐘， 放置時(shí)間到立即中和，然后合并3份溶液，即得到所述的小分子RNA復(fù)合物溶液。
7.權(quán)利要求1所述的哺乳動(dòng)物RNA小分子復(fù)合物，其特征在于所述的分離純化和人工降解后得到的小分子RNA復(fù)合物，再用70%的乙醇洗，然后在5°C下以6000轉(zhuǎn)/分的速度離心20分鐘后收集沉淀。
8.—種權(quán)利要求1所述的RNA小分子復(fù)合物在治療腦部疾病的藥物的制備中的應(yīng)用， 其特征在于將所述RNA小分子復(fù)合物按照常規(guī)方法制備成注射劑。
9.權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述的注射劑為水性注射液或注射用無(wú)菌凍干粉末。
10.權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述的腦部疾病是癡呆癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種核糖核酸(RNA)小分子復(fù)合物，它是由哺乳動(dòng)物腦組織中分離出的大分子RNA經(jīng)過(guò)分離純化和人工降解后得到的小分子的RNA組成的。本發(fā)明的RNA小分子復(fù)合物在治療癡呆癥等腦部疾病中具有顯著療效。
文檔編號(hào)A61P25/28GK102174513SQ20111003961
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月17日
發(fā)明者楊雯欣 申請(qǐng)人:楊俊海