專利名稱：內(nèi)共生細(xì)胞器的檢測方法和從中可鑒定的化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疾病的診斷和/或細(xì)胞生物體(cellular organism)功能的測定，所述的細(xì)胞生物體可以是多細(xì)胞的或者單細(xì)胞的，可以是肉眼可見的或者是微生物。
背景技術(shù)：
研究細(xì)胞生物體功能(障礙)的疾病診斷專家可以對該生物體進(jìn)行廣泛的深入調(diào)查以獲得關(guān)于功能障礙各個(gè)方面的相關(guān)信息。這些深入調(diào)查范圍很廣，比如可通過研究來自不同病人的尿樣檢驗(yàn)?zāi)I結(jié)石的相對比率，通過內(nèi)鏡檢查探查有無腸道潰瘍，利用核磁共振(NMR)掃描發(fā)現(xiàn)腫瘤，通過血漿中的胰島素水平和/或葡萄糖濃度檢測糖尿病，通過測定癌基因的轉(zhuǎn)錄水平確定癌變傾向等等。
目前對較高等生物體如動物和植物疾病或者功能障礙的測定(或與之相反，健康和正常功能的檢測)依賴于從這些生物體獲得的樣品并在實(shí)驗(yàn)室中對這些樣品進(jìn)行研究來完成。人們發(fā)現(xiàn)對確定、鑒別或測定生物體的疾病或功能障礙有效的方法通常在測試或者篩選治療或引發(fā)這種疾病或功能障礙的化合物或者方法方面也是有用的?？梢源_定，鑒定或檢測疾病的多個(gè)方面的方法，通常能評價(jià)這樣的候選化合物或方法在治療或引發(fā)我們正在談?wù)摰募膊』蚬δ苷系K中的有效性。顯然，生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室一直都需要通過對生物體的其它深入研究來獲得與疾病或者功能障礙有關(guān)以及關(guān)于引發(fā)或治療疾病或功能障礙相關(guān)化合物和方法的更多的信息。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種細(xì)胞生物體功能(障礙)的測定方法，該方法包含了測定來自生物體的樣品中內(nèi)共生細(xì)胞器核酸和/或其基因產(chǎn)物與另一種核酸或基因產(chǎn)物的相對比例。在本發(fā)明中，術(shù)語″相對比率″是指將所述的第一種內(nèi)共生細(xì)胞器核酸和/或它的基因產(chǎn)物的量與所述的第二種核酸和/或它的基因產(chǎn)物的量進(jìn)行比較。例如，所述的相對比率可能是以第二種核酸或它的基因產(chǎn)物的量除第一種內(nèi)共生細(xì)胞器核酸或它的基因產(chǎn)物的量得到的數(shù)值，或反之。該一種或者兩種化合物的量還可被一個(gè)參考值除或者減。在此處細(xì)胞生物體功能的測定是指檢測細(xì)胞生物體是否處于健康狀態(tài)，或者生物體是否受到某些影響，如疾病和/或(有毒的)的化合物。疾病和/或(有毒的)化合物對生物體的影響達(dá)到一定程度后，可能會呈現(xiàn)出臨床癥狀。也有可能疾病和/或(有毒的)化合物對生物體有影響但尚沒有表現(xiàn)出臨床癥狀。
內(nèi)共生細(xì)胞器包括那些被認(rèn)為來源于真核細(xì)胞進(jìn)化早期、存在于真核細(xì)胞中的原核細(xì)菌所形成的細(xì)胞器。這些細(xì)菌(如它們被認(rèn)為的那樣)與早期的真核細(xì)胞共生，而且現(xiàn)在包含這些內(nèi)共生細(xì)胞器的真核細(xì)胞一般都不能在沒有細(xì)胞器的情況下存活。如今的真核細(xì)胞還沒有一種能在沒有線粒體的情況下發(fā)揮正常功能，而且大多數(shù)植物細(xì)胞如果沒有原質(zhì)體或者其來源的細(xì)胞器如葉綠體、白色體(etioplast)、造粉體(amyloplast)、造油體(elaioplast)或有色體(chromoplast)的話，至少也會發(fā)生功能障礙。一般而言，這些細(xì)胞器好象至少是部分自我復(fù)制的，雖然也受細(xì)胞核的控制，但是仍有相當(dāng)?shù)淖灾餍浴?br> 特別的，本發(fā)明提供了一種方法，通過這種方法，所述的內(nèi)共生細(xì)胞器核酸和/或它的基因產(chǎn)物的相對比率是由所述樣品中檢測到的基本上為細(xì)胞核核酸的量(其可以是DNA或RNA)，或所述的細(xì)胞核核酸(此處的細(xì)胞核核酸包含染色體DNA及轉(zhuǎn)錄的RNA)存在于所述樣品細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)組分或者部分中的基因產(chǎn)物(通過轉(zhuǎn)錄和/或翻譯得到，如mRNA或(多)肽)決定的。編碼小核糖核蛋白(SNRNP)的DNA或相應(yīng)的mRNA、或者其它來自染色體DNA的基本上共同的核酸，因?yàn)樗鼈兪菑V泛存在的，所以對于測試來說是特別有用的。在這方面，本發(fā)明提供了研究內(nèi)共生細(xì)胞器如線粒體和原質(zhì)體(proplastid)相關(guān)疾病的一種方法。此處的內(nèi)共生細(xì)胞器相關(guān)疾病是指某種情況下，所述的內(nèi)共生細(xì)胞器的核酸和/或它的基因產(chǎn)物的量和/或至少有一種特性與自然情況不同，例如所述核酸的表達(dá)可能減少了。內(nèi)共生細(xì)胞器相關(guān)疾病例如由缺陷的所述細(xì)胞器DNA編碼，表現(xiàn)在許多不同的綜合癥中，而且由于異質(zhì)性(heteroplasmy)，它的表達(dá)多變(而且因此一般很難僅僅通過測驗(yàn)臨床參數(shù)來檢測)，而異質(zhì)性也是為何突變型和野生型核酸共存在一種細(xì)胞中以及它的分布發(fā)生改變的原因。內(nèi)共生細(xì)胞器相關(guān)疾病通常隨著受影響個(gè)體的年齡增大而惡化。當(dāng)用各種藥物對其它的疾病進(jìn)行治療后往往也會觀察到內(nèi)共生細(xì)胞器相關(guān)疾病，然后內(nèi)共生細(xì)胞器相關(guān)疾病促成這些藥物的多種副作用，而這些副作用是治療時(shí)意欲避免的?，F(xiàn)在這些副作用可使用此處提供的方法更好地進(jìn)行研究。
此外，本發(fā)明還提供了一種方法，根據(jù)此方法，所述的一種內(nèi)共生細(xì)胞器核酸和/或它的基因產(chǎn)物的相對比率由所述樣品中能檢測到的另一種(不同的)內(nèi)共生細(xì)胞器核酸(其可以是DNA或RNA)的量，或由所述的內(nèi)共生細(xì)胞器核酸的基因產(chǎn)物(由轉(zhuǎn)錄和/或翻譯得到，如mRNA或(多)肽)決定。本發(fā)明的一個(gè)方面還包括了測定細(xì)胞器DNA(如mtDNA)和與之相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄后的細(xì)胞器RNA(例如相關(guān)的mtRNA)或者翻譯后的基因產(chǎn)物的比率。這種方法可以測定轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的水平。當(dāng)轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的水平與自然水平相比有所改變時(shí)，則表示所述細(xì)胞的功能也發(fā)生了變化。所說的功能改變可能是因?yàn)槟撤N疾病或某個(gè)特定的治療副作用所導(dǎo)致的所述細(xì)胞器的功能障礙，而所述的功能障礙可能包含如轉(zhuǎn)錄水平的降低等。或者，所述的功能改變也可能是所述細(xì)胞器的功能改善，例如在內(nèi)共生細(xì)胞器相關(guān)疾病的治療和/或治愈過程中。
所述的功能障礙可能也包含轉(zhuǎn)錄水平的增加。一種疾病或一種疾病的治療可能涉及內(nèi)共生細(xì)胞器DNA的減少。然而，所說的減少在所述疾病的第一階段至少能夠部分地從所述DNA轉(zhuǎn)錄水平的增加得到補(bǔ)償。這樣，源自所述的內(nèi)共生細(xì)胞器DNA的RNA的量可能一點(diǎn)也不會減少，或者相對于所述的內(nèi)共生細(xì)胞器DNA而言減少的程度少一點(diǎn)。那樣的話所述疾病或治療的癥狀可能還(完全地)感覺不到。然而，若所述的內(nèi)共生細(xì)胞器DNA的量進(jìn)一步減少，來自所述DNA的RNA的量最后也將明顯地降低。然后副作用發(fā)生了。照慣例，往往根據(jù)副作用的臨床表現(xiàn)來決定是治療這種疾病還是把治療減少或者停止治療。但是，在這種傳統(tǒng)的方式下，病人已經(jīng)遭受了所述的副作用造成的痛苦。不過，如果用本發(fā)明中的方法，包括臨床癥狀的副作用就能夠被預(yù)測。例如，內(nèi)共生細(xì)胞器核酸的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯水平的改變是細(xì)胞生物體功能改變?nèi)缢龅纳矬w遭受(未來的)副作用的一種指征。內(nèi)共生細(xì)胞器DNA和/或它的基因產(chǎn)物與細(xì)胞核核酸或其基因產(chǎn)物的相對比率的改變也是細(xì)胞生物體功能變化的一種指示。
本發(fā)明的另一種方面測定了兩個(gè)不同的細(xì)胞器DNA或其相關(guān)基因產(chǎn)物間的比率。一方面，提供的本發(fā)明的方法中所述的第一種內(nèi)共生細(xì)胞器核酸和第二種內(nèi)共生細(xì)胞器核酸都來自同一種細(xì)胞器。例如，所述的細(xì)胞器包含線粒體。
本發(fā)明中的方法尤其適于疾病的分期。一種生物體可能已經(jīng)受到了某種疾病的影響，雖然基本上還沒有或者幾乎沒有臨床癥狀。但是，雖然基本沒有表現(xiàn)出臨床癥狀，但一種內(nèi)共生細(xì)胞器核酸和/或基因產(chǎn)物與另一種內(nèi)共生細(xì)胞器核酸和/或其基因產(chǎn)物的相對比率可能已經(jīng)改變了。如實(shí)施例所示，所述的相對比率的所述改變可以在臨床癥狀和/或傳統(tǒng)測試方法，如測定乳酸丙酮酸的比率之前檢測到，顯示生物體的功能改變。因此，所述的相對比率非常適于確定某種特定疾病的分期。所以本發(fā)明的一方面提供了一種確定疾病的分期的方法，包含確定從正經(jīng)受或?qū)?jīng)受所述疾病的生物體所取的樣品中內(nèi)共生細(xì)胞器核酸和/或其基因產(chǎn)物的相對比率。
本發(fā)明的一種用于疾病分期的方法也可用來診斷疾病。例如，人們可以按一定的時(shí)間間隔用本發(fā)明中的方法進(jìn)行常規(guī)檢測，他們也可以在出現(xiàn)臨床癥狀后進(jìn)行測試。所述的相對比率的改變指示疾病發(fā)展到了某種程度。所述疾病的種類不必用本發(fā)明中的方法診斷。本發(fā)明還可用于候選藥物的測試，發(fā)現(xiàn)可能的藥劑或藥學(xué)組分如抗寄生蟲化合物，抗生素以及細(xì)胞增殖抑制劑等候選物的有益活性和/或副作用。例如，本發(fā)明提供了一種確定候選化合物治療活性和/或可能的副作用的方法，比如測定候選化合物在治療細(xì)胞生物體功能障礙中的有效性，包含測定來源于所述生物體的樣品中內(nèi)共生細(xì)胞器核酸和/或其基因產(chǎn)物的相對比率，優(yōu)選地所述生物體或者基本相關(guān)的生物體(如屬于同一種種或?qū)?為經(jīng)過所述化合物處理過的。如果用所述的候選化合物處理所述的生物體后，該生物體的內(nèi)共生細(xì)胞器核酸和/或其基因產(chǎn)物的相對比率發(fā)生了改變則顯示所述的候選化合物用于該生物體時(shí)會產(chǎn)生治療和/或副作用。此外，這也表明該化合物用于基本相關(guān)的生物體時(shí)也有治療和/或副作用。因此，當(dāng)用本發(fā)明中的方法來確定一種候選化合物在細(xì)胞生物體功能障礙治療中的治療活性和/或副作用時(shí)，并非必須使用同一種生物體，也可使用基本相關(guān)的生物體。
另一方面，本發(fā)明提供了確定一種藥劑治療活性和/或可能的副作用的方法，包含測定來源于所述生物體的樣品中內(nèi)共生細(xì)胞器核酸和/或其基因產(chǎn)物的相對比率，優(yōu)選地所述生物體是經(jīng)過所述的藥劑處理過的。根據(jù)本發(fā)明，治療活性是指至少能部分的治療疾病的能力。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述的治療活性包含針對一種HIV相關(guān)疾病和/或一種腫瘤相關(guān)疾病的治療活性。例如，所述的藥劑包含了cytostaticum，它可以與其它的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療方法適當(dāng)結(jié)合。根據(jù)荷蘭的ATHENA研究，接受一種逆轉(zhuǎn)錄治療的病人中有40％由于不良的副作用而需要更換逆轉(zhuǎn)錄治療。因此，本發(fā)明中的方法在這樣的治療中是非常受歡迎的，因?yàn)樗龅姆椒茉?嚴(yán)重的)臨床癥狀出現(xiàn)之前發(fā)現(xiàn)副作用。然后所述的治療就可在所述的臨床癥狀出現(xiàn)之前就停止和/或更換。那樣的話所述的臨床癥狀就不會或者在較小的范圍內(nèi)出現(xiàn)。這將防止很多痛苦。因此在其優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供了一種方法，其中當(dāng)使用該方法時(shí)，所述的副作用可以基本上不出現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明，“基本上不出現(xiàn)”是指副作用沒有(還沒有)、或只有部分有臨床癥狀。
一方面，本發(fā)明中所提供的方法中所述的化合物或藥劑包含cytostaticum。通常使用的cytostatica包含如烷化劑、antimitotoxiccytostatica、抗腫瘤抗生素和拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑等。其中非限制性的例子包含chloorambucil、環(huán)磷酰胺(cyclofosfamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環(huán)磷酰胺(ifosamide)、melfalanthiotepabusulfan、曲奧舒凡(treosulfan)、卡氮芥(carmustne)、環(huán)己亞硝脲(lomustine)、順鉑(cisplatine)、卡鉑(carboplatine)、奧沙利鉑(oxaliplatine)、達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)、甲基芐肼(procarbazine)、替莫佐胺(temozolomide)、長春花堿(vinblastine)、長春新堿(vincristine)、長春地新(vindesine)、多舍他西(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、柔紅霉素(daunorubicine)、阿霉素(doxorubicine)、表阿霉素(epirubicine)、去甲氧柔紅霉素(idarubicine)、米托蒽醌(mitoxanthron)、博來霉素(bleomycine)、放線菌素D(dactinomycine)、絲裂霉素(mitomycine)、伊立替康(irinotecan)、托潑替坎(topotecan)、足葉乙甙(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)安丫啶(amsacrine)、左旋門冬酰胺酶(asparaginase)、cladribine、hydroxyarbaide、噴司他丁(pentostatine)、甲氨喋呤(methotrexaat)和/或雷替曲塞(raltitrexed)。在抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療和/或腫瘤相關(guān)疾病的治療期間常常使用核苷和/或核苷酸類似物。這些類似物很容易出現(xiàn)副作用，因?yàn)樗鼈兏蓴_生物體的復(fù)制和/或轉(zhuǎn)錄過程。然后內(nèi)共生細(xì)胞器核酸的量也常常有所改變。因此，當(dāng)用包括核苷和/或核苷酸類似物的藥劑處理生物體時(shí)，很適合用本發(fā)明中的方法進(jìn)行測定。
一方面，本發(fā)明提供了一種方法，其中所述的化合物或藥劑包含了核苷和/或核苷酸類似物。這種類似物的非限制性實(shí)例是氟達(dá)拉濱、巰基嘌呤、硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、氟尿嘧啶和/或gemeytabine。而另一方面，本發(fā)明提供了一種方法，其中所述的化合物或藥劑包含AZT、ddI、ddC、d4T、3TC和/或替諾福韋(tenofofir)。本發(fā)明的方法中所述生物體或基本上相關(guān)的生物體已經(jīng)優(yōu)選地與所述化合物或生物體一起提供。
某些疾病如HIV相關(guān)疾病的治療不得不需要很長的一種時(shí)期。本發(fā)明中的方法尤其適于在長的時(shí)期內(nèi)進(jìn)行治療的疾病。在所述的長時(shí)期內(nèi)，會有很多副作用出現(xiàn)，不過現(xiàn)在病人能在(還)沒有臨床癥狀就進(jìn)行有規(guī)律的檢測。因此，一方面本發(fā)明中提供的方法中所述的藥劑至少使用了3個(gè)月，優(yōu)選地至少6個(gè)月，更優(yōu)選地至少12個(gè)月。一方面提供了本發(fā)明的一種方法，其中在至少3個(gè)月的時(shí)間內(nèi)使用所述藥劑，優(yōu)選在至少6個(gè)月的時(shí)間內(nèi)使用所述藥劑。一方面，所述的藥劑用于慢性疾病的治療。此處的慢性病是指那種不能被完全治愈的疾病。一旦個(gè)體獲得了所述的這種疾病，雖然臨床癥狀會不斷的變化，但所述的疾病將一直存在于所述的個(gè)體中。所述的個(gè)體有時(shí)甚至不會注意到所述的癥狀。慢性病包含了如HIV-相關(guān)疾病之類的疾病。
此處的化合物的副作用是指所述化合物除了目的效應(yīng)之外的其他作用。所述的副作用可能是不希望有的效應(yīng)。例如，一種治療化合物能解除疾病，但同時(shí)也降低了生物體的代謝。所述的代謝的所謂降低被稱作(負(fù)的)副作用?；蛘撸衔锏母弊饔靡部赡苁且环N有益的作用，如對另一種疾病的免疫力。
在此還提供了用于(選擇性)檢測毒素，如除草劑、殺蟲劑、抗寄生蟲化合物、抗生素等化合物的用途。本發(fā)明提供了一種測定候選化合物毒性的方法，例如確定它是否引起細(xì)胞生物體的功能障礙例如通過細(xì)胞增殖抑制甚至是細(xì)胞毒性效應(yīng)，所述的方法包含測定來源于所述的生物體的樣品中內(nèi)共生細(xì)胞器核酸和/或其基因產(chǎn)物的相對比率，優(yōu)選地所述生物體或相關(guān)生物體使用了所述的化合物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中還對選擇性進(jìn)行了測試，其利用或應(yīng)用此處提供的方法(優(yōu)選地通過平行實(shí)驗(yàn))檢測一種生物體和另一種基本上無關(guān)的生物體，希望二者屬于不同的科或目，優(yōu)選地屬于不同的種或門，最優(yōu)選地是屬于不同的界。例如選擇性方面可通過測試一種靶生物體(如細(xì)菌或寄生蟲)中(如果需要可只在其細(xì)胞中)以及其宿主或其細(xì)胞(屬于基本上不相關(guān)的另一種生物體如哺乳動物或植物)中的所述的化合物，或者通過測試農(nóng)作物或其細(xì)胞以及基本上不相關(guān)的雜草植物或其細(xì)胞中的所述的化合物來確定該化合物的選擇性毒性或選擇性治療作用。它還可用于來源于個(gè)體的正常細(xì)胞與異常細(xì)胞的平行測試或比較測試，例如來源于同一個(gè)體的腫瘤細(xì)胞，檢測或篩選用來治療所述個(gè)體或其他有相似或相關(guān)疾病的個(gè)體的腫瘤特異的或至少具有選擇性的細(xì)胞增殖抑制或細(xì)胞毒性的化合物。
例如，用本發(fā)明的方法確定相對比率可通過測量所述樣品中所述核酸和/或基因產(chǎn)物的量來確定，通常在至少一種處理步驟之后，例如靶核酸的擴(kuò)增。在測量完所述的量后，所述的相對比率可用一個(gè)量除以另一個(gè)量得到。
微量的靶核酸可通過酶擴(kuò)增檢測和定量。酶擴(kuò)增技術(shù)包括如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)1、核酸序列為基礎(chǔ)的擴(kuò)增(NASBA)2、SDA、TMA和其它技術(shù)。在擴(kuò)增反應(yīng)中加入兩個(gè)引物序列就可實(shí)現(xiàn)靶核酸序列的特異擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束時(shí)，用所述的擴(kuò)增區(qū)特異的探針就能檢測擴(kuò)增的區(qū)域。也可在所述的擴(kuò)增反應(yīng)中所述核酸的產(chǎn)生過程中檢測到擴(kuò)增的區(qū)域。在后面的這個(gè)方法中，當(dāng)所述的探針與互補(bǔ)的核酸雜交后就可檢測到探針上連接的標(biāo)記信號。TaqMan3和分子信號探針4；5就是這樣一種能在擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)行實(shí)時(shí)同源檢測的探針。
靶核酸序列的定量通常通過加入一種競爭性分子來完成。競爭性分子使用與靶核酸同樣的引物，而且其包括一段能區(qū)分競爭性分子和靶核酸序列的序列2；6。擴(kuò)增的競爭性分子和靶核酸序列的比例可用來對所述的靶核酸進(jìn)行定量。在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束時(shí)或者在所述的擴(kuò)增反應(yīng)過程中，用競爭性分子或者靶核酸序列的特異探針對競爭性分子或者靶核酸序列進(jìn)行檢測。在后面的這個(gè)方法中，當(dāng)所述的探針與互補(bǔ)的核酸雜交并且所述的靶核酸超過閾值時(shí)，就可檢測到探針上連接的標(biāo)記信號，檢出陽性的時(shí)間或循環(huán)數(shù)。在另一種定量方法中，檢出陽性時(shí)間可在不加競爭物的情況下定量。
其中，本發(fā)明中的方法在檢測細(xì)胞生物體的功能(障礙)、候選藥物的測試和選擇性毒素的測試方面非常適合。已經(jīng)用該方法完成了許多反應(yīng)過程，而且證實(shí)這種方法是一種很有用的手段(見實(shí)施例)。當(dāng)消除了結(jié)果中的雙向擴(kuò)散(double spreading)后，用本發(fā)明的方法可以得到一種更精確的結(jié)果。一般來說，本發(fā)明方法所得結(jié)果中的雙向擴(kuò)散是因不同反應(yīng)混合物的條件不同所致。例如，擴(kuò)增步驟對于檢測和定量樣品中的特異核酸通常是必須的。然而，核酸1反應(yīng)混合物的溫度可能比核酸2反應(yīng)混合物的溫度略微高一些，這樣可能會使核酸1的產(chǎn)量較高，并且因此得到的核酸1與核酸2的量的比率高于核酸1混合物和核酸2混合物在同樣的溫度下擴(kuò)增所得的比率。因?yàn)樗龅幕旌衔镏兴鰷囟鹊牟町?，最初樣品中兩個(gè)核酸的測定比率與二者的實(shí)際比率并不完全符合。同樣地，其它條件的微小變化如加入的酶量也會導(dǎo)致核酸1和核酸2的測定量的改變。因此，核酸1和2的測量值可不依賴于對方而獨(dú)立變化。所述測定量的獨(dú)立變化會引起所述測定量的計(jì)算比率發(fā)生更大的改變。這就稱做結(jié)果中的雙向擴(kuò)散。因此，此處的雙向擴(kuò)散是指由于至少兩個(gè)反應(yīng)混合物至少一種反應(yīng)條件的變化所導(dǎo)致的所得結(jié)果中的至少一種變化。例如，兩個(gè)反應(yīng)混合物的體積總量也有些微的不同。
在一些特殊例子中，生物體由于某些疾病或治療而使內(nèi)共生細(xì)胞器核酸和/或其基因產(chǎn)物的相對比率結(jié)果中的雙向擴(kuò)散超出了變化值。例如，病毒聚合酶抑制劑經(jīng)常用于HIV的治療。病毒聚合酶抑制劑也對線粒體聚合酶γ有影響。因而在所述的HIV治療期間，線粒體聚合酶γ會減少，導(dǎo)致每個(gè)細(xì)胞中的線粒體數(shù)量減少。如果線粒體減少50％就會產(chǎn)生副作用。因子2會降低線粒體DNA與細(xì)胞核DNA的比率。然而，在一些案例中，由于提到的條件的變化，因子2所引起的線粒體DNA的減少能包括所述比率測量中的雙向擴(kuò)散。因此由于結(jié)果中的雙向擴(kuò)散，這種生物學(xué)上的線粒體的重要差異不一定能檢測到。所以一些實(shí)例中的雙向擴(kuò)散會降低核酸和/或它們的基因產(chǎn)物的比率中生物學(xué)上重要的差異的檢測的可靠性。因此，本發(fā)明的一種實(shí)施方案提供了結(jié)果中沒有雙向擴(kuò)散時(shí)測定細(xì)胞生物體功能的方法，包含測定來自所述生物體來源的樣品中內(nèi)共生細(xì)胞器核酸和/或它的基因產(chǎn)物與另一種內(nèi)共生細(xì)胞器核酸和/或它的基因產(chǎn)物的相對比率。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)中測定比率可以防止雙向擴(kuò)散。這意味著處理步驟和/或至少兩種核酸和/或它的基因產(chǎn)物的定量都在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明，實(shí)驗(yàn)通常使用一種反應(yīng)混合物。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中的各個(gè)組分在所述的測定中最好隨機(jī)地混合。所述的反應(yīng)混合物可以放在一個(gè)反應(yīng)管中。
然而，本領(lǐng)域的人員可以想更多的方法來防止結(jié)果中的雙向擴(kuò)散。例如他/她可以使用一種用(半)透膜分隔為不同部分的反應(yīng)容器。只要一種反應(yīng)條件隨所述的不同部分而變化，則雙向擴(kuò)散就可避免而且所得的結(jié)果也更精確。
在當(dāng)前這個(gè)發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)實(shí)驗(yàn)中至少擴(kuò)增兩個(gè)靶序列。所述的兩個(gè)靶序列可以是所述的內(nèi)共生細(xì)胞器核酸和所述的第二種核酸。因而當(dāng)前這個(gè)發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供的發(fā)明方法包含在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)增所述的內(nèi)共生細(xì)胞器核酸和所述的第二種核酸。當(dāng)在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增至少兩個(gè)靶序列時(shí)，所述實(shí)驗(yàn)中反應(yīng)條件的改變能獨(dú)立地影響所述的實(shí)驗(yàn)中每個(gè)序列的獲得量。例如所述的實(shí)驗(yàn)中得到的每個(gè)序列的量將受到同樣的溫度，同樣的總體積等的影響。然后利用兩個(gè)特異探針在擴(kuò)增反應(yīng)期間擴(kuò)增核酸產(chǎn)生過程中檢測所述的兩個(gè)靶序列。所述的兩個(gè)探針可以分別加上兩個(gè)能區(qū)分這兩個(gè)探針、從而能區(qū)分兩個(gè)不同序列的標(biāo)記。可通過把檢出陽性的時(shí)間與兩個(gè)實(shí)時(shí)擴(kuò)增反應(yīng)的相對的熒光增加值結(jié)合來進(jìn)行定量。優(yōu)選地在此之前先做好參考曲線。然后通過比較獲得的數(shù)值與參考值對所述核酸進(jìn)行定量。因此不需要一種內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)如競爭性分子。在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)中的兩個(gè)靶核酸的比較定量比兩個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中的定量準(zhǔn)確性高，而且所需的操作時(shí)間和試劑量都少。我們發(fā)現(xiàn)同一管中兩個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)為兩個(gè)靶核酸的比率提供了立即的指征。兩個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)的條件是相同的，排除了條件的變化，而且也不需要使用內(nèi)部或外部的校準(zhǔn)器。因此，就避免了結(jié)果中的雙向擴(kuò)散。所以，一方面，本發(fā)明提供了一種方法，其中的相對比率直接由一種核酸的量除另一種來確定。優(yōu)選地，所述的相對比率通過與參考值比較之后確定。根據(jù)本發(fā)明，直接確定是指兩個(gè)靶核酸的比率能立即指示出來，例如通過比較所述的兩個(gè)用不同熒光標(biāo)記的特異性探針的強(qiáng)度來確定。在這個(gè)實(shí)施方案中，一種核酸的量除另一種就是一種核酸的相應(yīng)的熒光強(qiáng)度除另一種的熒光強(qiáng)度。本發(fā)明方法中沒有使用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，其中所述的相對比率是直接確定的。
一方面，本發(fā)明中所述的細(xì)胞器核酸，它的基因產(chǎn)物，第二種核酸和/或其基因產(chǎn)物取自外周血單核細(xì)胞(PBMC)和/或成纖維細(xì)胞。本發(fā)明提供的一種方法，特別是單核細(xì)胞在使用時(shí)是首選，因?yàn)槟菢拥脑捑湍苁褂盟錾矬w的血液樣品。血樣易得而且量大，所以在優(yōu)選的實(shí)施方案中提供的方法中所使用的樣品包含了血樣。
本發(fā)明的方法對于定量一種含量可變的靶核酸和/或其基因產(chǎn)物與一種含量穩(wěn)定的靶核酸和/或其基因產(chǎn)物是特別有用的。一個(gè)例子是含量可變的線粒體DNA和含量穩(wěn)定的核基因的DNA(每個(gè)二倍體細(xì)胞有兩套)的定量。另一個(gè)例子包含了可變表達(dá)的RNA如線粒體RNA與細(xì)胞存活必需的組成性表達(dá)的RNA如編碼參與剪切的SNRPU1A或者其它廣泛存在的核DNA來源的必需核酸的定量。我們發(fā)現(xiàn)我們能夠測定因子2 à3的相對比率。
一方面，本發(fā)明提供了一種發(fā)明方法，其中所述的第一種核酸包含了RNA，而且第二種核酸包含了DNA。本發(fā)明方法特別適合于如線粒體RNA的細(xì)胞含量與核基因如U1的細(xì)胞含量的定量。如實(shí)施例22所示。
而且，本發(fā)明提供了一種診斷試劑盒，其包含至少一種根據(jù)本發(fā)明來使用這個(gè)方法的方式，所述的試劑盒包含至少一種與內(nèi)共生細(xì)胞器相關(guān)或來源于內(nèi)共生細(xì)胞器的核酸擴(kuò)增和檢測用的選擇性引物或探針，以及(如果需要)必需的擴(kuò)增試劑，如詳細(xì)的說明書中例證中或本專業(yè)其它地方所顯示的那些。特別的，本發(fā)明提供了一種診斷試劑盒，其中所述的試劑盒包含為細(xì)胞器相關(guān)的核酸序列擴(kuò)增所設(shè)計(jì)的一種以上的引物或探針，優(yōu)選地補(bǔ)充了為染色體相關(guān)的核酸擴(kuò)增所設(shè)計(jì)的引物或探針，如SNRP特異引物或探針。尤其本發(fā)明還提供了一種試劑盒，包含至少一種表1中用于擴(kuò)增細(xì)胞器核酸序列引物或探針。毫無疑問優(yōu)選地，試劑盒提供的所述的擴(kuò)增試劑包含了如PCR或NASBA擴(kuò)增所需的具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的酶。當(dāng)然試劑盒包含了一種檢測基因產(chǎn)物而非核酸的方式，在此還提供了本發(fā)明的方法的用途。
此外，本發(fā)明還提供了可依據(jù)本發(fā)明方法獲得或檢測的化合物在制備藥物、除草劑、殺蟲劑、抗寄生蟲藥物、增殖抑制劑等中的用途以及可依據(jù)本發(fā)明方法獲得、衍生或鑒定的藥物、除草劑、殺蟲劑、抗寄生蟲藥物等。
在詳細(xì)的說明書中對本發(fā)明進(jìn)行了更進(jìn)一步的解釋，其中大多數(shù)實(shí)施例是由測試線粒體這一細(xì)胞中的能量供應(yīng)和使用中心的例子指示的。不過，很容易理解這一原理在檢測其他內(nèi)共生細(xì)胞器如葉綠體(植物細(xì)胞的碳水化合物供應(yīng)中心)時(shí)也是一樣的。
實(shí)施例所用的成分和一般方法表1中總結(jié)了實(shí)施例中用到的引物和探針。標(biāo)準(zhǔn)的NASBA核酸擴(kuò)增反應(yīng)反應(yīng)體積為20μl、反應(yīng)體系包括40mM Tris-pH8.5、70mMKCl、12mM MgCl2、5mM二硫蘇糖醇、1mM dNTP(每種)、2mMrNTP(每種)、0.2μM引物(每種)、0.05μM分子信號、375mM山梨醇，0.105μg/μl牛血清白蛋白，6.4單位的AMV RT、32單位的T7 RNA聚合酶，0.08單位的RNAse H和加入的核酸。除了酶、山梨醇和/或牛血清白蛋白之外其它的混合之后，在加入到酶混合物之前先在65℃加熱2分鐘，以使RNA中的二級結(jié)構(gòu)變性，引物與模板退火。把混合物冷卻到41℃，然后加入酶。在一種熒光計(jì)(CytoFluor2000)中41℃擴(kuò)增90min，而且測定每分鐘的熒光信號(用濾光片組在530/25nm和485/30nm測定)。如果擴(kuò)增DNA靶序列，則把變性溫度改為95℃，變性時(shí)間從2min變?yōu)?min。
為了實(shí)現(xiàn)量化，一系列稀釋的靶序列用一套特殊的引物擴(kuò)增，而且反應(yīng)變?yōu)殛栃缘臅r(shí)間點(diǎn)(檢出陽性的時(shí)間(TTP))對加入的核酸量繪圖。這樣就得到了校準(zhǔn)曲線，如果輸入的核酸量未知，就可根據(jù)反應(yīng)的TTP值從曲線上推知輸入量。圖1顯示了RNA和DNA量化的典型標(biāo)準(zhǔn)曲線的例子。
對一些靶序列來說，沒有能確定拷貝數(shù)可靠的絕對數(shù)量的可用的稀釋系列。給出的那些系列是一些測量所得的任意單位而不是DNA或RNA拷貝數(shù)如細(xì)胞等效的或者ET-單位。結(jié)果有時(shí)與我們期望的相反，好象RNA少于DNA。
細(xì)胞(成纖維細(xì)胞和PBMC)在本領(lǐng)域人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中按標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行培養(yǎng)，并按實(shí)施例中所定義的加入藥物或可能有毒性或刺激作用的化合物。按Boom等人所描述的方法從細(xì)胞中分離核酸(Boom R、Sol C J、Salimans M M、Jansen C L、Wertheim-van DillenP M、van der Noordaa J、1990.Rapid and simple method for purificationof nucleic acids.J Clin Microbiol；28(3)495-503)或者用從Qiagen(Qiagen GmbH、Max Volmer Strasse 4、40724 Hilden、Germany)購買的分離專用試劑盒，按制造者的操作手冊進(jìn)行核酸的分離。取少量的分離的核酸液體用瓊脂糖凝膠電泳分析，剩余的儲存在-80℃，以待進(jìn)一步的分析所用。通常核酸用水稀釋10倍后取5μl用于NASBA擴(kuò)增反應(yīng)。
實(shí)施例1
在這一實(shí)施例中，說明了根據(jù)本發(fā)明中的方法可以測量哪種比率以及這些比率在診斷上的意義例如本發(fā)明提供了測定細(xì)胞器DNA與染色體DNA相對比率的方法。當(dāng)這個(gè)比率與正常值相比或至少在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)測定了這個(gè)比率時(shí)，那這個(gè)比率就表明每個(gè)細(xì)胞中細(xì)胞器的減少或增加。本發(fā)明也提供了確定細(xì)胞器RNA與染色體編碼的RNA比率的方法。當(dāng)這個(gè)比率與正常值相比或至少在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)測定了這個(gè)比率時(shí)，那這個(gè)比率就表明每個(gè)細(xì)胞中細(xì)胞器轉(zhuǎn)錄活動的減少或增加，使細(xì)胞的活動狀態(tài)(即轉(zhuǎn)錄狀態(tài))標(biāo)準(zhǔn)化。
還提供了細(xì)胞器RNA與染色體DNA比率的測定方法。當(dāng)這個(gè)比率與正常值相比或至少在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)測定了這個(gè)比率時(shí)，那這個(gè)比率就表明每個(gè)細(xì)胞中細(xì)胞器轉(zhuǎn)錄活動的減少或增加。
也提供了細(xì)胞器DNA與細(xì)胞器RNA比率的測定方法。當(dāng)這個(gè)比率與正常值相比或至少在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)測定了這個(gè)比率時(shí)，那這個(gè)比率就表明每個(gè)細(xì)胞中細(xì)胞器轉(zhuǎn)錄活動的減少或增加，顯示為了實(shí)現(xiàn)某個(gè)mRNA(并且從而蛋白)水平而在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行的調(diào)控。
也提供了細(xì)胞器DNA與染色體編碼的RNA比率的測定方法。當(dāng)這個(gè)比率與正常值相比或至少在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)測定了這個(gè)比率時(shí)，那這個(gè)比率就表明細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄活動的減少或增加，與染色體RNA的轉(zhuǎn)錄水平有關(guān)，顯示了細(xì)胞器的活動狀態(tài)。當(dāng)測定的染色體RNA編碼細(xì)胞器蛋白或其它組分時(shí)，這種方法格外有用。
實(shí)施例2成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)4周，培養(yǎng)基中分別加入抗病毒藥物DDC、AZT和D4T，每一種兩個(gè)濃度，分別是3μM和30μM。以在細(xì)胞培養(yǎng)物加入溴乙錠和細(xì)胞培養(yǎng)物中不加藥物作為對照。已知溴乙錠可以完全耗盡細(xì)胞中的線粒體，所以作為對細(xì)胞中的線粒體含量有影響的陽性對照。每隔一星期，收獲部分細(xì)胞并按所述的NASBA操作分析其線粒體DNA(引物MtD p1和MtD p2以及探針MtD mb)和染色體DNA(引物SnrpD p1和SnrpD p2以及探針SnrpD mb)的量。在4周的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，加了AZT、D4T和沒有添加物的培養(yǎng)物的線粒體DNA與染色體DNA的比率沒有表現(xiàn)出可測量的變化。加了溴乙錠的細(xì)胞中線粒體DNA的量如預(yù)期的那樣降低了。DDC的結(jié)果見圖2。
圖2中的數(shù)據(jù)清楚地表明每個(gè)細(xì)胞中線粒體DNA的數(shù)量減少了至少2個(gè)對數(shù)值，因此證明了抗病毒藥物DDC的線粒體毒性。
實(shí)施例3成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)4周，培養(yǎng)基中分別加入抗病毒藥物DDC、AZT和D4T，每一種兩個(gè)濃度，分別是3μM和30μM。以在細(xì)胞培養(yǎng)物加入溴乙錠和細(xì)胞培養(yǎng)物中不加藥物作為對照。已知溴乙錠可以完全耗盡細(xì)胞中的線粒體，所以作為對細(xì)胞中的線粒體含量有影響的陽性對照。每隔一星期，收獲部分細(xì)胞并按所述的NASBA操作分析其線粒體RNA(引物MtR p1和MtR p2以及探針MtR mb)和染色體編碼的RNA(引物SnrpR p1和SnrpR p2以及探針SnrpRmb)。在4周的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，加了AZT、D4T和沒有添加物的培養(yǎng)物的線粒體RNA與染色體RNA的比率沒有表現(xiàn)出可測量的變化。如所預(yù)期，加了溴乙錠的細(xì)胞中線粒體RNA的量降低了。DDC的結(jié)果見圖3。圖3中的數(shù)據(jù)清楚地表明每個(gè)細(xì)胞中線粒體RNA的數(shù)量減少了至少2個(gè)對數(shù)值，因此證明了抗病毒藥物DDC的線粒體毒性。三周的時(shí)間點(diǎn)所對應(yīng)的比率非常低，推測可能是逸出值(outliermeasurement)。
實(shí)施例4成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)4周，培養(yǎng)基中分別加入抗病毒藥物DDC、AZT和D4T，每一種兩個(gè)濃度，分別是3μM和30μM。以在細(xì)胞培養(yǎng)物加入溴乙錠和細(xì)胞培養(yǎng)物中不加藥物作為對照。已知溴乙錠可以完全耗盡細(xì)胞中的線粒體，所以作為對細(xì)胞中的線粒體含量有影響的陽性對照。每隔一星期，收獲部分細(xì)胞并按所述的NASBA操作分析其線粒體RNA(引物MtR p1和MtR p2以及探針MtR mb)和染色體DNA(引物SnrpD p1和SnrpD p2以及探針SnrpD mb)的量。
在4周的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，加了AZT、D4T和沒有添加物的培養(yǎng)物的線粒體RNA與染色體DNA的比率沒有表現(xiàn)出可測量的變化。如預(yù)期的那樣，加了溴乙錠的細(xì)胞中線粒體RNA的量降低了。DDC的結(jié)果見圖4。
圖4中的數(shù)據(jù)清楚地表明每個(gè)細(xì)胞中線粒體RNA的數(shù)量減少了至少2個(gè)對數(shù)值，因此證明了抗病毒藥物DDC的線粒體毒性。三周的時(shí)間點(diǎn)所對應(yīng)的比率非常低，推測可能是逸出值。
實(shí)施例5成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)4周，培養(yǎng)基中分別加入抗病毒藥物DDC、AZT和D4T，每一種兩個(gè)濃度，分別是3μM和30μM。以在細(xì)胞培養(yǎng)物加入溴乙錠和細(xì)胞培養(yǎng)物中不加藥物作為對照。已知溴乙錠可以完全耗盡細(xì)胞中的線粒體，所以作為對細(xì)胞中的線粒體含量有影響的陽性對照。每隔一星期，收獲部分細(xì)胞并按所述的NASBA操作分析其線粒體RNA(引物MtR p1和MtR p2以及探針MtR mb)和線粒體DNA(引物MtD p1和MtD p2以及探針MtD mb)的量。
在4周的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，加了AZT、D4T和沒有添加物的培養(yǎng)物的線粒體RNA與線粒體DNA的比率沒有表現(xiàn)出可測量的變化。如預(yù)期的那樣，加了溴乙錠的細(xì)胞中線粒體RNA的量降低了。DDC的結(jié)果見圖5。
圖5中的數(shù)據(jù)清楚地表明每個(gè)細(xì)胞中線粒體RNA的數(shù)量減少了至少2個(gè)對數(shù)值，因此證明了抗病毒藥物DDC的線粒體毒性。三周的時(shí)間點(diǎn)所對應(yīng)的比率非常低，推測可能是逸出值。
實(shí)施例6成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)4周，培養(yǎng)基中分別加入抗病毒藥物DDC、AZT和D4T，每一種兩個(gè)濃度，分別是3μM和30μM。以在細(xì)胞培養(yǎng)物加入溴乙錠和細(xì)胞培養(yǎng)物中不加藥物作為對照。已知溴乙錠可以完全耗盡細(xì)胞中的線粒體，所以作為對細(xì)胞中的線粒體含量有影響的陽性對照。每隔一個(gè)星期，收獲部分細(xì)胞并按所述的NASBA操作分析其染色體編碼的RNA(引物SnrpR p1和SnrpR p2以及探針SnrpR mb)和染色體DNA(引物SnrpD p1和SnrpD p2以及探針SnrpD mb)的量。
在4周的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，加了AZT、D4T和沒有添加物的培養(yǎng)物的線粒體RNA與線粒體DNA的比率沒有表現(xiàn)出可測量的變化。如預(yù)期的那樣，加了溴乙錠的細(xì)胞中線粒體RNA的量降低了。DDC的結(jié)果見圖6。
圖6中的數(shù)據(jù)清楚地表明染色體DNA與RNA的比率在4周的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)沒有顯著的變化。
實(shí)施例7成纖維細(xì)胞在抗病毒藥物DCC存在的條件下體外培養(yǎng)4周，DCC的濃度為30μM。之后細(xì)胞在沒有DCC的條件下繼續(xù)培養(yǎng)。在沒有DCC的培養(yǎng)期間，12周每隔兩個(gè)星期，收獲部分細(xì)胞并按所述的NASBA操作分析其線粒體DNA(引物MtD p1和MtD p2以及探針MtD mb)和染色體DNA(引物SnrpD p1和SnrpD p2以及探針SnrpD mb)的量。分析結(jié)果見圖7。
圖7的結(jié)果清楚地表明當(dāng)DCC從培養(yǎng)物中移開后，每個(gè)細(xì)胞中線粒體的量增加2個(gè)對數(shù)值以上。這個(gè)結(jié)果說明如果細(xì)胞中仍有一些線粒體能在新長出的細(xì)胞中重新聚集的話，DDC的毒性效應(yīng)可以逆轉(zhuǎn)。
實(shí)施例8成纖維細(xì)胞在抗病毒藥物DCC存在的條件下體外培養(yǎng)4周，DCC的濃度為30μM。之后細(xì)胞在沒有DCC的條件下繼續(xù)培養(yǎng)。在沒有DCC的培養(yǎng)期間，12周每隔兩個(gè)星期，收獲部分細(xì)胞并按所述的NASBA操作分析其線粒體RNA(引物MtR p1和MtR p2以及探針MtR mb)和染色體編碼的RNA(引物SnrpR p1和SnrpR p2以及探針SnrpR mb)。分析結(jié)果如圖8所示。
圖7的結(jié)果清楚地表明當(dāng)DCC從培養(yǎng)物中移開后，每個(gè)細(xì)胞中線粒體RNA的量增加2個(gè)對數(shù)值以上。這個(gè)結(jié)果說明DDC的毒性效應(yīng)可以逆轉(zhuǎn)而且通過RNA和隨后的蛋白合成線粒體的功能也得到恢復(fù)。
實(shí)施例9取自健康的供血者的新鮮的外周血單核細(xì)胞(PBMC)體外培養(yǎng)5天，培養(yǎng)液中加入抗病毒藥物DDC、AZT和D4T，每一種兩個(gè)濃度，分別為6μM和60μM。對照是在細(xì)胞培養(yǎng)物加入DMSO和不加藥物的細(xì)胞培養(yǎng)物。DMSO是溶解藥物的溶劑的一部分。5天后收集細(xì)胞并按所述的NASBA操作分析線粒體DNA(引物MtD p1和MtD p2以及探針MtD mb)和染色體DNA(引物SnrpD p1和SnrpD p2以及探針SnrpD mb)的量。
在5天的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，加了AZT、D4T、DMSO和沒有添加物的培養(yǎng)物的比率沒有表現(xiàn)出可測量的變化。DDC的結(jié)果見圖9。
圖9的結(jié)果清楚地表明在5天的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，每個(gè)PBMC的線粒體DNA的量減少1對數(shù)值以上。
實(shí)施例10取自健康的供血者的新鮮的外周血單核細(xì)胞(PBMC)體外培養(yǎng)5天，培養(yǎng)液中加入抗病毒藥物DDC、AZT和D4T，每一種兩個(gè)濃度，分別為6μM和60μM。對照是在細(xì)胞培養(yǎng)物加入DMSO和不加藥物的細(xì)胞培養(yǎng)物。DMSO是溶解藥物的溶劑的一部分。5天后收集細(xì)胞并按所述的NASBA操作分析線粒體RNA(引物MtR p1和MtR p2以及探針MtR mb)和染色體編碼的RNA(引物SnrpR p1和SnrpR p2以及探針SnrpR mb)的量。
在5天的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，加了AZT、D4T、DMSO和沒有添加物的培養(yǎng)物的比率沒有表現(xiàn)出可測量的變化。DDC的結(jié)果見圖10。有趣的是，在5天的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，在最高的DCC濃度下，圖10的結(jié)果沒有清楚地顯示出每個(gè)PBMC的線粒體RNA的量有所減少。這與實(shí)施例9所示的線粒體DNA的結(jié)果相反?？赡苻D(zhuǎn)錄的增加補(bǔ)償了線粒體DNA的減少，從而維持了線粒體RNA的水平。這個(gè)機(jī)制延遲了線粒體RNA的減少。
因此，可以說線粒體RNA是線粒體功能當(dāng)時(shí)狀態(tài)的一種反應(yīng)，而且線粒體DNA是線粒體功能(不遠(yuǎn)的)將來會出現(xiàn)的問題的一種前兆，因而線粒體DNA更有預(yù)測性。
實(shí)施例11用引物和探針Rubisco-DNA p1、Rubisco-DNA p2、Rubisco-DNAMB、Rubisco-RNA p1、Rubisco-RNA p2和Rubisco-RNA-MB(表1)能定量Oryza sativum(水稻)葉綠體的DNA和RNA，而且用引物和探針OryzaDNA p1、OryzaDNA p2、OryzaDNA mb、OryzaRNA p1、OryzaRNA p2、OryzaRNA mb(表1)能測定染色體DNA和RNA的比率。在應(yīng)用除草劑(或其它)化合物時(shí)，可以用PCR和NASBA這樣的本領(lǐng)域人員熟知的擴(kuò)增方法測定細(xì)胞葉綠體核酸的含量來評估植物的情況。同時(shí)，使用草特異的一套引物可以監(jiān)測不必要的植物的破壞情況。顯然這些分子工具對于研究新的除草劑特別是只特異地攻擊一種植物而對其它沒有損害的除草劑非常適合。
實(shí)施例12
在這一實(shí)施例中，DNA靶序列的NASBA核酸擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體積為20μl，并且反應(yīng)體系還包括40mM Tris-pH8.5、70mM KCl、12mM MgCl2、5mM二硫蘇糖醇、1mM dNTP(每種)、2mM rNTP(每種)、0.2μM引物(每種)、0.05μM分子信號、1.5單位限制性內(nèi)切酶MspI、375mM山梨醇，0.105μg/μl牛血清白蛋白、6.4單位AMV RT、32單位T7 RNA聚合酶、0.08單位RNAse H以及加入的核酸。除了酶、山梨醇和/或牛血清白蛋白之外其它的混合之后，在加入到酶混合物之前先在37℃孵育25min，隨后95℃變性2min，以使DNA變性從而可使引物與模板退火。把混合物冷卻到41℃，然后加入酶。在一種熒光計(jì)(CytoFluor 2000)中41℃擴(kuò)增90min，而且測定每分鐘的熒光信號(用濾光片組在530/25nm和485/30nm出測定)。如果擴(kuò)增DNA靶序列，則把變性溫度改為95℃，變性時(shí)間從2min變?yōu)?min。為了實(shí)現(xiàn)量化，用一套特定的引物擴(kuò)增一系列稀釋的靶序列，而且反應(yīng)變?yōu)殛栃缘臅r(shí)間點(diǎn)(檢出陽性的時(shí)間(TTP))對加入的核酸量繪圖。這樣就得到了校準(zhǔn)曲線，如果輸入的核酸量未知，就可根據(jù)反應(yīng)的TTP值從曲線上推知輸入量。圖1顯示了RNA和DNA量化的典型標(biāo)準(zhǔn)曲線的例子。為了定量，系列稀釋的靶序列用特異的引物組擴(kuò)增而且用反應(yīng)到達(dá)陽性的時(shí)間點(diǎn)(檢出陽性的時(shí)間(TTP))與輸入的核酸量作圖。來自健康供血者的新鮮的外周血單核細(xì)胞(PBMC)體外培養(yǎng)5天。5天后收集細(xì)胞并用“所用成分與一般方法”部分中描述的NASBA方法來分析染色體DNA(引物SnrpDp1和SnrpD2 p2以及探針SnrpD mb)的量，并與這個(gè)例子中的NASBA方法所得的結(jié)果進(jìn)行比較如圖11中可以清楚地看到的那樣，在DNANASBA反應(yīng)前用內(nèi)切酶進(jìn)行預(yù)處理比沒有處理的效果好得多。其原理是從p1引物的T7啟動子部分產(chǎn)生的MspI的直接延伸。
實(shí)施例13用引物和探針tRNA-L-D p1、tRNA-L-D p2、tRNA-L-D MB、petBRNA p1、petB RNA p2和petB RNA MB(表1)能定量Oryza sativum(水稻)的葉綠體DNA和RNA，而且用引物和探針OryzaDNA p1、OryzaDNA p2、OryzaDNA mb、OryzaRNA p1、OryzaRNA p2、OryzaRNA mb(表1)能測定染色體DNA和RNA的比率。在應(yīng)用除草劑(或其它)化合物時(shí)，可以用PCR和NASBA這樣的本領(lǐng)域人員熟知的擴(kuò)增方法測定細(xì)胞葉綠體核酸的含量來評估植物的情況。同時(shí)，使用草特異的一套引物可以檢測不必要的植物的破壞情況。顯然這些分子工具對于研究新的除草劑特別是只特異地攻擊一種植物而對其它沒有損害的除草劑非常適合。
實(shí)施例14包含Snrp DNA的上千個(gè)質(zhì)粒與4×105、2×105、105、5×104、2.5×104或104包含線粒體DNA的質(zhì)粒分子混合，并作為反應(yīng)的輸入核酸。反應(yīng)體系與實(shí)施例12中的相似，只是用來在一管中擴(kuò)增Snrp-核和線粒體DNA的引物和信號有所不同。反應(yīng)混合物(二重混合)包括了兩套引物和信號SnrpD p1和SnrpD p2、MtD p1-2和MtD p2-2(每種0.2μM)以及信號SnrpD mb(ROX-標(biāo)記)和MtD mb-2(FAM-標(biāo)記)(每種0.05μM)。限制性酶消化，擴(kuò)增和檢測與實(shí)施例12中的相同。熒光計(jì)的濾光片組(CytoFluor 2000)適于同時(shí)檢測FAM和ROX-標(biāo)記(FAM在485/20和530/25nm處；ROX是590/20和645/40nm)。在兩個(gè)競爭性擴(kuò)增的同步反應(yīng)中，對應(yīng)時(shí)間的熒光曲線的斜率與每個(gè)擴(kuò)增的物種中分子的數(shù)量成比例(見圖12)。
實(shí)施例15分別在沒有和加入了5μM DDC的條件下培養(yǎng)PBMC。培養(yǎng)5天后取樣。按照Boom等人的方法從105個(gè)PBMC細(xì)胞中分離核酸，并用50μl不含有DNAse和RNAse的水溶解。然后分別稀釋10倍和100倍，并從中各取5μl稀釋液(分別相當(dāng)于1000個(gè)或者100個(gè)PBMC細(xì)胞)加到反應(yīng)混合物中去擴(kuò)增特異的靶核酸。同樣的，包含SnrpDNA的103個(gè)質(zhì)粒分子與包含線粒體DNA的4×105、2×105、105或5×104個(gè)質(zhì)粒分子混合，然后加到反應(yīng)混合物中。反應(yīng)體系與實(shí)施例12中的相似，只是用來在一管中擴(kuò)增Snrp-核和線粒體DNA的引物和信號有所不同。反應(yīng)混合物(二重混合)包括了兩套引物和信號SnrpD p1和SnrpD p2、MtD p1-2和MtD p2-2(每種0.2μM)以及信號SnrpD mb(ROX-標(biāo)記)和MtD mb-2(FAM-標(biāo)記)(每種0.05μM)。限制性酶消化，擴(kuò)增和檢測與實(shí)施例12中的相同。熒光計(jì)的濾光片組(CytoFluor 2000)適于同時(shí)檢測FAM和ROX-標(biāo)記(FAM在485/20和530/25nm處；ROX是在590/20和645/40nm)。在兩個(gè)競爭性擴(kuò)增的同步反應(yīng)中，對應(yīng)時(shí)間的熒光曲線的斜率與每種擴(kuò)增的物種中分子的數(shù)量成比例。質(zhì)粒Snrp/線粒體DNA混合物的數(shù)據(jù)用來做標(biāo)準(zhǔn)曲線，從曲線上可以估計(jì)存在和不存在5μM ddC條件下的PBMC樣品稀釋10倍和100倍后，其中線粒體與Snrp核DNA的比率(見圖13)。
實(shí)施例16從一個(gè)死于重癥乳酸性酸中毒的HIV-1感染的病人的血中抽取了4個(gè)血液樣品，并分析了其外周血單核細(xì)胞(PBMC)中的線粒體含量。樣品1取自病人死前1年，樣品2取自死前3個(gè)月，樣品3取自死前1.5個(gè)月，而樣品4則是在病人剛剛死去的時(shí)候取的。用Ficoll-Isopaque純化方法從血中制備外周血單核細(xì)胞(PBMC)。用加了5％DMSO的培養(yǎng)液凍存PBMC細(xì)胞，并保存在液氮中。用Boom的方法從10PBMC中提取核酸。相當(dāng)于105個(gè)PBMC細(xì)胞的核酸用作測定線粒體DNA(引物MtD p1和MtD p2以及探針MtD mb)和染色體DNA(引物SnrpD p1和SnrpD p2以及探針SnrpD mb)的NASBA的輸入核酸。引物和探針序列見表1。這個(gè)分析的結(jié)果表示為每個(gè)染色體DNA拷貝的線粒體DNA拷貝數(shù)(見圖14)。這一實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表示為每個(gè)染色體DNA拷貝的線粒體DNA拷貝數(shù)(見圖14)。
實(shí)施例17本實(shí)施例中分析了質(zhì)粒中的線粒體和染色體DNA靶序列的不同比率包括了2×103U1a DNA/8×103Mt DNA、2×103U1a DNA/2×104MtDNA、2×103U1aDNA/4×104MtDNA、2×103U1aDNA/105MtDNA、2×103U1a DNA/2×105Mt DNA、2×103U1a DNA/4×105Mt DNA和2×103U1a DNA/8×105MtDNA分子。反應(yīng)混合體系的制備與實(shí)施例12中的相似，只是在同一管中擴(kuò)增染色體和線粒體DNA所用的引物和信號不同。反應(yīng)混合物(二重混合)包含兩套引物和信號SnrpD P1和SnrpD2 P2(第一套引物，每種0.2μM)、MtD P1-2和MtD P2-2(第二套引物，每種0.3μM)、以及SnrpD mb-2(FAM-標(biāo)記的)和MtD mb-3(ROX-標(biāo)記的)(每種0.04μM)。引物和信號序列見表1。限制性酶消化、擴(kuò)增和檢測與實(shí)施例12中的相同。熒光計(jì)的濾光片組(CytoFluor2000)適于同時(shí)檢測FAM和ROX-標(biāo)記(FAM在485/20和530/25nm處；ROX是在590/20和645/40nm)。在兩個(gè)競爭性擴(kuò)增的同步反應(yīng)中，對應(yīng)時(shí)間的熒光曲線的斜率與每個(gè)擴(kuò)增的物種中分子的數(shù)量成比例。結(jié)果見圖16。FAM和ROX信號的斜率系數(shù)之間的關(guān)系與輸入的線粒體DNA和染色體DNA的比率呈線相關(guān)。可以把這個(gè)結(jié)果作成校準(zhǔn)曲線，然后用這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的校準(zhǔn)曲線計(jì)算每個(gè)細(xì)胞內(nèi)線粒體DNA的拷貝數(shù)。
實(shí)施例18成纖維細(xì)胞在抗病毒藥物DDC(30μM)存在的條件下培養(yǎng)4周，之后分別在有和沒有DDC的條件下再繼續(xù)培養(yǎng)6周。在培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，收集部分細(xì)胞并用本領(lǐng)域人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法來分析乳酸-丙酮酸的比率。乳酸-丙酮酸比率的測定結(jié)果見圖17。
圖17中的數(shù)據(jù)清楚地表明DCC存在時(shí)，乳酸-丙酮酸的比率增加，不過只有在培養(yǎng)4周以后才觀察到非常明顯的增加。在存在DCC的繼續(xù)培養(yǎng)中細(xì)胞的乳酸-丙酮酸的比率保持高水平，而在培養(yǎng)4周后不再加入DCC的培養(yǎng)中乳酸-丙酮酸的比率降到了正常水平。
而且，我們還測定了與實(shí)施例17相同的樣品中線粒體DNA和染色體DNA的比率。結(jié)果如圖18所示。
圖18中的數(shù)據(jù)清楚地說明在DCC存在時(shí)，成纖維細(xì)胞的線粒體DNA丟失(頂部圖示中黑線的逐漸降低)。在DCC存在的條件下培養(yǎng)，兩周后就已經(jīng)觀察到線粒體含量的明顯降低，而在三周后幾乎見不到任何線粒體DNA了。與這些數(shù)據(jù)不同，傳統(tǒng)的乳酸-丙酮酸測定方法只有在四周后才能檢測到明顯的變化。這些結(jié)果清楚地表明測量線粒體DNA的含量能及時(shí)預(yù)言性地評價(jià)其對功能的影響。
在DDC存在的條件下繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)，線粒體DNA的量保持在非常低的水平上(底部左邊的兩個(gè)圖示)。而在沒有DDC的條件下繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)，成纖維細(xì)胞中線粒體DNA的量出現(xiàn)了明顯的反彈(底部右邊的兩個(gè)圖示)。
實(shí)施例19PBMC在有抗病毒藥物DDC(5μM)存在的條件下培養(yǎng)11天，而且以相應(yīng)濃度的藥物溶劑(DMSO)作為對照。在培養(yǎng)期間，每兩天就收集部分細(xì)胞并按實(shí)施例17所描述的那樣分析線粒體DNA和U1a DNA的比率。結(jié)果見圖19。
這個(gè)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)清楚地表明DCC存在情況下培養(yǎng)的PBMC細(xì)胞中線粒體DNA的含量迅速降低。與對照相比，DCC存在情況下培養(yǎng)的第二天PBMC細(xì)胞中線粒體DNA的含量就降到了20％。DCC存在情況下培養(yǎng)的第11天PBMC中線粒體DNA的拷貝數(shù)進(jìn)一步降低至檢測不到的水平。
實(shí)施例2048名HIV-1感染的病人分別使用AZT、AZT+ddI或AZT+ddC隨機(jī)的進(jìn)行抗病毒治療。在治療開始后0、4、24和48周抽取血樣。用Ficoll-Isopaque純化方法從血中制備外周血單核細(xì)胞。用加了5％DMSO的培養(yǎng)液凍存PBMC細(xì)胞，并在使用之前保存在液氮中。
用Boom的方法從105個(gè)PBMC提取核酸。相當(dāng)于1,000個(gè)PBMC的核酸按實(shí)施例17所描述的方法進(jìn)行單管實(shí)時(shí)二重NASBA，來測定線粒體和染色體DNA。分析結(jié)果表示為病人樣品中單個(gè)細(xì)胞(即PBMC)中線粒體的含量。表2對結(jié)果進(jìn)行了小結(jié)。
治療開始時(shí)病人PBMC的mtDNA含量與治療4、24和48周的mtDNA含量比較并分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變化(見表3和圖20和21)。這些數(shù)據(jù)清楚的表明進(jìn)行AZT+ddI或ddC治療的病人的PBMC的線粒體DNA含量有明顯的減少。
實(shí)施例21本實(shí)施例中分析了質(zhì)粒中的線粒體RNA和染色體DNA靶序列的不同比率包括了2×103U1a DNA/5×104Mt RNA、2×103U1aDNA/2.5×105Mt RNA、2×103U1a DNA/5×105Mt RNA、2×103U1aDNA/2.5×106Mt RNA、2×103U1a DNA/5×106Mt RNA、2×103U1aDNA/107Mt RNA、2×103U1a DNA/2.5×107Mt RNA分子。反應(yīng)混合體系的制備與實(shí)施例12中的相似，只是在同一管中擴(kuò)增染色體DNA和線粒體RNA所用的引物和信號不同。反應(yīng)混合物(二重混合)包含兩套引物和信號SnrpD P1和SnrpD2 P2(第一套引物，每種0.2μM)、MtR P1-2和MtR P2-2(第二套引物，每種0.3μM)，以及SnrpD mb-2(FAM-標(biāo)記的)和MtR mb-3(ROX-標(biāo)記的)(每種0.04μM)。引物和信號序列見表1。限制性酶消化、擴(kuò)增和檢測與實(shí)施例12中的相同。熒光計(jì)的濾光片組(CytoFluor 2000)適于同時(shí)檢測FAM和ROX-標(biāo)記(FAM在485/20和530/25nm處；ROX是在590/20和645/40nm)。在兩個(gè)競爭性擴(kuò)增的同步反應(yīng)中，對應(yīng)時(shí)間的熒光曲線的斜率與每個(gè)擴(kuò)增的物種中分子的數(shù)量成比例。結(jié)果見圖22。FAM和ROX信號的斜率系數(shù)之間的關(guān)系與輸入的線粒體RNA和染色體DNA的比率呈線相關(guān)?？梢园堰@個(gè)結(jié)果作成校準(zhǔn)曲線，然后用這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的校準(zhǔn)曲線計(jì)算每個(gè)細(xì)胞內(nèi)線粒體DNA的拷貝數(shù)。
實(shí)施例22
成纖維細(xì)胞在抗病毒藥物DDC(30μM)存在的條件下培養(yǎng)8周，之后分別在有和沒有DDC的條件下再繼續(xù)培養(yǎng)8周。在這段培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，在不同的時(shí)間點(diǎn)收集部分細(xì)胞并用實(shí)施例21中所描述的方法來分析線粒體RNA和染色體DNA的比率。結(jié)果見圖23。
圖23的數(shù)據(jù)清楚地表明在DDC存在的條件下繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)，成纖維細(xì)胞的線粒體RNA丟失，在DCC存在時(shí)，線粒體RNA保持一種非常低的量。而在沒有DDC的條件下繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)，成纖維細(xì)胞中線粒體RNA的量出現(xiàn)了明顯的反彈(時(shí)間點(diǎn)為10、12、14和16周)。
實(shí)施例23分析用抗病毒療法(AZT+ddI)進(jìn)行治療的2名HIV-1感染的病人(病人1和2)PBMC中線粒體RNA的含量。在治療開始后0、4、24和48周抽取血樣。用Ficoll-Isopaque純化方法從血中制備外周血單核細(xì)胞。用加了5％DMSO的培養(yǎng)液凍存PBMC細(xì)胞，并在使用前保存在液氮中。
用Boom的方法從105個(gè)PBMC細(xì)胞中提取核酸。用相當(dāng)于1,000個(gè)PBMC的核酸按實(shí)施例21所描述的方法進(jìn)行單管實(shí)時(shí)二重NASBA，來測定線粒體RNA和染色體DNA。測定的結(jié)果表示為每個(gè)細(xì)胞中的線粒體RNA(即PBMC)的含量。表4對結(jié)果進(jìn)行了小結(jié)。
在這項(xiàng)研究中病人1和2經(jīng)過治療(藥物和劑量)后，病人PBMC中的線粒體RNA含量似乎沒有明顯變化。目前的研究將包含更多的個(gè)體和不同的療法以便對包括核苷類似物在內(nèi)的治療所帶來的線粒體RNA的變化有一種更好的評價(jià)。
表1.實(shí)施例中使用的引物和探針


1引物P1序列中的T7啟動子部分以斜體字表示，分子信號探針的主體序列用粗體表示。分子信號序列的3′末端用DABCYL(淬滅劑)標(biāo)記，5′末端用6-FAM(熒光標(biāo)記)標(biāo)記。
表2.用不同的治療方案連續(xù)治療48周的病人PBMC中線粒體DNA的含量

表3.執(zhí)行不同治療方案的病人PBMC中線粒體DNA含量顯著變化的分析

表4用不同的治療方案連續(xù)治療48周的病人PBMC中線粒體RNA的含量

表5 HIV-1抑制劑核苷和核苷類似物的線粒體毒性摘自A.Carr，D A Cooper.Lancet 2000；356；1423-1430



圖1.DNA和RNA靶序列標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)施例。
圖2.DDC存在條件下培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中線粒體DNA和染色體DNA的比率。
圖3.DDC存在條件下培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中線粒體RNA和染色體編碼RNA的比率。
圖4.DDC存在條件下培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中線粒體RNA和染色體DNA的比率。
圖5.DDC存在條件下培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中線粒體RNA和線粒體DNA的比率。
圖6.DDC存在條件下培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中染色體編碼RNA和染色體DNA的比率。
圖7.DDC存在條件下培養(yǎng)4周后去掉DDC繼續(xù)培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中線粒體DNA和染色體DNA的比率。
圖8.DDC存在條件下培養(yǎng)4周后去掉DDC繼續(xù)培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中線粒體RNA和染色體編碼RNA的比率。
圖9.DDC存在條件下培養(yǎng)5天的PBMC中線粒體DNA和染色體DNA的比率。
圖10.DDC存在條件下培養(yǎng)5天的PBMC中線粒體RNA和染色體編碼RNA的比率。
圖11.加與不加限制性酶MspI預(yù)處理的SNRNP DNA NASBA反應(yīng)的比較。
圖12.包含Snrp DNA的1000個(gè)質(zhì)粒分子與4×105(A)、2×105(B)、105(C)、5×104(D)、2.5×104(E)或104(F)個(gè)帶有線粒體DNA的質(zhì)粒分子混合后不同反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的熒光。以擴(kuò)增的線粒體DNA分子與Snrp核DNA量的比率和相應(yīng)時(shí)間的熒光斜率比率繪制曲線(G)。
圖13.包含Snrp DNA的1000個(gè)質(zhì)粒分子與4×105(A)、2×105(B)、105(C)、5×104(D)個(gè)帶有線粒體DNA的質(zhì)粒分子混合后不同反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的熒光。以擴(kuò)增的線粒體DNA分子與Snrp核DNA量的比率和來源于圖A-D的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的熒光斜率比率繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(E)。F、G為沒有ddC的條件下培養(yǎng)的PBMC細(xì)胞稀釋10倍或100倍對應(yīng)的點(diǎn)；H、I則是在5μM ddC存在下培養(yǎng)的PBMC稀釋10倍或100倍對應(yīng)的點(diǎn)。在圖E中，正方形代表沒有ddC情況下培養(yǎng)的PBMC樣品，而菱形表示有5μM ddC存在下的PBMC樣品。
圖14.死于乳酸性酸中毒的HIV-1感染病人的四個(gè)PBMC血樣中每個(gè)染色體DNA拷貝中的線粒體DNA拷貝數(shù)。對時(shí)間點(diǎn)的進(jìn)一步解釋見說明書。
圖15A.HIV-1感染個(gè)體的CD4陽性細(xì)胞數(shù)和HIV-1 RNA拷貝數(shù)。X軸下方標(biāo)記了ddC和AZT的柱形表示用這些藥物治療的時(shí)間段。X-軸下面的4個(gè)箭頭表示分析PBMC樣品中線粒體DNA含量和乳酸-丙酮酸比率的時(shí)間點(diǎn)。在時(shí)間點(diǎn)4之后大約1個(gè)月病人死于乳酸性酸中毒。
圖15B.左邊的柱形圖顯示了PBMC樣品1到4的乳酸-丙酮酸比率。這些PBMC中沒有檢測到乳酸-丙酮酸比率的增加。右邊的柱形圖表明了PBMC樣品1到4的線粒體DNA含量。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中可以觀察到線粒體DNA的含量有明顯的降低。
圖16.使用線粒體DNA與染色體DNA的不同比率作為輸入值的ROX的熒光值(染色體DNA，灰線)和FAM熒光信號(線粒體DNA，黑線)。下部的圖顯示的是信號比率與RNA和DNA比率的線性關(guān)系。
圖17.成纖維細(xì)胞在ddC存在條件下培養(yǎng)4周后，分別在ddC存在和不存在的條件下繼續(xù)培養(yǎng)所測得的乳酸-丙酮酸比率。
圖18.ddC存在條件下培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的ROX熒光值(染色體DNA，灰線)和FAM熒光信號(線粒體DNA，黑線)。下面的圖顯示的是信號比率與RNA和DNA比率的線性關(guān)系。上部的圖從左向右為ddC存在下分別培養(yǎng)1、2、3和4周的結(jié)果。底部左側(cè)的兩個(gè)圖為ddC存在下分別培養(yǎng)7周和10周的結(jié)果。而底部右側(cè)的兩個(gè)圖是在沒有ddC的條件下繼續(xù)培養(yǎng)7周和10周的結(jié)果。
圖19.柱形圖表示了ddC不存在(點(diǎn)狀柱)和存在(條形柱)條件下培養(yǎng)的PBMC中的線粒體百分比。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處對照(DMSO)的線粒體DNA量設(shè)定為100％。
圖20.分別用AZT、AZT+ddI和AZT+ddC治療的8個(gè)病人小組中的線粒體DNA含量的降低。柱上的P顯示了與時(shí)間點(diǎn)零即治療開始的時(shí)間相比線粒體DNA含量的重大變化。
圖21.分別用AZT、AZT+ddI和AZT+ddC治療的3個(gè)病人中的線粒體DNA含量。
圖22.使用線粒體RNA與染色體DNA的不同比率作為輸入值的ROX的熒光值(染色體DNA，灰線)和FAM熒光信號(線粒體RNA，黑線)。下面的圖顯示的是信號比率與RNA和DNA比率的線性關(guān)系。
圖23.柱形圖表示了成纖維細(xì)胞在ddC存在條件下培養(yǎng)8周后，分別在ddC存在和不存在的條件下繼續(xù)培養(yǎng)到16周所測得的線粒體RNA的量。
圖24.因?yàn)楦弊饔枚淖兛鼓孓D(zhuǎn)錄病毒治療的病人的ATHENA研究。
圖25.DNA-NASBA擴(kuò)增圖示。
圖26.線粒體DNA遺傳圖譜中的兩個(gè)區(qū)域顯示了表1中所示的部分?jǐn)U增引物的位置。表1中其它的擴(kuò)增引物位于線粒體基因組的其它區(qū)域，沒有在圖中顯示。
參考文獻(xiàn)1.Saiki RK、Gelfand DH、Stoffel S、Scharf SJ、Higuchi R、HornGT、Mullis KB、Erlich HA使用耐熱DNA聚合酶進(jìn)行引物指導(dǎo)的DNA酶性擴(kuò)增.Science 239487-491、19882.Van Gemen B、van Beuningen R、Nabbe A、Van Strijp D、Jurriaans S、Lens P、Kievits T使用電化學(xué)發(fā)光(ECL)標(biāo)記的探針進(jìn)行單試管定量性HIV-1 RNA NASBA核酸擴(kuò)增分析.J.Virol.Methods 49157-167、19943.Heid CA、Stevens J、Livak KJ、Williams PM實(shí)時(shí)定量PCR.Genome Res.6986-994、19964.Tyagi S、Kramer FR分子信號雜交后發(fā)光的探針.Nat.Biotechnol.14303-308、19965.Leone G、van Schijndel H、Van Gemen B、Kramer FR、SchoenCD分子信號探針結(jié)合NASBA擴(kuò)增對RNA進(jìn)行同源實(shí)時(shí)測定.Nucleic Acide Res.262150-2155 19986.Piatak M、Luk KC、Williams B、Lifson JD用于精確定量HIV DNA和RNA的定量競爭PCR.Biotechniques 1470-81、19937.De Baar、MP、van Dooren、MW、de Rooij、E、Bakker、M、Van Gemen、B、Goudsmit、J、and de Ronde、A.單一快速實(shí)時(shí)監(jiān)測等溫RNA擴(kuò)增分析法以定量分析來自M、N和O組的HIV-1提取物.J.Clin.Microbiol.39(4)1378-1384、20018.Boom R、Sol CJ、Salimans MM、Jansen CL、Wertheim-vanKillen PM、van der NJ核酸純化的快速簡單方法.J.Clin.Microbiol.28495-503、1990
權(quán)利要求
1.測定細(xì)胞生物體功能的方法，其包含測定來源于所述生物體的樣品中的第一種內(nèi)共生細(xì)胞器核酸和/或其基因產(chǎn)物與第二種核酸和/或其基因產(chǎn)物的量的相對比率。
2.權(quán)利要求1的方法，其中測定第一種內(nèi)共生細(xì)胞器核酸和/或其基因產(chǎn)物與在所述樣品中可檢測到的一種細(xì)胞核核酸和/或其基因產(chǎn)物的量的相對比率。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述的細(xì)胞核核酸包含DNA。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述的細(xì)胞核核酸包含編碼小核糖體核蛋白組分或其片段的DNA。
5.權(quán)利要求2的方法，其中所述的細(xì)胞核核酸包含RNA。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述的細(xì)胞核核酸包含編碼小核糖體核蛋白組分或其片段的RNA。
7.權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)的方法，其中所述的內(nèi)共生細(xì)胞器核酸和/或其基因產(chǎn)物包含RNA。
8.權(quán)利要求1的方法，其中測定第一種內(nèi)共生細(xì)胞器核酸和/或其基因產(chǎn)物與在所述樣品中可檢測到的第二種內(nèi)共生細(xì)胞器核酸和/或其基因產(chǎn)物的量的相對比率。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述的第一種核酸包含DNA。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述的第一種核酸包含RNA。
11.權(quán)利要求1、2或8中任一項(xiàng)的方法，其中所述的第一種核酸包含DNA，且所述的第二種核酸包含RNA。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述的第二種核酸基本上由所述的第一種核酸轉(zhuǎn)錄得到。
13.權(quán)利要求8到11中任一項(xiàng)的方法，其中所述的第一種內(nèi)共生細(xì)胞器核酸和所述的第二種內(nèi)共生細(xì)胞器核酸來自同一種細(xì)胞器。
14.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述的第一種核酸包含RNA，第二種核酸包含DNA。
15.確定疾病分期的方法，其包含測定從患有所述疾病或具有患有所述疾病的風(fēng)險(xiǎn)的生物體中所取的樣品中的內(nèi)共生細(xì)胞器核酸和/或其基因產(chǎn)物的相對比率。
16.確定用于治療一種細(xì)胞生物體功能障礙的候選化合物的治療活性和/或可能的副作用的方法，其包含測定來源于所述生物體的樣品中的內(nèi)共生細(xì)胞器核酸和/或其基因產(chǎn)物的相對比率。
17.確定一種藥物的治療活性和/或可能的副作用的方法，其包含測定來源于一種生物體的樣品中的內(nèi)共生細(xì)胞器核酸和/或其基因產(chǎn)物的相對比率。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述的藥物至少使用了3個(gè)月。
19.權(quán)利要求17或18的方法，其中所述的藥物用來治療慢性疾病。
20.權(quán)利要求16到19中任一項(xiàng)的方法，其中所述的副作用在使用所述的方法時(shí)基本上不出現(xiàn)。
21.權(quán)利要求16到20中任一項(xiàng)的方法，其中所述的治療活性包含針對HIV相關(guān)疾病和/或腫瘤相關(guān)疾病的治療活性。
22.權(quán)利要求16到21中任一項(xiàng)的方法，其中所述的化合物或藥物包含核苷和/或核苷酸類似物。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述的核苷和/或核苷酸類似物包含氟達(dá)拉濱、巰基嘌呤、硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、氟尿嘧啶和/或gemeytabine。
24.權(quán)利要求16到23中任一項(xiàng)的方法，其中所述的化合物或藥物包含AZT、ddI、ddC、d4T、3TC和/或替諾福韋。
25.權(quán)利要求16到24中任一項(xiàng)的方法，其中所述的生物體或一基本上相關(guān)的生物體已經(jīng)使用了所述的化合物或藥物。
26.測定引起細(xì)胞生物體功能障礙的候選化合物的毒性的方法，其包含測定來源于所述生物體的樣品中的內(nèi)共生細(xì)胞器核酸和/或其基因產(chǎn)物的相對比率。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述的生物體或一基本上相關(guān)的生物體已經(jīng)使用了所述的化合物。
28.測定候選化合物對第一種生物體的選擇性活性的方法，其包含按權(quán)利要求16或20-25中任一項(xiàng)的方法測定候選化合物的治療活性和/或可能的副作用和/或按權(quán)利要求26或27的方法測定候選化合物的毒性。
29.權(quán)利要求28的方法，其進(jìn)一步包含為基本上無關(guān)的第二種生物體提供所述的化合物。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述的第一種生物體包含病原體，而所述的第二種生物體包含所述病原體的宿主。
31.權(quán)利要求29的方法，其中所述的第一種生物體包含雜草植物，而所述的第二種生物體包含農(nóng)作物。
32.權(quán)利要求1到31中任一項(xiàng)的方法，其中所述的相對比率在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)中測定。
33.權(quán)利要求32的方法，其包含在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)中對所述的內(nèi)共生細(xì)胞器的核酸和所述的第二種核酸進(jìn)行擴(kuò)增。
34.權(quán)利要求32或33的方法，其中所述的相對比率由核酸的一個(gè)量除以另一個(gè)量直接測定。
35.權(quán)利要求1到34中任一項(xiàng)的方法，其中所述的相對比率通過與參考曲線比較來確定。
36.權(quán)利要求1到35中任一項(xiàng)的方法，其中所述的內(nèi)共生細(xì)胞器核酸、所述的其基因產(chǎn)物、所述的第二種核酸和/或其基因產(chǎn)物都來自外周血單核細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞。
37.一種診斷試劑盒，其包含至少一種進(jìn)行權(quán)利要求1到36中任一項(xiàng)的方法的手段。
38.權(quán)利要求37的試劑盒，其包含至少一種用于選擇性擴(kuò)增并檢測與內(nèi)共生細(xì)胞器相關(guān)的或來源于其的核酸的引物或探針。
39.權(quán)利要求38的試劑盒，其中所述的至少一種引物或探針列在表1中。
40.按權(quán)利要求16或20-36中任一項(xiàng)的方法可得到的或可選擇出的化合物在制備藥物、除草劑、殺蟲劑、抗寄生蟲藥物、細(xì)胞增殖抑制劑或細(xì)胞毒性制劑中的用途。
41.按權(quán)利要求16或20-36中任一項(xiàng)的方法可得到的或可選擇出的藥物、除草劑、殺蟲劑、抗寄生蟲藥物、細(xì)胞增殖抑制劑或細(xì)胞毒性制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及疾病的診斷或細(xì)胞生物體的功能測定，所述的細(xì)胞生物體可以是多細(xì)胞的或者單細(xì)胞的，可以是肉眼可見的生物體或微生物。本發(fā)明提供了一種測定細(xì)胞生物體功能的方法，該方法包含測定來源于所述生物體的樣品中的第一種內(nèi)共生細(xì)胞器核酸和/或其基因產(chǎn)物與第二種核酸和/或其基因產(chǎn)物的量的相對比率。
文檔編號C12Q1/02GK1526022SQ01822477
公開日2004年9月1日 申請日期2001年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月4日
發(fā)明者鮑勃·范格曼, 鮑勃 范格曼, 凱瑟琳娜 安娜 克拉西娜 蒂默曼斯, 伊夫琳·凱瑟琳娜·安娜·克拉西娜·蒂默曼斯, 德龍德, 安東尼·德龍德, 約翰娜 莫尼卡 多伯拉爾, 伊雷妮·約翰娜·莫尼卡·多伯拉爾 申請人:普里馬根公司