專利名稱：在酵母菌中高效生產(chǎn)異源性蛋白質(zhì)的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體說，本發(fā)明涉及在酵母菌和其他真菌中通過操縱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)加工，來高效生產(chǎn)異源性蛋白質(zhì)的新方法。本發(fā)明的方法可用于大規(guī)模生產(chǎn)異源性蛋白質(zhì)并且包括這種生產(chǎn)所需的方法和新式載體。
背景技術(shù)：
基因操縱技術(shù)的發(fā)展使得用微生物大量生產(chǎn)有用的蛋白質(zhì)成為可能。原核細(xì)胞如大腸桿菌或枯草芽孢桿菌因它們的遺傳學(xué)特征已熟知而被廣泛用作宿主。然而，具有藥物價(jià)值的大多數(shù)生物分子是真核細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)，當(dāng)它們在原核細(xì)胞中產(chǎn)生時(shí)常常失去功能。以產(chǎn)業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)需要的真核細(xì)胞蛋白質(zhì)，如激素、抗體、凝血因子、蛋白酶、各種酶、生長因子和抑制劑以及疫苗用的病原分子，一直是一個(gè)難題。理論上可采用發(fā)酵使微生物無限制繁殖來生產(chǎn)這些分子，然而細(xì)菌等的表達(dá)系統(tǒng)缺乏真核細(xì)胞使用的分泌裝置，故不能完完全全地合成這類蛋白質(zhì)。
作為單細(xì)胞真核生物，酵母菌似乎對(duì)解決此難題有相當(dāng)前景，因?yàn)榻湍妇哂兴姓婧松锕餐恼?guī)分泌通路。但酵母生產(chǎn)方法只獲得有限的成功，因?yàn)榇蠖鄶?shù)異源性蛋白質(zhì)產(chǎn)生在錯(cuò)誤的部位或不能恰當(dāng)?shù)卣郫B。有助于分泌性蛋白質(zhì)適當(dāng)定位的一種方法，是融合一段內(nèi)源性信號(hào)序列以指導(dǎo)異源蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)中，這是分泌通路的第一步。這有助于解決定位問題，但發(fā)現(xiàn)大多數(shù)異源蛋白質(zhì)即使在內(nèi)源信號(hào)序列幫助下被恰當(dāng)?shù)剞D(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔室(compartment)中仍不能折疊。在這種情況下，采用哺乳動(dòng)物組織培養(yǎng)來合成蛋白質(zhì)成為唯一實(shí)用選擇。不幸的是，需要的生長培養(yǎng)基和設(shè)備使此方法費(fèi)用高昂、選擇復(fù)雜。
酵母菌是高度安全的，因?yàn)橐验L期使用釀酒酵母菌生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品，如酒制品或面包。酵母菌通常以高于細(xì)菌的細(xì)胞密度被培養(yǎng)并且可連續(xù)培養(yǎng)。在分泌的蛋白輸出到培養(yǎng)基中時(shí)，酵母菌還可提供其糖基化，從而保存了其活性需要這種修飾的蛋白質(zhì)的活性。然而，仍然需要解決的是，其他生物的許多分泌性蛋白在酵母菌中生產(chǎn)時(shí)為何不能產(chǎn)生活性蛋白？以及為什么酵母菌對(duì)這些類型的蛋白質(zhì)仍然是一種不穩(wěn)定的表達(dá)系統(tǒng)？從以上所述可以明白，本領(lǐng)域仍然需要開發(fā)有效、方便和高效率的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，以獲取在酵母菌中生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)但沒有蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊問題。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供能完成上述需要的酵母菌轉(zhuǎn)化方法。
本發(fā)明的另一目的是提供將用于細(xì)菌的轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)商品化異源蛋白質(zhì)的機(jī)制。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供用于此種轉(zhuǎn)基因方法的聚核苷酸構(gòu)建物(constructs)、載體、轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
本發(fā)明的其他目的通過以下對(duì)本發(fā)明的描述將變得清晰。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的方法能夠?qū)湍妇M(jìn)行基因修飾，促進(jìn)其作為生物發(fā)酵器的用途，以大規(guī)模生產(chǎn)重要的商品化蛋白質(zhì)產(chǎn)品，如人生長激素。本發(fā)明促進(jìn)了異源性分泌蛋白在酵母菌中的恰當(dāng)合成，克服了先前酵母表達(dá)系統(tǒng)不能折疊許多異源性蛋白質(zhì)的問題。此外，本發(fā)明提高了已獲得的某些成功的酵母表達(dá)蛋白質(zhì)的產(chǎn)量和活性。簡言之，本發(fā)明使得酵母產(chǎn)生的異源性蛋白質(zhì)更類似于(如果不是相同于)原先宿主生物所合成的蛋白質(zhì)。
可以采用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化方法與本領(lǐng)域已知的常規(guī)應(yīng)用于細(xì)菌、植物和動(dòng)物的遺傳工程技術(shù)，一起來從遺傳上操縱酵母菌生產(chǎn)，收獲重組蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明，操縱酵母菌的質(zhì)量控制機(jī)制，使錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)返回胞質(zhì)溶膠，操縱其降解從而分泌這些蛋白質(zhì)。本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例包括利用受到操縱的受體酵母細(xì)胞，以抑制與O-糖基化相關(guān)的酶或Bypass of Sec Thirteen家族。作為質(zhì)量控制的一部分，要消除對(duì)蛋白質(zhì)的酵母菌的特異性修飾。抑制O-糖基化可防止不適當(dāng)?shù)慕湍妇禺愋孕揎棌亩荛_了酵母菌的質(zhì)量控制機(jī)制?？捎帽景l(fā)明的任何方法來產(chǎn)生本發(fā)明的受體宿主細(xì)胞，包括缺失突變、反義序列或者甚至給予參與這些酶家族調(diào)節(jié)通路的酶的外源性激動(dòng)劑或拮抗劑。
本發(fā)明還包括含有分離自這種轉(zhuǎn)基因酵母菌的蛋白產(chǎn)物的新穎組合物。還包括用于該程序和轉(zhuǎn)化細(xì)胞、載體和摻入了它們的轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞。在一優(yōu)選實(shí)施例中，設(shè)計(jì)了一種新的載體，可幫助提高轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)在酵母菌中的產(chǎn)量。
定義以上所用的以及整個(gè)說明書和權(quán)利要求書所用的與本發(fā)明組合物和方法有關(guān)的各種術(shù)語，除另有說明，都具有這里所說明的含義。
各種單位、前綴和符號(hào)可以它們的SI形式表示。除非另有說明，分別為核酸序列書寫從左到右為5’-3’方向，氨基酸序列書寫從左到右為氨基末端——羧基末端方向。數(shù)字范圍包括確定范圍的編號(hào)和確定范圍中的各個(gè)整數(shù)。氨基酸可用其通常知道的三字碼表示或IUPAC-IUB生化命名委員會(huì)推薦的單字碼表示。同樣核苷酸可用它們通常接受的單字碼表示。除非另有說明，本文所用的軟件、電氣或電子學(xué)術(shù)語如“新的IEEE電氣和電子學(xué)術(shù)語標(biāo)準(zhǔn)詞典”所定義的那樣(1993第5版)。以下的術(shù)語參見本說明書后對(duì)整個(gè)含義的理解會(huì)更加完全。
“反義寡核苷酸”是一種至少6個(gè)連續(xù)核苷酸的、最好與DNA互補(bǔ)(反基因)或RNA互補(bǔ)(反義)的分子，能干擾內(nèi)源蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄或翻譯過程，以抑制基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。
“克隆載體”是一種DNA分子，例如質(zhì)粒、粘?；蚣?xì)菌噬菌體，能在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制?？寺≥d體一般含有一個(gè)或多個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，外源性DNA序列可以限定方式插入此位點(diǎn)而不會(huì)喪失載體的基本生物學(xué)功能，此位點(diǎn)也可插入適當(dāng)?shù)臉?biāo)志基因，用于鑒定和選擇受此克隆載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。標(biāo)志基因一般包括提供對(duì)抗菌素如潮霉素、四環(huán)素或氨芐青霉素等的抗性的基因。
“編碼序列”或“編碼區(qū)”指一種核酸分子，其含有必須的序列信息，當(dāng)此序列表達(dá)時(shí)可產(chǎn)生一基因產(chǎn)物。
術(shù)語“保守性修飾變異體”用于氨基酸和核酸序列兩者。對(duì)于具體的核酸序列，保守性修飾變異體指編碼相同氨基酸序列的或編碼氨基酸序列保守性修飾變異體的那些核酸。由于遺傳密碼子的簡并性，許多功能相同的核酸可能編碼任一給定的蛋白質(zhì)。例如密碼子GCA，GCC，GCG和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此在一密碼子編碼的丙氨酸的每一位點(diǎn)，該密碼子可以改變?yōu)樯鲜鱿鄳?yīng)密碼子之一，而不會(huì)改變所編碼的多肽。這類核苷酸變異是“沉默變異”，代表一種保守性修飾變異。本文中編碼一條多肽的每條核酸序列也稱為遺傳密碼，描述了該核酸的每一個(gè)可能的沉默變異。普通技術(shù)人員懂得，可對(duì)核酸中的每個(gè)密碼子(除AUG和UGG外，AUG是甲硫氨酸的唯一密碼子，UGG是色氨酸的唯一密碼子)進(jìn)行修飾以產(chǎn)生功能相同的分子。因此編碼本發(fā)明多肽的核酸的每個(gè)沉默變異都包含在各個(gè)描述的多肽序列中并在本發(fā)明范圍內(nèi)。
對(duì)于氨基酸序列，技術(shù)人員懂得對(duì)核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列的各種取代、缺失或添加、改變、以增加或缺失了該編碼序列中的一個(gè)氨基酸或一小部分氨基酸，是一種“保守性修飾變異”，其中這種改變導(dǎo)致一個(gè)氨基酸被一個(gè)化學(xué)性質(zhì)上類似的氨基酸所取代。如此，可改變選自包括1至15之間整數(shù)的氨基酸殘基的任何數(shù)目。例如，可進(jìn)行1、2、3、4、5、7或10個(gè)殘基改變。保守性修飾變異體通常提供類似于衍生該變異序列的未修飾多肽序列的生物活性。例如，對(duì)其天然底物來說，底物特異性、酶活性或配體/受體結(jié)合一般至少為天然蛋白質(zhì)的30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的活性。本領(lǐng)域熟知能提供功能相似氨基酸的保守性取代的名單。以下6組各含有互相可保守性取代的氨基酸1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
也可參見Creighton(1984)Proteins W.H.Freeman and Company.
術(shù)語“共抑制”是一種在生物體中抑制基因表達(dá)的方法，其中該生物體被導(dǎo)入了一種構(gòu)建物。該構(gòu)建物具有一個(gè)或多個(gè)拷貝的序列，其與一駐留基因(resident gene)相同或享有核苷酸同源性。
關(guān)于一具體核酸所“編碼”或“編碼的”指其含有翻譯成為具體蛋白質(zhì)的信息。編碼一蛋白質(zhì)的核酸可能在核酸翻譯區(qū)中含有非翻譯序列(如內(nèi)含子)或可能缺乏這種間插性非翻譯序列(如在cDNA中)。編碼一蛋白質(zhì)的信息是在使用密碼子時(shí)特有的。通常核酸使用“通用性”遺傳密碼編碼氨基酸序列。然而，存在于某些植物、動(dòng)物和真菌線粒體，Capricolum支原體或纖毛蟲滋養(yǎng)核(ciliate Macronucleus)中的通用密碼變異體，當(dāng)核酸在這些生物中表達(dá)時(shí)可予以利用。
當(dāng)用合成方法制備或改變核酸時(shí)，可利用該核酸將要在其體內(nèi)表達(dá)的預(yù)定宿主的已知密碼子偏愛性(preferences)。例如，雖然本發(fā)明的核酸序列可在植物和真菌中表達(dá)，但可能要按照該生物的特異性密碼子偏愛性和GC成分偏愛性來修改序列，因?yàn)槿绫疚囊玫膮⒖嘉墨I(xiàn)所描述這些偏愛性顯示有所不同。
術(shù)語“表達(dá)”指基因產(chǎn)物的生物合成。結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)涉及該結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄為mRNA，然后該mRNA翻譯為一個(gè)或多個(gè)多肽。
“表達(dá)載體”是一種含有可在宿主細(xì)胞中表達(dá)的基因的DNA分子。通?；虮磉_(dá)處在某些調(diào)節(jié)元件包括啟動(dòng)子、組織特異性調(diào)節(jié)元件和增強(qiáng)子的調(diào)控下。這樣可以說該基因“操作性連接于”這些調(diào)控元件。
如本文所用，“異源性”核酸是來源于異種生物的核酸，或者如果來源于同種生物，則是經(jīng)過人類精心干預(yù)在組成和/或基因組基因座上與其天然核酸有實(shí)質(zhì)性修飾的核酸。例如一操作性連接于一異源性結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子，是來源于不同於衍生該結(jié)構(gòu)基因的生物的啟動(dòng)子，或者如果來源于同種生物，則該啟動(dòng)子有一處或兩處實(shí)質(zhì)上的被修飾而不同于其來源形式。異源性蛋白可來源于異種生物，或者如果來源于同種生物則是已經(jīng)過人類精心干預(yù)有實(shí)質(zhì)性修飾而不同于其來源形式。
如本文所用，術(shù)語“高嚴(yán)謹(jǐn)性”將意味著按以下條件或相等的條件雜交在含50％甲酰胺，5×SSPE、2％SDS、10×Denhardt’s溶液和100微克/毫升鮭精子DNA的緩沖液中，42℃雜交12小時(shí)，用0.1×SSC、0.1％SDS 55℃洗滌，-70℃曝光柯達(dá)X-Omat AR底片4天。
“宿主細(xì)胞”指含有載體并能支持該載體復(fù)制和/或表達(dá)的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是諸如大腸桿菌等原核細(xì)胞，或諸如真菌、昆蟲、兩棲動(dòng)物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞等真核細(xì)胞。宿主細(xì)胞優(yōu)選真菌細(xì)胞。
術(shù)語“導(dǎo)入的”即本文中將一核酸插入一細(xì)胞中，指“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”，包括指一核酸摻入一真核或原核細(xì)胞中，即該核酸可被插入該細(xì)胞的基因組中(例如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA中)轉(zhuǎn)變成自主復(fù)制子，或短暫(transiently)表達(dá)(如轉(zhuǎn)染的mRNA)。
術(shù)語“聚核苷酸構(gòu)建物”或 “DNA構(gòu)建物”有時(shí)用于指表達(dá)構(gòu)建物，然而也包括設(shè)計(jì)用于共抑制天然宿主細(xì)胞序列，或相應(yīng)于(例如)病毒中發(fā)現(xiàn)的那些外源性序列的反義寡核苷酸或核苷酸。
術(shù)語“操作性連接”，指將表達(dá)編碼序列所必須的調(diào)控序列置于核酸分子中該表達(dá)序列相關(guān)的適當(dāng)位置上，以能表達(dá)此編碼序列。此同一定義有時(shí)用于指表達(dá)載體中其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(如增強(qiáng)子)的排列。
轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列是一種DNA調(diào)控序列，例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、聚腺苷酸化信號(hào)、終止子等，它們保證了編碼序列在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。
如本文所用，“聚核苷酸”，包括指脫氧核糖聚核苷酸、核糖聚核苷酸或它們的同類物，其具有天然核糖核苷酸的基本性質(zhì)，能在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與天然核苷酸基本上相同的核苷酸序列雜交，或/和能翻譯成與天然核苷酸相同的氨基酸序列。聚核苷酸可以是天然基因或異源性結(jié)構(gòu)基因或調(diào)控基因的全長序列或亞序列(subsequence)。除非另有說明，該術(shù)語包括具體的序列及其互補(bǔ)序列，故為了穩(wěn)定性或其他理由(如本文中聚核苷酸術(shù)語所指)需采用骨架(backbone)修飾的DNA或RNA。然而本文所用的聚核苷酸這個(gè)術(shù)語中，DNA或RNA也包括稀有堿基如次黃嘌呤核苷，或修飾的堿基如三苯甲基化堿基這兩個(gè)例子。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)明白對(duì)DNA或RNA已作了很多不同的修飾使其服務(wù)于許多有用的目的。本文所用的聚核苷酸包括化學(xué)上、酶學(xué)性能上或代謝上改變的聚核苷酸類型，以及病毒和細(xì)胞，包括其他生物的細(xì)胞、單細(xì)胞和復(fù)雜細(xì)胞中，特征性的DNA和RNA化學(xué)類型。
術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。此術(shù)語可用于其中有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)的天然氨基酸的人工化學(xué)同類物的氨基酸聚合物，或用于天然存在的氨基酸聚合物。這類天然存在的氨基酸同類物的基本性質(zhì)是，當(dāng)其加入一蛋白質(zhì)中時(shí)，該蛋白可與含有全部天然氨基酸的相同蛋白質(zhì)所誘導(dǎo)的抗體起特異性反應(yīng)。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”也包括各種修飾，包括但不限于磷酸化、糖基化、脂質(zhì)結(jié)合(lipid attachment)、硫酸化、谷氨酸殘基的γ-羧基化、羥基化和ADP-核糖基化。如眾所周知和上述的那樣，可以明白多肽不都是線性的。例如，多肽可因遍在蛋白化作用而可能是分枝狀的，它們由于翻譯后加工可能是有或沒有分枝的環(huán)狀，包括天然加工產(chǎn)生的或不是天然加工而是人為操作產(chǎn)生的。環(huán)狀、分枝狀或分枝性環(huán)狀多肽，可經(jīng)非翻譯性天然加工或完全是人工合成方法來合成。另外，本發(fā)明考慮采用本發(fā)明的含甲硫氨酸和無甲硫氨酸、氨基末端變異的蛋白質(zhì)。關(guān)于蛋白質(zhì)“N末端區(qū)域”，包括毗鄰蛋白質(zhì)氨基末端端部的大約50個(gè)氨基酸。
術(shù)語“啟動(dòng)子”、“啟動(dòng)子區(qū)”或“啟動(dòng)子序列”通常指基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，見于該編碼區(qū)的5’或3’側(cè)或編碼區(qū)內(nèi)，或內(nèi)含子內(nèi)。通常啟動(dòng)子是能在細(xì)胞中結(jié)合RNA聚合酶和啟動(dòng)下游(3’方向)編碼序列轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)控區(qū)。通常5”啟動(dòng)子序列在其3’端接鄰轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，并向上游(5’方向)延伸包括啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄超過上述背景的可檢測水平所必須的最低數(shù)目的堿基或元件。啟動(dòng)子序列中有轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(可用核酸酶S1作圖來方便地確定)以及負(fù)責(zé)RNA聚合酶結(jié)合的蛋白質(zhì)結(jié)合域(共有序列)。啟動(dòng)子術(shù)語包括所述序列的必須的調(diào)節(jié)特性，以及可任選地包括翻譯起始位點(diǎn)前面的長末端重復(fù)區(qū)。
“重組宿主”，可以是含有克隆載體或表達(dá)載體之一的原核或真核細(xì)胞。此術(shù)語也包括那些經(jīng)基因工程改造在宿主細(xì)胞染色體或基因組中含有克隆基因的原核或真核細(xì)胞。
術(shù)語“報(bào)告基因”，指編碼一種易為標(biāo)準(zhǔn)方法直接或間接檢測到的產(chǎn)物的基因。
術(shù)語“選擇性標(biāo)志基因”，指編碼一種表達(dá)時(shí)能賦予轉(zhuǎn)化細(xì)胞可選擇表型(例如抗生素抗性)的產(chǎn)物的基因。
對(duì)于寡核苷酸或其它單鏈核酸分子，術(shù)語“特異性雜交”指兩個(gè)充分互補(bǔ)序列的兩個(gè)單鏈核酸分子之間的結(jié)合，使得在預(yù)先確定的條件下(本發(fā)明通常采用的嚴(yán)謹(jǐn)條件下，有時(shí)稱為“基本上互補(bǔ)的”條件下)發(fā)生雜交。具體說，該術(shù)語指寡核苷酸與單鏈DNA或RNA分子中的基本上互補(bǔ)序列的雜交，并指該寡核苷酸與非互補(bǔ)序列的單鏈核酸基本上不發(fā)生雜交。
“結(jié)構(gòu)基因”是一種DNA序列，其可轉(zhuǎn)錄成信使RNA(mRNA)后者再翻譯成具體多肽的特征性氨基酸序列。
“載體”是一種復(fù)制子，例如質(zhì)粒、噬菌體、粘?；虿《?，可將其它核酸節(jié)段操作性插入它們中間導(dǎo)致該節(jié)段的復(fù)制或表達(dá)。


圖1表明KHN在酵母菌中的表達(dá)。KHN在野生型細(xì)胞和ER相關(guān)降解突變體cue1細(xì)胞得到表達(dá)。用35S-氨基酸脈沖標(biāo)記細(xì)胞并按顯示的時(shí)間追蹤檢測。然后從去污劑溶胞產(chǎn)物(detergentlysates)免疫沉淀，洗滌劑裂解得到KHN，作SDS-PAGE分離然后放射自顯影觀察。
圖2表明用內(nèi)切糖苷酶H除去KHN的N-連接糖基。顯示用35S-氨基酸脈沖標(biāo)記的cue1細(xì)胞中KHN的表達(dá)和追蹤檢測的時(shí)間。KHN經(jīng)免疫沉淀并用內(nèi)切糖苷酶H處理或模擬處理。然后KHN作SDS-PAGE分離和放射自顯影觀察。
圖3表明通過O-連接糖基化修飾KHN。KHN在cue1、pmt2和pmt1突變株細(xì)胞中得到表達(dá)。脈沖標(biāo)記細(xì)胞并如上述追蹤檢測，如圖1中所述免疫沉淀KHN并進(jìn)行分析。
圖4A、4B、4C的曲線表明BST1基因和PMT2基因突變的細(xì)胞與野生型細(xì)胞相比KGFP活性顯著提高，平均熒光強(qiáng)度在Δbst1細(xì)胞升高5倍，在Δpmt2細(xì)胞升高9倍。
圖5所示為表達(dá)KGFP的細(xì)胞的熒光顯微鏡圖。用裝有Spot II數(shù)碼相機(jī)的Zeiss Axioplan上置熒光顯微鏡拍照顯示野生型和pmt2突變細(xì)胞所表達(dá)的KGFP。曝光時(shí)間見所示。
圖6A、6B、6C，KHN是一種轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體時(shí)快速降解的蛋白質(zhì)，圖6A顯示用[35S]甲硫氨酸/半胱氨酸30℃代謝性脈沖標(biāo)記10分鐘，然后按所示的時(shí)間冷追蹤檢測表達(dá)KHN的野生型細(xì)胞和Δcue1細(xì)胞。用抗HN多克隆抗血清免疫沉淀洗滌劑裂解物得到KHN，并經(jīng)10％SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。將免疫沉淀的蛋白質(zhì)與500單位內(nèi)切糖苷酶H(Endo H)培育3小時(shí)除去N-連接糖基。星號(hào)表示非特異性免疫沉淀的蛋白質(zhì)位置。圖6B如圖6A所述對(duì)表達(dá)KHN的野生型、Δpmt1和Δpmt2細(xì)胞作了分析。圖6C為22℃培養(yǎng)表達(dá)KHN的野生型、sec12-4和sec18-1細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長期，移至37℃，30分鐘后脈沖標(biāo)記細(xì)胞并如所示定時(shí)追蹤測定。免疫沉淀得到KHN并如圖6A所述進(jìn)行分析。KHN p1和p2形式的位置如圖6A所示，箭頭標(biāo)出p1形式的位置(圖6B和圖6C)。
圖7A、7B、7C、7D，KHNt是ERAD通路的降解底物。圖7A用[35S]甲硫氨酸/半膠氨酸脈沖標(biāo)記表達(dá)KHNt的野生型和突變株細(xì)胞10分鐘，隨后進(jìn)行冷追蹤檢測。用抗HA單克隆抗體(HA.11；BabCo)進(jìn)行KHNt的免疫沉淀，并用總TCA沉淀計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化，SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)并放射自顯影觀察。圖7B使用圖7A所示產(chǎn)生放射自顯影的同一塊凝膠作攝影分析(phosphorlmageranalysis)，定量測定圖7A的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖7C免疫印染法分析了野生型和ERAD突變株中KHNt的相對(duì)穩(wěn)態(tài)水平。將等量細(xì)胞裂解物(0.2 OD600當(dāng)量細(xì)胞)加入各泳道，電泳分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，用HA.11單抗探查，用化學(xué)發(fā)光法(Pierce Chemical Co.)顯示蛋白質(zhì)。圖7D用載玻片上固定和滲透的細(xì)胞進(jìn)行野生型和ERAD突變細(xì)胞中KHNt的免疫定位。分別用抗α-HA單抗和抗α-Kar2p多克隆抗血清檢測KHNt和BiP。熒光第二抗體結(jié)合后，紅色泳道(a、b和c)顯示KHNt，綠色泳道(d、e和f)顯示BiP，各泳道曝光時(shí)間相同。顯影。標(biāo)尺2微米。
圖8A、8B、8C、8D，可溶性而非膜結(jié)合的ERAD底物的降解要求內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)。圖8A、8B、8C、8D所示為22℃培養(yǎng)野生型細(xì)胞和表達(dá)HA標(biāo)記的ERAD底物的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)突變株Sec12-4和Sec18-1至對(duì)數(shù)生長期，移到37℃的限制性溫度30分鐘，如圖7所述進(jìn)行時(shí)間過程(time courses)和分析。數(shù)據(jù)作圖比較各細(xì)胞株背景上每一底物降解的速度，Δcue1株包括Ste6-166p和Sec61-2p的陽性對(duì)照。
圖9A、9B、9C，包含在COPII小泡(vesicles)中的可溶性ERAD底物，在自表達(dá)KHNt(圖9A)、CPY*HA(圖9B)和Ste6-166P(圖9C)的野生型細(xì)胞株分離獲得的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，進(jìn)行重建的COPII出芽反應(yīng)。標(biāo)記T的泳道代表用于出芽反應(yīng)總膜量的十分之一。減號(hào)(-)泳道表示缺乏純化COPII成分時(shí)形成的小泡量。加號(hào)(+)泳道表示加入COPII蛋白時(shí)產(chǎn)生的小泡。離心收集總膜和出芽的小泡，在聚丙酰胺凝膠上分離，免疫印染顯示蛋白質(zhì)。用熒光自顯影檢測糖基化前α因子(gpαf)的量。
圖10A、10B、10C、10D、10E、10F，KHNt和CPY*HA而非Ste6-166p的降解需要高爾基體向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)。如圖2所述對(duì)表達(dá)KHNt(圖10A)、CPY*HA(圖10B)和Ste6-166p(圖10C)的野生型和sec21-1細(xì)胞株進(jìn)行了脈沖追蹤檢測分析。22℃培養(yǎng)細(xì)胞株至對(duì)數(shù)生長期，移至33℃后立即脈沖標(biāo)記。33℃繼續(xù)培養(yǎng)作冷追蹤檢測(時(shí)間如所示)放射自顯影觀察凝膠(左)并攝影分析定量測定(右)，圖10C中為攝影掃描的凝膠圖象。
圖11A、11B、11C、11D、11E、11F，per17-1是對(duì)阻斷錯(cuò)誤折疊蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，但不阻斷正確折疊蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的挽回(retrieval)通路有特異性的突變株。圖11A通過圖7所述代謝性脈沖-追蹤分析，測定了野生型和per17-1細(xì)胞中的KHNt、CPY*HA、Ste6-166p和Sec61-2p的轉(zhuǎn)化。實(shí)驗(yàn)在30℃下進(jìn)行，表達(dá)Sec61-2p的細(xì)胞株除外。30℃培養(yǎng)表達(dá)Sec61-2p的細(xì)胞株至對(duì)數(shù)生長期，移至37℃30分鐘，繼續(xù)培養(yǎng)作脈沖追蹤檢測。圖11B上圖顯示在A部分所示時(shí)間進(jìn)程中，KHNt凝膠產(chǎn)生的放射自顯影圖，標(biāo)出了p1(內(nèi)質(zhì)網(wǎng))和p2(高爾基體-已改變的)中形成的位置。從KHNt時(shí)間進(jìn)程制備的等分裂解物平行免疫沉淀得到內(nèi)源性CPY和Gas1p。凝膠電泳分離這些蛋白質(zhì)，放射自顯影觀察(p1，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)前CPY；p2高爾基體前CPY；mCPY；成熟CPY；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Gaslp，Gaslp的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形式；mGas1，成熟的高爾基體改變的Gaslp)。圖11C所示為脈沖標(biāo)記野生型和per17-1細(xì)胞10分鐘并在所示時(shí)間追蹤檢測，免疫沉淀CPS和ALP并作凝膠電泳，然后放射自顯影分析。標(biāo)明了各蛋白質(zhì)的前體形式(proCPS和proALP)和成熟形式(mCPS和mALP)。
圖12A、12B，per17-1細(xì)胞中錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的免疫定位。圖12A所示為固定和滲透化處理對(duì)數(shù)生長培養(yǎng)的表達(dá)KHNt(a-c)和CPY*HA細(xì)胞(d-f)的per17-1細(xì)胞和表達(dá)CPY*HA(g-I)的Δder1細(xì)胞。該細(xì)胞用抗HA和抗α-、Kar2p抗體，然后用Alexa熒光546羊抗小鼠(a、d和g)和Alexa熒光488羊抗兔(b、e和h)第二抗體染色。用DAPI(c、f和I)染色表明核的位置。箭頭指出特異性著色點(diǎn)(colocalization)。圖12B所示為圖12A中顯示經(jīng)加工并結(jié)合第一抗體的、表達(dá)HA表位標(biāo)記SRβ的野生型和Per17-1細(xì)胞。采用Alexa熒光546羊抗兔和Alexa熒光488羊抗小鼠抗體，故Bip呈現(xiàn)紅色泳道(a和d)而SRβ呈現(xiàn)綠色泳道(b和e)。標(biāo)尺2微米。
圖13所示為假設(shè)的出芽酵母菌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量控制模型，檢索蛋白質(zhì)易位后，錯(cuò)誤折疊蛋白分為保留通路(白色箭頭)或挽回通路(黑色箭頭)。挽回通路中蛋白質(zhì)包裝在COPII小泡中轉(zhuǎn)運(yùn)入高爾基體，通過逆向轉(zhuǎn)運(yùn)通路得以挽回。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中兩通路的底物會(huì)聚為ERAD，這些蛋白質(zhì)通過易位子復(fù)合物穿越內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，受到遍在蛋白化作用標(biāo)記和胞質(zhì)26S蛋白酶體的降解。
圖14所示為pDN477，一種允許異源性蛋白質(zhì)在酵母菌中高水平表達(dá)的酵母表達(dá)載體，的質(zhì)粒圖。強(qiáng)力TDH3啟動(dòng)子(已標(biāo)示)驅(qū)動(dòng)了信息RNA的合成。包含了酵母BiP(KAR2)基因的信號(hào)序列(SS)，通過將其cDNA插入Cla1(5’)和Xba1(3’)位點(diǎn)，它指導(dǎo)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)位入共翻譯(更多是哺乳動(dòng)物的)SRP分泌通路。為了避免分泌或利用內(nèi)源性信號(hào)序列，將編碼序列插入BamH1(5’)和Xba1(3’)位點(diǎn)，ACT1終止子終止了轉(zhuǎn)錄。該載體還含有供酵母菌中選擇的URA3基因和酵母的復(fù)制起點(diǎn)(ARS1)以及著絲粒(CEN4)?？傻玫骄哂衅渌鼧?biāo)志或整合入基因組的pDN477版本。
具體實(shí)施例方式
通過諸多研究建立了本發(fā)明以了解酵母菌中分泌性蛋白質(zhì)的折疊和成熟過程。研究過程中，在酵母分泌通路中表達(dá)了許多異源性蛋白質(zhì)，第一種是水母(jellyfish)的綠熒光蛋白(GFP)。為了將其導(dǎo)入分泌通路，將Kar2p蛋白的內(nèi)源性酵母信號(hào)序列與GFP的氨基端融合，該信號(hào)序列引導(dǎo)蛋白質(zhì)進(jìn)入特異的轉(zhuǎn)位通路，Kar2p利用了酵母菌中較多的“哺乳動(dòng)物”的SRP通路。優(yōu)選的此信號(hào)序列與常用的α因子信號(hào)序列(其利用酵母菌特有的翻譯后通路)相反。此外，將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)保留基序HDEL與其羧基末端融合以將該蛋白質(zhì)定位于ER。GFP是監(jiān)測蛋白質(zhì)折疊的理想分子，因?yàn)槠錈晒饣钚砸蕾囉诘鞍踪|(zhì)的正確構(gòu)型并易于檢測。當(dāng)該稱為KGFP嵌合性蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)能恰當(dāng)定位，但熒光活性很低，提示其在ER中并未恰當(dāng)折疊。這種低活性對(duì)其在分泌通路中表達(dá)是特有的，因?yàn)槠湓诎|(zhì)中的表達(dá)采用ER轉(zhuǎn)位突變株sec63顯示為明亮的胞質(zhì)熒光。不清楚KGFP為何在酵母菌分泌通路中不能有效折疊。
突破來自于表達(dá)猿猴病毒5的、稱為HN的哺乳動(dòng)物病毒糖蛋白，選HN是因?yàn)樗恼郫B容易監(jiān)測。為了在酵母中表達(dá)HN，將該病毒的信號(hào)/錨著結(jié)構(gòu)域(在酵母菌中不被識(shí)別)用Kar2p信號(hào)序列取代。產(chǎn)生的蛋白質(zhì)稱為KHN，能恰當(dāng)?shù)匕邢蚍置谕范行У乇惶腔?圖1)。
此蛋白質(zhì)被迅速降解(圖1)，這對(duì)ER中錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)來說是常見的。當(dāng)我們發(fā)現(xiàn)KHN在遍在蛋白化突變cue1細(xì)胞(其為ER相關(guān)蛋白降解缺陷性細(xì)胞)中是穩(wěn)定的證實(shí)了這一點(diǎn)(圖1)，觀察了遷移率中的時(shí)間依賴性轉(zhuǎn)移，表明存在糖修飾(KHN是一種糖蛋白)。故檢驗(yàn)了該轉(zhuǎn)移是否是由于其受到內(nèi)切糖苷酶H的消化KHN而發(fā)生N-連接糖基化修飾。如圖2所示其轉(zhuǎn)移并非由于其N-連接糖基修飾。其它可能性是KHN受到O-連接糖基化修飾，這是令人驚奇的，因?yàn)镠N通常在正常哺乳動(dòng)物宿主中只受到N-連接糖基化修飾。通過在O-連接糖基化缺陷性酵母菌株中表達(dá)KHN檢驗(yàn)了這種可能性。酵母菌ER中的O-連接糖基化，通過稱為蛋白質(zhì)甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(PMT)的基因家族的作用而開始。令人驚奇的是本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在顯示KHN受到O-連接糖基化不恰當(dāng)修飾的兩種突變體pmt1和pmt2中，HN的修飾受到阻礙(圖3)。
高等真核細(xì)胞中，高爾基體中發(fā)生O-連接糖基化是一種罕見的修飾。所有的多肽都在加入任何O-連接糖基前折疊完畢。相反酵母細(xì)胞ER中第一步為O-連接糖基化。不知道什么物質(zhì)傳導(dǎo)了O-連接糖基化信號(hào)？是否有可能大多數(shù)異源性蛋白質(zhì)可被O-連接糖基化？因?yàn)橐郧安恢肋@一點(diǎn)，本發(fā)明人假設(shè)，新生的多肽在ER中受到O-連接糖基化的不恰當(dāng)修飾可能改變該鏈的化學(xué)性質(zhì)并可能導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊。充其量即使該蛋白質(zhì)可因此種修飾而折疊但其活性和穩(wěn)定性可能受損傷，因?yàn)榛瘜W(xué)性質(zhì)上不同于其天然形式。為了檢驗(yàn)這個(gè)假設(shè)我們采用我們的報(bào)告構(gòu)建物KGFP，檢測了抑制O-連接糖基化對(duì)折疊的影響(對(duì)于此目的KHN不夠理想，因?yàn)樗翘烊籋N的可溶形式在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中折疊會(huì)部分受損)。
酵母菌TDH3啟動(dòng)子在野生型和pmt突變細(xì)胞中能驅(qū)動(dòng)KGFP表達(dá)。因?yàn)镵GFP是一種熒光標(biāo)志物，可通過發(fā)射光強(qiáng)度變化監(jiān)測其折疊，采用上置熒光顯微鏡觀察表達(dá)細(xì)胞中的KGFP。在所有情況下，KHN都適當(dāng)?shù)匕邢虻紼R，令人感興趣的是pmt2突變體具有最強(qiáng)的效果，顯示ER著染模式比對(duì)照明亮得多；而其它pmt突變體4和3顯示較差的效果。為了定量測定和特征鑒定熒光活性的明顯增強(qiáng)，對(duì)表達(dá)KGFP的野生型和pmt2突變株細(xì)胞進(jìn)行了流式細(xì)胞計(jì)數(shù)。如圖4所示，pmt2細(xì)胞中的熒光活性顯示較野生型細(xì)胞有均勻一致的增強(qiáng)，平均熒光活性pmt2突變細(xì)胞高近8.5倍(109.5單位對(duì)12.9單位)，bst1細(xì)胞高5.5倍(71.4單位對(duì)12.9單位)這種差別可歸因于比活性的差別，因?yàn)槎棵}沖追蹤分析顯示表達(dá)水平和穩(wěn)定性兩細(xì)胞株相類似。此外，直接熒光顯微鏡觀察顯示活性顯著增加，但這種增加不是由于KGFP的錯(cuò)誤定位(圖5)。
這些資料顯示酵母菌中表達(dá)的異源性蛋白受到O-連接糖基化的不適當(dāng)修飾。此種修飾進(jìn)而可能對(duì)該蛋白質(zhì)的成熟和活性具有不良后果。本發(fā)明人認(rèn)定，若采用內(nèi)源信號(hào)序列與O-連接糖基化缺陷的特定突變株偶聯(lián)表達(dá)，酵母表達(dá)的異源蛋白質(zhì)的活性可以顯著提高。由于酵母中有6個(gè)不豐裕的PMT基因并且底物特異性表現(xiàn)有差異，這6個(gè)基因任何一個(gè)缺失的細(xì)胞株可能提供所需的對(duì)O-糖基化異常的抑制。此外，可聯(lián)合諸突變進(jìn)一步促進(jìn)適當(dāng)折疊。因此，本發(fā)明人發(fā)展了一種新的辦法來克服市場上重要分子在酵母菌中低成本表達(dá)潛力受到限制的問題。
近年來，已有了以制備規(guī)模合成蛋白質(zhì)的各種表達(dá)系統(tǒng)。最常用的微生物體大腸桿菌一般不用于真核分泌性蛋白的合成，因?yàn)榧?xì)菌的分泌是根本不同的。而酵母系統(tǒng)應(yīng)用有限，因?yàn)樵S多蛋白質(zhì)不能正確合成，以前對(duì)此原因未明。本發(fā)明觀察到病毒糖蛋白SV5HN的可溶形式在酵母細(xì)胞中受到不恰當(dāng)修飾，導(dǎo)致其錯(cuò)誤折疊，這一現(xiàn)象已有可能被利用來克服這個(gè)問題。本發(fā)明人證明抑制O-連接糖基化(實(shí)施例顯示的是特定的突變株，但任何抑制方法預(yù)計(jì)會(huì)有同樣效果)可顯著增強(qiáng)活性異源性蛋白質(zhì)的合成。此外，采用“更像哺乳動(dòng)物的”內(nèi)源性共翻譯特異性信號(hào)序列也是優(yōu)選的，可指導(dǎo)蛋白質(zhì)正確導(dǎo)向酵母菌的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。雖然是在釀酒酵母菌中發(fā)展了此方法，但此方法也可用于所有其他酵母菌，包括pombe和巴斯德酵母菌以及其它真菌，因?yàn)樗鼈儍?nèi)質(zhì)網(wǎng)都具有O-糖基化蛋白質(zhì)的機(jī)構(gòu)。
此系統(tǒng)具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，因?yàn)閷?shí)際上任何異源性蛋白質(zhì)(分泌性或非分泌性)都可以合成，包括但不限于抗體、激素、生長因子和抑制劑、毒素、凝血因子、酶和免疫接種用蛋白質(zhì)。除了用于大規(guī)模蛋白合成外，本發(fā)明將使得酵母菌可用作強(qiáng)有力的研究工具來研究和篩選用于人類疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的藥物。這包括但不限于束性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(CFTR)、朊蛋白、細(xì)胞受體表達(dá)篩選激動(dòng)劑和拮抗劑，和早老性癡呆病的β淀粉樣蛋白前體的加工。
本發(fā)明的酵母轉(zhuǎn)化是在其質(zhì)量控制機(jī)制受到抑制或操縱，蛋白質(zhì)不能經(jīng)由高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的傳統(tǒng)通路降解的環(huán)境中進(jìn)行。在一優(yōu)選實(shí)施形式中，受體細(xì)胞環(huán)境是O-糖基化受到抑制的環(huán)境，這可通過使用本領(lǐng)域已知的反義物質(zhì)或共抑制方法，或通過工程改造宿主酵母菌株使之與O-連接糖基化有關(guān)的基因突變而喪失功能而實(shí)現(xiàn)。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，通過操縱PMT家族的基因來抑制O-連接糖基化。
另一實(shí)施例中，通過突變或抑制Bypass of Sec Thirteen基因，或者其他功能類似基因來操縱質(zhì)量控制機(jī)制。
反義物質(zhì)和共抑制機(jī)制是本領(lǐng)域眾所周知和采用的，Ausubel等(同上)作了舉例說明。此外，本領(lǐng)域也知曉在受體酵母細(xì)胞系中構(gòu)建突變的技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)，見Sambrook等1989描述。包括整合性破壞技術(shù)Shortle，1982，Science 217373“整合性DNA轉(zhuǎn)化的酵母肌動(dòng)蛋白基因的致死性破壞”；一步基因破壞Rothstein 1983，Methods Enzymol.101202-210“酵母的一步基因破壞”；PCR介導(dǎo)的一步基因破壞，Baudin等1993釀酒酵母，Nucl.Acids Res.213329-3330，“導(dǎo)致釀酒酵母菌基因缺失的一種簡單有效的方法”；或置換Scherer和Davis1979 PNAS764951-4955“用體外構(gòu)建的改變的DNA序列置換染色體區(qū)段”。在優(yōu)選實(shí)施例中通過基因工程改造正常質(zhì)量控制必須基因缺陷的酵母菌缺失突變株或受體真菌菌株，來創(chuàng)造內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量控制受到操縱的受體菌環(huán)境。
在一優(yōu)選實(shí)施方式中采用的基因是Bypass基因或SecThirteen基因(Elrod-Erickson和Kaiser，1996，Molecular biology ofthe Cell，71043)。預(yù)計(jì)一些具有類似功能可用于本發(fā)明的BST家族的其他這類基因?qū)⒃诮湍妇械玫借b定。按照本領(lǐng)域熟知的本文和Ausubel(Protocols in Molecular Biology 1997，Wiley and Sons出版社)所公開的技術(shù)，可用其他生物的已知序列產(chǎn)生探針，與文庫雜交來鑒定酵母菌的其他BST基因。
在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，操縱受體酵母細(xì)胞使其O-甘露糖基化受到抑制，這可通過抑制O-連接糖基化通路中的任何酶而實(shí)現(xiàn)。蛋白質(zhì)O-甘露糖基化最初見于真菌始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從分泌性蛋白質(zhì)的絲氨?；蛱K氨酰殘基的多萜醇活化甘露糖轉(zhuǎn)變?yōu)楦事短?，蛋白質(zhì)O-甘露糖轉(zhuǎn)化酶(PMT)家族催化此反應(yīng)。見Strahl-Bolsinger等，蛋白質(zhì)的O-甘露糖基化，Biochimicaet Biophysica Acta 1999，1426297-307。
在一優(yōu)選實(shí)施方式中，受抑制的酶是PMT基因家族的酶。近年已知至少有6個(gè)或更多的蛋白質(zhì)O-糖基化基因PMT1-7，見Gentzsch等PMT基因家族“釀酒酵母中的蛋白質(zhì)O-糖基化是生命所必須的”EMBO J 1996 15(21)，5752-5759。
蛋白質(zhì)O-甘露糖基化是O-連接糖基化的第一步，抑制此通路的其他幾步預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生本發(fā)明的類似結(jié)果。見Hersgovics等，“酵母中的糖蛋白生物合成”FASEB J 1993，7540-550。例如可抑制催化第3個(gè)甘露糖殘基連接的MNT/KRE2基因家族(KTR1/YUR1)?？刹捎帽疚蔫b定其他突變的方法不難篩選其他O-連接糖基化突變株，按本發(fā)明做工作量不會(huì)比常規(guī)篩選法大。
在酵母菌中產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)聯(lián)合了目前公開的本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)手段。本發(fā)明還包括采用需要在真菌宿主細(xì)胞中表達(dá)的編碼結(jié)構(gòu)性基因的聚核苷酸，這些聚核苷酸常常是以表達(dá)構(gòu)建物形式摻入與結(jié)構(gòu)基因操作性相連并常常是末端序列的啟動(dòng)子區(qū)域中，此構(gòu)建物也可包含信號(hào)序列以指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因蛋白的分泌。此種構(gòu)建物常包含在一載體通常為質(zhì)粒載體中。這種載體應(yīng)具有在細(xì)菌中該載體復(fù)制和保留的性能(克隆載體)，和顯示在宿主中整合和/或發(fā)揮功能(表達(dá)載體)的可選擇性標(biāo)志基因和/或序列。
本發(fā)明方法中所用的這些組分每一個(gè)都屬于本發(fā)明范圍之中。大多數(shù)情況下，也可對(duì)整個(gè)過程的各個(gè)階段進(jìn)行開發(fā)。選擇開發(fā)目標(biāo)依賴于對(duì)其進(jìn)行的變化，例如對(duì)所選的用于克隆和導(dǎo)入重組DNA分子的質(zhì)粒載體系統(tǒng)、待修飾的酵母菌種類、具體的結(jié)構(gòu)基因、所用的啟動(dòng)子元件和上游元件的變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇和利用適當(dāng)?shù)奶娲飦韺?shí)現(xiàn)其功能。表達(dá)所需的結(jié)構(gòu)基因和培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域知道的。本領(lǐng)域還知道可得到許多種類的可轉(zhuǎn)化和可發(fā)酵的酵母菌，它們含有并能表達(dá)在本發(fā)明啟動(dòng)子分子調(diào)控下的所需要的基因。
以下是可用于實(shí)施本發(fā)明方法的分子生物學(xué)技術(shù)的非限制性綜述。
本發(fā)明的聚核苷酸構(gòu)建物具有分子生物學(xué)領(lǐng)域熟知的類似元件。例如在每個(gè)構(gòu)建物中感興趣的DNA序列宜操作性連接(位于能確保其起作用的部位)于在酵母細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子，從而使該DNA能被轉(zhuǎn)錄(成RNA轉(zhuǎn)錄物)并包含一含有復(fù)制系統(tǒng)的載體。在一優(yōu)選實(shí)施例中，為了防止內(nèi)源性基因發(fā)生共抑制，感興趣的DNA序列應(yīng)是外源性的，除非共抑制方案是需要的。
酵母菌的克隆載體和基因根據(jù)酵母菌的復(fù)制方式，常用的酵母載體可分為5類Yip，Yrp，Ycp，YTEp和Ylp質(zhì)粒。除Ylp質(zhì)粒(線性酵母質(zhì)粒)外，其它均可在大腸桿菌中保持，Plasmid Vector Development。
Struhl等人開發(fā)了三種嵌合型質(zhì)粒載體(Struhl，K.“酵母菌的高頻率轉(zhuǎn)化雜交DNA分子的自主復(fù)制”Proc Natl Acad Sci USA1979，761035-1039)(i)YIp(酵母整合性質(zhì)粒)不能通過整合進(jìn)入受體菌株基因組而復(fù)制和轉(zhuǎn)化；(ii)YEp(酵母游離型質(zhì)粒)攜帶有酵母菌2微米環(huán)形復(fù)制起點(diǎn)。它是一種酵母內(nèi)源性質(zhì)?？稍谑荏w細(xì)胞中復(fù)制；和(iii)YRp(酵母復(fù)制性質(zhì)粒)可利用酵母菌自主復(fù)制序列(ARS)復(fù)制。整合性載體以低效率(1-10個(gè)轉(zhuǎn)化體/微克)轉(zhuǎn)化。質(zhì)粒在轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞中能以高得多的效率復(fù)制。YEp載體一般以0.5-2.0×104轉(zhuǎn)化體/每微克輸入質(zhì)粒DNA的效率轉(zhuǎn)化，而YRp-7質(zhì)粒產(chǎn)生0.5-2.0×103轉(zhuǎn)化體/每微克輸入質(zhì)粒DNA。Struhl等(Struhl，K“酵母菌的高頻率轉(zhuǎn)化雜交DNA分子的自主復(fù)制”，Proc Natl Acad Sci USA 1979，761035-1039))(i)YIp(酵母整合性質(zhì)粒)顯示要求整合入基因組的該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率低于能在酵母細(xì)胞中自主復(fù)制的那些酵母質(zhì)粒載體。因此已開發(fā)了其它兩種酵母質(zhì)粒載體，攜帶有ARS和酵母著絲粒的酵母著絲粒質(zhì)粒(YCp)(Clarke，L.等“酵母著絲粒的分離和功能性環(huán)狀小染色體的構(gòu)建”Nature，1980 287504-509；Parent，S.A.等“在釀酒酵母菌中表達(dá)、分析和克隆DNA序列的載體系統(tǒng)”Yeast J 1985，83-138)比YRp質(zhì)粒更穩(wěn)定，但每個(gè)細(xì)胞只存在一個(gè)拷貝。將人造酵母染色體(YACs)培養(yǎng)增殖成為含著絲粒、ARS和兩個(gè)選擇標(biāo)志、兩端粒和一克隆位點(diǎn)的環(huán)狀質(zhì)粒(Burke等“通過人造染色體載體將外源性DNA的大片段克隆入酵母菌中”Science，1987，236806-812；Murray，A.W.等“在酵母中構(gòu)建人造染色體”Nature1983，305189-193)。通過去除端粒之間的序列線性化此載體并將外源性DNA插入克隆位點(diǎn)，結(jié)果獲得一線性人造染色體，長100-1000Kb，可通過有絲分裂和減數(shù)分裂增殖。
啟動(dòng)子用于本發(fā)明方法的表達(dá)構(gòu)建物、啟動(dòng)子或控制系統(tǒng)可包括可誘導(dǎo)啟動(dòng)子或組成性啟動(dòng)子?？傻玫皆S多適合的啟動(dòng)子系統(tǒng)?？烧T導(dǎo)的酵母啟動(dòng)子的例子包括GAL(半乳糖激酶)和PHO5(堿性磷酸酶)，見Schneider和Guarente，1991。半乳糖可激活GAL啟動(dòng)子，而缺乏磷酸鹽的培養(yǎng)基可誘導(dǎo)PHO5啟動(dòng)子。
也可使用組成性啟動(dòng)子，例子包括最常用的ADH1(醇脫氫酶I)、TPI(丙糖磷酸異構(gòu)酶)和PGK(3磷酸甘油酸激酶)。見Ausubel，分子生物學(xué)短方案，1999 John Wiley and Sons出版社。
這些和其他的這類啟動(dòng)子是已知的并可通過Genebank來源進(jìn)入查詢，在一優(yōu)選實(shí)施方式中，啟動(dòng)子是受體宿主細(xì)胞種類的同源性啟動(dòng)子。例如，在釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化方案中，可在聚核苷酸構(gòu)建物中采用釀酒酵母菌的啟動(dòng)子。
在啟動(dòng)子構(gòu)建物中包含某些內(nèi)含子序列也許是理想的，因?yàn)榫幋a區(qū)包含內(nèi)含子序列可能導(dǎo)致表達(dá)和特異性提高。
另外，可將一個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域與不同啟動(dòng)子的區(qū)域相連接以在產(chǎn)生的嵌合啟動(dòng)子中獲得所需的啟動(dòng)子活性，也可采用能調(diào)節(jié)基因表達(dá)的合成性啟動(dòng)子。
通過增加諸如轉(zhuǎn)錄終止子和/或增強(qiáng)子元件等補(bǔ)充元件可進(jìn)一步優(yōu)化表達(dá)系統(tǒng)。
其他調(diào)控元件除啟動(dòng)子序列外，表達(dá)盒或聚核苷酸構(gòu)建物也應(yīng)含有位于結(jié)構(gòu)基因下游的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)以提供有效終止。此終止區(qū)域或聚腺苷酸化信號(hào)可得自啟動(dòng)子序列的同一基因，或可得自不同基因，聚腺苷酸化序列包括但不限于Octopine土壤桿菌的合酶信號(hào)(Gielen等EMBO J.1984，3835-846)或胭脂氨酸(nopaline)合酶信號(hào)(Depicker等Mol and Appl Genet.19821561-573)。
轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)入亞細(xì)胞腔室如液泡、過氧化物酶體、乙醛酸循環(huán)體、細(xì)胞壁或線粒體，或分泌進(jìn)入質(zhì)外體或生長培養(yǎng)基，是通過將編碼信號(hào)序列的核苷酸序列操作性連接于編碼感興趣蛋白質(zhì)的基因的5’和/或3’區(qū)而實(shí)現(xiàn)的。蛋白質(zhì)合成和加工過程中結(jié)構(gòu)基因5’和/或3’端的靶向序列可能決定了該編碼蛋白質(zhì)最終定位在那里。存在的信號(hào)序列引導(dǎo)多肽進(jìn)入胞內(nèi)細(xì)胞器或亞細(xì)胞腔室或分泌入質(zhì)外體或分泌到胞外環(huán)境。本領(lǐng)域知道許多這種信號(hào)序列，特別是酵母菌的，如BiP序列。一序列與蛋白質(zhì)編碼序列操作性相連使產(chǎn)生的蛋白質(zhì)成為分泌性蛋白質(zhì)。本發(fā)明對(duì)分泌性蛋白優(yōu)選采用信號(hào)序列，但除了信號(hào)肽引導(dǎo)的分泌性蛋白質(zhì)外，本發(fā)明也包括傳統(tǒng)加工的蛋白質(zhì)。
標(biāo)志基因含本文所述任何DNA序列和啟動(dòng)子的重組DNA分子還可含選擇性標(biāo)志基因，該基因編碼的選擇性基因產(chǎn)物可賦予受該重組DNA分子轉(zhuǎn)化的細(xì)胞對(duì)一種化學(xué)試劑或生理性應(yīng)激的抗性，或賦予該細(xì)胞一種特征性的可鑒別表型，可采用選擇性試劑容易地挑選出該細(xì)胞。酵母菌轉(zhuǎn)化中所用的選擇標(biāo)志性基因包括URA3、LEU2、HIS3和TRP1，這些基因彌補(bǔ)了酵母宿主的特定代謝性缺陷(營養(yǎng)性缺陷型)。也可采用賦予抵抗殺真菌劑，如苯菌靈(benomyl)或真核細(xì)胞毒素抗性的標(biāo)志。
復(fù)制基團(tuán)(replicators)酵母表達(dá)載體也可含有衍生自酵母2微米環(huán)的復(fù)制子，其具有保證產(chǎn)生適當(dāng)拷貝數(shù)目和適當(dāng)分離進(jìn)入子代細(xì)胞的DNA位點(diǎn)和基因。
蛋白質(zhì)采用本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因酵母，可以商品化數(shù)量生產(chǎn)外源性蛋白質(zhì)。選擇和培養(yǎng)增殖轉(zhuǎn)化酵母菌的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。以常規(guī)方法收獲產(chǎn)生的大量轉(zhuǎn)基因酵母菌，外源性蛋白質(zhì)可從感興趣的組織或從總生物量中提取，或分泌入生長培養(yǎng)基(液體或固體狀態(tài))再回收?？捎盟懻摰囊阎椒ㄌ崛≈参锖驼婢锪恐械牡鞍踪|(zhì)，例如見Heney and Orr.Anal.Biochem.1981，11492-6和本文所引用的參考文獻(xiàn)。
轉(zhuǎn)化酵母轉(zhuǎn)化有許多標(biāo)準(zhǔn)方法，可用于本發(fā)明，其描述見下文。
原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化有許多方法轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，包括原生質(zhì)球方法。此法在用PEG和質(zhì)粒DNA(優(yōu)選自身復(fù)制型)處理前優(yōu)選用酶催化(蝸牛酶，glusulase)方法去除酵母細(xì)胞壁。
原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化方法舉例1、在50ml YPAD中培養(yǎng)細(xì)胞到3×107細(xì)胞/毫升密度。
2、離心400-600g 5分鐘收獲細(xì)胞，用20毫升滅菌水洗二次，20毫升山梨醇洗一次。將細(xì)胞重懸于20毫升SPEM(1M山梨醇，10mM磷酸鈉，PH7.5，10mM EDTA加40微升β-巰基乙醇，用前加入)中。
3、加入45微升酶解酶(zymolyase)20T(10微克/毫升)，30℃輕搖培育20-30分鐘，使細(xì)胞轉(zhuǎn)變成原生質(zhì)球。此時(shí)，應(yīng)有90％細(xì)胞變成原生質(zhì)球。
4、離心250g 4分鐘收獲原生質(zhì)球，小心去除上清液。以20毫升STC(1M山梨醇，10mM Tris-HCl，pH7.5，10mM CaCl2)洗粒狀沉淀一次，重懸于2毫升STC中。
5、取150微升STC懸液與5微克運(yùn)載體DNA和5微克質(zhì)粒DNA(體積少于10微升)輕輕混合轉(zhuǎn)化原生質(zhì)球。室溫培育該混合物10分鐘，加入1毫升PEG試劑(10mM Tris-HCl，pH7.5，10mMCaCl2，20％(w/v)PEG8000；過濾除菌)，輕輕混合再培育10分鐘。
6、離心250g 4分鐘收獲原生質(zhì)球，重懸于150微升SOS(1.0M山梨醇，6.5mM CaCl2，0.25％酵母提取物，0.5％細(xì)菌蛋白胨(bactopeptone))中。將原生質(zhì)球稀釋液與8毫升TOP(含1.0M山梨糖醇和2.5％瓊脂的選擇培育基，保持于45℃)和含0.9M山梨糖醇和3％葡萄糖的合適選擇培養(yǎng)基混合。30℃培養(yǎng)3-4天后可回收轉(zhuǎn)化體。
Li+轉(zhuǎn)化此法涉及用特定的單價(jià)堿性陽離子(Na+，K+，Rb+，Cs+和Li+)聯(lián)合PEG處理酵母菌細(xì)胞，刺激完整酵母細(xì)胞攝取質(zhì)粒DNA。Ito等“用堿性陽離子處理轉(zhuǎn)化完整的酵母細(xì)胞”J.Bacteriology 1983，353163-168。經(jīng)5分鐘熱休克后將細(xì)胞接種在選擇培養(yǎng)基上。用乙酸鋰(LiAc)結(jié)果最好。加入超聲處理的運(yùn)載體DNA可增加效率，反應(yīng)中加入單鏈化DNA或RNA以優(yōu)化反應(yīng)。在一次轉(zhuǎn)化反應(yīng)中可用攜帶不同被選的標(biāo)志基因的兩種載體來敲除兩種不同的基因，或以可選擇質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染來尋找非選擇性基因破壞。以下是用大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室菌株已證明可工作并且適合用作酵母雙雜交系統(tǒng)高效轉(zhuǎn)化質(zhì)粒文庫的LiAc/ssDNA/PEG方案的標(biāo)準(zhǔn)方法。
LiAc/ssDNA/PEA方法舉例1、在2×YPAD中培養(yǎng)細(xì)胞過夜。重懸于溫?zé)?×YPAD中，密度為5×106細(xì)胞/毫升。再培養(yǎng)使細(xì)胞兩次分裂增殖至2×107細(xì)胞/毫升。
2、離心3000g 5分鐘收獲細(xì)胞，以滅菌蒸餾水洗二次，重懸在滅菌蒸餾水中，密度109細(xì)胞/毫升。
3、取樣108個(gè)細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到1.5毫升小離心管中，沉淀細(xì)胞，丟棄上清液。
4、沉淀重懸于360微升轉(zhuǎn)化混合液中(240微升，50％(w/v)PEG3500，36微升1.0M LiAc， 50微升2.0mg/ml單鏈運(yùn)載體DNA，0.1-10微克質(zhì)粒DNA，加水到34微升)。
5、42℃培育轉(zhuǎn)化混合液中的細(xì)胞40分鐘，微量離心機(jī)離心沉淀細(xì)胞，去除轉(zhuǎn)化混合液。
6、輕輕重懸細(xì)胞沉淀于1毫升滅菌水中，取樣，接種于選擇培養(yǎng)基上。
電穿孔電穿孔，即用電脈沖在細(xì)胞膜上形成瞬時(shí)沖擊，已廣泛用于植物和動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。也用于酵母原生質(zhì)球和完整的酵母細(xì)胞。Karube，F(xiàn)EBS lett，1985，18290-94；Hashimoto Appl Microbiol.Biotechnol 1985，21336-339。已將電穿孔與PEG以及LiAc/ssDNA/PEG法聯(lián)用?？芍貜?fù)的標(biāo)準(zhǔn)電穿孔方法見以下表3，電穿孔舉例1、在YPD中培養(yǎng)細(xì)胞到密度1×107細(xì)胞/毫升。
2、離心1500g 5分鐘收獲細(xì)胞，重懸于25mM DTT(用YPD培養(yǎng)液配制，20mM HEPES，PH8.0)中密度1×109細(xì)胞/毫升。30℃培育10分鐘。
3、用EB(10mM，Tris-HCl，pH7.5，270mM蔗糖，1mM MgCl2)洗細(xì)胞二次，重懸于EB中，密度1×109細(xì)胞/毫升。
4、取樣48微升與2微升質(zhì)粒DNA混合，遞送到方形脈沖發(fā)生器CNRS細(xì)胞電脈沖儀的兩電極之間。
5、以1.74KV/cm電場強(qiáng)度和15ms每次脈沖時(shí)間，脈沖細(xì)胞。
6、立即加入1毫升預(yù)熱至30℃的YPD，30℃培育懸液1小時(shí)。然后在微量離心機(jī)中離心沉淀細(xì)胞重懸于SD培養(yǎng)液中，接種適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上并培養(yǎng)。
酵母轉(zhuǎn)化也可用玻璃珠進(jìn)行，見Costanzo等Genetics1988，120667-670和用biolisitics，見Klein等Nature 1987，32770-73。
原生質(zhì)球，鋰陽離子和電穿孔已應(yīng)用于大多數(shù)種類的酵母菌，包括pompe酵母、白色念珠酵母、畢赤酵母、漢森酵母、克魯維酵母、Yamadazyma ohmeri、Yarrowia lipolytica和Schwanniomycesoccidentalis。
關(guān)于酵母轉(zhuǎn)化的其他信息可在以下文獻(xiàn)中找到Gietz等“酵母菌的基因轉(zhuǎn)化”BioTechniques 30816-831((2001年4月)和Wang等“非酵母菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)”Crit.Rev.Biotechnol.2001；21(3)177-218。
經(jīng)常需要用到純合期的DNA序列，其可能要求一次以上的轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生細(xì)胞系，要求用二者均編碼同一基因產(chǎn)物的第一和第二重組DNA分子進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在本發(fā)明方法的某些實(shí)施方式中，還考慮用含有至少兩種DNA序列的重組DNA分子，或用一種以上的重組DNA分子轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。在這類實(shí)施方式中DNA序列或重組DNA分子物理性連接在同一載體中，或物理性分開在不同的載體中。只要各載體具有其獨(dú)特的選擇標(biāo)志基因，就可用一個(gè)以上載體同時(shí)轉(zhuǎn)化一個(gè)細(xì)胞。或者，可用一個(gè)以上載體依次轉(zhuǎn)化一個(gè)細(xì)胞允許在用第一種載體轉(zhuǎn)化后有一個(gè)中間再生步驟。也可能在含不同DNA序列或重組DNA分子(優(yōu)選連鎖于或位于同一染色體上的DNA序列或重組分子)的各酵母細(xì)胞或酵母細(xì)胞系之間進(jìn)行有性交配，然后從交配的子代中選出含有DNA序列或重組DNA分子二者的酵母菌。
可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的Northern印染技術(shù)和/或Southern印染技術(shù)監(jiān)測上述轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞中含有DNA序列和啟動(dòng)子的重組DNA分子的表達(dá)。
將再生的酵母菌轉(zhuǎn)移到標(biāo)準(zhǔn)生長培養(yǎng)基上(如固體或液體營養(yǎng)培養(yǎng)基、谷物、礦石、混合肥料，泥炭、木材、木屑、稻草等)，并培養(yǎng)或以本領(lǐng)域?qū)嵤┤藛T知道的方法培養(yǎng)。
在聚核苷酸穩(wěn)定地?fù)饺肓嗽偕D(zhuǎn)基因酵母菌后，該核苷酸可能通過有性交配轉(zhuǎn)移到其他酵母菌，可采用許多標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)之一種，這取決于要繁殖的菌種。
上述方法也可用來產(chǎn)生許多受重組構(gòu)建物單個(gè)轉(zhuǎn)化的酵母菌，以挽回沒有任何位置效應(yīng)(positional effects)的酵母菌。也可能較好的是挑選出含有一個(gè)以上拷貝的導(dǎo)入的重組DNA分子的酵母菌，這樣可獲得該重組分子的高水平表達(dá)。
如以上所表明的那樣，如果在具體酵母菌種中可能的話，理想的是產(chǎn)生某具體基因的純合型酵母細(xì)胞品系，在某些類型酵母菌中這可通過采用單孢子(monosporous)培養(yǎng)來實(shí)現(xiàn)。采用這些技術(shù)，有可能產(chǎn)生攜帶著插入基因的單倍體品系，然后自發(fā)性或用秋水仙素使染色體數(shù)目增倍，這樣產(chǎn)生了插入基因的純合型酵母菌株，如果插入的基因含有適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)志基因則不難通過試驗(yàn)檢測出帶有該基因的酵母菌。
以下實(shí)施例目的是進(jìn)一步闡明本發(fā)明而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本文的實(shí)施例和討論具體指釀酒酵母菌，然而本文所講的同樣可應(yīng)用于任何其他類型的酵母菌。本文引用的所有參考文獻(xiàn)均納入其整體內(nèi)容作為參考。
實(shí)施例實(shí)施例1被選定要進(jìn)入分泌通路的蛋白質(zhì)，首先須通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜，須橫穿稱為“易位子”的蛋白質(zhì)的孔進(jìn)入(ER)腔(Johnson and VanWaes 1999)。新生的可溶性蛋白質(zhì)進(jìn)入ER腔，而膜蛋白質(zhì)整合入ER膜，因?yàn)檫@些蛋白質(zhì)以非折疊狀態(tài)易位，后一步驟是在ER中裝配成其天然構(gòu)型。為此，該細(xì)胞器(ER)保留了為蛋白質(zhì)恰當(dāng)折疊和修飾所需的原始材料，酶和伴侶分子的目錄清單。由于這些功能活動(dòng)的局部定位性質(zhì)、一種稱為“ER質(zhì)量控制”的機(jī)制防止了新合成多肽轉(zhuǎn)運(yùn)到發(fā)揮其功能的部位直到它們獲得其天然構(gòu)型(Ellgaard等1999)。
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)不能折疊時(shí)該質(zhì)量控制機(jī)制也發(fā)揮了重要作用。錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)被引向稱為ER相關(guān)蛋白降解(ERAD)的降解通路(Sommer and Wolf 1997；Brodsky and McCracken，1999)。此通路在ER腔中不會(huì)發(fā)生降解，而是蛋白質(zhì)通過輸入所用的同樣的易位子復(fù)合物被轉(zhuǎn)運(yùn)回到胞質(zhì)中(Wiertz等1996；Pilon等1997；Plemper等1997；Zhou and Schekman 1999)。稱為逆的易位或脫位的該過程常常與遍在蛋白化作用(一種底物降解必須的共價(jià)修飾)相連系(Biederer等1997)。遍在蛋白化作用發(fā)生在ER的胞質(zhì)表面，因?yàn)镋2和E3分別酶解位于那兒的Ubc7p和Hrdlp/Der3p，遍在蛋白化作用的位置可能毗鄰易位子(Hiller等1996；Bordallo等1998；Bays等2001)。一旦受到標(biāo)記，這些蛋白即被胞質(zhì)26S蛋白酶體迅速降解(Hiller等1996)。
雖然對(duì)降解部位附近的ERAD底物的結(jié)局知道得挺多，但關(guān)于它們?nèi)绾巫R(shí)別、保留和引導(dǎo)向易位/遍在蛋白化機(jī)制卻知之甚少。一個(gè)模式浮現(xiàn)在腦中即新生多肽輸出后一部分仍留在易位子中，多肽只能以折疊形式釋放，而錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)經(jīng)同一個(gè)孔逆易位回到胞質(zhì)。這個(gè)假設(shè)有吸引力，因?yàn)樗鼮楸Ａ艉徒到馓峁┝艘环N簡單的機(jī)理。當(dāng)已明確的酵母可溶性ERAD底物(稱為CPY*的羧肽酶Y的突變體形式)完全穿過膜易位時(shí)，此模式產(chǎn)生了問題。(Plemper等1999)。
在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中觀察到一種已明確特性的水泡性口炎病毒G(VSV-G)蛋白突變體ts045，當(dāng)移到可引起它錯(cuò)誤折疊的39.5℃后定位于細(xì)胞的ER中(Kreis and Lodish 1986)。一項(xiàng)采用融合于綠熒光蛋白的VSV-G ts 045的精彩研究是對(duì)ER保留機(jī)制的直接證據(jù)。采用活細(xì)胞光漂白實(shí)驗(yàn)，顯示整合的膜蛋白在膜平面中自由移動(dòng)但不離開ER(Nehles等2000)。通過在該限制性溫度下延長培養(yǎng)時(shí)間，細(xì)胞過度表達(dá)了VSV-G ts 045，此蛋白中一個(gè)組分逃出ER轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體被收回(Hammond and Helenius 1994)。雖然這些早期實(shí)驗(yàn)是在比較極端的條件下進(jìn)行，但它們開辟了闡明錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)再循環(huán)機(jī)制的可能性。酵母菌中此機(jī)制不大清楚，但Ste6P和Yorlp膜整合蛋白的突變型缺乏ER向高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)而有效降解似乎支持哺乳動(dòng)物中的這個(gè)看法(Loayza等1998；Katzmann等1999)。
錯(cuò)誤折疊的可溶性蛋白和膜蛋白二者的共同質(zhì)量控制機(jī)制提出了一個(gè)空間問題，因?yàn)檫@兩種類型蛋白質(zhì)可能占據(jù)ER的不同區(qū)域(即腔和膜)。因此，似乎有理由認(rèn)為存在著不同的識(shí)別和引導(dǎo)機(jī)制將這些蛋白引入降解通路。按此看法，可能會(huì)考慮錯(cuò)誤折疊的可溶性蛋白和膜蛋白質(zhì)二者利用的遍在蛋白/蛋白酶體通路要么是ER保留機(jī)制的終點(diǎn)，或是不同機(jī)制的會(huì)聚點(diǎn)。
在此項(xiàng)研究中，申請(qǐng)人檢驗(yàn)了出芽釀酒酵母菌中易遭ERAD特異性降解的幾種質(zhì)量控制底物的結(jié)局。已證明保留和回收機(jī)制共同存在，它們具有不同類型的質(zhì)量控制底物。這兩條通路的分揀步驟發(fā)生在ER中，借此回收通路的底物被包裹在COPII轉(zhuǎn)運(yùn)水泡中，而待保留的底物受到排斥。另外，申請(qǐng)人采用遺傳學(xué)方法分離了能剖析兩條通路的突變體。一種突變體喪失了稱為per17-1的BSTI基因的等位基因功能(任何喪失功能的突變體都有類似作用)，它可阻止錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的ER向高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)，而保存了大多數(shù)正常蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。在per17-1細(xì)胞中挽回通路早期步驟的質(zhì)量控制受到破壞，如觀察到在ER相關(guān)亞區(qū)室中有錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)積累和穩(wěn)定化現(xiàn)象。
KHN是一種從高爾基體挽回的ERAD錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)。
病毒膜蛋白是研究蛋白質(zhì)折疊和ER質(zhì)量控制的極佳模型(Gething等1986；Machamer等1990；Hammomd and Helenius，1994)。為了更好了解質(zhì)量控制機(jī)制，申請(qǐng)人探索將它們(病毒膜蛋白)的優(yōu)點(diǎn)與出芽性釀酒酵母菌的易得到的遺傳學(xué)特征結(jié)合起來，雖然所說的這些技術(shù)同樣可用于任何類型的真菌。選擇了猿猴病毒5的凝血性神經(jīng)氨酸酶(HN)，因?yàn)樗恼郫B狀態(tài)可用現(xiàn)有方法監(jiān)測(Ng等1989)。為了表達(dá)HN，用酵母Kar2蛋白的可切割信號(hào)序列置換了HN的信號(hào)/錨著結(jié)構(gòu)域，將該融合構(gòu)建物置于溫和(moderate)酵母菌PRO(CPY)啟動(dòng)子下游。這樣就繞過了酵母內(nèi)源性信號(hào)/錨著結(jié)構(gòu)域的不佳利用。產(chǎn)生的蛋白質(zhì)命名為KHN，類似于哺乳動(dòng)物細(xì)胞已鑒定的可溶性HN形式(Parks and Lamb 1990)。
申請(qǐng)人采用代謝性脈沖追蹤分析監(jiān)測了KHN的表達(dá)，取得了出乎預(yù)料的發(fā)現(xiàn)，如圖6A所示，在30分鐘追蹤分析后KHN迅速消失，60分鐘后幾乎檢測不到。因?yàn)槊庖叱恋淼牡鞍踪|(zhì)是細(xì)胞和培養(yǎng)液二者的蛋白，解釋KHN的消失可不考慮是由于其分泌。另一種可選擇的解釋是外源性蛋白質(zhì)KHN可能不能恰當(dāng)折疊，而受到質(zhì)量控制機(jī)制的作用導(dǎo)致其降解。此與以下看法相一致，即KHN不能形成二硫鍵相連的二聚體，不與構(gòu)型依賴性抗HN單抗起反應(yīng)。CUD是一個(gè)注定要經(jīng)受ERAD的蛋白質(zhì)遍在蛋白化作用所需的基因，在缺失了這樣一個(gè)CUD基因的一株酵母菌中(Biederer等1997)，KHN看來在同樣的時(shí)間過程中達(dá)到了穩(wěn)定(圖6A中)。申請(qǐng)人證實(shí)KHN是真正的ERAD底物，因?yàn)樗ㄟ^多種ERAD特異性突變體而得到了穩(wěn)定(見下)。令人感興趣的是KHN的穩(wěn)定化提高了對(duì)ERAD底物的出乎預(yù)料的特性，即凝膠遷移率的時(shí)間依賴性減低(圖6A P1和P2)。申請(qǐng)人接著研究了此改變形式的性質(zhì)。
在酵母分泌通路的許多蛋白質(zhì)成熟過程中均常觀察到分子量的逐步增加。這種增加是由于最初在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中結(jié)合的糖增加而致(Herscovics and Orlean 1993)。延遲反映了新生多肽轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體(在那兒受到酶修飾)所需的時(shí)間(Gemmill and Trimble，1999；Strahl Bolsinger等1999)。記住此點(diǎn)，所觀察到的修飾提出了令人興趣的一種可能性，即KHN轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體并被回收到ER避免了降解。申請(qǐng)人通過先檢定這種改變是否確實(shí)是由于糖修飾來說明此可能性。采用內(nèi)切糖苷酶H消化去除KHN的N-連接糖基團(tuán)。如果凝膠遷移率的改變只是由于N-連接糖的修飾。那么內(nèi)切糖苷酶H處理后所有類型的KHN應(yīng)作同樣遷移。但如圖6A(右)所示，去除N-連接糖沒有消除遷移率差異。申請(qǐng)人接著利用O-甘露糖基化第一步特異性缺陷的變異株，測試了O-連接糖。ER中O-甘露糖基化始于一個(gè)甘露殘基從Man-P-多萜醇轉(zhuǎn)移到該多肽。甘露糖轉(zhuǎn)移酶(PMT)蛋白質(zhì)家族的酶催化此反應(yīng)。缺失各個(gè)PMT基因的菌株顯示糖基化時(shí)缺乏底物特異性，反映了這些基因不豐裕性質(zhì)(Gentzsch and Tanner1996)。申請(qǐng)人在每一種PMT家族成員(PMT1-PMT6)單一缺失的菌株中表達(dá)KHN。如圖6B所示，缺失PMT1和PMT2的菌株防止了KHN遷移率的改變，結(jié)果p1保留了最終被降解的主要形式。這些資料表明KHN的O-糖基化依賴于PMT1和PMT2，它們的產(chǎn)物前已證明是作為復(fù)合物一起起作用的(Gentzsch等1995)。在PMT3至PMT6單一缺失的菌株中蛋白質(zhì)的KHN特異性加工不受影響可能是由于此蛋白質(zhì)的底物特異性之故。其他PMT可能與其他蛋白質(zhì)一起工作。
ER中的蛋白質(zhì)O-甘露糖基化修飾通常在高爾基體中延長糖鏈(Lussier等1997)。為了檢驗(yàn)KHN的凝膠遷移率改變是否是由于ER后加工所致，申請(qǐng)人在特性明確的ER向高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)突變株sce12-4和sec18-1中，表達(dá)了KHN(Eakle等1988；Nakano等1988；Barlowe and Schekman 1993)。當(dāng)這些菌株中的轉(zhuǎn)運(yùn)受阻時(shí)，KHN在一段延長的時(shí)間過程中保留了p1形式(圖6C)，這與高爾基體中(有修飾性酶)形成的p2形式相一致。對(duì)這些資料我們命名ER形式為p1，命名高爾基體形式為p2。令人感興趣的是，KHN的轉(zhuǎn)向看來是因?yàn)樵谶@些突變株中受到損傷，提示轉(zhuǎn)運(yùn)離開ER可能需要降解步驟。不幸的是，蛋白質(zhì)的非特異性免疫沉淀使p1和p2形式重疊，使得難以測定KHN轉(zhuǎn)向的動(dòng)力學(xué)。因此，從這些實(shí)驗(yàn)得到的穩(wěn)定化程序無說服力。
為了精確測定KHN轉(zhuǎn)向的動(dòng)力學(xué)，構(gòu)建了其帶有COOH末端三聯(lián)HA表位標(biāo)記(KHNt)的修飾形式。當(dāng)采用抗HA單抗時(shí)，KHNt的免疫沉淀物可與背景(沉淀物)分開，其產(chǎn)量與用抗NH多克隆抗血清做的實(shí)驗(yàn)難以區(qū)別(圖7A)。KHNt的修飾和降解類似于KHN，除了轉(zhuǎn)向速度似乎略低外(圖7A上，與圖6A左，相比較)。雖然初步試驗(yàn)結(jié)果提示KHN也許是ERAD通路的底物，但其轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體提出了一種組分也許繼續(xù)向前輸送到液泡(酵母菌的溶酶體等價(jià)物)中降解的可能性。然而缺乏功能性液泡蛋白酶的突變株中KHNt降解與野生型中的降解相類似排除了這種可能性(圖7，A和B，Δpep4)。為了確定KHN是ERAD的底物，申請(qǐng)人測定了幾株該通路特異性缺陷的突變株中KHNt的穩(wěn)定性。如圖7所示，當(dāng)在缺失CUE1(其在遍在蛋白化中的作用是使Ubc7p錨著于ER膜)、DER1(編碼一種ERAD需要的ER膜蛋白質(zhì))或HRD1/DER3(編碼一種位于ER的E3遍在蛋白連接酶)基因的菌株中表達(dá)KHNt時(shí)，其降解受損的程度類似于其它已知的ERAD底物(Hampton等1996；Knop等1996；Biederer等1997；Bordallo等1998)。免疫印染分析顯示在各突變株中有較高分子量形式的KHNt的穩(wěn)態(tài)積累，證實(shí)了在野生型細(xì)胞中優(yōu)先降解的物質(zhì)正是KHNt。
錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)積累在ERAD功能缺陷細(xì)胞的ER中(Knop等1996；Loayza等1998)。因?yàn)镵HNt降解前轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體，故提出的問題是當(dāng)ERAD受到破壞時(shí)KHNt積累在什么地方？通過間接免疫熒光試驗(yàn)申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，如它與ER標(biāo)志BiP共同定位所顯示的那樣，在ERAD突變株細(xì)胞的ER中也有KHN的積累(圖7D)。這些資料表明KHNt的行為類似于某些已知的ERAD底物，提出了它的降解存在著一條回收通路的可能性。
注定要經(jīng)歷ERAD的蛋白質(zhì)的質(zhì)量控制的兩種不同機(jī)制KHN在ER的高爾基體突變株中的表達(dá)得到一出乎預(yù)料的發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)運(yùn)可能是其降解的專有步驟。這令人驚奇，因?yàn)槠渌鸈RAD底物，包括在突變株Ste6P和Yorlp中觀察到通常在相同條件下發(fā)生降解(Loayza等1998；Katzmann等1999)。如果存在著不同機(jī)制將異常蛋白質(zhì)引向降解即Ste6P和Yorlp(二者均為膜整合蛋白)類蛋白的靜止性(非再循環(huán))ER保留機(jī)制和KHN類其他蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)和挽回機(jī)制，這種明顯的矛盾可以得到解決。為了檢驗(yàn)此可能性，申請(qǐng)人采用了補(bǔ)充的體內(nèi)體外方法來評(píng)估這些底物降解前的結(jié)局。
首先，檢驗(yàn)了阻斷ER向高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，據(jù)報(bào)道在sec18突變株中ERAD底物Ste6-166P受到降解，提示即使此轉(zhuǎn)運(yùn)受阻ERAD功能還是正常的(Loayza等1998)。申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)Ste6-166P的穩(wěn)定性與野生型相同(圖8A)，證實(shí)了sec12和sec18細(xì)胞中的發(fā)現(xiàn)。作為對(duì)照，申請(qǐng)人證明在相同條件下ERAD缺陷性突變株使Ste6-166P穩(wěn)定(圖8A)。申請(qǐng)人還分析了要經(jīng)歷ERAD的另一膜蛋白Sec61-2p(Sommer and Jentsch1993；Biederer等1996)。因?yàn)镾ec61p本身在ERAD中起作用，故異位表達(dá)了Sec61-2p并與帶有HA表位標(biāo)記的野生型相區(qū)別。與Ste6-166p一樣，每一菌株中Sec61-2p均在限制性條件下正常降解(圖8B)。相反KHNt的降解受到嚴(yán)重?fù)p傷(圖8C)。因?yàn)檫@些菌株中核心ERAD的功能正常，缺陷可能是擾亂了降解前KHNt運(yùn)送方式的結(jié)果。提出的問題是這種需求是否對(duì)KHNt是獨(dú)有的？或反映了ER質(zhì)量控制的較普遍特征？為此，申請(qǐng)人檢驗(yàn)了另一已明確的可溶性底物CPY*的HA表位標(biāo)記形式(Finger等1993)。雖然已清楚知道CPY*HA利用核心ERAD機(jī)制，但不清楚它是否保留或經(jīng)歷回收循環(huán)。如圖8D所示，在sec12和sec18兩個(gè)突變株中CPY*HA很穩(wěn)定，提示它也依賴液泡轉(zhuǎn)運(yùn)通路。然而，這是令人驚奇的，因?yàn)橄惹皥?bào)道CPY*在sec18突變株中降解(Finger等1996)。經(jīng)3小時(shí)長時(shí)追蹤分析這種降解最為明顯。申請(qǐng)人還發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)運(yùn)突變株中有一些降解，因此我們設(shè)想，如果我們采用類似的延長追蹤分析可能發(fā)現(xiàn)該底物組分被降解。
上述資料提示有二類ERAD底物，一類底物的質(zhì)量控制利用液泡運(yùn)送機(jī)制，另一類依賴靜止性ER保留。這種差別預(yù)示在ER中發(fā)生分揀，將待轉(zhuǎn)運(yùn)的錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)與待保留的蛋白質(zhì)分開。sec12和sec18突變株中降解速度的差異只提供了提示性證據(jù)，不排除間接作用的可能性。為了檢驗(yàn)此觀點(diǎn)進(jìn)行了體外試驗(yàn)來再現(xiàn)COPII包被的小泡出芽和從ER膜選擇運(yùn)送貨物(Barlowe等1994)。為了這些實(shí)驗(yàn)，制備了表達(dá)KHNt、CPY*HA和Ste6-166p野生型菌株的微粒體。分離了這些微粒體的COPII出芽小泡，用免疫印染監(jiān)測了各個(gè)蛋白質(zhì)包裝入小泡的水平(圖9)。通過密度測量計(jì)算了各蛋白質(zhì)摻入率，表示為總量的百分比。申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)KHNt和CPY*HA兩種蛋白有1-2％包裹入COPII小泡，而陰性對(duì)照Sec61p不被包裹。雖然包裹入COPII小泡的錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的量比其它分泌性蛋白低，但這與KHNt比其他貨物蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)較慢相符(圖11B)。為了用此法分析KHNt和CPY*HA，用胰蛋白酶處理膜以保證測定(內(nèi)質(zhì)網(wǎng))腔中受保護(hù)的蛋白酶。這些資料獨(dú)立證實(shí)了，注定要經(jīng)歷ERAD的亞組蛋白質(zhì)，首先通過標(biāo)準(zhǔn)的膜運(yùn)送機(jī)制運(yùn)離ER。
接著申請(qǐng)人檢查了Ste6-166p。已有證據(jù)表明Ste6-166p是用ER保留機(jī)制被靶向降解。然而保留的性質(zhì)不清楚。將ER小泡出芽試驗(yàn)應(yīng)用于Ste6-166p，它仍然獨(dú)自排斥地位于ER膜內(nèi)，即使其他膜整合蛋白有效地?fù)饺肓薈OPII包被的小泡中(圖9C)。這些資料顯示胞漿膜蛋白Ste6p當(dāng)錯(cuò)誤折疊時(shí)保留在ER內(nèi)而排斥在轉(zhuǎn)運(yùn)運(yùn)小泡外。綜合這些結(jié)果揭示了ER質(zhì)量控制的一個(gè)新方面，作為其監(jiān)督機(jī)制的一部分，細(xì)胞對(duì)錯(cuò)誤折疊的蛋白作ER保留或者轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行分揀。
KHNt和CPY*HA轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體后，ERAD對(duì)它們的降解要求逆向轉(zhuǎn)運(yùn)到ER。膜和蛋白質(zhì)從高爾基體逆向流動(dòng)受到COPI類包被小泡形成的驅(qū)動(dòng)。為了檢驗(yàn)錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)是否利用COPI包被的小泡，申請(qǐng)人在r-COP突變株sec21-1中表達(dá)了KHN和CPY*HA，并測定了它們的轉(zhuǎn)變。在30℃允許溫度時(shí)正向轉(zhuǎn)運(yùn)不受影響，逆向轉(zhuǎn)運(yùn)受影響極小(Letourneur等1994)，觀察到KHNt和CPY*HA降解有一小的但可重現(xiàn)的延遲。然而在半允許溫度33℃時(shí)(部分破壞逆向轉(zhuǎn)運(yùn)而僅極微小延遲正向轉(zhuǎn)運(yùn))(Letourneur等1994)兩蛋白質(zhì)的降解受到抑制(圖10A和B)。通過分析內(nèi)源性CPY(數(shù)據(jù)未公布)和KHNp2高爾基體形式的形成(圖10A)，證實(shí)了正向轉(zhuǎn)運(yùn)的精確性。排除了對(duì)ERAD功能的間接作用，因?yàn)閟ec21-1細(xì)胞中Ste6-166p的降解是正常的(圖10C)。這些資料綜合起來表明對(duì)錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)進(jìn)行了ER保留或轉(zhuǎn)運(yùn)和從高爾基體回收的分揀，最后這兩條通路會(huì)聚在ER中受ERAD通路的降解。
回收通路早期ER質(zhì)量控制所需要的基因近年研究已證明某些貨物蛋白質(zhì)離開ER時(shí)受到主動(dòng)分揀進(jìn)入轉(zhuǎn)運(yùn)小泡(Mouiz等2001)。雖然這些分揀活動(dòng)的分子機(jī)制不大了解，但轉(zhuǎn)運(yùn)涉及的具體基因是一個(gè)蛋白亞組的基因(Belden andBarlowe 1996；Muniz等2000)。由于KHNt和CPY*HA可能代表新的一類貨物蛋白質(zhì)，故提出了是否存在分揀和包裹錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)進(jìn)入轉(zhuǎn)運(yùn)小泡的因子這個(gè)問題。為了說明此問題申請(qǐng)人采用了遺傳學(xué)方法。如果存在這類因子我們有理由認(rèn)為它們功能的喪失會(huì)導(dǎo)致正常時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)出ER的錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)保留和穩(wěn)定化。申請(qǐng)人曾報(bào)道過一種根據(jù)非折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)通路的合成致死率的基因篩選方法，可作為鑒定ER質(zhì)量控制相關(guān)基因的強(qiáng)有力工具(Ng等2000)。由于最初的篩選余地遠(yuǎn)沒有用完，故擴(kuò)大了其范圍，目的是解析質(zhì)量控制的ER保留和再循環(huán)機(jī)制。申請(qǐng)人因此而發(fā)現(xiàn)了挽回通路中錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)順行轉(zhuǎn)運(yùn)所需的一個(gè)基因。
從ER(per)突變株中152個(gè)隱性蛋白加工池開始，這些表現(xiàn)為正常蛋白整體加工缺陷，包括糖基化和轉(zhuǎn)運(yùn)被排斥(Ng等2000)。通過按圖8說明中所述的方法測定CPY*HA和Sec61-2p的穩(wěn)定性，分析了其余107個(gè)蛋白質(zhì)的ERAD活性。申請(qǐng)人分析了KHNt的穩(wěn)定性和加工。對(duì)一個(gè)突變株per17-1(功能喪失)，對(duì)KHNt和CPY*HA降解是缺陷的(圖11A)，然而與其他ERAD突變株不同(圖7)，per17-1細(xì)胞中KHNt保留著ERp1形式，這與向高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)受阻相符(圖11B上)。Gas1p(圖11B下)和幾丁質(zhì)酶(殼多糖酶)糖基加工在per17-1細(xì)胞中是正常的，其作用是控制per17-1細(xì)胞中的功能性O(shè)-甘露糖基化和修飾(Nuoffer等1991；Gentzsch andTanner 1996)。這表明KHNtp1形式的普遍性反映出是轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷而不是對(duì)糖基化的間接作用。令人感興趣的是折疊的貨物蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)顯示出差別性結(jié)果，CPY轉(zhuǎn)運(yùn)類似于野生型而Gas lp較正常蛋白為慢(圖11B)。因Gas lp固定在膜中，申請(qǐng)人檢測了其他兩種膜整合貨物蛋白質(zhì)，羧肽酶S(CPS)和堿性磷酸酶(ALP)(Cowles等1997Spormann等1992)。如圖11C所示，這二種蛋白對(duì)野生型菌轉(zhuǎn)運(yùn)沒有不同，證實(shí)per17-1突變不會(huì)導(dǎo)致ER向高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)的整體缺陷。
以上資料提示，per17-1突變由于不能促進(jìn)錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到挽回通路而抑制降解。為了強(qiáng)化此觀點(diǎn)，我們分析了分揀到ER保留通路的ERAD底物的命運(yùn)。如果PER17在ER質(zhì)量控制中起著獨(dú)特作用，設(shè)想保留通路是起作用的，這些底物在per17-1細(xì)胞中將正常轉(zhuǎn)變。如圖11A(下)所示，per17-1細(xì)胞中Ste6-166p和Sec61-2p以野生型細(xì)胞動(dòng)力學(xué)方式降解。這些資料表明per17-1等位基因?qū)υ傺h(huán)通路是特異的，驗(yàn)證了我們遺傳的策略。雖然這些資料與采用sce12和sce18突變株獲得的資料相似但它們擴(kuò)大了證據(jù)，表明轉(zhuǎn)運(yùn)是降解的重要步驟，因?yàn)閜er17-1轉(zhuǎn)運(yùn)受阻影響了錯(cuò)誤折疊的可溶性蛋白，而幾種正常的貨物蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)保持完好。
為了更好了解per17-1轉(zhuǎn)運(yùn)受阻的性質(zhì)，申請(qǐng)人進(jìn)行了間接免疫熒光分析以確定per17-1細(xì)胞中KHNt和CPY*HA被穩(wěn)定的位置。如圖12所示，KHNt和CPY*HA二者都濃積在整個(gè)細(xì)胞的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)中，這與轉(zhuǎn)運(yùn)有活性ERAD突變株不同，因?yàn)樗鼈兺ㄟ^ER彌漫地累積這些底物(Knop等1996；圖7D)。令人感興趣的是，這種點(diǎn)狀分布使人聯(lián)想到sec12突變株細(xì)胞中所見的貨物蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)受阻模式(Nishikawa等1994)。在這此細(xì)胞中，ER伴侶蛋白BiP與貨物蛋白共同位于ER中的分開的部位。因?yàn)殄e(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)受到類似阻斷，我們還檢查了per17-1細(xì)胞中BiP的分布。如圖12所示在與KHNt和CPYHA同一點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)中找到了BiP(圖12A、B和E)。雖然BiP廣泛用作ER形態(tài)學(xué)標(biāo)志，申請(qǐng)人要問，這種模式是否反映了ER的亞結(jié)構(gòu)域(如sec12細(xì)胞)或ER膜的全面改組？為說明這一點(diǎn)選擇了另一種ER標(biāo)志信號(hào)識(shí)別顆粒受體β亞基(SRβ)。SRβ是一種膜整合蛋白質(zhì)分布在整個(gè)ER中(Ogg等1998)。如圖12B所示per17-1細(xì)胞SRβ染色與野生型相似，表明ER形態(tài)沒有大的改變(圖12B，e)這與用同一菌株作的超微結(jié)構(gòu)分析很相符。在雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中經(jīng)SRβ確定該點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)總是與ER重合(圖12B)，以上資料表明錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)與BiP積累在per17-1細(xì)胞的不同ER部位。
接著鑒定了PER17基因。將基于著絲粒YCP50載體的酵母菌基因組文庫轉(zhuǎn)化為per17-1突變株，通過恢復(fù)扇形表型獲得一互補(bǔ)克隆(Ng等2000)。檢索整個(gè)缺失圖譜鑒定到一個(gè)編碼BST1(Bypassof sec thirteen)的ORF為PER17基因。BST1編碼一種通過與SEC13(COPII小泡包膜的一種成分)的遺傳性相互影響第一次克隆的ER膜整合蛋白質(zhì)(Elrod-Erickson和Kaiser1996)。因此據(jù)信BST1在ER向高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)中起作用。然而其精確作用在本領(lǐng)域中還不知道，因?yàn)锽ST1基因缺失似乎不影響兩原型貨物蛋白質(zhì)，CPY和轉(zhuǎn)化酶的轉(zhuǎn)運(yùn)。以上資料提示了BST1在ER質(zhì)量控制中的新功能。因?yàn)閜er17-1和Δbst1細(xì)胞防止錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)而不防止大多數(shù)適當(dāng)折疊蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，所以此資料也提示了其在貨物蛋白質(zhì)分揀中起作用(圖11B；資料未公布)。
討論幾乎25年前就首先發(fā)現(xiàn)了監(jiān)視內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中新生蛋白折疊狀態(tài)的細(xì)胞監(jiān)視系統(tǒng)。這些領(lǐng)先研究表明病毒膜蛋白錯(cuò)誤折疊時(shí)不能轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)膜而留在合成部位(Gething等1986；Kreis andLodish1986)。后來該現(xiàn)象被恰當(dāng)?shù)胤Q為“ER質(zhì)量控制”。根據(jù)突變蛋白質(zhì)保留和降解的分子基礎(chǔ)導(dǎo)致對(duì)幾種人類疾病(包括膀胱纖維增生病)的認(rèn)識(shí)(Carrell and Gooptu1998；Kim and Arvan，1998；Kopito and Ron2000)。最近的重要的進(jìn)展提高了我們對(duì)ER質(zhì)量控制的認(rèn)識(shí)，最值得注意的是現(xiàn)認(rèn)識(shí)到降解步驟或ERAD涉及底物通過ER易位子孔逆向易位至胞質(zhì)(Wiertz等1996；Pilon等1997；Plemper等1997；Zhou and Schekmann1999)。逆向易位過程中或之后，底物受到遍在蛋白化及26S蛋白酶體的降解(Ward等1995；Hiller等1996)。除了這些進(jìn)展外，上游至ERAD的活動(dòng)仍不清楚。
申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)兩種不同機(jī)制的合作保證了酵母分泌通路中蛋白質(zhì)生物合成的質(zhì)量控制。通過生化和遺傳方法聯(lián)用，再次證實(shí)了此保留機(jī)制，同時(shí)提示了另一種利用已知的ER向高爾基體小泡轉(zhuǎn)運(yùn)和挽回通路機(jī)制(圖13)。申請(qǐng)人公開了錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的體內(nèi)外ER向高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)的直接證據(jù)和逆向轉(zhuǎn)運(yùn)所需成分。
該方法的關(guān)鍵是作為新ERAD底物的KHN特征鑒定。與通常研究的其他錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)不同，KHN使得我們可利用O-連接糖修飾監(jiān)測其轉(zhuǎn)運(yùn)(圖6)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中天然HN蛋白沒有O-糖基化，因此似乎有可能這種修飾是由于酵母菌中蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊時(shí)發(fā)生了混亂的O-甘露糖基化(Harty等2001)。這些糖的加工表明大多數(shù)(如果不是全部)蛋白質(zhì)在ERAD之前利用了一種挽回機(jī)制。而且申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)正向或逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的破壞損傷了KHN的降解。轉(zhuǎn)運(yùn)所需成分沒有特殊性，因?yàn)橐咽熘牡孜顲PY*在所有情況下受到的影響相似。由于在這些突變株中被保留的底物正常降解，故我們的研究資料強(qiáng)烈提示轉(zhuǎn)運(yùn)和挽回是KHN和CPY*有效降解的專門步驟。
采用純化成分進(jìn)行的體外小泡出芽試驗(yàn)提供了KHN和CPY*包裝入COPII包裹的小泡中，而Ste6-166p則被是排斥的直接證據(jù)。這些實(shí)驗(yàn)很重要，因?yàn)橐郧耙呀⒌脑囼?yàn)反映了ER向高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)的早期活動(dòng)，雖然該資料的作用是證實(shí)和擴(kuò)展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，但它們也揭示對(duì)于錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)在其形成COPII小泡時(shí)或之前存在一種新的ER分揀機(jī)制。挽回通路主要利用標(biāo)準(zhǔn)的小泡轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，但我們不知道錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)是否占用與正確折疊貨物蛋白質(zhì)相同的小泡。最近已證明不同類型折疊的貨物蛋白質(zhì)占用不同的小泡群(Shimoni等2000；Muniz等2001)。因此似乎有可能錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)為了轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體被分揀到特定的小泡中。
材料和方法本研究所用的質(zhì)粒采用標(biāo)準(zhǔn)的克隆方法(Sambrook等1989)構(gòu)建質(zhì)粒。如前所述(Ng等2000)pDN431和pDN436為HA表位標(biāo)記的CPY*表達(dá)載體。pSM1083和pSM1346為HA表位標(biāo)記的Ste6-66p表達(dá)載體，是S.Michaelis Johns Hopkins University，Baltimore，MD贈(zèng)送(Loayza等1998)。
構(gòu)建HA表位標(biāo)記的Sec61-2p表達(dá)載體pDN1002用Vent聚合酶(New England Biolabs，Inc.)按制造商的方法通過擴(kuò)增基因組DNA從菌株RSY533(MATα，sec61-2，leu2，ade2，ura3，pep4-3)克隆了啟動(dòng)子和see61-2的編碼序列。采用引物N782(5’-CGAATCCGTCGTTCGTCACC-3’)和N183(5’-TTCCCATGGAATCAGAAAATCCTGG-3’)擴(kuò)增2016-bp片段。用HindIII和NcoI消化，純化1931-bp片段。將此純化片段連接于用同樣的酶消化的pDN333。將pDN280(Ng等1996)的HA標(biāo)記插入物插入pRS315(Sikorski and Hieter1989)中產(chǎn)生pDN333。N183的NcoI位點(diǎn)安置Sec61-2p編碼序列于框內(nèi)帶上編碼一個(gè)HA標(biāo)記的載體序列后又隨ACTT終止子序列。
構(gòu)建KHN表達(dá)載體pSM31、pSM56、pSM70和pSM72。
通過連接Kar2p前45個(gè)氨基酸(信號(hào)序列和信號(hào)肽酶切割位點(diǎn))的編碼序列與SV5HN基因的COOH末端528個(gè)氨基酸，構(gòu)建了KHN融合基因。用Vent聚合酶通過PCR擴(kuò)增二片段，將其插入pDN251中產(chǎn)生pSM31。pDN251與酵母表達(dá)載體pDN201相同(Ng等1996)，除了它含有溫和的PRC7啟動(dòng)子以代替TDH3啟動(dòng)子外。pSM70與pSM31相同，除了增加一框內(nèi)插入到KHN的COOH末端的三聯(lián)HA表位標(biāo)記外。從pCS124(C.Shamu，HarvardUniversity贈(zèng)，Cambridge，MA)切下三聯(lián)HA表位標(biāo)記的編碼序列。pSM56和pSM72分別類似于pSM31和pSM70，除了KHN基因序列亞克隆入pRS315。
通過將含有pS0459(Ogg等1998)的HA表位標(biāo)記SRβ基因的NotI/KpnI片段插入pRS426(Sikorski and Hieter 1989)構(gòu)建pES69。
菌株和抗體本研究所用酵母菌株見表1，抗HA單克隆抗體(HA.11)購自BabCo。Peter Walter(University of California，San Francisco，CA)提供了抗Kar2p抗體?？笴PY抗血清由Reid Gilmore提供(University of Massachusetts，Worcester，MA)，抗Gaslp為HowardRiezman(University of Basel，Basel，Switzerland)贈(zèng)送?？笰LP和抗CPS抗血清為Chris Burd and Scott Emr(University ofCalifornia，San Diego，CA)贈(zèng)送。抗HN抗血清如前所述制備(Ng等1990)。標(biāo)記Alexa Fluor 488或546的第二抗體購自MolecularProbes，Inc.。
細(xì)胞標(biāo)記和免疫沉淀通常沉淀對(duì)數(shù)生長期的(酵母)細(xì)胞2單位A600OD，重懸于1毫升不含甲硫氨酸和半胱氨酸的合成性完全培養(yǎng)液中。在適當(dāng)溫度培育30分鐘后用480微居里的Tran35S標(biāo)記物(1CN Biomedicals)標(biāo)記細(xì)胞。加入冷的甲硫氨酸/半胱氨酸至最終濃度2mM啟動(dòng)追蹤。在脈沖結(jié)束前30秒開始追蹤以耗盡未能摻入的標(biāo)記的細(xì)胞內(nèi)池。加入三氯醋酸至10％終止標(biāo)記/追蹤。如前所述(Ng等2000)制備細(xì)胞裂解液，進(jìn)行免疫沉淀，凝膠電泳和免疫沉淀蛋白的定量測定。
體外出芽試驗(yàn)如(Bariowe等1994)所述，將微粒體(Wuestehube andSchekmann，1992)與純化的COPII蛋白(Sarlp，Sec23p復(fù)合物和Sec13p復(fù)合物)一起培育體外再現(xiàn)了ER的小泡出芽。從表達(dá)錯(cuò)誤折疊的KHNt、CPY’HA和Ste6-166p(SMY248、WKY114和SMY225)細(xì)胞制備微粒體。為了測定蛋白摻入COPII小泡，用TLA100.3轉(zhuǎn)頭(Beck.Man，Coulter)100,000g離心15微升等份的總出芽反應(yīng)物和150微升含出芽小泡的上清液，收集膜。將得到的膜沉淀物溶于30微升SDS-PAGE標(biāo)本緩沖液，取10-15微升在12.5％聚丙烯酰胺凝膠上分離。為了測定COPII小泡中含有的KHNt和CPY’，冰上用胰酶(100微克/毫升)處理膜10分鐘，然后加入胰酶抑制劑(100微克/毫升)以保證檢測到不受蛋白酶影響的成份。通過免疫印染的密度儀掃描，確定總反應(yīng)物中包裹入小泡的各蛋白質(zhì)(KHNt、CPY、Ste6-166p、Boslp、Erv25p和Sec61p)的百分比。[35S]-prepro-α-F翻譯后易位入微粒體后通過伴刀豆球蛋白A-Sepharose沉淀，測定了包裹入出芽小泡的未受蛋白酶影響的[35S]glycol-proα因子(Wuestehube and Schekman，1992)。轉(zhuǎn)移到硝纖膜和曝光于磷光屏后作攝影分析(Molecular Dynamics)觀察[35S]glycol-pro-α因子。
間接免疫熒光顯微鏡觀察以合成性完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞至0.5～0.9OD600。培養(yǎng)液中直接加入甲醛(EM級(jí)Polyscience Inc)到3.7％，30℃培育1小時(shí)。固定后離心收集細(xì)胞，用5毫升0.1M磷酸鉀緩沖液pH7.5洗滌。將細(xì)胞在原生質(zhì)球緩沖液(1.0毫克/毫升zymolyase20T，(ICNBiomedicals)0.1M磷酸鉀pH7.5，0.1％2巰基乙醇)30℃培育30分鐘消化細(xì)胞壁。以PBS洗細(xì)胞一次終止消化。取30微升細(xì)胞懸液加到聚L賴氨酸包被的載玻片各孔中1分鐘，用PBS洗三次。將載玻片浸入-20℃丙酮中5分鐘，空氣干燥。在室溫下進(jìn)行以后的步驟，各孔加入30微升PBS封閉液(PBS中含3％BSA)培育30分鐘。分別加入用PBS封閉液1∶1000或1∶5000稀釋的第一抗體α-HA或α-Kar2p，反應(yīng)1小時(shí)。用PBS封閉液洗孔3-5次。各孔加入30微升第二抗體(Alexa Flour488羊抗小鼠或抗兔，及AlexaFlour546羊抗小鼠或抗免Molecular Probes，Inc.)暗處培育45分鐘。用PBS封閉液洗滌各孔5-7次，用PBS洗二次。各孔用5微升固定液(mounting medium)(PBS 90°甘油0.025微克/毫升DAPI)和蓋玻片密封。在ZEISS Axioplan上置熒光顯微鏡上觀察標(biāo)本。用Spot 2冷卻式數(shù)碼相機(jī)(Diagnostic Instruments)收集影象，用Adobe Photoshopm4.0存檔。在用KHNt的實(shí)驗(yàn)中將兩個(gè)拷貝的基因?qū)敫骶暌蕴岣邫z測。單拷貝表達(dá)水平低可能是由于酵母細(xì)胞利用這種哺乳動(dòng)物病毒基因密碼子為亞適程度。通過增加基因劑量，表達(dá)水平類似于單拷貝時(shí)的CPY*HA，對(duì)例如ERAD底物的加工無影響(資料未公布)。
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實(shí)施例2表達(dá)真核性分泌蛋白的酵母載體系統(tǒng)。我們設(shè)計(jì)和構(gòu)建了通用的載體系統(tǒng)(見圖14)，在酵母中表達(dá)異源性(如哺乳動(dòng)物的)分泌性或膜蛋白。該載體含有能在大腸桿菌中增殖和操縱的細(xì)菌性復(fù)制子，還含有酵母來源的著絲粒，提供了復(fù)制和有絲分裂的穩(wěn)定性，另外，可得到基因組整合產(chǎn)生穩(wěn)定的菌株所需要的描述文本(version)。表達(dá)模式根據(jù)用戶需要不難操縱。釀酒酵母菌中的已知最強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子是TDH3啟動(dòng)子，它驅(qū)動(dòng)表達(dá)。戰(zhàn)略安置限制性位點(diǎn)的方法使得可采用受試者自己的信號(hào)序列(如果在酵母菌中確定能起作用)或采用此模型中含有的酵母BiP信號(hào)序列。已證明酵母菌BiP信號(hào)序列比其他序列效率高，因?yàn)樗芤龑?dǎo)重組蛋白進(jìn)入SRP通路，這是一種共同翻譯的易位機(jī)制，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分泌蛋白和膜蛋白所使用的主要通路。通常用的α因子信號(hào)序列已證明有問題，因?yàn)樗酶叩日婧思?xì)胞不常用的翻譯后通路。相反BiP信號(hào)序列對(duì)表達(dá)異源蛋白的功效中顯示了100％成功率。此模型也含有6個(gè)組氨酸的尾，有利于重組蛋白的純化。在目的cDNA插入時(shí)如果不需要可去除此尾。以酵母ACT1終止子終止轉(zhuǎn)錄。
序列表<110>賓夕法尼亞研究基金<120>在酵母菌中高效生產(chǎn)異源性蛋白質(zhì)的方法和組合物<130>P05424WO0<140>PCT/US01/47319<141>2001-12-05<150>US 60/251,374<151>2000-12-05<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>Saccharomyces cerevisiae<400>1cgaatccgtc gttcgtcacc<210>2<211>25
<212>DNA<213>Saccharomyces cerevisiae<400>2ttcccatgga atcagaaaat cctgg 25<210>3<211>483<212>PRT<213>yeast<400>3Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys1 5 10 15Ile Ser Ala Ile Asp Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu20 25 30Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe35 40 45Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys50 55 60Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr65 70 75 80Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala85 90 95Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr100 105 110Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Lys Ser Ser Ser Ser Trp Ser Tyr115 120 125
Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr130 135 140Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser<110>賓夕法尼亞研究基金<120>在酵母菌中高效生產(chǎn)異源性蛋白質(zhì)的方法和組合物<130>P05424WO0<140>PCT/US01/47319<141>2001-12-05<150>US 60/251,374<151>2000-12-05<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>Saccharomyces cerevisiae<400>1
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Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His290 295 300Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val305 310 315 320His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe325 330 335Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly340 345 350Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile355 360 365Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val370 375 380Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser385 390 395 400Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu405 410 415Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro420 425 430Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val435 440 445Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met450 455 460His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser465 470 475 480Pro Gly Lys
<210>4<211>236<212>PRT<213>YEAST<400>4Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys1 5 10 15Ile Ser Ala Ile Asp Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr20 25 30Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly35 40 45Pro Val Thr Thr Gly His Phe Ser Tyr Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly50 55 60Gln Ala Pro Arg Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Thr Asn Lys His Ser Trp65 70 75 80Thr Pro Ala Arg Phe Ser Ala Ser Leu Leu Gly Gly Lys Cys Ala Leu85 90 95Thr Leu Ser Gly Ala Arg Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Leu100 105 110Leu Ser Tyr Gly Asp Gly Val Val Ile Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr115 120 125Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro130 135 140Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile145 150 155 160
Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser165 170 175Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser180 185 190Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln195 200 205Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser210 215 220Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser225 230 23權(quán)利要求
1.一種在真菌中生產(chǎn)異源性蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，此方法包括提供一種受體真菌細(xì)胞，和向所述受體真菌細(xì)胞導(dǎo)入一聚核苷酸表達(dá)構(gòu)建物；所述細(xì)胞中的質(zhì)量控制機(jī)制經(jīng)修飾以致折疊不完全的異源性蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中不會(huì)被降解。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述真菌細(xì)胞是一種酵母菌細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述導(dǎo)入通過選自以下的一種轉(zhuǎn)化方法來進(jìn)行PEG、電穿孔、粒子轟擊和乙酸鋰。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)化方法是乙酸鋰介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚核苷酸構(gòu)建物在一酵母菌質(zhì)粒中。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述受體細(xì)胞經(jīng)修飾后致使O-糖基化受抑制。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述受體細(xì)胞包括蛋白質(zhì)甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的抑制。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因包括選自PMT1、PMT2、PMT3、PMT4、PMT5和PMT6組的一個(gè)基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述PMT基因是PMT1。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述PMT基因是PMT2。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述受體基因提供了對(duì)Bypass of Sec Thirteen基因的抑制。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述Bypass of SecThirteen基因是BST1。
13.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法轉(zhuǎn)化的酵母菌細(xì)胞。
14.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)。
15.一種在真菌中生產(chǎn)異源性蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，此方法包括提供一種受體真菌細(xì)胞，和向所述受體真菌細(xì)胞導(dǎo)入一聚核苷酸表達(dá)構(gòu)建物；所述受體真菌細(xì)胞中的糖基化受到抑制以致錯(cuò)誤折疊的異源性蛋白質(zhì)不會(huì)被降解；所述構(gòu)建物含有在所述細(xì)胞中表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因，所述基因操作性連接于在所述受體真菌細(xì)胞中表達(dá)所需的調(diào)控序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述真菌細(xì)胞是一種酵母細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述導(dǎo)入通過選自以下的一種轉(zhuǎn)化方法來進(jìn)行PEG、電穿孔、粒子轟擊和乙酸鋰。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)化方法是乙酸鋰介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。
19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述聚核苷酸構(gòu)建物在一酵母菌質(zhì)粒中。
20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述受體細(xì)胞含有的蛋白質(zhì)甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因其表達(dá)受到抑制。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因包括選自PMT1、PMT2、PMT3、PMT4、PMT5和PMT6組中的一個(gè)基因。
22.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述PMT基因是PMT1。
23.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述PMT基因是PMT2。
24.一種根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法轉(zhuǎn)化的酵母菌細(xì)胞。
25.一種根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)。
26.一種在真菌中生產(chǎn)異源性蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，此方法包括提供一種受體真菌細(xì)胞，和向所述受體真菌細(xì)胞導(dǎo)入一聚核苷酸表達(dá)構(gòu)建物；所述受體真菌細(xì)胞中的Bypass of SecThirteen表達(dá)受到抑制以致錯(cuò)誤折疊的異源性蛋白質(zhì)不會(huì)被降解；所述構(gòu)建物含有在所述細(xì)胞中表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因，所述基因操作性連接于在所述受體真菌細(xì)胞中真菌細(xì)胞表達(dá)所需的調(diào)控序列。
27.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述真菌細(xì)胞是一種酵母細(xì)胞。
28.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述導(dǎo)入通過選自以下的一種轉(zhuǎn)化方法來進(jìn)行PEG、電穿孔、粒子轟擊和乙酸鋰。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)化方法是乙酸鋰介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述聚核苷酸構(gòu)建物在一酵母菌質(zhì)粒中。
31.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述Bypass of SecThirteen基因是BST1。
32.一種根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法轉(zhuǎn)化的酵母菌細(xì)胞。
33.一種根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)。
34.一種用于轉(zhuǎn)化酵母菌細(xì)胞的聚核苷酸，其特征在于，此聚核苷酸含有能驅(qū)動(dòng)酵母細(xì)胞表達(dá)的啟動(dòng)子、大腸桿菌中增殖所需的細(xì)菌復(fù)制子、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、酵母BiP信號(hào)序列、復(fù)制和有絲分裂穩(wěn)定性所需的酵母起點(diǎn)和著絲粒；其中所述聚核苷酸引導(dǎo)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)SRP通路。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的聚核苷酸還含有一6個(gè)組氨酸的尾，以利于蛋白質(zhì)純化。
36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的聚核苷酸，其中載體如圖14所示。
37.一種用于生產(chǎn)異源性蛋白質(zhì)的酵母細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞的修飾為所述細(xì)胞中質(zhì)量控制機(jī)制的修飾，以致錯(cuò)誤折疊的異源性蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中不受到降解。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的酵母細(xì)胞，其中所述修飾包括抑制O-連接糖基化的修飾。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的酵母細(xì)胞，其中所述修飾是PMT功能喪失修飾。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的酵母細(xì)胞，其中所述PMT修飾是針對(duì)PMT1的。
41.根據(jù)權(quán)利要求41所述的酵母細(xì)胞，其中所述PMT修飾是針對(duì)PMT2的。
42.根據(jù)權(quán)利要求37所述的酵母細(xì)胞，其中所述修飾包括抑制Bypass of Sec Thirteen產(chǎn)生的修飾。
全文摘要
本發(fā)明提供的方法和組合物克服了以前這些蛋白質(zhì)不能恰當(dāng)折疊的問題，因而能在酵母菌和其他真菌中高效生產(chǎn)異源性蛋白質(zhì)。按照本發(fā)明，真菌所使用的質(zhì)量控制機(jī)制將錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)送回胞質(zhì)，操縱其降解從而分泌這些蛋白質(zhì)。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1592786SQ01822437
公開日2005年3月9日 申請(qǐng)日期2001年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月5日
發(fā)明者戴維斯·T·W·吳, 希爾帕·瓦什斯特 申請(qǐng)人:賓夕法尼亞州立研究基金會(huì)