專利名稱：用于生產(chǎn)人類抗體的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)染色體嚙齒動物的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因動物、分子免疫學和醫(yī)學技術(shù)領域。
背景技術(shù)：
抗體代表一類應用于包括移植、心血管疾病、傳染病、癌癥和自身免疫病在內(nèi)的許多不同領域的治療分子(Goldenberg，M.，1999，Clin.Ther.21309-318；Present，D.等，1999，New Engl.J.Med.3401398-1405；Targan，S.等，1997，New Engl.J.Med.3371029-1035；Davis，T.等，1999，Blood 9488a；Saez-Llorens，X.等，1998，Pediatr.Infect.Dis.J.17787-791；Berard，J.等，1999，Pharmacotherapy 191127-1137；Glennie，M.等2000，Immunol.Today 21403-410；Miller，R.，1982，New Engl.J.Med.306517-522；Maini，R.等，1999，Lancet，3541932-1939)。雜交瘤技術(shù)的開發(fā)使得能夠分離嚙齒動物單克隆抗體(也稱為MAb)作為候選治療分子(Kohler，G.和Milstein，C.，1975，Nature 256495-497)。然而，涉及將非人類單克隆抗體用于體內(nèi)人類治療的早期研究證明，人抗小鼠抗體(HAMA)應答可能限制了這類藥物的應用(Schroff，R.等，1985，CancerRes.45，879-885；Shawler，D.等，1985，J.Immunol.1351530-1535)。因此，人們認識到，需要降低治療性抗體的免疫原性。已經(jīng)用重組DNA技術(shù)來降低非人類抗體的免疫原性(Boulianne，G.等，1984，Nature 312，643-646；Morrison，S.等，1984，Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A.816851-6855；Riechmann，L.等，1988，Nature 332323-327；Jones，P.等，1986，Nature 321522-525；Queen，C.等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8610029-10033)。然而，人們也認識到，全人單克隆抗體是用于治療人類疾病的低免疫原性治療藥的潛在來源(Little，M.等，2000，Immunol.Today 21364-70)。在種系構(gòu)型中帶有人免疫球蛋白(Ig)基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠的應用，可供分離針對包括人免疫系統(tǒng)正常情況下耐受的人自身抗原在內(nèi)的多種靶的高親和性全人單克隆抗體(Lonberg，N.等，1994，Nature 368856-9；Green，L.等，1994，Nature Genet.713-21；Green，L.和Jakobovits，1998，Exp.Med.188483-95；Lonberg，N和Huszar，D.，1995，Int.Rev.Immunol.1365-93；Bruggemann，M.等，1991，Eur.J.Immunol.211323-1326；Fishwild，D.等，1996，Nat.Biotechnol.14845-851；Mendez，M.等，1997，Nat.Genet.15146-156；Green，L.，1999，J.Immunol.Methods 23111-23；Yang，X.等，1999，Cancer Res.591236-1243；Brüggemann，M.和Taussig，MJ.，Curr.Opin.Biotechnol.8455-458，1997)。人抗體基于輕鏈(κ和λ)和重鏈(IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM)分為各種各樣不同的類別。這些不同類別可能提供不同的治療應用。例如，不同重鏈同種型具有不同的與補體和基于Fc受體的與細胞的相互作用。其中某些重鏈類別(IgM和IgA)也可以形成多聚體，因而增加了Fc和V區(qū)相互作用的價位。因此，理想的是有一個產(chǎn)生所有同種型人單克隆抗體的平臺。然而，人Ig基因座(1-2Mb)的大尺寸對于將完整基因座導入轉(zhuǎn)基因小鼠以重建完全多樣化人抗體庫而言是一個主要的障礙，因為甚至應用酵母人工染色體時，包含完整人Ig基因座的兆堿基大小的DNA片段的克隆也是困難的。最近，一種采用人類染色體自身作為基因轉(zhuǎn)移載體的新方法，促進了將完整IgH和Igκ基因座轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)基因小鼠中，而無需將DNA片段克隆到人工DNA載體中(Tomizuka，K.等，1997，Nature Genet.16133-143；Tomizuka，K.等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.97722-727)。Tomizuka等(Tomizuka，K.等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97722-727)證明，將兩個可遺傳人染色體片段(hCF)導入其內(nèi)源IgH和Igκ基因座被失活的轉(zhuǎn)基因小鼠品系中，所述兩個染色體片段一個含有免疫球蛋白(Ig)重鏈基因座(IgH，～1.5Mb)，而另一個含有κ輕鏈基因座(Igκ，～2Mb)。在所得的雙轉(zhuǎn)染色體(Tc)/雙敲除(KO)小鼠中，相當大比率的體細胞保留兩種hCF，在無小鼠重鏈和κ輕鏈的情況下人Ig重鏈和κ輕鏈的高水平表達，表明缺乏Ig產(chǎn)生時的拯救。另外，4種人Igγ亞類的血清表達分布型類似在人類中觀察到的分布型。所述轉(zhuǎn)基因小鼠在用人血清白蛋白(HSA)免疫時產(chǎn)生抗原特異性人抗體應答，并且從這些小鼠中獲得具有各種同種型的HSA特異性人單克隆抗體。Tomizuka等(出處同前)的研究也證明含有Igκ基因座的hChr.2源性hCF(hCF(2-W23))在小鼠中的不穩(wěn)定性。所觀察到的κ轉(zhuǎn)染色體的不穩(wěn)定性可能是最佳表達人κ輕鏈和產(chǎn)生人κ陽性雜交瘤的障礙。實際上，得自雙Tc/KO小鼠的2/3的抗HSA雜交瘤是小鼠λ陽性(mλ+)，并且發(fā)現(xiàn)大多數(shù)(83％)IgG/mλ雜交瘤丟失了hCF(2-W23)。因此，需要保留Tomizuka等(出處同前)所述的轉(zhuǎn)染色體所賦予特性的轉(zhuǎn)基因動物，特別是基本上表達整個人重鏈同種型庫、并且也表現(xiàn)出所導入人序列穩(wěn)定性改善、允許提高獲得全人抗體效率的動物。
發(fā)明概述本發(fā)明提供包含兩個人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物，其中所述兩個人免疫球蛋白基因座中的一個是人重鏈基因座，而另一個基因座是人輕鏈基因座；并且其中所述基因座中僅一個是轉(zhuǎn)染色體(transchromosome)的。在某些轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物中，所述轉(zhuǎn)染色體是自主型的。在某些轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物中，所述轉(zhuǎn)染色體包含一個人類14號染色體的片段。在某些轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物中，所述人輕鏈基因座與內(nèi)源哺乳動物染色體相連。在某些轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物中，所述人重鏈基因座是轉(zhuǎn)染色體的，并且所述人輕鏈基因座與內(nèi)源哺乳動物染色體相連。在某些這樣的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物中，所述人輕鏈基因座的至少一部分被克隆到Y(jié)AC載體中。在某些轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物中，所述人重鏈基因座包含在hCF(SC20)中，而所述人輕鏈基因座包含在人κ輕鏈基因座轉(zhuǎn)基因KCo5中。在某些轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物中，所述人輕鏈基因座是轉(zhuǎn)染色體的基因座，而所述人重鏈基因座與內(nèi)源哺乳動物染色體相連。在某些轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物中，所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物是小鼠。在轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物中，所述內(nèi)源哺乳動物重鏈基因座和至少一個哺乳動物輕鏈基因座被失活。在某些這樣的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物中，所述內(nèi)源哺乳動物重鏈基因座和κ輕鏈基因座被失活。
另一方面，所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物還包含基因突變，其中所述突變增強對自身抗原的免疫應答。在某些轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物中，所述突變是Fc-γIIB基因失活。
本發(fā)明還提供用于產(chǎn)生多種表達人抗體序列的B細胞的方法，所述方法包括提供包含兩個人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物，其中所述兩個人免疫球蛋白基因座中的一個是人重鏈基因座，而另一個基因座是人輕鏈基因座；并且其中所述基因座中僅一個是轉(zhuǎn)染色體的；并且對所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物免疫，以產(chǎn)生多種表達人抗體序列的B細胞。在某些這樣的方法中，所述轉(zhuǎn)染色體是人類14號染色體的片段。在某些這樣的方法中，所述人轉(zhuǎn)染色體是人染色體片段SC20(hCF(SC20))。某些這樣的方法還包括收集多種表達人抗體表達序列的B細胞。某些這樣的方法還包括使所述多種B細胞與無限增殖化細胞融合形成雜交瘤。其它這樣的方法還包括從所述雜交瘤收集所述人抗體序列。在某些這樣的方法中，純化所述人抗體序列。某些這樣的方法還包括收集編碼人抗體的序列。在某些這樣的方法中，所述編碼人抗體的序列是全長的。在某些方法中，所述編碼人抗體的序列在轉(zhuǎn)染細胞中表達。在某些這樣的方法中，所述人輕鏈基因座包含得自天然人κ輕鏈基因座的未經(jīng)重排的序列。在某些這樣的方法中，所述人κ輕鏈基因座是插入的KCo5轉(zhuǎn)基因。在某些這樣的方法中，所述多種B細胞至少包含編碼具有選自以下的第一同種型的抗體的第一B細胞IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。在某些方法中，所述IgA同種型是IgA1或IgA2。在某些方法中，所述IgG同種型是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在某些這樣的方法中，所述多種B細胞至少包含編碼具有選自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的不同于所述第一同種型的第二同種型的抗體的第二B細胞。在某些方法中，所述多種B細胞至少包含5種B細胞，每種B細胞編碼一種具有不同同種型的抗體，其中所述抗體的同種型分別為IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。另一方面，所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物還包含基因突變，其中所述突變增強對自身抗原的免疫應答。在某些這樣的方法中，所述突變是Fc-γIIB基因失活。
本發(fā)明還提供一種用于產(chǎn)生與預定抗原結(jié)合的人序列抗體的方法，所述方法包括下述步驟用一種預定抗原免疫轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物，其中所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物包含兩個人免疫球蛋白基因座，其中所述兩個人免疫球蛋白基因座中的一個是人重鏈基因座，而另一個是人輕鏈基因座；并且其中所述基因座中僅一個是轉(zhuǎn)染色體的；并且從所述經(jīng)免疫的非人類哺乳動物中收集所述人序列抗體。另一方面，所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物還包含基因突變，其中所述突變增強對自身抗原的免疫應答。在某些這樣的方法中，所述突變是Fc-γIIB基因失活。
本發(fā)明的人序列抗體可以包括各種抗體同種型或其混合物，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE。所述人序列抗體可以是全長的(例如IgG1、IgG4、IgA1或IgA2抗體)，或者可以僅包括抗原結(jié)合部分(例如Fab、F(ab’)2、Fv或Fd片段)。某些人序列抗體是重組人序列抗體。本發(fā)明的人序列抗體通?？梢耘c預定抗原以至少108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1和1012M-1的平衡締合常數(shù)(Ka)結(jié)合。本發(fā)明的某些人序列抗體是單克隆抗體。本發(fā)明的某些人序列抗體是抗原特異性的。
本發(fā)明還提供一種產(chǎn)生分泌人序列抗體的抗原特異性雜交瘤的方法，所述方法包括用預定抗原免疫所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物，其中所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物包含兩個人免疫球蛋白基因座，其中所述兩個人免疫球蛋白基因座中的一個是人重鏈基因座，而另一個基因座是人輕鏈基因座；并且其中所述基因座中僅一個是轉(zhuǎn)染色體的；使得自所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物的淋巴細胞與無限增殖化細胞融合形成雜交瘤細胞；并且測定所述雜交瘤細胞所產(chǎn)生的抗體與所述預定抗原的結(jié)合。在某些這樣的方法中，超過50％的所述抗原特異性雜交瘤克隆分泌具有人重鏈和人輕鏈的抗體。另一方面，所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物還包含基因突變，其中所述突變增強對自身抗原的免疫應答。在某些這樣的方法中，所述突變是Fc-γIIB基因失活。
本發(fā)明還提供一種產(chǎn)生與預定抗原結(jié)合的人序列抗體的方法，所述方法包括下述步驟用預定抗原免疫轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物，其中所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物包含兩個人免疫球蛋白基因座，其中所述兩個人免疫球蛋白基因座中的一個是人重鏈基因座，而另一個基因座是人輕鏈基因座，其中僅一個基因座是轉(zhuǎn)染色體的；并且篩選所形成的存在抗原反應性抗體的雜交瘤細胞。在某些這樣的方法中，所述雜交瘤細胞以超過20％的效率亞克隆。在某些這樣的方法中，所述抗原反應性抗體由培養(yǎng)物中的雜交瘤分泌。在某些這樣的方法中，所述抗原反應性抗體是基本純的。在某些方法中，配制所述基本純的抗體用于治療用途。另一方面，所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物還包含基因突變，其中所述突變增強對自身抗原的免疫應答。在某些這樣的方法中，所述突變是Fc-γIIB基因失活。
本發(fā)明還提供一種產(chǎn)生重排免疫球蛋白序列的方法，所述方法包括提供一種轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物，其中所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物包含兩個人免疫球蛋白基因座，其中所述兩個人免疫球蛋白基因座中的一個是人重鏈基因座，而另一個基因座是人輕鏈基因座，其中僅一個基因座是轉(zhuǎn)染色體的；并且從所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物中獲得所述經(jīng)重排的人免疫球蛋白序列。在某些方法中，所述獲得步驟包括從所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物收集含有所述經(jīng)重排的人免疫球蛋白序列的B淋巴細胞。在這樣的方法中，所述獲得步驟包括從B淋巴細胞中分離和擴增mRNA，以產(chǎn)生cDNA。某些這樣的方法還包括從所述cDNA分離和擴增重鏈和輕鏈可變區(qū)序列。本發(fā)明還提供得自所述cDNA的編碼這些擴增重鏈可變區(qū)序列的分離的核酸。本發(fā)明也提供得自所述cDNA的編碼所述擴增輕鏈可變區(qū)序列的分離的核酸。另一方面，所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物還包含基因突變，其中所述突變增強對自身抗原的免疫應答。在某些這樣的方法中，所述突變是Fc-γIIB基因失活。
另一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的編碼所述人序列抗體、或者抗原結(jié)合部分的核酸分子。因此，包括本發(fā)明抗體編碼核酸的重組表達載體和用這類載體轉(zhuǎn)染的宿主細胞(或這些宿主細胞的后代)也包括在本發(fā)明中，通過培養(yǎng)這些宿主細胞制備本發(fā)明抗體的方法同樣也包括在本發(fā)明中。某些這樣的方法包括在致使所述核酸被表達的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞；并且從所述培養(yǎng)的宿主細胞或其培養(yǎng)基中回收所述核酸。某些宿主細胞是真核細胞。某些這樣的表達載體包含編碼本發(fā)明重鏈和輕鏈可變區(qū)序列的核酸，其中所述重鏈和輕鏈可變區(qū)序列與控制所述核酸在宿主細胞中表達的調(diào)節(jié)序列操作上連接。
本發(fā)明還提供一種產(chǎn)生人抗體展示文庫的方法，所述方法包括將免疫原導入所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物中，其中所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物包含兩個人免疫球蛋白基因座，其中所述兩個人免疫球蛋白基因座中的一個是人重鏈基因座，而另一個基因座是人輕鏈基因座，其中僅一個基因座是轉(zhuǎn)染色體的；從所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物的淋巴細胞中分離編碼人抗體鏈的核酸群體；并且生成展示所述抗體鏈的展示包裝文庫，其中一個文庫成員包含編碼抗體鏈的核酸，而所述抗體鏈由所述包裝展示。在某些這樣的方法中，當進行所述分離步驟時，所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物缺乏對所述免疫原的可檢測效價。在某些這樣的方法中，所述免疫原是一種核酸。在某些這樣的方法中，所述核酸編碼一種膜結(jié)合受體。另一方面，所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物還包含基因突變，其中所述突變增強對自身抗原的免疫應答。在某些這樣的方法中，所述突變是Fc-γIIB基因失活。
本發(fā)明還提供一種產(chǎn)生與預定抗原結(jié)合的人序列抗體或其片段的方法，所述方法包括下述步驟用預定抗原免疫轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物，其中所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物包含兩個人免疫球蛋白基因座，其中所述兩個人免疫球蛋白基因座中的一個是人重鏈基因座，而另一個基因座是人輕鏈基因座，其中僅一個基因座是轉(zhuǎn)染色體的；從所述經(jīng)免疫的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物中收集抗體V區(qū)序列；將所收集的V區(qū)克隆到DNA載體中，產(chǎn)生一個表達文庫；讓所述文庫表達，以鑒定編碼與所述預定抗原結(jié)合的抗體或其片段的V區(qū)序列。另一方面，所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物還包含基因突變，其中所述突變增強對自身抗原的免疫應答。在某些這樣的方法中，所述突變是Fc-γIIB基因失活。
本發(fā)明還提供一種產(chǎn)生與預定抗原結(jié)合的人序列抗體或其片段的方法，所述方法包括下述步驟用預定抗原免疫轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物，其中所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物包含至少兩個人免疫球蛋白基因座，其中所述人免疫球蛋白基因座中的一個是人重鏈基因座，而另一個基因座是人輕鏈基因座；并且其中至少一個基因座是轉(zhuǎn)染色體的；從所述經(jīng)免疫的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物的B細胞或從通過使所述B細胞與無限增殖化細胞融合產(chǎn)生的雜交瘤中，分離編碼至少一個人抗體V區(qū)的cDNA；將所述cDNA克隆到表達載體中；將所述載體導入宿主細胞中；培養(yǎng)所述宿主細胞；并且從所述宿主細胞或其培養(yǎng)基中收集所述人序列抗體或其片段。在某些這樣的方法中，所述分離步驟通過PCR進行。在某些這樣的方法中，所述分離步驟通過用至少一種DNA探針篩選cDNA文庫來進行。在某些這樣的方法中，所述分離步驟通過噬菌體展示文庫篩選來進行。在某些這樣的方法中，所述cDNA編碼全長人抗體序列。在某些方法中，所收集的人序列抗體同種型不同于所述經(jīng)免疫的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物的抗體生產(chǎn)細胞的同種型。另一方面，所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物還包含基因突變，其中所述突變增強對自身抗原的免疫應答。在某些這樣的方法中，所述突變是Fc-γIIB基因失活。
本發(fā)明還提供一種改進表達與預定抗原反應的人抗體的轉(zhuǎn)染色體小鼠雜交瘤細胞的穩(wěn)定性的方法，所述方法包括讓包含轉(zhuǎn)染色體上的第一人免疫球蛋白基因座的第一小鼠和包含插入內(nèi)源小鼠染色體中的第二人免疫球蛋白基因座的第二小鼠一起配種；從所述育種中獲得第三小鼠，所述第三小鼠既包含所述第一人免疫球蛋白基因座，又包含所述第二人免疫球蛋白基因座；用所述預定抗原免疫所述第三小鼠或其后代；從所述經(jīng)免疫的小鼠中收集B細胞；并且使所述B細胞與無限增殖化細胞融合，獲得表達與所述預定抗原反應的人抗體的雜交瘤細胞。某些這樣的方法還包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述雜交瘤細胞；測試所述培養(yǎng)基，以鑒定表達與所述預定抗原反應的人抗體的雜交瘤細胞的存在；稀釋所述雜交瘤細胞；并且培養(yǎng)所述經(jīng)稀釋的雜交瘤細胞，獲得表達與所述預定抗原反應的人單克隆抗體的克隆細胞系。在某些這樣的方法中，從至少50％的經(jīng)鑒定的雜交瘤細胞獲得所述克隆細胞系。
另一方面，本發(fā)明提供一種分泌具有IgA同種型的人序列抗體的小鼠雜交瘤細胞，所述人序列抗體以至少1010M-1的平衡締合常數(shù)(Ka)與特定抗原結(jié)合。
另一方面，本發(fā)明提供一種具有IgA同種型的人序列抗體，所述抗體以至少1010M-1的平衡締合常數(shù)(Ka)與特定抗原結(jié)合。
附圖簡述

圖1.Cμ打靶載體的設計。A)Cμ區(qū)的小鼠基因組DNA。B)Cμ打靶載體。C)被所述Cμ打靶載體同源重組的小鼠基因組DNA。
圖2.人Igμ、γ、κ和小鼠λ鏈在雙TC/KO和雜種小鼠中的血清濃度。
圖3.抗CD4人Igγ在經(jīng)免疫的雙TC/KO和雜種小鼠中第34天時的血清濃度。
圖4.抗CD4人Igκ在經(jīng)免疫的雙TC/KO和雜種小鼠中第34天時的血清濃度。
圖5.在每組(N＝5)中顯示出最高血清效價的雙TC/KO和雜種小鼠中在第34天時抗CD4人Igγ應答的時程。
圖6.在每組(N＝5)中顯示出最高血清效價的雙TC/KO和雜種小鼠在第34天時抗CD4人Igκ應答的時程。
圖7.KM2-3雜交瘤細胞的生長曲線和抗CD4人單克隆抗體的產(chǎn)生。
圖8.抗GCSF人Igγ在經(jīng)免疫的雙TC/KO和雜種小鼠中第34天時的血清濃度。
圖9.抗GCSF人Igκ在經(jīng)免疫的雙TC/KO和雜種小鼠中第34天時的血清濃度。
圖10.在每組(N＝5)中顯示出最高血清效價的雙TC/KO和雜種小鼠在第34天時抗GCSF人Igγ應答的時程。
圖11.在每組(N＝5)中顯示出最高血清效價的雙TC/KO和雜種小鼠在第34天時抗GCSF人Igκ應答的時程。
圖12.抗CTLA-4人單克隆抗體的阻斷活性的劑量反應曲線。
圖13.用單克隆抗體抑制CTLA-4(生物素)與B7.2細胞的結(jié)合。
圖14.雜種(Fc)小鼠血清中對牛C-IV的增強的應答。
發(fā)明詳述術(shù)語“轉(zhuǎn)染色體”是指可以被轉(zhuǎn)移到非人類哺乳動物細胞中的染色體或其片段。一種導入所述轉(zhuǎn)染色體的示例性細胞為ES細胞。轉(zhuǎn)染色體可以包含選擇標記，并且可以來源于非人類哺乳動物的不同物種。轉(zhuǎn)染色體可以包含人染色體的一部分。術(shù)語“轉(zhuǎn)染色體的(transchromosomic)”或者“轉(zhuǎn)染色體(transchromosome)”是指“保留轉(zhuǎn)染色體”或“轉(zhuǎn)染色體的(be of transchromosome)”。
本發(fā)明的人序列抗體可以在轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物如轉(zhuǎn)基因小鼠中生產(chǎn)，所述人序列抗體能夠通過經(jīng)歷抗體V-D-J重組以及對于非IgM/非IgD而言的同種型轉(zhuǎn)換，產(chǎn)生針對各種各樣抗原的多種人(例如單克隆或多克隆)抗體同種型(例如IgM、IgD、IgG、IgA和/或IgE)。因此，本發(fā)明的各個方面包括抗體和抗體片段及其藥用組合物、以及用于制備這樣的單克隆抗體的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物、B細胞和雜交瘤。
除非另有說明，術(shù)語“患者”或“受治療者”可互換使用，是指哺乳動物如人類患者和非人類靈長類動物、和實驗動物如兔子、大鼠和小鼠、以及其它動物。
術(shù)語“治療”包括給予本發(fā)明的化合物或藥物，以預防或延遲癥狀、并發(fā)癥或疾病的生物化學指標的發(fā)生、緩解癥狀或阻滯或抑制疾病、病癥或失調(diào)(例如自身免疫病)的進一步發(fā)展。治療可以是預防性的(以預防或延遲疾病發(fā)生，或者預防其臨床或亞臨床癥狀表現(xiàn))、或者在疾病表現(xiàn)后癥狀的治療性抑制或緩解。
一般而言，短語“很好耐受的”是指在健康狀況下沒有由于所述治療而發(fā)生的并且可能影響治療決定的不利變化。
本文使用的術(shù)語“淋巴細胞”具有本領域的正常含義，是指在血液、淋巴和淋巴組織中存在的任何單核非吞噬性白細胞，即B淋巴細胞和T淋巴細胞。
短語“T淋巴細胞亞群”或“T細胞亞群”是指特征為表達特定細胞表面標記的T淋巴細胞或T細胞(參見Barclay，A.N.等(編著)，1997，THE LEUKOCYTE ANTIGEN FACTS BOOK，2ND.EDITION，Academic Press，London，United Kingdom；該文獻通過引用結(jié)合到本文中用于所有目的)。
術(shù)語“細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原-4”、“CTLA-4”、“CTLA4”、“CTLA-4抗原”和“CD152”(參見例如Murata，1999，Am.J.Pathol.155453-460)可互換使用，包括人CTLA-4的變異體、同種型、物種同系物和具有至少一種與CTLA-4共同的表位的類似物(參見例如Balzano，1992，Int.J.Cancer Suppl.728-32)。
人CTLA-4的完整cDNA序列的Genbank登記號為L15006。氨基酸1-37的區(qū)為前導肽；38-161為胞外V樣結(jié)構(gòu)域；162-187為跨膜結(jié)構(gòu)域；且188-223為胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。所述核苷酸序列的變異體已有報道，包括49位的G→A轉(zhuǎn)變、272位的C→T轉(zhuǎn)變和439位的A→G轉(zhuǎn)變。小鼠CTLA-4的完整DNA序列的EMBL登記號為X05719(Brunet等，1987，Nature 328267-270)。氨基酸1-35區(qū)為前導肽。
術(shù)語“表位”是指能夠與抗體特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)決定簇。表位通常由分子如氨基酸或糖側(cè)鏈的化學活性表面集合(surface grouping)組成，通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征以及特定的電荷特征。構(gòu)象和非構(gòu)象表位的區(qū)別在于，在變性溶劑存在下，與前者的結(jié)合而非與后者的結(jié)合喪失。
完整的“抗體”至少包含通過二硫鍵互聯(lián)的兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈。每條重鏈由重鏈可變區(qū)(在此縮寫為VH)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三個結(jié)構(gòu)域-CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(在此縮寫為VL)和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個結(jié)構(gòu)域-CL組成。VH區(qū)和VL區(qū)還可以進一步細分為散布有更為保守的區(qū)(稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的超變區(qū)(稱為互補性決定區(qū)(CDR)。每個VH和VL由三個CDR和四個FR組成，從氨基末端至羧基末端按以下順序排布FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有一個與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可以通過細胞受體如Fc受體(例如FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIII和FcRη)和經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一組分(Clq)，介導免疫球蛋白與包括免疫系統(tǒng)的各種細胞(例如效應細胞)在內(nèi)的宿主組織或因子的結(jié)合。術(shù)語抗體包括完整抗體中保留結(jié)合抗原能力的抗原結(jié)合部分。抗原結(jié)合部分的實例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；(ii)F(ab’)2片段，包含在鉸鏈區(qū)通過二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成；(iv)Fv片段，由抗體一個臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成，(v)dAb片段(Ward等，1989 Nature 341544-546)，由一個VH結(jié)構(gòu)域組成；和(vi)分離的互補性決定區(qū)(CDR)。此外，雖然Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域VL和VH由分開的基因編碼，但可以采用重組方法，將它們用一個合成接頭連接起來，所述合成接頭使它們能夠成為一個單一蛋白鏈，其中VL和VH區(qū)配對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如Bird等，1988，Science 242423-426；和Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.855879-5883)。這樣的單鏈抗體包括在術(shù)語“抗體”范圍內(nèi)。通過重組技術(shù)或者酶促或化學切割完整的抗體，可以制備片段。
術(shù)語“人序列抗體”包括具有來源于人免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)(如果有的話)的抗體。本發(fā)明的人序列抗體可以包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如通過體外隨機誘變或定點誘變或者通過體內(nèi)體細胞突變引入的突變)。然而，本文所用的術(shù)語“人序列抗體”并不包括其中足以賦予抗原特異性且來源于另一哺乳動物物種(例如小鼠)種系的完整CDR序列已被移植到人構(gòu)架序列上的抗體(即人源化抗體)。
術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”是指單分子組合物的抗體分子的制備物。單克隆抗體組合物表現(xiàn)出對特定表位的單一的結(jié)合特異性和親和性。因此，術(shù)語“人單克隆抗體”是指具有來源于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)(如果有的話)、顯示出單一結(jié)合特異性的抗體。在一個實施方案中，所述人單克隆抗體由雜交瘤產(chǎn)生，所述雜交瘤包括得自具有包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物(例如轉(zhuǎn)基因小鼠)、與無限增殖化細胞融合的B細胞。
術(shù)語“雙克隆(diclonal)抗體”是指針對一種抗原的至少兩種抗體的制備物。通常，不同的抗體結(jié)合不同的表位。
術(shù)語“寡克隆(oligoclonal)抗體”是指針對一種抗原的3-100種不同抗體的制備物。通常，這樣一種制備物中的抗體與許多不同的表位結(jié)合。
術(shù)語“多克隆抗體”是指指針對一種抗原的不止一種(兩種或兩種以上)不同抗體的制備物。通常，這樣一種制備物包括與許多不同的表位結(jié)合的抗體。
本發(fā)明提供針對各種各樣抗原的人序列抗體，包括抗人CTLA-4、人G-CSF、人HSA、人CD4和人EGFR的人抗體。本發(fā)明的人抗體包括阻斷或拮抗由細胞表面受體(如人CTLA-4受體和人CD4共同受體)所轉(zhuǎn)導信號的抗體。這些抗體中的某些抗體可以與人CTLA-4上的表位結(jié)合，以抑制CTLA-4與人B7反受體相互作用。同樣所述抗體中的某些抗體可以與人CD4上的表位結(jié)合，以抑制CD4與人II類MHC相互作用。因為人CTLA-4與人B7的相互作用轉(zhuǎn)導一種信號，導致帶有人CTLA-4受體的T細胞失活，所以對所述相互作用的拮抗有效誘導、增加或延長帶有人CTLA-4受體的T細胞的活化，從而延長或增強免疫應答?！胺忾]性抗體”是指在抗體結(jié)合位點與人CTLA-4配體結(jié)合位點之比大于1∶1并且抗體的濃度高于10-8M的條件下，將可溶性人CTLA-4與表達人B7配體的細胞的結(jié)合降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或99.9％的抗體。
本發(fā)明還提供針對各種各樣人抗原的人序列IgA抗體。示例性的IgA抗體包括CD4、G-CSF、CTLA-4和EGFR。因為IgA抗體可以形成二聚體，所以這種IgA抗體可以具有改進的交聯(lián)特性。
有時稱為多價制備物的其它抗體制備物與細胞表面受體如人CTLA-4結(jié)合，其結(jié)合方式使得同一細胞上的多個人CTLA-4受體交聯(lián)。
通過組合具有不同表位特異性的可溶性二價抗體，也可以完成交聯(lián)。這些多克隆抗體制備物包含與所述抗原上不同表位結(jié)合的至少兩對重鏈和輕鏈，使得由于抗體介導的交聯(lián)而可以轉(zhuǎn)導信號。
術(shù)語“重組人抗體”包括通過重組方法制備、表達、構(gòu)建或分離的本發(fā)明的所有人序列抗體，例如從對于人免疫球蛋白基因為轉(zhuǎn)基因的動物(例如小鼠)中分離的抗體(在下文有進一步的描述)；利用轉(zhuǎn)染到宿主細胞中的重組表達載體表達的抗體、從重組組合人抗體文庫分離的抗體、或者通過涉及將人免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列上的任何其它方法制備、表達、構(gòu)建或分離的抗體。這樣的重組人抗體具有來源于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)(如果有的話)。然而，可以對這樣的抗體進行體外誘變(或者當使用對于人Ig序列為轉(zhuǎn)基因的動物時，進行體內(nèi)體細胞誘變)，因此所述重組抗體的VH區(qū)和VL區(qū)的氨基酸序列是雖然來源于人種系VH和VL序列并且與之相關(guān)、但可能在體內(nèi)于通常情況下并不存在于人抗體種系庫中的序列。
“異源抗體”是對于產(chǎn)生這種抗體的轉(zhuǎn)基因非人類生物體而言定義的。該術(shù)語是指具有對應于在不包括所述轉(zhuǎn)基因非人類動物的生物體中存在的、一般得自除所述轉(zhuǎn)基因非人類動物以外的物種的氨基酸序列或編碼核酸序列的抗體。
“異源雜種抗體”是指具有來源于不同生物體的輕鏈和重鏈的抗體。例如，與鼠輕鏈結(jié)合的人重鏈的抗體是一種異源雜種抗體。
術(shù)語“基本純的”或“分離的”是指已經(jīng)鑒定并且從其天然環(huán)境組分中分離和/或回收使其成為所存在的主要種類的目標種類(objectspecies)(例如本發(fā)明的抗體)(即以摩爾濃度計，它比組合物中的任何其它個別種類更為豐富)；“基本純”或“分離的”組合物也指其中所述目標種類至少占所存在的所有大分子種類的大約50％(以摩爾濃度計)。基本純或分離的組合物也可以占所述組合物中所存在的所有大分子種類重量的大約80-90％以上。分離的目標種類(例如本發(fā)明的抗體)也可以被純化至基本均質(zhì)(在所述組合物中用常規(guī)檢測法檢測不到污染種類)，其中所述組合物基本上由單一大分子種類的衍生物組成。例如，分離的抗人CTLA-4抗體可以基本上不含不與人CTLA-4結(jié)合而與不同抗原結(jié)合的其它抗體。此外，與人CTLA-4的一種表位、同種型或變異體特異性結(jié)合的分離的抗體卻可能具有與其它相關(guān)抗原如得自其它物種的抗原(例如CTLA-4物種同系物)的交叉反應性。此外，本發(fā)明的分離抗體基本上不含其它細胞物質(zhì)(例如非免疫球蛋白相關(guān)蛋白)和/或化學物質(zhì)。
“特異性結(jié)合”是指相對于其它非特定抗原而言，抗體優(yōu)先與特定抗原結(jié)合。短語與抗體“特異性地(或選擇性地)結(jié)合”是指確定在不均一蛋白質(zhì)群體和其它生物制品中存在所述蛋白質(zhì)的結(jié)合反應。通常，所述抗體以至少大約1×106M-1或107M-1、或者大約108M-1-109M-1、或者大約1010M-1-1011M-1或更高的締合常數(shù)(Ka)結(jié)合，并且與所述特定抗原的結(jié)合親和力至少兩倍于與除所述特定抗原或密切相關(guān)抗原以外的非特定抗原(例如BSA、酪蛋白)結(jié)合的親和力。短語“識別一種抗原的抗體”和“對一種抗原特異性的抗體”在此與術(shù)語“與抗原特異性結(jié)合的抗體”可互換使用。預定的抗原是在選擇與該抗原結(jié)合的抗體之前選擇出的抗原。
短語“特異性結(jié)合”當指肽時，是指具有僅與靶分子或主要與靶分子結(jié)合的中等或高結(jié)合親和力的肽分子。短語“特異性結(jié)合”是指確定在不均一蛋白質(zhì)群體和其它生物制品中存在靶蛋白的結(jié)合反應。因此，在指定的測定條件下，所述特指的結(jié)合部分優(yōu)先與特定靶蛋白結(jié)合，而不以顯著量與試驗樣品中存在的其它組分結(jié)合。在這種條件下與靶蛋白的特異性結(jié)合可能需要根據(jù)其對特定靶抗原的特異性而選擇出的一種結(jié)合部分。可以使用各種各樣的測定形式，來選擇與特定蛋白特異性反應的配體。例如，使用固相ELISA免疫測定、免疫沉淀、Biacore和蛋白質(zhì)印跡法來鑒定與所述抗原特異性反應的肽。通常，特異性或選擇性反應將至少兩倍于本底信號或噪聲，更通常在10倍于本底以上。
術(shù)語抗體的“高親和性”是指平衡締合常數(shù)(Ka)至少為大約107M-1、至少大約108M-1、至少大約109M-1、至少大約1010M-1、至少大約1011M-1或者至少大約1012M-1或更高，例如高達1013M-1或1014M-1或更高。然而，“高親和性”結(jié)合對于其它抗體同種型而言可能改變。
本文所用的術(shù)語“Ka”是指特定抗體-抗原相互作用的平衡締合常數(shù)。這一常數(shù)的單位為1/M。
本文所用的術(shù)語“Kd”是指特定抗體-抗原相互作用的平衡解離常數(shù)。這一常數(shù)的單位為M。
本文所用的術(shù)語“ka”是指特定抗體-抗原相互作用的動態(tài)(kinetic)締合常數(shù)。這一常數(shù)的單位為1/Ms。
本文所用的術(shù)語“Kd”是指特定抗體-抗原相互作用的動態(tài)解離常數(shù)。這一常數(shù)的單位為1/s。
“特定抗體-抗原相互作用”是指測量平衡常數(shù)和動態(tài)常數(shù)的試驗條件。
“同種型”是指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類別。重鏈分為γ、μ、α、δ或ε，分別限定抗體的同種型為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。另外的結(jié)構(gòu)變異鑒定了IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)和IgA(例如IgA1和IgA2)的不同亞型。
“同種型轉(zhuǎn)換”是指抗體的類別或同種型從一種Ig類別變?yōu)槠渌麵g類別之一的現(xiàn)象。
“非轉(zhuǎn)換同種型”是指當不發(fā)生同種型轉(zhuǎn)換時產(chǎn)生的重鏈的同種型類別；編碼所述非轉(zhuǎn)換同種型的CH基因通常是緊接功能性重排VDJ基因下游的第一個CH基因。同種型轉(zhuǎn)換分為經(jīng)典或非經(jīng)典同種型轉(zhuǎn)換。經(jīng)典同種型轉(zhuǎn)換通過涉及所述轉(zhuǎn)基因中至少一個轉(zhuǎn)換序列區(qū)的重組事件而發(fā)生。非經(jīng)典同種型轉(zhuǎn)換可以通過例如人σμ和人∑μ(δ相關(guān)缺失)之間同源重組而發(fā)生?？晒┻x擇的非經(jīng)典轉(zhuǎn)換機制例如其中有轉(zhuǎn)基因間和/或染色體間重組可能發(fā)生，而完成同種型轉(zhuǎn)換。
術(shù)語“轉(zhuǎn)換序列”是指負責轉(zhuǎn)換重組的那些DNA序列?！稗D(zhuǎn)換供體”序列通常為μ轉(zhuǎn)換區(qū)，位于在所述轉(zhuǎn)換重組期間將被缺失的構(gòu)建體區(qū)的5’(即上游)?！稗D(zhuǎn)換受體”區(qū)位于構(gòu)建體待缺失區(qū)和取代恒定區(qū)(例如γ、ε等)之間。由于沒有總是發(fā)生重組的特定位點，故此最終的基因序列根據(jù)所述構(gòu)建體通常是不可預測的。
“糖基化模式”定義為與蛋白質(zhì)共價連接、更具體地說與免疫球蛋白共價連接的糖單位的模式?？紤]到本領域技術(shù)人員會認識到，與所述轉(zhuǎn)基因CH基因來源的物種相比，所述異源抗體的糖基化模式與所述轉(zhuǎn)基因非人類動物物種中的所述糖基化模式更為相似，所以異源抗體的糖基化模式可以被描述為與在所述轉(zhuǎn)基因非人類動物的物種所產(chǎn)生的抗體上正常發(fā)生的糖基化模式相似。
術(shù)語“天然存在的”當用于物體時，是指物體可以在自然界中發(fā)現(xiàn)的事實。例如，生物體(包括病毒)中存在的、可以從自然界的來源分離并且未經(jīng)人類在實驗室有意修飾的多肽或多核苷酸序列就是天然存在的。
術(shù)語“免疫球蛋白基因座”是指包含B細胞或B細胞前體可以用以表達免疫球蛋白肽的信息的遺傳元件或一組相關(guān)的遺傳元件。這種肽可以是重鏈肽、輕鏈肽，或者是重鏈肽和輕鏈肽的融合體。就未經(jīng)重排的基因座而言，所述遺傳元件被B細胞前體裝配，形成編碼免疫球蛋白肽的基因。就經(jīng)重排的基因座而言，編碼免疫球蛋白肽的基因包含在所述基因座中。
術(shù)語“重排的”是指其中在分別編碼基本上完整的VH或VL結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象中V區(qū)段緊鄰D-J或J區(qū)段定位的重鏈或輕鏈免疫球蛋白基因座的構(gòu)型。通過與種系DNA比較，可以鑒定重排的免疫球蛋白基因座；重排的基因座具有至少一個重組的七聚體/九聚體同源性元件。
涉及V區(qū)段的術(shù)語“未經(jīng)重排的”或“種系構(gòu)型”是指其中V區(qū)段未經(jīng)過重組而緊鄰D區(qū)段或J區(qū)段的構(gòu)型。
術(shù)語“核酸”或“核酸分子”是指或者單鏈形式或者雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，除非另有說明，可以包括可以以與天然存在的核苷酸類似的方式起作用的天然核苷酸的已知類似物。
涉及編碼與所述抗原結(jié)合的抗體或抗體部分(例如VH、VL、CDR3)的核酸的術(shù)語“分離的核酸”，是指其中編碼所述抗體或抗體部分的核苷酸序列不含編碼與除例如CTLA-4以外的抗原結(jié)合的抗體或抗體部分的其它核苷酸序列的核酸，所述其它序列在人基因組DNA中可能天然位于所述核酸的側(cè)翼。
在兩種核酸或多肽方面的術(shù)語“基本相同”是指當在最大對應方面進行比較和比對時，采用以下序列比較法和/或通過目測檢查測定，具有至少約80％、約90％、約95％或更高的核苷酸或氨基酸殘基同一性的兩個或兩個以上序列或亞序列。這樣的“基本相同的”序列通常被認為是同源的。“基本同一性”可以在序列中至少長約50個殘基的區(qū)內(nèi)、在至少約100個殘基的區(qū)內(nèi)、或者在至少150個殘基的區(qū)內(nèi)或者在兩個待比較的全長序列內(nèi)存在。如下所述，通過運用Kabat的編號方案，任兩個抗體序列可以僅以一種方式進行序列對比。因此，對于抗體而言，同一性百分比具有獨特和已有很好定義的含義。
得自免疫球蛋白成熟重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸被分別命名為Hx和Lx，其中x是依照Kabat，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(National Institutes of Health，Bethesda，MD，1987和1991)的方案，指定氨基酸位置的數(shù)字。Kabat列出了每個亞組抗體的許多氨基酸序列，并且列出了該亞組中每個殘基位置的最常存在的氨基酸，從而產(chǎn)生一個共有序列。Kabat采用給一個所列序列中的每個氨基酸指定一個殘基編號的方法，這種指定殘基編號的方法在本領域中已經(jīng)成為標準。通過以保守氨基酸為坐標將所述抗體與Kabat中的共有序列之一進行序列比對，Kabat方案可延伸至在其綱要中不包括的其它抗體。應用Kabat編號系統(tǒng)可容易地標識不同抗體中等同位置上的氨基酸。例如，人抗體L50位的氨基酸占據(jù)與小鼠抗體氨基酸位置L50等同的位置。同樣，當依照Kabat編號約定(Kabat numbering convention)對由相應核酸編碼的氨基酸序列進行比對時，對編碼抗體鏈的核酸進行序列比對。一個可供選擇的結(jié)構(gòu)限定已經(jīng)由Chothia等提出(Chothia，1987 J.Mol.Biol.196901-917；Chothia等，1989，Nature 342878-883；和Chothia等，J.Mol.Biol.186651-663(1989)，所述文獻通過引用結(jié)合到本文中用于所有目的)。
短語“選擇性(或特異性)雜交”是指當一種分子與特定核苷酸序列當所述序列存在于復雜混合物(例如總細胞或文庫DNA或RNA)中時在嚴格性雜交條件下的結(jié)合、形成雙鏈體或雜交，其中檢測到至少約10倍于本底的所述特定核苷酸序列。在一個實施方案中，可以根據(jù)核酸與在其它情況下確定屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的一種核酸(例如本文所述的示例性序列)在嚴格性條件下雜交的能力，確定所述核酸在本發(fā)明范圍內(nèi)。
短語“嚴格性雜交條件”是指探針將與通常在復雜的核酸混合物中的其靶亞序列雜交、而不與其它序列以顯著量(陽性信號(例如本發(fā)明核酸的鑒定)約10倍于本底雜交)雜交的條件。嚴格性條件依賴于序列，并且在不同情況下有所不同。較長的序列在較高溫度下特異性雜交。關(guān)于核酸雜交的多方面的指南在例如以下文獻中找到Sambrook編著，MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL(2NDED.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，(1989)；CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Ausubel編著.John Wiley &Sons，Inc.，New York(1997)；LABORATORY TECHNIQUES INBIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGYHYBRIDIZATIONWITH NUCLEIC ACID PROBES，PART I.Theory and Nucleic AcidPreparation，Tijssen編著.Elsevier，N.Y.(1993).
一般而言，嚴格性條件選擇為在限定的離子強度pH下低于特定序列熱解鏈溫度(Tm)約5-10℃。Tm為平衡條件下50％與靶互補的探針與靶序列雜交的溫度(在限定的離子強度、pH和核酸濃度下)(當靶序列過量存在時，在Tm下，平衡時有50％所述探針被占用)。嚴格性條件將是其中鹽濃度低于約1.0M鈉離子、通常約0.01-1.0M鈉離子濃度(或其它鹽)、pH 7.0-8.3且對于短探針(例如10-50個核苷酸)溫度至少為約30℃、而對于長探針(例如超過50個核苷酸)至少為約60℃的條件。嚴格性條件也可以通過加入去穩(wěn)定劑如Sambrook(下文所述)所述的甲酰胺來達到。對于高嚴格性雜交，陽性信號至少兩倍于本底、優(yōu)選10倍于本底雜交。示例性的高嚴格性或嚴格性雜交條件包括50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS、于42℃保溫，或者5×SSC和1％SDS、于65℃保溫；在0.2×SSC和0.1％SDS中于65℃洗滌。對于選擇性或特異性雜交，陽性信號(例如本發(fā)明核酸的鑒定)約10倍于本底雜交。用以鑒定本發(fā)明范圍內(nèi)的核酸的嚴格性雜交條件包括例如在包含50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS的緩沖液中于42℃雜交，或者在包含5×SSC和1％SDS的緩沖液中于65℃雜交，洗滌條件都為0.2×SSC和0.1％SDS、65℃。在本發(fā)明中，可以在標準DNA印跡中，在嚴格性條件下用此中公開的核酸序列，鑒定包含本發(fā)明核酸的基因組DNA或cDNA。用于這種雜交的其它嚴格性條件(用以鑒定本發(fā)明范圍內(nèi)的核酸)是包括在40％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的緩沖液中于37℃雜交的條件。
然而，雜交形式的選擇并不重要，正是洗滌條件的嚴格性建立了確定核酸是否在本發(fā)明范圍內(nèi)的條件。用以鑒定本發(fā)明范圍內(nèi)的核酸的洗滌條件包括例如約0.02M的鹽濃度、pH7和至少約50℃或約55℃至約60℃的溫度；或者約0.15M NaCl的鹽濃度、72℃達約15分鐘；或者0.2×SSC的鹽濃度、至少約50℃或約55℃至60℃的溫度達約15分鐘至約20分鐘；或者；雜交復合體用鹽濃度約2×SSC、含0.1％SDS的溶液于室溫洗滌2次，每次15分鐘，然后用含0.1％SDS的0.1×SSC于68℃洗滌2次，每次15分鐘；或者等同條件。參見Sambrook、Tijssen和Ausubel關(guān)于SSC緩沖液和等同條件的描述。
術(shù)語“序列同一性”是指氨基酸序列或核苷酸序列之間相似性的度量，可以采用本領域已知的方法例如以下所述的方法測量涉及兩個或兩個以上核酸序列或多肽序列的術(shù)語“相同”或“同一性”百分率，是指當在比較窗或者指定區(qū)域內(nèi)的最大對應方面進行比較和比對時，采用以下序列比較算法或者通過人工序列比對和目測檢查測量，相同或者具有特定百分比的相同氨基酸殘基或核苷酸(即60％同一性、優(yōu)選65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性)的兩個或兩個以上的序列或亞序列。
涉及兩種核酸或多肽的短語“基本相同”是指當在最大對應方面進行比較和比對時，采用以下序列比較算法或者通過目測檢查測量，核苷酸或氨基酸殘基的同一性至少60％、通常至少70％、優(yōu)選至少80％、最優(yōu)選至少90％或至少95％的兩個或兩個以上的序列或亞序列。優(yōu)選在長度至少為約50個堿基或殘基的序列區(qū)域內(nèi)、更優(yōu)選在至少約100個堿基或殘基的區(qū)域內(nèi)存在顯著同一性，最優(yōu)選所述序列在至少約150個堿基或殘基內(nèi)基本相同。在一個最優(yōu)選的實施方案中，所述序列在全長編碼區(qū)內(nèi)基本相同。
關(guān)于序列比較，通常將一個序列作為參比序列，將待測序列與其進行比較。當使用序列比較算法時，將待測序列和參比序列輸入計算機，必要時指定亞序列坐標，并且指定序列算法程序參數(shù)?？梢允褂萌笔〕绦騾?shù)，或者可以指定參數(shù)。根據(jù)所述程序參數(shù)，序列比較算法則計算待測序列相對于參比序列的序列同一性百分比。關(guān)于核酸和蛋白質(zhì)的序列比較，可以使用BLAST和BLAST 2.0算法以及以下論述的缺省參數(shù)。
本文所用的“比較窗”包括涉及具有選自20-600、通常約50-200、更通常約100-150的任一數(shù)目的連續(xù)位置、其中在將一個序列與具有相同數(shù)目的連續(xù)位置的參比序列在兩個序列最佳比對后可以將其進行比較的區(qū)段。將序列比對以供比較的方法是本領域眾所周知的?？梢岳缤ㄟ^以下算法，進行用于比較的最佳序列比對Smith和Waterman的局部同源性算法，1981，Adv.Appl.Math.2482)；Needleman和Wunsch的同源性比對算法，1970，J.Mol.Biol.48443；Pearson和Lipman的相似性搜索方法，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.852444；這些算法的計算機工具(FASTDB(Intelligenetics)、BLAST(National Center for Biomedical Information)、Wisconsin GeneticsSoftware Package中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)；或者人工序列比對和目測檢查(參見例如Ausubel等，1987(1999 Suppl.)，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.)。
適合于測定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一個優(yōu)選實例是FASTA算法，它在Pearson，W.R.和Lipman，D.J.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.852444中有描述。也參見W.R.Pearson，1996，Methods Enzymol.266227-258。在DNA序列的FASTA算法中用來計算同一性百分比的優(yōu)選參數(shù)是優(yōu)選的，BL50 Matrix 15-5，k-tuple＝2；joining penalty＝40，optimization＝28；gap penalty-12，gap length penalty＝-2；和width＝16。
適用于測定序列同一性和序列相似性百分比的另一個優(yōu)選的算法實例是BLAST和BLAST 2.0算法，它們分別在Altschul等，1977，Nuc.Acids Res.253389-3402和Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215403-410中有描述。使用BLAST和BLAST 2.0和本文所述的參數(shù)，來測定本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)的序列同一性百分比。用于進行BLAST分析的軟件公眾可通過the National Center for Biotechnology Information(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)得到。該算法包括首先通過鑒定在查詢序列中與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字串比對時或者匹配或者滿足某些正數(shù)值最低分值T的長度W的短字串，來鑒定高分序列配對(HSP)。T被稱為鄰近字串最低分值(Altschul等，參見上文)。這些原始鄰近字串命中作為起始搜索以發(fā)現(xiàn)含有它們的更長HSP的種子。只要累積序列比對分值可以增加，字串命中則以兩個方向沿每個序列延伸。對于核苷酸序列，使用參數(shù)M(一對匹配殘基的獎分(reward score)；總是＞0)和N(錯配殘基的罰分(penalty score)；總是＜0)，計算累積分值。對于氨基酸序列，使用打分矩陣來計算累積分值。字串命中在每個方向的延伸當遇到下述情況之一時終止累積序列比對分值比其獲得的最大值低數(shù)量X；累積分值為零或零以下，這是由于一個或多個負打分殘基比對的累積所致；或者到達任一序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定所述比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用的缺省字長(wordlength)(W)為11，期望值(Expectation)(E)為10，M＝5，N＝-4，并且比較兩條鏈。對于氨基酸序列而言，BLASTP程序使用的缺省字長(W)為3，期望值(E)為10，使用BLOSUM62打分矩陣(參見Henikoff和Henikoff，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8910915)序列比對(B)為50，期望值(E)為10，M＝5，N＝-4，并且比較兩條鏈。
BLAST算法也進行兩個序列之間相似性的統(tǒng)計學分析(參見例如Karlin和Altschul，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.905873-5787)。BLAST算法提供的一種相似性測定是最小和概率(P(N))，它提供兩個核苷酸序列或氨基酸序列可能偶然發(fā)生匹配的概率的指標。例如，如果待測核酸與參比核酸比較中的最小和概率低于大約0.2，更優(yōu)選低于大約0.01，最優(yōu)選低于大約0.001，則認為待測核酸與參比序列相似。
有用算法的另一個實例是PILEUP。PILEUP運用漸近配對序列比對，由一組相關(guān)序列創(chuàng)建多序列比對，以顯示相關(guān)性和序列同一性百分比。它也繪出進化樹或分枝圖(dendogram)，以顯示用來創(chuàng)建所述序列比對的聚類關(guān)系。PILEUP采用Feng和Doolittle，1987，J.Mol.Evol.35351-360的漸近序列比對方法的簡化方法。所使用的方法類似于Higgins和Sharp，1989，CABIOS 5151-153描述的方法。所述程序可以比對多達300個序列，每個序列最大長度為5,000個核苷酸或氨基酸。所述多序列比對法始于兩個最為相似序列的配對比對，產(chǎn)生一組兩個經(jīng)比對的序列。然后該組序列與下一個最相關(guān)的序列或下一組經(jīng)比對的序列進行比對。通過兩個個別序列的配對比對的簡單延伸，將兩組序列進行比對。通過一系列漸近配對序列比對，完成最終的序列比對。通過指定具體序列及其序列比較區(qū)的氨基酸或核苷酸坐標并且指定程序參數(shù)，運行該程序。例如，運用PILEUP，采用以下參數(shù)缺省空位加權(quán)(default gap weight)(3.00)、缺省空位長度加權(quán)(default gap lengthweight)(0.10)和加權(quán)末端空位(weighted end gap)，可以將參比序列與其它待測序列進行比較，以確定序列同一性關(guān)系百分比。可以從GCG序列分析軟件包得到PILEUP，例如7.0版本(Devereaux等，1984，Nuc.Acids Res.12387-395。
適用于多DNA和氨基酸序列比對的算法的另一優(yōu)選實例是CLUSTALW程序(Thompson，J.D.等，1994，Nucl.Acids.Res.224673-4680)。ClustalW在多組序列之間進行多配對比較，然后根據(jù)同源性將它們裝配為一個多序列比對。Gap open(空位開放)罰分和Gap extension(空位拓展)罰分分別為10和0.05。對于氨基酸序列比對，可以用BLOSUM算法作為蛋白質(zhì)分子量矩陣(Henikoff和Henikoff，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8910915-10919)。
本發(fā)明的核酸以全細胞、細胞裂解液或者部分純化或基本純的形式存在。當通過標準技術(shù)，包括堿/SDS處理、CsCl分帶(CsCl banding)、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳和本領域熟知的其它方法(參見例如本文論述的Sambrook、Tijssen和Ausubel的方法，所述文獻通過引用結(jié)合到本文中用于所有目的)，將核酸純化而使其與其它細胞組分或其它污染物如其它細胞核酸或蛋白質(zhì)分離時，則所核酸是“分離的”或者“成為基本純的”。本發(fā)明的核酸序列和用于實施本發(fā)明的其它核酸，無論是RNA、cDNA、基因組DNA，還是其雜合體，都可以從各種各樣的來源分離，對其遺傳工程改造、擴增和/或重組表達?？梢允褂萌魏沃亟M表達系統(tǒng)，除細菌外，包括例如酵母、昆蟲或哺乳動物系統(tǒng)。另一方面，可以在體外化學合成這些核酸。核酸操作的技術(shù)如亞克隆到表達載體中、標記探針、測序和雜交，在科學文獻和專利文獻中有全面的描述，參見例如Sambrook，Tijssen和Ausubel?？梢圆捎帽绢I域技術(shù)人員熟知的多種通用方法中的任何一種，對核酸進行分析和定量。這些包括例如分析性生物化學方法例如NMR、分光光度法、射線照相術(shù)、電泳、毛細管電泳、高效液相層析(HPLC)、薄層層析(TLC)和超擴散層析；各種免疫學方法，例如流體或凝膠沉淀素反應、免疫擴散(單向或雙向)、免疫電泳、放射免疫測定(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、免疫熒光測定、DNA印跡分析、RNA印跡分析、斑點印跡分析、凝膠電泳(例如SDS-PAGE)、RT-PCR、定量PCR、其它核酸或靶或信號擴增法、放射性標記、閃爍計數(shù)和親和層析。
本發(fā)明的核酸組合物雖然通常在天然序列中(除經(jīng)修飾的限制位點等)，但可以依照標準技術(shù)，使得自或者cDNA、基因組或者混合物的本發(fā)明的核酸突變，以提供基因序列。對于編碼序列，這些突變可能影響所需的氨基酸序列。具體地說，考慮了與天然V、D、J、恒定區(qū)、轉(zhuǎn)換序列和本文所述的其它這類序列基本同源或來源于所述序列的DNA序列(其中“來源于”表示一種序列與另一序列相同或由另一序列經(jīng)修飾而來)。
當將核酸置于與另一核酸序列的功能關(guān)系中時，所述核酸被“操作上連接”。例如，如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則所述啟動子或增強子與所述序列操作上連接。關(guān)于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，操作上連接是指所連接的DNA序列相鄰，并且必要時使兩個蛋白質(zhì)編碼序列相鄰并且符合讀框地連接。對于轉(zhuǎn)換序列，操作上連接表示所述序列能夠影響轉(zhuǎn)換重組。
術(shù)語“載體”是指能夠轉(zhuǎn)運與之連接的另一種核酸的核酸分子。一種類型的載體是“質(zhì)?！?，質(zhì)粒是指可以將額外的DNA區(qū)段連接到其中的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種類型的載體是病毒載體，其中額外的DNA區(qū)段可以被連接到所述病毒基因組中。某些載體能夠在所導入的宿主細胞中自主復制(例如具有細菌復制起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其它載體(例如非附加型哺乳動物載體)在被導入宿主細胞后可以整合到宿主細胞的基因組中，從而隨宿主基因組一起復制。此外，某些載體能夠指導與之操作上連接的基因的表達。這類載體在此被稱為“重組表達載體”(或者簡稱“表達載體”)。一般而言，可用于重組DNA技術(shù)中的表達載體通常為質(zhì)粒形式。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可以互換使用，因為質(zhì)粒是最常用的載體形式。然而，本發(fā)明包括用于等同功能的這樣的其它形式的表達載體，例如病毒載體(例如復制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)。
術(shù)語“重組宿主細胞”(或簡稱“宿主細胞”)是指其中導入了重組表達載體的細胞。應該理解，這類術(shù)語不僅指特定的題述細胞，而且也指這種細胞的后代。因為在后續(xù)世代中可能由于或者突變或者環(huán)境影響而發(fā)生某些修飾，所以這樣的后代可能事實上與親代細胞不完全相同，但仍包括在本文所用的術(shù)語“宿主細胞”的范圍內(nèi)。
“標記”是可通過光譜學、光化學、生物化學、免疫化學或化學方法檢測的組合物。例如，有用的標記包括32P、熒光染料、電子致密試劑、酶(例如ELISA中常用的酶)、生物素、洋地黃毒苷或半抗原以及可得到抗血清或單克隆抗體的蛋白質(zhì)(例如通過將放射性標記摻入本發(fā)明的肽中，可以使本發(fā)明的多肽成為可檢測的，用本發(fā)明的多肽來檢測與所述肽特異性反應的抗體)。
本文所用的在細胞方面的術(shù)語“分類”是指細胞的物理分類(可以采用例如熒光激活細胞分類器來實現(xiàn))以及基于細胞表面標記表達的細胞分析(例如無分類時的FACS分析)。
短語“免疫細胞應答”是指免疫系統(tǒng)細胞對外部或內(nèi)源刺激(例如抗原、細胞因子、趨化因子和其它細胞)應答，在所述免疫細胞中產(chǎn)生生物化學變化，導致免疫細胞遷移、殺傷靶細胞、吞噬作用、產(chǎn)生抗體、免疫應答的其它可溶性效應物等。
術(shù)語“T淋巴細胞應答”和“T淋巴細胞活性”在此可互換使用，是指依賴于T淋巴細胞的免疫應答組分(即T淋巴細胞增殖和/或分化為輔助性T淋巴細胞、細胞毒性殺傷T淋巴細胞或者抑制性T淋巴細胞，輔助性T淋巴細胞提供信號給B淋巴細胞，引起或者防止抗體產(chǎn)生，細胞毒性T淋巴細胞殺傷特定靶細胞，以及釋放調(diào)節(jié)其它免疫細胞功能的可溶性因子如細胞因子)。
術(shù)語“免疫應答”是指淋巴細胞、抗原呈遞細胞、吞噬細胞、粒細胞和上述細胞或肝產(chǎn)生的可溶性大分子(包括抗體、細胞因子和補體)的協(xié)同作用，導致選擇性損傷、破壞侵入的病原體、感染病原體的細胞或組織、癌細胞、或者在自身免疫或病理性炎癥的情況下為正常人細胞或組織，或者將其從人體中清除。
免疫應答的組分可以在體外用本領域技術(shù)人員熟知的各種方法來檢測。例如，(1)可以將細胞毒性T淋巴細胞與放射性標記的靶細胞共同孵育，然后根據(jù)放射性的釋放，檢測這些靶細胞的裂解，(2)可以將輔助T淋巴細胞與抗原和抗原呈遞細胞共同孵育，然后用標準方法測量細胞因子的合成和分泌(Windhagen，A.等，1995，Immunity 2373-80)，(3)可以將抗原呈遞細胞與完整的蛋白質(zhì)抗原共同孵育，然后或者通過T淋巴細胞激活測定，或者通過生物物理方法檢測所述抗原在MHC上的呈遞(Harding等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，864230-4)，(4)可以將肥大細胞與交聯(lián)其Fc-ε受體的試劑共同孵育，然后通過酶免疫測定，測定組胺釋放(Siraganian等，1983，TIPS 4432-437)。
同樣，也可以用本領域技術(shù)人員熟知的各種方法，檢測模型生物體(例如小鼠)或者人類患者體內(nèi)的免疫應答產(chǎn)物。例如，(1)采用臨床實驗室中目前使用的標準方法，例如ELISA，可以容易地檢測對疫苗接種應答的抗體產(chǎn)生；(2)通過刮傷皮膚表面，放置無菌容器來捕獲刮傷部位上的遷移細胞，可以檢測免疫細胞到炎癥部位的遷移(Peters等，1988，Blood 721310-5)；(3)可以用3H-胸苷，測量對促細胞分裂原應答的外周血單核細胞增殖或混合淋巴細胞反應；(4)通過將PBMC與標記顆粒一起接種到孔中，可以測量粒細胞、巨噬細胞和PBMC中其它吞噬細胞的吞噬能力(Peters等，1988)；以及(5)通過用抗CD分子(例如CD4和CD8)抗體標記PBMC，并且測量表達這些標記的PBMC的比例，可以測量免疫系統(tǒng)細胞的分化。
本文所用的短語“信號轉(zhuǎn)導途徑”或“信號轉(zhuǎn)導事件”是指由于細胞與刺激性化合物或因子相互作用而引起的至少一種生物化學反應，但更通常是一系列生物化學反應。因此，刺激性化合物與細胞的相互作用，產(chǎn)生通過所述信號轉(zhuǎn)導途徑傳遞、最終導致細胞應答(例如上述的免疫應答)的“信號”。
信號轉(zhuǎn)導途徑是指在各種各樣在信號從細胞的一部分傳遞至細胞的另一部分中起作用的信號轉(zhuǎn)導分子之間的生物化學關(guān)系。本文所用的短語“細胞表面受體”包括能夠接受信號并且將這種信號跨過細胞質(zhì)膜傳遞的分子和分子的復合物。本發(fā)明的“細胞表面受體”的一個實例是T細胞受體(TCR)或CTLA-4的B7配體。
細胞中的信號轉(zhuǎn)導途徑通過細胞與所述細胞內(nèi)或細胞外的刺激物的相互作用來起始。如果外來的(即所述細胞之外)刺激物(例如抗原呈遞細胞上的MHC-抗原復合物)與細胞表面受體(例如T細胞受體)相互作用，則信號轉(zhuǎn)導途徑可以將信號穿過所述細胞的細胞膜傳遞至所述細胞的胞質(zhì)，在某些情況下，傳遞到細胞核中。如果內(nèi)部的(例如在所述細胞內(nèi))刺激物與胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導分子相互作用，則信號轉(zhuǎn)導途徑可以導致信號通過所述細胞的胞質(zhì)傳遞，在某些情況下傳遞到所述細胞的細胞核中。
信號轉(zhuǎn)導可以通過例如以下途徑發(fā)生分子磷酸化；非共價變構(gòu)相互作用；分子的復合；分子的構(gòu)象變化；鈣的釋放；肌醇磷酸的產(chǎn)生；蛋白酶解；環(huán)狀核苷酸的產(chǎn)生和二酰甘油酯的產(chǎn)生。通常，信號轉(zhuǎn)導通過使信號轉(zhuǎn)導分子磷酸化而發(fā)生。
術(shù)語“非特異性T細胞激活”是指與其抗原特異性無關(guān)的T細胞的刺激。
通用方法為了達到改進人κ輕鏈基因座的穩(wěn)定性，聯(lián)合轉(zhuǎn)染色體技術(shù)與早期原核微注射技術(shù)，來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。人κ輕鏈基因座轉(zhuǎn)基因KCo5(Fishwild，D.等，1996，Nat.Biotechnol.14845-851；美國專利第5,770,429號)包括人κ基因座相當大的部分，并且穩(wěn)定地保持在小鼠種系以及表達來源于所述轉(zhuǎn)基因的人κ鏈的B細胞和雜交瘤細胞中。將這種轉(zhuǎn)基因與穩(wěn)定的hCF(SC20)轉(zhuǎn)染色體以及小鼠內(nèi)源重鏈和κ輕鏈基因座的功能失活突變結(jié)合在一起，產(chǎn)生表達包括多種人重鏈同種型在內(nèi)的大范圍人抗體庫的動物。因此，所述輕鏈轉(zhuǎn)基因相對于雙-TC/KO小鼠(Tomizuka，K.等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.97722-727)改進的穩(wěn)定性，達到從每種融合回收大量的雜交瘤。
本發(fā)明提供任何所需重鏈同種型的全人抗體的分離，所述同種型包括IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM。具體地說，從一個轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物中可以分離出對預定抗原具有高親和性的幾種不同抗體。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物(優(yōu)選為小鼠或其它嚙齒動物)也可以用保藏的材料產(chǎn)生。保留hCF(SC20)的雞DT40細胞已經(jīng)根據(jù)布達佩斯條約，于2001年5月9日保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心(International Patent Organism Depository，NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology)，Tsukuba Central6，1-1，Higashi 1-Chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566 Japan。保藏號為FERM BP-7583。所述細胞系的名稱指定為SC20。
保留hCF(SC20)的雞DT40細胞也已經(jīng)于1999年8月18日保藏于臺灣的食品工業(yè)研究開發(fā)研究所(FIRDI)。保藏號為CCRC 960099。所述細胞系的名稱在臺灣保藏中心指定為SC20(D)。可以如WO00/10383(EP 1106061)中所述，將在雞DT-40細胞中保留的hCF(SC20)轉(zhuǎn)移到小鼠ES細胞中。簡而言之，從雞DT-40細胞產(chǎn)生微細胞，將其與CHO細胞融合。然后根據(jù)G418抗性，可以選擇出保留hCF(SC20)的CHO細胞?？梢允褂檬惺鄣娜薈OT1 DNA探針或人14號染色體特異性探針，通過PCR或FISH分析，證實hCF(SC20)的保留。此后，從所述保留hCF(SC20)的CHO細胞產(chǎn)生微細胞，將其與小鼠ES細胞融合。以與CHO細胞相同的方式，可以選擇出保留hCF(SC20)的ES細胞。
保留KCo5轉(zhuǎn)基因DNA的細胞已經(jīng)根據(jù)布達佩斯條約，于2001年11月8日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollection)(ATCC)，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，給予的保藏號為酵母中的17E1(YAC y17，Medarex KCo5)指定為ATCC No.PTA-3842(所述遺傳材料為含有人免疫球蛋白κ可變區(qū)基因座插入片段的酵母人工染色體)；大腸桿菌(E.coli)中的pKV4(Medarex KCo5)指定為ATCC No.PTA-3843(含有人免疫球蛋白可變區(qū)基因的質(zhì)粒)；大腸桿菌中的pKCIB(Medarex KCo5)指定為ATCC No.PTA-3844(含有人免疫球蛋白Jκ和κ恒定區(qū)基因的質(zhì)粒)。
保留KCo5轉(zhuǎn)基因DNA的細胞也已經(jīng)于2001年11月22日保藏于臺灣的食品工業(yè)研究開發(fā)研究所(FIRDI)。pKV4、YACy17和pKCIB的保藏號分別為CCRC 940383、CCRC 940385和CCRC 940386。
可以按照先前已描述的方法，將轉(zhuǎn)基因KCo5轉(zhuǎn)移傳到小鼠細胞中(Fishwild，D.出處同前，也參見美國專利第5,770,429號中的實施例38；也參見以下實施例2)。
免疫球蛋白的一般特性已知基本抗體結(jié)構(gòu)單位包含一個亞基四聚體。每個四聚體由兩對相同的多肽鏈組成，每對具有一條“輕”鏈(大約25kDa)和一條“重”鏈(大約50-70kDa)。每條鏈的氨基末端部分包括一個約100-110個或更多個氨基酸的可變區(qū)，主要負責抗原識別。每條鏈的羧基末端部分限定一個恒定區(qū)，主要負責效應子功能。
輕鏈或者分類為κ或者分類為λ。重鏈分類為γ、μ、α、δ或ε，將抗體同種型分別確定為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在輕鏈和重鏈中，可變區(qū)和恒定區(qū)通過約12個或更多個氨基酸的“J”區(qū)連接，重鏈還包括一個約1個至10多個氨基酸的“D”區(qū)。(一般參見FundamentalImmunology(Paul，W.編著，2nd ed.Raven Press，N.Y.，1989)，Ch.7(通過引用全文結(jié)合到本文中用于所有目的)。
每對輕鏈/重鏈的可變區(qū)構(gòu)成抗體結(jié)合位點。因此，完整的抗體具有兩個結(jié)合位點。除了在雙功能或雙特異性抗體中之外，所述兩個結(jié)合位點是相同的。所述鏈都表現(xiàn)出通過三個超變區(qū)-也稱為互補性決定區(qū)或CDR連接的相對保守的構(gòu)架區(qū)(FR)的相同的一般結(jié)構(gòu)。來自每對的兩條鏈的CDR通過構(gòu)架區(qū)排列，使得能夠與特定的表位結(jié)合。輕鏈和重鏈從N末端至C末端，都包含結(jié)構(gòu)域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。按照Kabat，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(National Institutes of Health，Bethesda，MD，1987和1991)或Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196901-917(1987)；Chothia等，Nature 342878-883(1989)的定義，對每個結(jié)構(gòu)域指定氨基酸編號。
天然人免疫球蛋白基因座人免疫球蛋白天然由三個不同的基因座編碼重鏈、κ輕鏈和λ輕鏈。這些天然基因座分別位于14號、2號和22號染色體上。天然人重鏈基因座位于14q32.3，在人14號染色體長臂的端粒附近，遍布在大約1.3兆堿基內(nèi)，編碼大約45種已表達的V基因區(qū)段、27種D基因區(qū)段、6種J基因區(qū)段和9種恒定(C)區(qū)基因區(qū)段。天然人κ輕鏈基因座位于2號染色體的2p11.12，延伸超過大約1.8兆堿基，包含大約34種已表達的V基因區(qū)段、5種J基因區(qū)段和一個C區(qū)基因區(qū)段。天然人λ基因座位于22q11.2，延伸超過大約0.9兆堿基，編碼大約30種V基因區(qū)段和4種功能性J-C對，每對包含一個J基因區(qū)段和一個C基因區(qū)段。這些天然基因座中的每一個也可以包含缺失、插入和單核苷酸多態(tài)性。
通過雜交瘤融合生產(chǎn)單克隆抗體通過例如用抗原(例如人蛋白質(zhì)抗原，諸如CD4、G-CSF、HSA、EGFR或CTLA-4、病原體編碼的抗原、毒素或其它抗原)免疫動物，可以實現(xiàn)單克隆抗體的產(chǎn)生。也可以使用包含所述抗原或所述抗原的免疫原性片段或者針對抗所述抗原抗體的抗獨特型抗體的較長的多肽。參見Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(CSHP NewYork，NY，1988)以及Mishell和Shiigi，Selected Methods in CellularImmunology，(W.H Freeman and Co.New York，NY 1980)(這兩篇文獻通過引用結(jié)合到本文中用于所有目的)。這樣一種免疫原可以得自天然來源、通過肽合成或者通過重組表達而獲得。任選地如下所述，將所述免疫原與載體蛋白連接或者與載體蛋白復合而給予。任選將所述免疫原與佐劑一起給予。可以如下所述使用幾種類型的佐劑。優(yōu)選給予完全弗氏佐劑，然后給予不完全佐劑，來免疫實驗動物。通常用兔子和豚鼠來生產(chǎn)多克隆抗體。通常用嚙齒動物(例如小鼠、大鼠和倉鼠)來生產(chǎn)單克隆抗體。這些小鼠可以是轉(zhuǎn)基因的，可以包含人免疫球蛋白基因序列，如下所述。在免疫后，免疫動物將產(chǎn)生對所導入免疫原的血清應答。這種血清應答可以用各種各樣的不同測定、通過測定所收集血清的效價來測量。常用測定的一個實例是ELISA。血清應答的大小通常被稱為效價。例如，效價為1,000，表示通過測定血清的1,000倍稀釋液可以檢測到反應性抗體的存在。通常，免疫將引起比未經(jīng)免疫動物中存在的血清應答大幾個數(shù)量級的血清應答。僅一個或兩個數(shù)量級的血清應答被認為是弱應答，通常表明存在少數(shù)表達抗原反應性抗體的B細胞。通過將淋巴細胞與無限增殖化細胞(例如骨髓瘤細胞)融合形成稱為雜交瘤細胞的雜種細胞，獲得單克隆抗體。新形成的雜交瘤細胞從親代淋巴細胞獲得抗體表達特性，而從親代無限增殖化細胞獲得生長特性。讓新形成的雜交瘤細胞在含培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(例如96孔板)中生長。測試(通常在融合后1周至2周之間)培養(yǎng)上清液中所需重鏈和輕鏈同種型的抗原反應性抗體的存在情況。然后將這種原代培養(yǎng)物中的細胞稀釋，再接種，以便分離分泌一種單克隆抗體的雜交瘤細胞的單個克隆?？梢詫⑦@種次級培養(yǎng)物進一步亞克隆，獲得第三培養(yǎng)物等等?？梢杂靡酝ㄟ^這種亞克隆法獲得雜交瘤克隆的抗原反應性原代培養(yǎng)物的比率，提供了對亞克隆效率的度量。如果所有的所述抗原陽性原代雜交瘤培養(yǎng)物都可以用來得到克隆細胞系，則亞克隆效率為100％。如果編碼所述已表達抗體的免疫球蛋白基因座不穩(wěn)定，例如在細胞分裂期間易丟失-或者通過染色體、染色體片段或轉(zhuǎn)染色體的丟失，或者通過插入序列的缺失重組、或者通過某些其它機制-則亞克隆效率將降低(即低于100％)。有得到單克隆抗體、亞克隆效率高(例如高于20％、優(yōu)選高于50％、更優(yōu)選高于80％，最優(yōu)選高于90％或95％)的平臺特別有用。根據(jù)與所述抗原的特異性結(jié)合來篩選抗體。任選根據(jù)與所述抗原的特定區(qū)的結(jié)合，進一步篩選抗體。對于蛋白質(zhì)抗原，可以通過測定抗體與所述抗原肽的一組缺失突變體的結(jié)合、然后測定哪些缺失突變體與所述抗體結(jié)合，完成后一篩選?？梢岳缤ㄟ^蛋白質(zhì)印跡法或ELISA評估結(jié)合。顯示出與所述抗體特異性結(jié)合的最小片段，限定了所述抗體的表位。然而，某些表位包含非連續(xù)的結(jié)構(gòu)元件，它們可能由于位于所述確切表位之外的元件的缺失而丟失。另一方面，可以用試驗抗體和參比抗體競爭與所述抗原結(jié)合的競爭測定，測定表位特異性。如果試驗抗體和參比抗體競爭，它們則與同一表位結(jié)合，或者足夠鄰近其中一種抗體的這種結(jié)合的表位將干擾另一種抗體的結(jié)合。
從B細胞雜交瘤克隆編碼抗體的核酸可以從或者經(jīng)免疫的或者未經(jīng)試驗的轉(zhuǎn)基因動物中，克隆編碼至少重鏈和輕鏈可變區(qū)的核酸。核酸可以作為基因組DNA或cDNA從這樣的動物的淋巴細胞中克隆。在免疫球蛋白序列克隆之前，不需要這類細胞的無限增殖化。通常，分離mRNA，用oligo-dT引物通過逆轉(zhuǎn)錄進行擴增。然后用引物擴增人免疫球蛋白保守區(qū)的cDNA。采用對非μ序列特異性的3’引物，可以在所述文庫中容易地富集非μ同種型(例如IgG或IgA)。通常，輕鏈的擴增群體包含至少100、1000、10,000、100,000或1,000,000種不同的輕鏈。同樣，重鏈的擴增群體包含至少100、1000、10,000、100,000或1,000,000種不同的重鏈。例如，使用IgG引物，通常至少90％、95％或99％的擴增重鏈為IgG同種型。采用各種眾所周知的方法，例如PCR或者用對人抗體的保守區(qū)特異性的DNA探針篩選cDNA文庫，也可以從上述雜交瘤中克隆編碼至少重鏈和輕鏈的可變區(qū)的核酸。通過對側(cè)翼序列進行限制性消化，可以切下編碼待亞克隆抗體鏈的核酸，或者所述核酸可以用針對鄰接編碼序列的位點的引物通過PCR來擴增。一般參見PCR TechnologyPrinciplesand Applications for DNA Amplification(H.A.Erlich編著，F(xiàn)reeman Press，NY，NY，1992)；PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications(Innis等編著，Academic Press，San Diego，CA，1990)；Mattila等，1991，Nucleic Acids Res.19967；Eckert等，1991，PCR Methods andApplications 117；PCR(McPherson等編著，IRL Press，Oxford)。這些參考文獻和其中引用的參考文獻通過引用結(jié)合到本文中用于所有目的。
抗體的重組表達將編碼與恒定區(qū)操作上連接的輕鏈和重鏈可變區(qū)的核酸插入到表達載體中?？梢栽谙嗤虿煌谋磉_載體中克隆輕鏈和重鏈。將編碼抗體鏈的DNA區(qū)段與所述表達載體中的確保抗體鏈表達的控制序列操作上連接。這類控制序列包括信號序列、啟動子、增強子和轉(zhuǎn)錄終止序列。表達載體通?？稍谒拗魃矬w中或者作為附加體或者作為宿主染色體的整合部分復制。
大腸桿菌是一種對于本發(fā)明抗體表達特別有用的原核宿主。適合使用的其它微生物宿主包括桿菌如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilus)和其它腸桿菌科如沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)和各種假單胞菌屬(Pseudomonas)菌種。在這些原核宿主中，人們也可以制備表達載體，所述表達載體通常含有與宿主細胞匹配的表達控制序列(例如復制起點)和調(diào)節(jié)序列如乳糖啟動子系統(tǒng)、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)、β-內(nèi)酰胺酶啟動子系統(tǒng)或得自噬菌體λ的啟動子系統(tǒng)。
其它微生物例如酵母，也可以用來表達。酵母屬(Saccharomyces)是優(yōu)選的宿主，并且有根據(jù)需要具有表達控制序列如啟動子(包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動子)和復制起點、終止序列等的合適載體。
哺乳動物組織細胞培養(yǎng)物也可以用來表達和生產(chǎn)本發(fā)明的抗體(參見Winnacker，F(xiàn)rom Genes to Clones(VCH Publishers，N.Y.，1987)。優(yōu)選真核細胞，因為已經(jīng)開發(fā)了許多能夠分泌完整抗體的合適宿主細胞系。用于表達編碼本發(fā)明免疫球蛋白的核酸的優(yōu)選的合適宿主細胞包括用SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎系(293)(Graham等，1977，J.Gen.Virol.3659)；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.774216)；小鼠支持細胞(TM4，Mather，1980，Biol.Reprod.23243-251)；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL 1587)；人宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；狗腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；buffalo rat肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；和TRI細胞(Mather等，1982，Annals N.Y Acad.Sci.3 8344-46)；桿狀病毒細胞。
可以將含有目標多核苷酸序列(例如重鏈和輕鏈編碼序列和表達控制序列)的載體轉(zhuǎn)移到宿主細胞中。對于原核細胞通常使用氯化鈣轉(zhuǎn)染，而對于其它細胞宿主可以使用磷酸鈣處理或電穿孔(一般參見Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual(Cold SpringHarbor Press，2nd ed.，1989)(通過引用全文結(jié)合到本文中用于所有目的)。當重鏈和輕鏈在不同表達載體上克隆時，用所述載體共轉(zhuǎn)染，從而達到完整免疫球蛋白的表達和裝配。在導入重組DNA之后，對表達免疫球蛋白產(chǎn)物的細胞系進行細胞選擇。優(yōu)選能夠穩(wěn)定表達的細胞系(即在所細胞系50次傳代之后表達水平不降低)。
一旦表達，則可以依照本領域的標準方法，包括硫酸銨沉淀、親和柱、柱層析、凝膠電泳等，純化本發(fā)明的完整抗體、其二聚體、單個輕鏈和重鏈或其它免疫球蛋白形式(一般參見Scopes，ProteinPurification(Springer-Verlag，N.Y.，1982)。優(yōu)選至少約90-95％同質(zhì)性的基本純的免疫球蛋白，最優(yōu)選98-99％或更高的同質(zhì)性。
嵌合抗體和人源化抗體嵌合抗體和人源化抗體具有與提供構(gòu)建嵌合抗體或人源化抗體的原材料的小鼠或其它非人類抗體相同或相似的結(jié)合特異性和親和性。嵌合抗體是通常通過遺傳工程從屬于不同物種的免疫球蛋白基因區(qū)段構(gòu)建了其輕鏈和重鏈基因的抗體。例如，可以將得自小鼠單克隆的基因的可變區(qū)(V)區(qū)段與人恒定區(qū)(C)區(qū)段例如IgG1和IgG4連接。優(yōu)選人同種型IgG1。一種典型的嵌合抗體因此是由得自小鼠抗體的V區(qū)或抗原結(jié)合區(qū)和得自人抗體的C區(qū)或效應子區(qū)組成的雜種蛋白。
人源化抗體具有基本上來自人抗體的可變區(qū)構(gòu)架殘基(稱為接納體抗體)和基本上得自小鼠抗體的互補性決定區(qū)(稱為供體免疫球蛋白)。參見Queen等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8610029-10033和WO 90/07861，U.S.5,693,762，U.S.5,693,761，U.S.5,585,089，U.S.5,530,101以及Winter，U.S.5,225,539(通過引用全文結(jié)合到本文中用于所有目的)。恒定區(qū)如果存在，也基本上或全部來自人免疫球蛋白。人可變區(qū)通常選自人抗體，其中構(gòu)架序列表現(xiàn)出與CDR來源的鼠類可變區(qū)結(jié)構(gòu)域高度的序列同一性。重鏈和輕鏈可變區(qū)構(gòu)架殘基可以來源于相同或不同的人抗體序列。所述人抗體序列可以是天然存在的人抗體序列，或者可以是幾種人抗體的共有序列。參見Carter等，WO92/22653。根據(jù)對CDR構(gòu)象和/或與抗原結(jié)合的可能影響，選擇來自人可變區(qū)構(gòu)架殘基的某些氨基酸以供取代。通過建模、對特定位置的氨基酸特性的檢查或者憑經(jīng)驗觀察特定氨基酸取代或誘變的影響，對這類可能影響進行研究。
例如，當一個氨基酸在鼠可變區(qū)構(gòu)架殘基和所選人可變區(qū)構(gòu)架殘基之間不同時，人構(gòu)架氨基酸在可合理地預測有以下情形之一時，通常應該被來自小鼠抗體的等同構(gòu)架氨基酸所取代(1)所述氨基酸非共價直接結(jié)合抗原，(2)所述氨基酸與CDR區(qū)相鄰，(3)所述氨基酸在其它情況下與CDR區(qū)相互作用(即在CDR區(qū)的大約6A內(nèi))，或(4)所述氨基酸參與VL-VH連接。
可供取代的其它候選物是對于人免疫球蛋白該位置上稀有的接納體人構(gòu)架氨基酸。這些氨基酸可以用來自小鼠供體抗體等同位置或者來自更通常的人免疫球蛋白等同位置的氨基酸取代?？晒┤〈钠渌蜻x物是對于人免疫球蛋白該位置上稀有的接納體人構(gòu)架氨基酸。人源化免疫球蛋白的可變區(qū)構(gòu)架通常顯示出與人可變區(qū)構(gòu)架序列或這類序列的共有序列至少有85％的序列同一性。
人抗體針對特定抗原的人抗體可通過以下所述的多種方法來提供。某些人抗體通過競爭性結(jié)合實驗來選擇，或者選擇具有與特定小鼠抗體(例如實施例中所述的小鼠單克隆抗體之一)相同的表位特異性的某些人抗體。也可以僅用抗原的片段作為免疫原，根據(jù)特定的表位特異性，篩選人抗體，和/或在蛋白質(zhì)抗原的情況下，通過篩選針對所述抗原的一組缺失突變體的抗體，篩選人抗體。
Trioma方法用于該方法的基本方法和示例性細胞融合成分(fusion partner)-SPAZ-4已經(jīng)由以下文獻描述Oestberg等，1983，Hybridoma 2361-367；Oestberg，美國專利第4,634,664號；和Engleman等，美國專利4,634,666(每篇文獻通過引用全文結(jié)合到本文中用于所有目的)。用該方法獲得的抗體生產(chǎn)細胞系稱為trioma，因為它們是從三種細胞-兩種人細胞和一種小鼠細胞轉(zhuǎn)變而來。開始，將小鼠骨髓瘤系與人B淋巴細胞融合，獲得不產(chǎn)生抗體的異種雜交細胞，如Oestberg所述的SPAZ-4細胞系(參見上文)。然后將所述異種細胞與無限增殖化人B淋巴細胞融合，獲得抗體生產(chǎn)trioma細胞系。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)trioma中產(chǎn)生比由人細胞制備的通常的雜交瘤更為穩(wěn)定的抗體。
雖然trioma是遺傳穩(wěn)定的，但它們不產(chǎn)生非常高水平的抗體。通過將抗體基因從所述trioma克隆到一種或多種表達載體中，將所述載體轉(zhuǎn)化到標準哺乳動物、細菌或酵母細胞系中，可以提高表達水平。
轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物也可以用包含人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物，生產(chǎn)針對各種各樣抗原的人抗體。通常，這些免疫球蛋白基因座可以編碼基本為人序列的抗體，優(yōu)選與人序列有95％或更高的同一性，更優(yōu)選98-99％或更高的同一性，最優(yōu)選100％相同。免疫球蛋白基因座可以是重排的或是未經(jīng)重排的，可以包含相對于天然人免疫球蛋白基因座的缺失或插入。所述基因座可以包括來自其它物種和來自非免疫球蛋白基因座的、基本上不產(chǎn)生次級組分(secondary repertoire)(非IgM)抗體編碼部分的遺傳元件(例如非編碼元件如增強子、啟動子和轉(zhuǎn)換序列，或者編碼元件如μ恒定區(qū)基因區(qū)段)。優(yōu)選的人免疫球蛋白基因座在所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物體內(nèi)的淋巴樣細胞和/或淋巴樣細胞前體中經(jīng)歷DNA序列改變，包括V(D)J連接、重鏈類別轉(zhuǎn)換和體細胞突變，產(chǎn)生針對預定抗原的高親和性人抗體。包含在這些轉(zhuǎn)基因哺乳動物中的人免疫球蛋白基因座優(yōu)選包括天然人重鏈和人輕鏈基因座的未經(jīng)重排序列。通常，使這種轉(zhuǎn)基因哺乳動物的內(nèi)源免疫球蛋白基因座功能性失活(美國專利第5,589,369號；Takeda，S.等，1993，EMBO J.122329-2366；Jakobovits，A.等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.902551-2555；Kitamura，D.和Rajewsky，K.，1992，Nature 356154-156；Gu，H.等，1991，Cell 6547-54；Chen，J.等，EMBO J 12821-830；Sun，W.等，1994，J.Immunol 152695-704；Chen，J.等，1993，Intl.Immunology 5647-656；Zou，X.等，1995，Eur.J.Immunol 252154-2162；Chen，J.等，1993 Intl.Immunology 5647-656；Boudinot，P.等，1995，Eur.J.Immunol.252499-2505；Chen，J.等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.904528-4532；Roes，J.和Rajewsky，K.，1991，Intl.Immunology 31367-1371；Gu，H.等，1993，Cell 731155-1164；Taki，S.等，1993，Science 2621268-71；Kitamura，D.等，1991，Nature 350423-6；Lutz，C.等，1998，Nature 393797-801；Zou，Y.等，1994，Current Biology 41099-1103；Chen，J.等，1993，EMBO J.124635-4645；Serwe，M.和Sablitzky，F(xiàn).，1993，EMBO J.122321-2327；Sanchez，P.等，1994，Intl.Immunology 6711-719；Zou，Y.等，1993，EMBO J.12811-820)。內(nèi)源免疫球蛋白基因的失活優(yōu)選可以例如通過定向同源重組來達到。外源人免疫球蛋白基因座可以被結(jié)合到所述內(nèi)源小鼠染色體上，或者可以是所導入的轉(zhuǎn)染色體的(例如為其部分、插入其中或與其連接)。將轉(zhuǎn)染色體作為非內(nèi)源染色體或者具有一個中心粒和兩個端粒的染色體片段導入細胞中。這些轉(zhuǎn)染色體通常包含端粒和中心粒序列，并且可以包含相對于親代完整染色體的缺失。轉(zhuǎn)染色體也可以包含額外的插入序列。例如，通過將第一免疫球蛋白基因座的序列(例如來自YAC克隆、轉(zhuǎn)染色體或完整染色體)插入到包含第二免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)染色體中，可以將兩個人免疫球蛋白基因座結(jié)合在單個轉(zhuǎn)染色體上。也可以重復這一過程，以將所有三種人免疫球蛋白基因座結(jié)合到一個轉(zhuǎn)染色體上。包含兩個或三個不同免疫球蛋白基因座的單個轉(zhuǎn)染色體提供了這些基因座的遺傳連鎖，這提高了可用于生產(chǎn)人抗體的轉(zhuǎn)基因后代的比率。轉(zhuǎn)染色體的優(yōu)選形式是在以下文獻中詳述的形式Tomizuka，K.等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97722-727，Tomizuka，K.等，1997，Nature Genetics 16133-143，以及WO 97/07671、WO 98/37757和WO 00/10383，每篇文獻通過引用全文結(jié)合到本文中用于所有目的。轉(zhuǎn)染色體也可以包括整合的選擇標記(例如新霉素抗性基因)和在親代完整染色體中不存在的其它序列。在轉(zhuǎn)染色體和內(nèi)源小鼠染色體之間的重組事件中，來自轉(zhuǎn)染色體的序列被插入或加入到所述內(nèi)源小鼠染色體中?？梢匀鏦O98/37757、EP 0972445和WO 00/10383(所述文獻通過引用結(jié)合到本文中用于所有目的)中所述進行缺失、易位、取代等來修飾轉(zhuǎn)染色體。例如，轉(zhuǎn)染色體在被導入到小鼠胚胎干(ES)細胞的過程中可能自發(fā)片段化，通過端粒指導的截短而片段化和/或通過Cre/loxP定點重組或相似的方法而易位。特異性插入重組位點(例如loxP序列和其它序列；參見例如Abuin，A.和Bradley，A.，1996，Mol.Cell.Biol.161851-1856；Mitani，K.等，1995，Somat.Cell.Mol.Genet.21221-231；Li，Z.W.等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.936158-6162；Smith，AJ.等，1995，Nat.Genet.9376-385；Trinh，K R.和Morrison，S.L.，2000，J.Immunol.Methods 244185-193；Sunaga，S.等，1997，Mol.Reprod.Dev.46109-113；Dymecki，S.M.，1996，Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A.936191-6196；Zou，YR.等，1994，Curr.Biol.41099-1103；Rudolph，U.等，1993，Transgenic Res.2345-355；Rickert，R.C.等，1997，Nucleic Acids Res.251317-1318)，可以促進這樣的重組或易位事件。在引入loxP位點的情況下，編碼cre重組酶的轉(zhuǎn)基因的表達將促進兩個loxP位點之間的重組。轉(zhuǎn)染色體也可以是由于上述易位所致的由不同染色體片段組成的融合染色體。轉(zhuǎn)染色體可以是自主型的。自主型轉(zhuǎn)染色體與小鼠內(nèi)源染色體不同、不鄰接，也不插入到所述小鼠內(nèi)源染色體中。這些自主型轉(zhuǎn)染色體包含使得能夠進行自主復制的端粒和中心粒序列?；蛘撸梢詫⑥D(zhuǎn)染色體序列導入小鼠細胞核中之后，將其易位到小鼠染色體上。小鼠內(nèi)源染色體包括19對常染色體以及X和Y染色體。
導入外源人免疫球蛋白基因座可以采用各種各樣的方法來實現(xiàn)，包括例如半日齡胚胎原核微注射、胚胎干細胞的轉(zhuǎn)染、或者胚胎干細胞與酵母原生質(zhì)球或包含轉(zhuǎn)染色體的小核融合。用上述方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因哺乳動物能夠功能性地重排所導入的外源免疫球蛋白組分序列，并且表達由人免疫球蛋白基因編碼的各種同種型的抗體庫，而不表達內(nèi)源免疫球蛋白基因。具有這些特性的哺乳動物的產(chǎn)生和特性詳述于例如Lonberg等，WO 93/12227(1993)；美國專利第5,877,397、5,874,299、5,814,318、5,789,650、5,770,429、5,661,016、5,633,425、5,625,126、5,569,825、5,545,806號，Nature 481547-1553(1994)，NatureBiotechnology 14，826(1996)，Kucherlapati，WO 91/10741(1991)，WO94/02602(1993)，WO 96/34096(1995)，WO 96/33735(1996)，WO98/24893(1997)，美國專利第5,939,598、6,075,181、6,114,598號，Tomizuka，K.等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97722-727，Tomizuka，K.等，1997，Nature Genetics 16133-143，和Tomizuka，K.，WO 97/07671，WO 98/37757，WO 00/10383以及JP 2000-42074(每篇文獻通過引用全文結(jié)合到本文中用于所有目的)。諸如嚙齒動物的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物特別合適。例如通過用常規(guī)的Kohler-Milstein技術(shù)，將得自這樣的哺乳動物的B細胞與合適的無限增殖細胞系融合，可以制備單克隆抗體。運用PCR擴增V區(qū)(Schrader等，1997，美國專利第5,627,052號)，也可以直接從單個B細胞中得到單克隆抗體，從培養(yǎng)基中分離單克隆抗體?；蛘?，經(jīng)FACs分類的、或者經(jīng)富集的B細胞制劑可以用作RNA或DNA源，以供經(jīng)PCR擴增V區(qū)序列。噬菌體展示法(在下文描述)也可以用來從包含人免疫球蛋白基因座的免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得人抗體序列。然后可以用通過這些方法獲得的人抗體V區(qū)序列，產(chǎn)生保留原始親代抗體結(jié)合特性的完整抗體。下面描述這種方法。
噬菌體展示方法獲得人抗體的另一種方法是按照Huse等，1989，Science 2461275-1281概述的通用方案，篩選得自B細胞的cDNA文庫。這種B細胞可以從用所需抗原、片段、含所述抗原或片段的較長多肽或者抗獨特型抗體免疫的人中獲得。任選地從未曾接觸所述抗原的個體獲得這樣的B細胞。B細胞也可以得自表達人免疫球蛋白序列的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物?？梢杂每乖蛞唤M抗原免疫所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物。所述動物也可以是未經(jīng)免疫的。使用編碼人抗體的B細胞mRNA序列，用逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生cDNA。然后將所述cDNA序列的V區(qū)編碼區(qū)段克隆到指導所述抗體V區(qū)表達的DNA載體中。通常，在克隆之前通過PCR特異性地擴增所述V區(qū)序列。也通常將所述V區(qū)序列克隆到所述DNA載體內(nèi)經(jīng)構(gòu)建而使得所述V區(qū)作為融合蛋白表達的位點中。這樣的融合蛋白的實例包括m13大腸桿菌噬菌體基因3和基因8融合蛋白。然后用該組克隆V區(qū)序列產(chǎn)生抗體V區(qū)的表達文庫。為了產(chǎn)生表達文庫，用包含所述克隆V區(qū)序列的DNA載體轉(zhuǎn)化真核或原核宿主細胞。除V區(qū)之外，所述載體還可以任選地編碼整個或部分病毒基因座，并且可以包含病毒包裝序列。在某些情況下，所述載體不包含完整的病毒基因組，然后將所述載體與輔助病毒或輔助病毒DNA序列一起使用。所述已表達抗體V區(qū)存在于轉(zhuǎn)化細胞或者得自所述轉(zhuǎn)化細胞的病毒顆粒內(nèi)或其表面。然后，用包含所述細胞或病毒顆粒的這種表達文庫鑒定編碼與預定抗原反應的抗體或抗體片段的V區(qū)序列。為了鑒定這些V區(qū)序列，根據(jù)所述已表達V區(qū)與預定抗原的反應性，對所述表達文庫進行篩選或選擇。用鑒定或富集具有與預定抗原有反應性(例如結(jié)合締合或催化活性)的V區(qū)的細胞或病毒顆粒的方法，篩選或選擇包含所述克隆V區(qū)序列并且具有已表達V區(qū)的細胞或病毒顆粒。例如，可以檢測與已表達V區(qū)結(jié)合的放射性或熒光標記的抗原，并用所述抗原鑒定或分選細胞或病毒顆粒。與固相基質(zhì)或微珠結(jié)合的抗原也可以用來選擇在表面具有反應性V區(qū)的細胞或病毒顆粒。如此從表達文庫中鑒定的V區(qū)序列然后可以用來在轉(zhuǎn)化宿主細胞中指導對預定抗原具有反應性的抗體或其片段的表達。Huse所述的方案與噬菌體展示技術(shù)結(jié)合變得更為有效。參見例如Dower等，WO91/17271和McCafferty等，WO 92/01047，美國專利第5,871,907、5,858,657、5,837,242、5,733,743和5,565,332號(每篇文獻通過引用全文結(jié)合到本文中用于所有目的)。在這些方法中，產(chǎn)生其中成員(展示包裝)在其外表面展示不同抗體的噬菌體文庫?？贵w通常以Fv或Fab片段展示。展示具有所需特異性的抗體的噬菌體可以通過用所述抗原或其片段進行親和富集來選擇。與表達人免疫球蛋白基因的免疫轉(zhuǎn)基因非人類動物聯(lián)合的噬菌體展示，甚至當對所述抗原的免疫應答弱時，也可以用來獲得抗原特異性抗體。
在噬菌體展示法的一個變體中，可以產(chǎn)生具有選定鼠抗體結(jié)合特異性的人抗體。參見例如Winter，WO 92/20791。在這種方法中，所選鼠抗體的或者重鏈可變區(qū)或者輕鏈可變區(qū)被用作起始材料。如果例如選擇輕鏈可變區(qū)作為起始材料，則構(gòu)建其成員展示相同輕鏈可變區(qū)(即鼠起始材料)和不同重鏈可變區(qū)的噬菌體文庫。所述重鏈可變區(qū)得自經(jīng)重排人重鏈可變區(qū)的文庫。選擇顯示出與CTLA-4強特異性結(jié)合(例如至少108M-1，優(yōu)選至少109M-1)的噬菌體。得自該噬菌體的人重鏈可變區(qū)則用作構(gòu)建另一噬菌體文庫的起始材料。在該文庫中，每個噬菌體展示相同的重鏈可變區(qū)(即從第一展示文庫中鑒定的區(qū))和不同的輕鏈可變區(qū)。所述輕鏈可變區(qū)得自經(jīng)重排人輕鏈可變區(qū)的文庫。再次選擇顯示出對所選抗原強特異性結(jié)合的噬菌體。可以從例如在CDR區(qū)中摻入隨機序列或合成序列的噬菌體展示文庫中，獲得與人抗體相似的人工抗體。
恒定區(qū)的選擇可以采用各種熟知的方法，將嵌合抗體、人源化抗體或人抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)與人恒定區(qū)的至少一部分連接(參見例如Queen等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8610029-10033和WO 90/07861；這些參考文獻和其中引用的參考文獻通過引用結(jié)合到本文中用于所有目的)。恒定區(qū)的選擇部分取決于是否需要抗體依賴性補體和/或細胞介導毒性。例如，同種型IgG1和IgG3通常比同種型IgG2或IgG4具有更高的補體結(jié)合活性。同種型的選擇也可以影響腦中的抗體進入。輕鏈恒定區(qū)可以是λ或者是κ恒定區(qū)?？贵w可以作為含兩條輕鏈和兩條重鏈的四聚體、作為分離的重鏈、輕鏈、作為Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv或者作為重鏈和輕鏈可變區(qū)通過一個間隔區(qū)連接的單鏈抗體來表達。
對于某些應用，非IgG抗體可能是有用。例如，當需要多價抗體復合物時，可以使用IgM和IgA抗體。
應用部分抗體序列表達完整的抗體抗體主要通過位于6個重鏈和輕鏈互補決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。為此，在各個抗體之間，CDR內(nèi)的氨基酸序列比CDR之外的序列更多樣化。因為CDR序列負責大多數(shù)的抗體-抗原相互作用，所以有可能通過構(gòu)建包括來自特定天然存在的抗體的CDR序列被移植到來自具有不同特性的不同抗體的構(gòu)架序列上的表達載體，表達模擬特定天然存在抗體特性的重組抗體(參見例如Riechmann，L.等，1988，Nature 332323-327；Jones，P.等，1986，Nature321522-525；和Queen，C.等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8610029-10033)。這樣的構(gòu)架序列可以得自包括種系抗體基因序列的公共DNA數(shù)據(jù)庫。這些種系序列將不同于成熟抗體基因序列，因為它們將不包括通過B細胞成熟期間V(D)J連接而形成的完全裝配的可變區(qū)基因。種系基因序列也將與高親和性次級組分抗體的序列因體細胞突變而在個別核苷酸上有所不同。然而，體細胞突變在所述可變區(qū)中并非均勻分布。例如，在構(gòu)架區(qū)1的氨基末端部分和構(gòu)架區(qū)4的羧基末端部分中體細胞突變的頻率相對較低。此外，許多體細胞突變并不顯著改變抗體的結(jié)合特性。因此，獲得特定抗體的完整DNA序列以再構(gòu)建具有與原始抗體相似結(jié)合特性的完整重組抗體并不是必需的(參見1999年3月12日申請的PCT/US99/05535，該文獻通過引用結(jié)合到本文中用于所有目的)。跨越所述CDR區(qū)的部分重鏈序列和輕鏈序列通常對于該目的是足夠的。用所述部分序列來確定哪些種系可變區(qū)基因區(qū)段和連接基因區(qū)段對所述重組的抗體可變區(qū)基因有貢獻。然后用所述種系序列補上所述可變區(qū)缺失的部分。在蛋白質(zhì)成熟期間重鏈和輕鏈前導序列被切除，不影響最終抗體的特性。因此，表達構(gòu)建體不必使用對應的種系前導序列。為了加上缺失的序列，可以通過連接或PCR擴增將克隆cDNA序列與合成寡核苷酸結(jié)合。或者，完整的可變區(qū)可以作為一組短的重疊寡核苷酸來合成，然后通過PCR擴增將其連接，構(gòu)建完整的合成可變區(qū)克隆。該方法有一些優(yōu)點，例如消除或包括特定限制位點或優(yōu)化特定密碼子。
得自一個雜交瘤的重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列可以用來設計一組重疊的合成寡核苷酸，以構(gòu)建具有與天然序列相同的氨基酸編碼能力的合成V序列。所述合成的重鏈序列和κ輕鏈序列可以在三種方式上不同于天然序列重復核苷酸堿基序列段被中斷，以利于寡核苷酸合成和PCR擴增；根據(jù)Kozak原則(Kozak，1991，J.Biol.Chem.26619867-19870)，加入最適翻譯起始位點；以及在翻譯起始位點上游工程加入HindIII位點。
對于重鏈和輕鏈可變區(qū)，優(yōu)化的編碼鏈序列和相應的非編碼鏈序列被打斷為30-50個核苷酸的區(qū)段，使得在相應的非編碼寡核苷酸的大約中點處發(fā)生所述編碼鏈序列核苷酸之間的斷開。因此，對于每條鏈，可以將所述寡核苷酸裝配為完全跨越所需序列的重疊雙鏈組。將這些寡核苷酸混合為多個跨越150-400個核苷酸的區(qū)段的庫。然后用所述庫作為模板，產(chǎn)生150-400個核苷酸的PCR擴增產(chǎn)物。通常，一個可變區(qū)寡核苷酸組被分為兩個庫，分別擴增所述庫，產(chǎn)生兩種重疊PCR產(chǎn)物。然后，通過PCR擴增合并這些重疊產(chǎn)物，形成完整的可變區(qū)。也可能需要在PCR擴增中包括重鏈或輕鏈恒定區(qū)的重疊片段(包括κ輕鏈的BbsI位點或γ重鏈的AgeI位點)，以產(chǎn)生可以容易被克隆到所述表達載體構(gòu)建體中的片段。
重構(gòu)建的重鏈和輕鏈可變區(qū)然后與克隆啟動子序列、翻譯起始序列、恒定區(qū)序列、3’非翻譯序列、聚腺苷酸化序列和轉(zhuǎn)錄終止序列結(jié)合，構(gòu)成表達載體構(gòu)建體。可以將所述重鏈和輕鏈表達構(gòu)建體結(jié)合到一種載體中、共轉(zhuǎn)染、連續(xù)轉(zhuǎn)染或分別轉(zhuǎn)染到宿主細胞中，然后融合形成表達兩種鏈的宿主細胞。
下面描述用于構(gòu)建人IgGκ表達載體的質(zhì)粒。構(gòu)建所述質(zhì)粒，使得PCR擴增的V重鏈和Vκ輕鏈cDNA序列可以用來重構(gòu)建完整的重鏈和輕鏈小基因。這些質(zhì)?？梢杂脕肀磉_完整的人或嵌合IgG1κ或IgG4κ抗體?？梢詷?gòu)建相似的質(zhì)粒，用于表達其它重鏈同種型，或者用于表達包含λ輕鏈的抗體。
以下所示的κ輕鏈質(zhì)粒pCK7-96(SEQ ID NO1)包括κ恒定區(qū)和聚腺苷酸化位點，使得用在起始甲硫氨酸上游包括HindIII位點的5’引物擴增的κ序列可以用HindIII和BbsI消化，然后克隆到用HindIII和BbsI消化的pCK7-96中，重構(gòu)建具有聚腺苷酸化位點的完整輕鏈編碼序列。該盒可以作為HindIII/NotI片段分離，并且與轉(zhuǎn)錄啟動子序列連接，構(gòu)建一個功能性小基因，以供轉(zhuǎn)染到細胞中。
γ1重鏈質(zhì)粒pCG7-96(SEQ ID NO2)包括人γ1恒定區(qū)和聚腺苷酸化位點，使得用在起始甲硫氨酸上游包括HindIII位點的5’引物擴增的γ序列可以用HindIII和AgeI消化，然后克隆到用HindIII和AgeI消化的pCG7-96中，重構(gòu)建具有聚腺苷酸化位點的完整γ1重鏈編碼序列。該盒可以作為HindIII/SalI片段分離，并且與轉(zhuǎn)錄啟動子序列連接，構(gòu)建一個功能性小基因，以供轉(zhuǎn)染到細胞中。
γ4重鏈質(zhì)粒pG4HE(SEQ ID NO3)包括人γ4恒定區(qū)和聚腺苷酸化位點，使得用在起始甲硫氨酸上游包括HindIII位點的5’引物擴增的γ序列可以用HindIII和AgeI消化，然后克隆到用HindIII和AgeI消化的pG4HE中，重構(gòu)建具有聚腺苷酸化位點的完整γ4重鏈編碼序列。該盒可以作為HindIII/EcoRI片段分離，并且與轉(zhuǎn)錄啟動子序列連接，構(gòu)建一個功能性小基因，以供轉(zhuǎn)染到細胞中。
可以用多種不同啟動子(包括但不限于CMV啟動子、遍在蛋白啟動子、SRα啟動子和β-肌動蛋白啟動子)來表達所述重構(gòu)建的重鏈和輕鏈基因。例如，可以用HindIII和或者NotI、XhoI或者EcoRI切割載體pCDNA3.1+(Invitrogen，Carlsbad，CA)，用于與上述的或者κ、γ1或γ4盒連接，構(gòu)成可以直接轉(zhuǎn)染到哺乳動物細胞中的表達載體。[150] pCK7-96(SEQ ID NO1)TCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTAGCGGCCGCGGTCCAACCACCAATCTCAAAGCTTGGTACCCGGGAGCCTGTTATCCCAGCACAGTCCTGGAAGAGGCACAGGGGAAATAAAAGCGGACGGAGGCTTTCCTTGACTCAGCCGCTGCCTGGTCTTCTTCAGACCTGTTCTGAATTCTAAACTCTGAGGGGGTCGGATGACGTGGCCATTCTTTGCCTAAAGCATTGAGTTTACTGCAAGGTCAGAAAAGCATGCAAAGCCCTCAGAATGGCTGCAAAGAGCTCCAACAAAACAATTTAGAACTTTATTAAGGAATAGGGGGAAGCTAGGAAGAAACTCAAAACATCAAGATTTTAAATACGCTTCTTGGTCTCCTTGCTATAATTATCTGGGATAAGCATGCTGTTTTCTGTCTGTCCCTAACATGCCCTGTGATTATCCGCAAACAACACACCCAAGGGCAGAACTTTGTTACTTAAACACCATCCTGTTTGCTTCTTTCCTCAGGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGAGGGAGAAGTGCCCCCACCTGCTCCTCAGTTCCAGCCTGACCCCCTCCCATCCTTTGGCCTCTGACCCTTTTTCCACAGGGGACCTACCCCTATTGCGGTCCTCCAGCTCATCTTTCACCTCACCCCCCTCCTCCTCCTTGGCTTTAATTATGCTAATGTTGGAGGAGAATGAATAAATAAAGTGAATCTTTGCACCTGTGGTTTCTCTCTTTCCTCAATTTAATAATTATTATCTGTTGTTTACCAACTACTCAATTTCTCTTATAAGGGACTAAATATGTAGTCATCCTAAGGCGCATAACCATTTATAAAAATCATCCTTCATTCTATTTTACCCTATCATCCTCTGCAAGACAGTCCTCCCTCAAACCCACAAGCCTTCTGTCCTCACAGTCCCCTGGGCCATGGATCCTCACATCCCAATCCGCGGCCGCAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGC[151] pCG7-96(SEQ ID NO2)GAACTCGAGCAGCTGAAGCTTTCTGGGGCAGGCCAGGCCTGACCTTGGCTTTGGGGCAGGGAGGGGGCTAAGGTGAGGCAGGTGGCGCCAGCCAGGTGCACACCCAATGCCCATGAGCCCAGACACTGGACGCTGAACCTCGCGGACAGTTAAGAACCCAGGGGCCTCTGCGCCCTGGGCCCAGCTCTGTCCCACACCGCGGTCACATGGCACCACCTCTCTTGCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGGTGAGAGGCCAGCACAGGGAGGGAGGGTGTCTGCTGGAAGCCAGGCTCAGCGCTCCTGCCTGGACGCATCCCGGCTATGCAGCCCCAGTCCAGGGCAGCAAGGCAGGCCCCGTCTGCCTCTTCACCCGGAGGCCTCTGCCCGCCCCACTCATGCTCAGGGAGAGGGTCTTCTGGCTTTTTCCCCAGGCTCTGGGCAGGCACAGGCTAGGTGCCCCTAACCCAGGCCCTGCACACAAAGGGGCAGGTGCTGGGCTCAGACCTGCCAAGAGCCATATCCGGGAGGACCCTGCCCCTGACCTAAGCCCACCCCAAAGGCCAAACTCTCCACTCCCTCAGCTCGGACACCTTCTCTCCTCCCAGATTCCAGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGGTAAGCCAGCCCAGGCCTCGCCCTCCAGCTCAAGGCGGGACAGGTGCCCTAGAGTAGCCTGCATCCAGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGACACGTCCACCTCCATCTCTTCCTCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGTGGGACCCGTGGGGTGCGAGGGCCACATGGACAGAGGCCGGCTCGGCCCACCCTCTGCCCTGAGAGTGACCGCTGTACCAACCTCTGTCCCTACAGGGCAGCCCCGAGAACCACACATGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTGCGACGGCCGGCAAGCCCCCGCTCCCCGGGCTCTCGCGGTCGCACGAGGATGCTTGGCACGTACCCCCTGTACATACTTCCCGGGCGCCCAGCATGGAAATAAAGCACCCAGCGCTGCCCTGGGCCCCTGCGAGACTGTGATGGTTCTTTCCACGGGTCAGGCCGAGTCTGAGGCCTGAGTGGCATGAGGGAGGCAGAGCGGGTCCCACTGTCCCCACACTGGCCCAGGCTGTGCAGGTGTGCCTGGGCCCCCTAGGGTGGGGCTCAGCCAGGGGCTGCCCTCGGCAGGGTGGGGGATTTGCCAGCGTGGCCCTCCCTCCAGCAGCACCTGCCCTGGGCTGGGCCACGGGAAGCCCTAGGAGCCCCTGGGGACAGACACACAGCCCCTGCCTCTGTAGGAGACTGTCCTGTTCTGTGAGCGCCCCTGTCCTCCCGACCTCCATGCCCACTCGGGGGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCATCGATGATATCAGATCTGCCGGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCGATAAGCCAGGTTAACCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGGACATATTGTCGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCTTATGTATCATACACATACGATTTAGGTGACACTATA[152] pG4HE(SEQ ID NO3)GAACTCGAGCAGCTGAAGCTTTCTGGGGCAGGCCGGGCCTGACTTTGGCTGGGGGCAGGGAGGGGGCTAAGGTGACGCAGGTGGCGCCAGCCAGGTGCACACCCAATGCCCATGAGCCCAGACACTGGACCCTGCATGGACCATCGCGGATAGACAAGAACCGAGGGGCCTCTGCGCCCTGGGCCCAGCTCTGTCCCACACCGCGGTCACATGGCACCACCTCTCTTGCAGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGGTGAGAGGCCAGCACAGGGAGGGAGGGTGTCTGCTGGAAGCCAGGCTCAGCCCTCCTGCCTGGACGCACCCCGGCTGTGCAGCCCCAGCCCAGGGCAGCAAGGCATGCCCCATCTGTCTCCTCACCCGGAGGCCTCTGACCACCCCACTCATGCTCAGGGAGAGGGTCTTCTGGATTTTTCCACCAGGCTCCGGGCAGCCACAGGCTGGATGCCCCTACCCCAGGCCCTGCGCATACAGGGGCAGGTGCTGCGCTCAGACCTGCCAAGAGCCATATCCGGGAGGACCCTGCCCCTGACCTAAGCCCACCCCAAAGGCCAAACTCTCCACTCCCTCAGCTCAGACACCTTCTCTCCTCCCAGATCTGAGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCATCATGCCCAGGTAAGCCAACCCAGGCCTCGCCCTCCAGCTCAAGGCGGGACAGGTGCCCTAGAGTAGCCTGCATCCAGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGACGCATCCACCTCCATCTCTTCCTCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGTGGGACCCACGGGGTGCGAGGGCCACATGGACAGAGGTCAGCTCGGCCCACCCTCTGCCCTGGGAGTGACCGCTGTGCCAACCTCTGTCCCTACAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGAGTGCCAGGGCCGGCAAGCCCCCGCTCCCCGGGCTCTCGGGGTCGCGCGAGGATGCTTGGCACGTACCCCGTCTACATACTTCCCAGGCACCCAGCATGGAAATAAAGCACCCACCACTGCCCTGGGCCCCTGTGAGACTGTGATGGTTCTTTCCACGGGTCAGGCCGAGTCTGAGGCCTGAGTGACATGAGGGAGGCAGAGCGGGTCCCACTGTCCCCACACTGGCCCAGGCTGTGCAGGTGTGCCTGGGCCACCTAGGGTGGGGCTCAGCCAGGGGCTGCCCTCGGCAGGGTGGGGGATTTGCCAGCGTGGCCCTCCCTCCAGCAGCAGCTGCCCTGGGCTGGGCCACGGGAAGCCCTAGGAGCCCCTGGGGACAGACACACAGCCCCTGCCTCTGTAGGAGACTGTCCTGTCCTGTGAGCGCCCTGTCCTCCGACCCCCCATGCCCACTCGGGGGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCATCGATGATATCAGATCTGCCGGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCGATAAGCCAGGTTAACCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGGACATATTGTCGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCTTATGTATCATACACATACGATTTAGGTGACACTATA重組抗體的表達嵌合抗體、人源化抗體和人抗體通常通過重組表達來產(chǎn)生。重組多核苷酸構(gòu)建體通常包括與抗體鏈編碼序列操作上連接的表達控制序列，包括天然相連的啟動子區(qū)或者異源啟動子區(qū)。優(yōu)選所述表達控制序列是能夠轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染真核宿主細胞的載體中的真核啟動子系統(tǒng)。一旦將所述載體摻入到合適的宿主中，則將宿主在適合于高水平表達所述核苷酸序列和收集并純化交叉反應性抗體的條件下保持。
這些表達載體在宿主生物體中通?？苫蛘咦鳛楦郊芋w或者作為宿主染色體DNA的整合部分復制。表達載體通常含有選擇標記，例如氨芐青霉素抗性或潮霉素抗性，以允許檢測出用所需DNA序列轉(zhuǎn)化的那些細胞。
大腸桿菌是一種對于本發(fā)明DNA序列克隆尤其有用的原核宿主。例如酵母的微生物也可用于表達。酵母屬是優(yōu)選的酵母宿主，并且有根據(jù)需要帶有表達控制序列、復制起點、終止序列等的合適載體。常用的啟動子包括3-磷酸甘油酸激酶啟動子和其它糖酵解酶啟動子。誘導型酵母啟動子其中包括得自醇脫氫酶、異細胞色素C和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子。
哺乳動物細胞是用于表達編碼免疫球蛋白或其片段的核苷酸區(qū)段的優(yōu)選宿主。參見Winnacker，F(xiàn)ROM GENES TO CLONES，(VCHPublishers，NY，1987)。本領域已經(jīng)開發(fā)了能夠分泌完整異源蛋白質(zhì)的許多合適的宿主細胞系，包括CHO細胞系、各種COS細胞系、HeLa細胞、L細胞和骨髓瘤細胞系。所述細胞優(yōu)選是非人類的。用于這些細胞的表達載體可以包括表達控制序列，例如復制起點、啟動子、增強子(Queen等，1986，Immunol.Rev.8949)；和必需的加工信息位點，例如核糖體結(jié)合位點、RNA剪接位點、聚腺苷酸化位點和轉(zhuǎn)錄終止序列。優(yōu)選的表達控制序列是來源于內(nèi)源基因、巨細胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒等的啟動子。參見Co等，1992，J.Immunol.1481149。
另一方面，可以將抗體編碼序列摻入到轉(zhuǎn)基因中，以導入到轉(zhuǎn)基因動物的基因組中，隨后在所述轉(zhuǎn)基因動物的乳中表達(參見例如美國專利第5,741,957、5,304,489和5,849,992號)。合適的轉(zhuǎn)基因包括與得自乳腺特異性基因(例如酪蛋白基因或β-乳球蛋白)的啟動子和增強子操作上連接的輕鏈和/或重鏈的編碼序列。
可以根據(jù)細胞宿主的類型，用眾所周知的方法，將含有目標DNA區(qū)段的載體轉(zhuǎn)移到宿主細胞中。例如，對于原核細胞，通常利用氯化鈣轉(zhuǎn)染法，而對于其它細胞宿主，可以使用磷酸鈣處理、電穿孔、脂轉(zhuǎn)染、基因槍法(biolistics)或基于病毒的轉(zhuǎn)染。用于轉(zhuǎn)化哺乳動物細胞的其它方法包括應用polybrene、原生質(zhì)體融合、脂質(zhì)體、電穿孔和微注射(一般參見Sambrook等，參見上文)。對于轉(zhuǎn)基因動物的產(chǎn)生，可以將轉(zhuǎn)基因顯微注射到受精卵中，或者可以摻入到胚胎干細胞的基因組中，然后將這種細胞的細胞核轉(zhuǎn)移到去核卵母細胞中。
一旦表達，可以依照本領域的標準方法純化抗體，所述標準方法包括HPLC純化，柱層析、凝膠電泳等(一般參見Scopes，ProteinPurification(Springer-Verlag，NY，1982))。
經(jīng)修飾的抗體本發(fā)明也包括經(jīng)修飾的抗體。術(shù)語“經(jīng)修飾的抗體”包括已經(jīng)通過例如缺失、加入或取代所述抗體的部分而被修飾的抗體，例如單克隆抗體、嵌合抗體和人源化抗體。例如，可以通過缺失其恒定區(qū)并用可能造成增加所述抗體的半壽期如血清半壽期、穩(wěn)定性或親和性的恒定區(qū)取代，來修飾抗體。
本發(fā)明的抗體綴合物可以用來改變給定的生物反應或引起生物反應(例如募集效應細胞)。所述藥物部分不應解釋為限于經(jīng)典的化學治療藥。例如，所述藥物部分可以是一種具有所需生物活性的蛋白質(zhì)或多肽。這樣的蛋白質(zhì)可以包括例如酶活性毒素或其活性片段，例如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質(zhì)，例如腫瘤壞死因子或干擾素-α；或生物反應調(diào)節(jié)物，例如淋巴因子、白介素-1 (“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒細胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其它生長因子。
用于將這樣的治療部分與抗體綴合的技術(shù)是眾所周知的，參見例如Arnon等，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InCancer Therapy″，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(編著)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，″AntibodiesFor Drug Delivery″，Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson等(編著)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，″Antibody Carriers OfCytotoxic Agents In Cancer TherapyA Review″，Monoclonal Antibodies′84Biological And Clinical Applications，Pinchera等(編著)，pp.475-506(1985)；″Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic UseOf Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy″，Monoclonal Antibodies ForCancer Detection And Therapy，Baldwin等(編著)，pp.303-16(AcademicPress 1985)，和Thorpe等，″The Preparation And Cytotoxic Properties OfAntibody-Toxin Conjugates″，Immunol.Rev.，62119-58(1982)。
治療方案本發(fā)明提供包含與藥學上可接受的載體一起配制的一種或一種組合的單克隆抗體(完整的或其結(jié)合片段)的藥用組合物。某些組合物包括一種組合的多種(例如兩種或兩種以上)本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分。在某些組合物中，所述組合物的每種抗體或其抗原結(jié)合部分是與抗原的一種不同的預先選定的表位結(jié)合的單克隆抗體或人序列抗體。
在預防應用中，給予易感疾病或病癥(即免疫疾病)或有此危險的患者足量的藥用組合物或藥物，以消除或降低此危險、減輕所述疾病(包括所述疾病的生物化學、組織學和/或行為癥狀)、其并發(fā)癥和在發(fā)病期間存在的中間病理表型的嚴重程度或延遲其發(fā)作。在治療應用中，給予疑有或者已經(jīng)患有這種疾病的患者足量的組合物或藥物，以治愈或者至少部分阻止所述疾病(生物化學、組織學和/或行為)包括其并發(fā)癥和發(fā)病期間的中間病理學表型的癥狀。適合實現(xiàn)治療性或預防性治療的量被定義為治療有效量或預防有效量。在預防方案和治療方案中，藥物通常都分數(shù)個劑量給予，直至達到足夠的免疫應答。通常監(jiān)視免疫應答，如果免疫應答開始消退，則給予重復的劑量。
有效量本發(fā)明組合物用于治療本文所述免疫相關(guān)病癥和疾病的有效量視許多不同因素而變，所述因素包括給藥方法、靶部位、患者的生理狀況、患者是人類還是動物、給予的其它藥物以及治療是預防性的還是治療性的。所述患者通常為人類，但也可以治療非人類哺乳動物，包括轉(zhuǎn)基因哺乳動物。治療劑量需要逐漸增加，以對安全性和效力進行優(yōu)化。
對于給予抗體，劑量范圍為約0.0001-100mg/kg宿主體重，更通常為0.01-5mg/kg宿主體重。例如，劑量可以是1mg/kg體重或10mg/kg體重，或者在1-10mg/kg范圍內(nèi)。一種示例性的治療方案需要每兩周給予1次或者每月給予1次，或者每3-6個月給予1次。在某些方法中，同時給予具有不同結(jié)合特異性的兩個或更多種單克隆抗體，在這種情況下，每種抗體的給藥劑量在指定的范圍內(nèi)。通常給予多次抗體。單次給藥之間的間隔可以是每周、每月或者是每年。根據(jù)通過測量患者體內(nèi)血液抗體水平表明，間隔也可以是不規(guī)則的。在某些方法中，調(diào)節(jié)劑量，以達到1-1000μg/ml的血漿抗體濃度，在某些方法中達到25-300μg/ml的血漿抗體濃度。另一方面，抗體可以作為緩釋制劑給予，在這種情況下需要的給藥頻率較低。劑量和頻率視所述抗體在患者體內(nèi)的半壽期而有所變化。一般而言，人抗體顯示出最長的半壽期，然后是人源化抗體、嵌合抗體和非人類抗體。給藥劑量和給藥頻率可以根據(jù)所述治療是預防性的還是治療性的而有所變化。在預防應用中，在一段長時間內(nèi)以頻率相對較低的間隔給予相對低的劑量。某些患者此后將終身接受治療。在治療應用中，有時需要以相對短的間隔給予相對高的劑量，直至疾病發(fā)展減弱或終止，優(yōu)選直至患者顯示出病狀的部分緩解或完全緩解。此后，可以給予該患者一種預防方案。
對于編碼免疫原的核酸而言，劑量范圍為每位患者約10ng-1g、100ng-100mg、1μg-10mg或30-300μg DNA。用于感染性病毒載體的劑量在10-100或更多病毒體/劑范圍內(nèi)變化。
給藥途徑用于誘發(fā)免疫應答的藥物可以通過胃腸外、局部、靜脈內(nèi)、經(jīng)口、皮下、動脈內(nèi)、顱內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或肌內(nèi)途徑給予，以用于預防性和/或治療性治療。免疫原性藥物最常用的給藥途徑是皮下，雖然其它途徑可能同樣有效。下一個最常用的途徑是肌內(nèi)注射。這種類型的注射最為常見的是在臂部或腿部肌肉中進行。在某些方法中，直接將藥物注射到已經(jīng)積累了沉淀物(deposit)的特定組織中，例如顱內(nèi)注射。對于抗體的給予，與靜脈輸注相比，優(yōu)選肌內(nèi)注射。在某些方法中，直接將特定的治療性抗體注射到顱內(nèi)。在某些方法中，抗體以緩釋組合物或裝置如MedipadTM裝置給予。
本發(fā)明的藥物可以任選地與在治療包括免疫相關(guān)疾病在內(nèi)的各種疾病中至少部分有效的其它藥物聯(lián)合給予。就在腦中發(fā)生淀粉狀蛋白沉積的早老性癡呆和唐氏綜合征而論，也可以將本發(fā)明的藥物與增加本發(fā)明藥物穿過血腦屏障(BBB)的其它藥物結(jié)合給予。
制劑本發(fā)明的藥物通常作為藥用組合物給予，所述藥用組合物包含活性治療藥即和各種各樣的其它藥學上可接受的組分。參見Remington′sPharmaceutical Science(15th ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，1980)。優(yōu)選的形式取決于計劃的給藥方式和治療應用。根據(jù)所需的制劑，所述組合物也可以包括藥學上可接受的無毒載體或稀釋劑，其定義為通常用來配制供動物或人類給藥用的藥用組合物的載體。選擇稀釋劑，以便不會影響所述組合的生物活性。這類稀釋劑的實例是蒸餾水、生理磷酸緩沖鹽溶液、Ringer氏溶液、葡萄糖溶液和Hank氏溶液。另外，所述藥用組合物或制劑也可以包括其它載體、輔料或無毒、非治療性、非免疫原性穩(wěn)定劑等。
藥用組合物也可以包括大的被緩慢代謝的大分子，例如蛋白質(zhì)、多糖如脫乙酰殼多糖、聚乳酸、聚羥基乙酸和共聚物(例如膠乳官能化sepharoseTM、瓊脂糖、纖維素等)、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和脂質(zhì)聚集體(例如油珠或脂質(zhì)體)。另外，這些載體可以用作免疫刺激劑(即佐劑)。
對于胃腸外給藥，本發(fā)明的藥物可以作為注射劑量的所述物質(zhì)在生理上可接受的稀釋劑與藥用載體中的溶液或懸浮液來給予，所述藥用載體可以是無菌液體，例如水、油、鹽水、甘油或乙醇。另外，組合物可以存在輔料，例如潤濕劑或乳化劑、表面活性劑、pH緩沖物質(zhì)等。藥用組合物的其它成分是來源于石油、動物、植物或合成的那些成分，例如花生油、豆油和礦物油。一般而言，甘醇類如丙二醇或聚乙二醇是優(yōu)選的液體載體，尤其對于注射液而言?？贵w可以以長效注射劑(depotinjection)或植入制劑的形式給予，所述長效注射劑或植入制劑可以以允許所述有效成分緩釋的方式配制。一種示例性組合物包含配制在由50mM L-組氨酸、150mM NaCl組成用HCl調(diào)至pH6.0的水性緩沖液中的5mg/ml的單克隆抗體。
通常，組合物配制為注射劑，或為液體溶液或為懸浮液；也可以制備適合于在注射前在液體溶媒中制成溶液或懸浮液的固體形式。所述制劑也可以如上所述被乳化，或者包封在脂質(zhì)體或微粒如聚丙交酯、聚乙交酯或共聚物中以便增強佐劑效應(參見Langer，1990，Science2491527和Hanes，1997，Advanced Drug Delivery Reviews 2897-119)。本發(fā)明的藥物可以以長效注射劑或植入制劑的形式給予，所述注射劑或制劑以允許所述有效成分緩釋或脈沖釋放的方式配制。
適用于其它給藥模式的其它制劑包括經(jīng)口、鼻內(nèi)和肺部用制劑、栓劑和透皮應用。
對于栓劑，粘合劑和載體包括例如聚亞烷基二醇或甘油三酯；可以由含有0.5％-10％、優(yōu)選1％-2％范圍內(nèi)的有效成分的混合物，形成這種栓劑?？诜苿┌ㄙx形劑，例如藥物級甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素和碳酸鎂。這些組合物采用溶液劑、混懸劑、片劑、丸劑、膠囊劑、緩釋制劑或散劑的形式，含有10％-95％有效成分，優(yōu)選含25％-70％有效成分。
局部用藥可以導致經(jīng)皮或皮內(nèi)遞藥。通過將所述藥物與霍亂毒素或其解毒型衍生物或亞單位或其它相似的細菌毒素共同給予，可以促進局部給藥(參見Glenn等，1998，Nature 391851)。使用作為混合物或作為通過化學交聯(lián)或者作為融合蛋白表達獲得的連接分子，可以達到共同給藥。
另一方面，用皮膚貼劑或transferosomes(Paul等，1995，Eur.J.Immunol.25，3521-24；Cevc等，1998，Biochem.Biophys.Acta 1368，201-15)，可以達到經(jīng)皮遞藥。
所述藥用組合物一般配制為無菌、基本等滲的，并且完全符合美國食品藥物管理局的所有Good Manufacturing Practice(藥品生產(chǎn)管理規(guī)范)(GMP)條例。
毒性優(yōu)選治療有效量的本文所述蛋白將提供治療效益，而不引起顯著的毒性本文所述蛋白的毒性可以用標準藥學方法，在細胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游镏袦y定，例如通過測定LD50(使50％群體致死的劑量)或LD100(使100％群體致死的劑量)來測定。毒性作用和治療效應之間的劑量比是治療指數(shù)。從這些細胞培養(yǎng)物測定和動物研究獲得的數(shù)據(jù)，可以用于制訂人類用無毒的劑量范圍。本文所述蛋白的劑量優(yōu)選在包括低毒性或無毒的有效量的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。所述劑量可以在該范圍內(nèi)根據(jù)所用劑型和所用的給藥途徑而有所變化。確切的制劑、給藥途徑和劑量可以由各個醫(yī)師根據(jù)患者的病癥來選擇(參見例如Fingl等，1975，載于The Pharmacological Basis of Therapeutics，第1章，第1頁)。
試劑盒包含本發(fā)明的組合物(例如單克隆抗體、人序列抗體、人抗體、多特異性分子和雙特異性分子)和使用說明的試劑盒也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。所述試劑盒還可以包含至少一種另外的試劑、或者一種或多種另外的本發(fā)明人抗體(例如具有與所述抗原中不同于第一人抗體的表位結(jié)合的互補活性的人抗體)。試劑盒通常包括指示試劑盒內(nèi)容物計劃應用的標簽。術(shù)語標簽包括在試劑盒上供應、或者與試劑盒一起供應或者伴隨試劑盒供應的任何書寫或記錄材料。
實施例實施例1Cμ被打中小鼠的產(chǎn)生CMD打靶載體的構(gòu)建。質(zhì)粒pICEμ含有一個跨越μ基因的鼠Ig重鏈基因座的EcoRI/XhoI片段，得自Balb/C基因組λ噬菌體文庫(Marcu等，1980，Cell 22187)。將這一基因組片段亞克隆到質(zhì)粒pICEMI9H(Marsh等，1984，Gene 32481-485)的XhoI/EcoRI位點。pICEμ中包括的重鏈序列從恰好位于μ內(nèi)含子增強子3’的EcoRI位點下游延伸至位于μ基因最后一個跨膜外顯子下游約1kb的XhoI位點；然而，μ轉(zhuǎn)換重復區(qū)中的大部分已經(jīng)由于在大腸桿菌中傳代而缺失。
如下構(gòu)建所述打靶載體(參見圖1)。從pICEμ切下一個1.3kbHindIII/SmaI片段，將其亞克隆到HindIII/SmaI消化的pBluescript(Stratagene，La Jolla，CA)中。這一pICEμ片段從位于Cμ1 5’大約1kb的HindIII位點延伸至Cμ1內(nèi)的SmaI位點。所得的質(zhì)粒用SmaI/SpeI消化，插入得自pICEμ、從Cμ1 3’中的SmaI位點延伸至恰好位于最后一個Cμ外顯子下游XbaI位點的約4kb SmaI/XbaI片段。將所得質(zhì)粒pTAR1在SmaI位點線性化，并插入一個neo表達盒。該盒由小鼠磷酸甘油酸激酶(pgk)啟動子(XbaI/TaqI片段；Adra等，1987，Gene 6065-74)的轉(zhuǎn)錄控制下并且含有pgk聚腺苷酸化位點(PvuII/HindIII片段；Boer等，1990，Biochemical Genetics 28299-308)的neo基因組成。該盒得自質(zhì)粒pKJ1(由Tybulewicz等描述，1991，Cell 651153-1163)，從所述質(zhì)粒中切取作為EcoRI/HindIII片段的neo盒，將其亞克隆到EcoRI/HindIII消化的pGEM-7Zf(+)中，產(chǎn)生pGEM-7(KJ1)。通過EcoRI/SalI消化，從pGEM-7(KJ1)中切取neo盒，將其平端化，并以與基因組Cμ序列相反的方向亞克隆到質(zhì)粒pTAR1中的SmaI位點。所得的質(zhì)粒用NotI線性化，插入單純皰疹病毒胸苷激酶(tk)盒，以便于富集帶有同源重組的ES克隆，如Mansour等，1988，Nature 336348-352所述。該盒由以小鼠pgk啟動子和聚腺苷酸化位點作支架的tk基因的編碼序列組成，如Tybulewicz等，1991，Cell 651153-1163所述。所得的CMD打靶載體與所述重鏈基因組有總共大約5.3kb的同源性，設計用以產(chǎn)生其中neo表達盒插入第一個Cμ外顯子的唯一SmaI位點中的突變型μ基因。所述打靶載體電穿孔到ES細胞中之前，用在質(zhì)粒序列內(nèi)切割的PvuI線性化。
被打中ES細胞的產(chǎn)生和分析。基本上按照已描述的方法(Robertson，E.J.(1987)Teratocarcinomas and Embryonic Stem CellsAPractical Approach(E.J.Robertson編著)Oxford，IRL Press，p.71-112)，讓AB-1 ES細胞(McMahon，A.P.和Bradley，A.，1990，Cell 621073-1085)在無有絲分裂活性的SNL76/7細胞飼養(yǎng)層(出處同前)上生長。采用Hasty等所述的方法(Hasty，P.R.等，1991，Nature 350243-246)，將線性化的CMD打靶載體電穿孔到AB-1細胞中。將電穿孔細胞以1-2×106細胞/皿的密度接種到100mm培養(yǎng)皿中。24小時后，向培養(yǎng)基中加入G418(200微克/ml有效成分)和FIAU(5×10-7M)，讓抗藥性克隆在8-9天內(nèi)產(chǎn)生。挑出克隆，用胰酶處理，將其分為兩個部分，進一步擴大培養(yǎng)。然后將得自每個克隆的一半細胞冷凍，分析另一半細胞的載體和靶序列之間的同源重組。
通過DNA印跡雜交法進行DNA分析。如Laird等所述(Laird，P.W.等，1991，Nucleic Acids Res.194293)，從克隆中分離DNA。分離的基因組DNA用SpeI消化，用915bp SacI片段即探針A探測(圖1)，探針A與μ內(nèi)含子增強子和μ轉(zhuǎn)換區(qū)之間的序列雜交。探針A從野生型基因座檢測到一個9.9kb SpeI片段，從μ基因座檢測到一個已經(jīng)與CMD打靶載體(neo表達盒含有一個SpeI位點)同源重組的7.6kb鑒別性條帶。在通過DNA印跡分析篩選出的1132個G418和FIAU抗性克隆中，3個克隆顯示出指示在μ基因座同源重組的所述7.6kb SpeI條帶。這3個克隆進一步用酶BglI、BstXI和EcoRI消化，以證實所述載體同源整合到μ基因中。當用探針A雜交時，用BglI、BstXI或EcoRI消化的野生型DNA的DNA印跡分別產(chǎn)生15.7、7.3和12.5kb的片段，而7.7、6.6和14.3kb的片段分別指示被打中μ等位基因的存在。所有3個通過SpeI消化所檢測的陽性克隆都顯示出預期的鑒別所述neo盒插入Cμ1外顯子中的BglI、BstXI和EcoRI限制性片段。
帶有突變型μ基因的小鼠的產(chǎn)生。將指定編號為264、272和408的所述3個被打中ES克隆解凍復蘇，如Bradley所述(Bradley，A.，1987，載于Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cellsa Practical Approach.(E.J.Robertson編著)OxfordIRL Press，p.113-151)，注射到C57BL/6J胚泡中。將經(jīng)注射的胚泡轉(zhuǎn)移到假孕雌性小鼠的子宮中，產(chǎn)生代表來源于輸入ES細胞和宿主胚泡的細胞混合物的嵌合小鼠。根據(jù)刺豚鼠毛色中C57BL/6J黑色背景上來源于所述ES細胞系的量，可以肉眼估計ES細胞對所述嵌合體的貢獻程度?？寺?72和408僅產(chǎn)生低百分比的嵌合體(即刺豚鼠著色的百分比低)，而克隆264產(chǎn)生高百分比的雄性嵌合體。讓這些嵌合體與C57BL/6J雌性配種，產(chǎn)生指示ES細胞基因組種系遺傳的刺豚鼠后代。通過對BglI消化的尾部活檢樣品的DNA的DNA印跡分析(如上文關(guān)于ES細胞DNA分析所述的方法)，篩選所述被打中的μ基因。大約50％的所述刺豚鼠后代除顯示15.7kb的野生型條帶之外，還顯示出一個7.7kb的BglI雜交條帶，證明所述被打靶μ基因的種系遺傳。
轉(zhuǎn)基因小鼠的μ基因的功能失活的分析。為了確定neo盒插入到Cμ1中是否使所述Ig重鏈基因失活，讓克隆264嵌合體與JHD突變純合小鼠配種，JHD突變由于JH基因區(qū)段的缺失而使重鏈表達失活(Chen等，1993，Immunol.5647-656)。產(chǎn)生了4個刺豚鼠后代。從1月齡這些動物中獲得血清，通過ELISA分析鼠IgM的存在。所述4個后代中的2個完全缺乏IgM(表1)。尾部活檢樣品DNA通過BglI消化并使其與探針A(圖1)雜交、以及通過StuI消化并與475bp EcoRI/StuI片段(出處同前)雜交進行DNA印跡分析，分析所述4只動物的基因型，證明不能表達血清IgM的動物是其中所述重鏈基因座中的一個等位基因帶有所述JHD突變、而另一個等位基因帶有所述Cμ1突變的動物。JHD突變雜合的小鼠顯示出血清Ig的野生型水平。這些數(shù)據(jù)證明，所述Cμ1突變使μ基因的表達失活。
表1

表1顯示了通過ELISA檢測的攜帶CMD突變和JHD突變的小鼠(CMD/JHD)、JHD突變雜合小鼠(+/JHD)、野生型小鼠(129Sv×C57BL/6J)F1小鼠(+/+)以及B細胞缺陷型JHD突變純合小鼠(JHD/JHD)的血清IgM水平。
實施例2人κ輕鏈轉(zhuǎn)基因KCo5人κ輕鏈轉(zhuǎn)基因小鼠系KCo5-9272的世代先前已被描述為KCo5(Fishwild，D.等，1996，Nat.Biotechnol.14，845-851；美國專利第5,770,429號中的實施例38)。該系通過共同注射人工人κ輕鏈基因座和包含多個人Vκ區(qū)段的YAC克隆而產(chǎn)生。從含有包含人Vκ基因座一部分的450kb酵母人工染色體(YAC)(ICRF YAC文庫命名4×17E1)的酵母菌株中分離出YAC克隆DNA。對從所述YAC DNA擴增的V基因區(qū)段的DNA序列分析證明，該克隆包含人遠端Vκ區(qū)的相當大的部分，包括大約32個不同Vκ區(qū)段。對該克隆不同分離株的分析(Brensing-Kuppers，J.等，1997，Gene 191173-181)證實了該結(jié)果，也證明該克隆代表人κ基因座C單倍型的一個實例，其中所述遠端V基因簇的5’部分類似近端V基因簇的同源區(qū)。因此，5’O家族V基因區(qū)段在序列上接近所述同源近端Op家族V區(qū)段。
為了獲得供微注射到胚胎原核用的純化YAC DNA，將總基因組DNA在瓊脂糖凝膠上進行大小分級分離。將含有YAC4×17E1的酵母細胞在裂解之前包埋在瓊脂糖中，通過脈沖場凝膠電泳將YAC DNA與酵母染色體DNA分開，分離YAC DNA，將其微注射到半日齡胚胎原核中。
對基因組DNA的DNA印跡分析證明，人VkA10基因(Cox，J.等，1994，Eur.J.Immunol.24827-836；Schable，K.和Zachau，H.，1993，Biol.Chem.Hoppe-Seyler 3741001-1022)摻入到KCo5-9272小鼠的基因組中。使用VκO1 5’區(qū)特異性的探針(m217-1，Genbank X76071；AB129，ccaccccataaacactgattc(SEQ ID NO4)；AB 130，ttgatgcatcctacccagggc(SEQ ID NO5))和VκL24和L25之間的基因間區(qū)特異性探針(m138-13，Genbank X72824；AB 127，cctgccttacagtgctgtag(SEQ ID NO6)；AB 128，ggacagcaacaggacatggg(SEQ ID NO7))進行PCR分析(Brensing-Kuppers，J.等，1997，Gene 191173-181)表明，得自YAC克隆4×17E1的Vκ基因簇的5’區(qū)和3’區(qū)包括在KCo5-9272轉(zhuǎn)基因整合體中。然后讓系KCo5-9272小鼠與人重鏈轉(zhuǎn)基因內(nèi)源免疫球蛋白基因座突變型小鼠配種，獲得內(nèi)源重鏈和κ輕鏈基因座破壞純合型、以及人重鏈轉(zhuǎn)基因HC2或HCo7(美國專利第5,770,429號)和人κ輕鏈轉(zhuǎn)基因KCo5半合型或純合型小鼠。內(nèi)源重鏈和κ輕鏈基因座破壞純合型、和人重鏈轉(zhuǎn)基因和人κ輕鏈轉(zhuǎn)基因半合型或純合型動物被命名為雙轉(zhuǎn)基因/雙缺失小鼠。
對直接得自KCo5雙轉(zhuǎn)基因/雙缺失小鼠或者得自由這些動物產(chǎn)生的雜交瘤的cDNA克隆的DNA序列分析揭示出以下Vκ基因表達L6、A27、O12、O4/O14、A10、L15、L18、L19和L24。
實施例3雜交育種通過雜交育種，使含有14號染色體片段hCF(SC20)的人重鏈基因座和人κ輕鏈轉(zhuǎn)基因結(jié)合到一個品系中。hCF(SC20)轉(zhuǎn)基因小鼠品系是內(nèi)源重鏈基因座(CM2D)和內(nèi)源κ輕鏈(CKD)失活突變純合型的。該品系也是λ1(low)突變純合型的(Tomizuka，K.等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97722-727)。CM2D突變包含覆蓋Cμ2、Cμ3-Cμ4的部分以及Mμ1和Mμ2的3.7kb BamHI-XhoI區(qū)段的缺失。CKD突變包含覆蓋Cκ外顯子的2kb SacII-BglII區(qū)段的缺失。這兩種突變先前已有報道(Tomizuka，K.等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97722-727)。讓這些小鼠分別與KCo5-9272人κ轉(zhuǎn)基因插入純合型小鼠以及內(nèi)源重鏈和κ鏈基因座的CMD和JKD破壞純合型小鼠配種。在以上實施例1中描述了CMD突變。JKD突變描述于美國專利第5,770,429號和Chen等，1993，EMBO J.12821-830)中。得自這些交配的hCF(SC20)轉(zhuǎn)染色體陽性的后代(SC20/KCo5小鼠，或者雜種小鼠)對于以下6種不同的遺傳修飾是半合子型的SC20、KCo5、CMD、CHD、JKD和CKD2。然而，由于內(nèi)源重鏈基因座的CMD突變和CM2D突變阻止小鼠μ基因的表達，而內(nèi)源κ基因座的JKD突變和CKD突變阻止小鼠κ的表達，所以這些SC20/KCo5小鼠對于這兩個基因座中的每個基因座的破壞是純合型的。因此，所述小鼠的含κ輕鏈的抗體的表達依賴于SC20和KCo5轉(zhuǎn)基因。它們也可以形成雜種人/小鼠抗體，因為內(nèi)源小鼠λ輕鏈基因座仍有功能。所述小鼠也可以表達包含人重鏈V區(qū)和小鼠非μ重鏈同種型恒定區(qū)序列的嵌合人/小鼠抗體。這些嵌合抗體可以通過類別轉(zhuǎn)換介導而將人SC20 IgH基因座染色體易位到小鼠IgH基因座中來形成。這樣的“轉(zhuǎn)換(trans-switching)”事件先前發(fā)現(xiàn)存在于含小基因座重鏈轉(zhuǎn)基因的小鼠中(Taylor，L.等，1994，Int.Immunol.6579-591)。40只雄性Kco5/CMD/JKD小鼠和98只雌性hCF(SC20)/CM2D/CKD小鼠之間的雜交育種，產(chǎn)生305只幼畜。對由這些幼畜制備的血清樣品的ELISA分析(Tomizuka，K.等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97722-727)表明，305只幼畜中的125只(41％)是人Igμ鏈表達陽性的。檢測人Igκ鏈的進一步分析表明，所有hμ陽性個體也都是hκ陽性的，表明KCo5轉(zhuǎn)基因保留(參見實施例2)。使用用于檢測hCF(SC20)的D14S1419和D14S1420引物對(Tomizuka，K.等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97，722-727)對尾部DNA的PCR分析表明，所有hμ陽性個體保留hCF(SC20)，而所有hμ陰性個體都是hCF(SC20)陰性的。hCF(SC20)從雌性hCF(SC20)/CM2D/CKD的遺傳效率(41％)與先前報道的數(shù)據(jù)相一致(Tomizuka，K.等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97722-727)。
實施例4人Ig在雜種小鼠血清中的表達通過ELISA檢查從6-12周齡雜種小鼠制備的血清樣品，以測定人Igμ、γ、κ和小鼠λ鏈的濃度(圖2)。與在相似條件下保持的內(nèi)源Cμ缺失半合子型小鼠相比，人Igμ和Igγ的平均水平高于小鼠μ鏈水平(273mg/l)，分別是小鼠γ鏈水平(590mg/l)的1/3。這些重鏈表達水平類似于雙Tc/雙KO小鼠(hCF(SC20)/hCF(2-W23)/CM2D/CKD Tomizuka，K.等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97722-727)的水平。預期通過雄性和雌性雜種小鼠之間交配產(chǎn)生的1/4的F2后代是mλC1(λlow)突變純合型的，因為雜種小鼠的第一代是該突變雜合型的。通過ELISA測定21只先前報道中所述的F2雜種小鼠(Tomizuka，K.等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97722-727)的人Igκ輕鏈和小鼠Igλ輕鏈的血清濃度。在所檢查的21只小鼠中，6只小鼠表現(xiàn)出低(＜0.1)小鼠λ/人κ之比，這是λlow突變純合型小鼠的特征(Tomizuka，K.等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97722-727)。因此，這6只雜種小鼠可能是λ(low)突變純合型的，這可用于有效產(chǎn)生分泌包含人Ig重鏈和κ輕鏈的抗體的雜交瘤。
實施例5抗人CD4人單克隆抗體的產(chǎn)生抗原的免疫。第0天皮下注射弗氏完全佐劑(Sigma)中的100μg可溶性人CD4(sCD4)，給雜種小鼠和雙Tc/KO小鼠(n＝5)進行免疫，然后在第9、19和27天用弗氏不完全佐劑(Sigma)的100μg可溶性人CD4免疫。第37天最后一次靜脈注射含40μg sCD4的PBS。
小鼠體內(nèi)的體液應答。第0、16、26、34和40天收集血清。根據(jù)抗sCD4的單克隆抗體(MAb)的產(chǎn)生，通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，測量抗原特異性人Igγ和Igκ。對于ELISA的詳細方案描述于實施例4中。用含1μg/ml抗原的碳酸氫鹽緩沖液(Sigma)過夜包被抗原特異性板。用一種對抗原特異性的人單克隆IgG作為標準品，定量測定抗原特異性Igγ和Igκ。結(jié)果示于圖3、4、5和6中。在初次免疫后34天，在雜種小鼠和雙Tc/雙KO小鼠體內(nèi)觀察到人γ和κ應答。
雜交瘤的產(chǎn)生。第40天，將得自免疫小鼠的脾細胞與Sp2/0-Ag14細胞融合。將細胞懸浮液以20,000脾細胞/孔接種到384孔板中。根據(jù)抗sCD4單克隆抗體(MAb)的產(chǎn)生，篩選所得的雜交瘤。結(jié)果示于以下表1中。
表1CD4單克隆抗體的產(chǎn)生

通過兩輪有限稀釋，高效地亞克隆了得自雜種小鼠的親代雜交瘤。得自雜種小鼠的所有雜交瘤都分泌人γ/人κ抗CD4 MAb，無一個雜交瘤分泌人γ/鼠λ抗CD4 MAb。這些數(shù)據(jù)表明，對于產(chǎn)生抗原特異性人單克隆抗體而言，雜種小鼠優(yōu)于雙TC/KO品系。通過多個ELISA，進一步檢查了由這些亞克隆雜交瘤分泌的MAb的同種型。7個孔是hγ1+，7個孔是hγ4+。
小規(guī)模培養(yǎng)物中的生長曲線和抗CD4人IgG1單克隆抗體的分泌水平。用其中一個產(chǎn)生抗CD4人IgG1κ的雜交瘤克隆(KM2-3)來測定小規(guī)模培養(yǎng)物中的生長曲線和人單克隆抗體的分泌水平。第0天，將KM2-3雜交瘤細胞以1×105細胞/ml接種到4升旋轉(zhuǎn)瓶(Bellco)中。使用1升補充ITS-X(Gibco BRL)和1％低IgG血清(Hyclone)的ERDF培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。每天收集1ml培養(yǎng)基，測量細胞數(shù)以及如先前報道中所述(Tomizuka，K.等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97722-727)通過ELISA測量IgG1κ濃度。結(jié)果示于圖7。估計的生產(chǎn)率為24.6pg/細胞/天，這在類似于對于在這些條件下優(yōu)良的鼠雜交瘤所預期的范圍內(nèi)。
實施例6抗人G-CSF人單克隆抗體的產(chǎn)生抗原的免疫。通過第0、9、19、27天皮下注射TiterMaxGold佐劑(CytRx)中的100g可溶性人G-CSF，免疫雜種小鼠和雙Tc/KO小鼠(n＝5)。第37天，給雜種小鼠和雙Tc/KO小鼠最后一次靜脈注射PBS中的20g G-CSF。
每個小鼠品系體內(nèi)的體液應答。第0、16、26、34和40天收集血清。通過ELISA定量測定抗原特異性人Ig的濃度。用含1μg/ml抗原的碳酸氫鹽緩沖液(Sigma)過夜包被抗原特異性板。用一種對G-CSF特異性的人單克隆IgG作為標準品，定量測定抗原特異性Igγ和Igκ。結(jié)果示于圖8、9、10和11中。雜種小鼠血清中的抗原特異性hγ和hκ濃度約10倍于雙Tc/KO小鼠的所述濃度。
雜交瘤的產(chǎn)生。第40天，將得自免疫小鼠的脾細胞與Sp2/0-Ag14細胞融合，根據(jù)抗G-CSF單克隆抗體(MAb)的產(chǎn)生，通過ELISA篩選所得的雜交瘤。結(jié)果示于以下表2中。
表2G-CSF單克隆抗體的產(chǎn)生

產(chǎn)生抗G-CSF IgG的雜交瘤中的一半分泌人γ/人κ抗G-CSFMAb，其余的雜交瘤分泌人γ/鼠λ抗G-CSF MAb。通過兩輪有限稀釋亞克隆產(chǎn)生hγ/hκ抗體的雜交瘤。進一步的ELISA實驗證明，分別有5個、3個和3個孔是hγ1+、hγ2+和hγ4+。
實施例7抗人血清白蛋白人單克隆抗體的產(chǎn)生第0天腹膜內(nèi)注射弗氏完全佐劑(Sigma)中的50μg人血清白蛋白，免疫雜種小鼠，然后在第7、14和21天用弗氏不完全佐劑(Sigma)的50μg人血清白蛋白免疫。
雜交瘤的產(chǎn)生。第24天，將得自免疫小鼠的脾細胞與Sp2/0-Ag14細胞融合，根據(jù)針對抗原的單克隆抗體(MAb)的產(chǎn)生，通過ELISA篩選所得的雜交瘤。從產(chǎn)生抗白蛋白hγ的雜交瘤中隨機選擇10孔雜交瘤，進行亞克隆。所有的雜交瘤都人分泌γ/人κ抗白蛋白。該數(shù)據(jù)表明，對于產(chǎn)生抗原特異性全人單克隆抗體而言，雜種小鼠優(yōu)于雙TC/雙KO小鼠，因為2/3的得自雙Tc/雙KO小鼠的抗白蛋白IgG雜交瘤是mλ+(Tomizuka，K.等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97722-727)。
實施例8抗人CTLA-4單克隆抗體的產(chǎn)生抗原。通過PCR擴增cDNA克隆以及橋接合成寡核苷酸，構(gòu)建包含得自人CTLA-4和鼠CD3ζ基因的序列的融合蛋白的DNA編碼區(qū)段。所編碼的融合蛋白含有以下序列i.)編碼氨基酸1-190(含有人CTLA-4的信號肽、胞外結(jié)構(gòu)域和完整的人CTLA-4推定的跨膜序列)的人CTLA-4；和ii.)從氨基酸52至羧基末端的鼠CD3ζ。將PCR擴增產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒載體中，測定所述DNA序列。然后將所克隆的插入片段亞克隆到載體pBABE(它含有編碼嘌呤霉素抗性的基因(Morganstern，JP和Land，H，1990 Nucl.Acids Res.183587-96)中，產(chǎn)生pBABE-huCTLA-4/CD3ζ。將pBABE-huCTLA4/CD3ζ轉(zhuǎn)染到逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝系ψ-2中，選擇出一個嘌呤霉素抗性細胞庫。將這些細胞與鼠T細胞雜交瘤BW5147(ATCC#TIB-47)共同培養(yǎng)。共同培養(yǎng)2天后，除去非貼壁BW5147細胞，根據(jù)對嘌呤霉素的抗性進行選擇。通過有限稀釋，亞克隆所述嘌呤霉素抗性細胞庫，并且根據(jù)人CTLA-4的表面表達，通過FACS進行測試。選擇出一個在細胞表面表達高水平人CTLA-4的克隆(BW-huCTLA-4CD3ζ-3#12)。包含人CTLA-4胞外結(jié)構(gòu)域的可溶性重組抗原購自R&D Systems(Cat.#325-CT-200)。
免疫。給3只SC20/KCo5雜種小鼠(ID#22227、22230和22231)分別腹膜內(nèi)(i.p.)注射10e7經(jīng)洗滌表達人CTLA-4胞外結(jié)構(gòu)域的BW-huCTLA-4CD3ζ-3#12全細胞，進行免疫。以大約1個月的間隔，給小鼠#22227和22230重復這一免疫步驟2次或更多次。第3個月，給小鼠#22231第三次腹膜內(nèi)注射經(jīng)洗滌的全細胞，而給小鼠#22227和22230分別腹膜內(nèi)注射和皮下(s.c.)注射MPL+TDM佐劑(Sigma Cat.#M6536)中20微克可溶性重組抗原。然后讓小鼠休息10天，在收獲用于雜交瘤融合的脾細胞之前2天，分別給小鼠#22227和22230尾靜脈(i.v.)注射20微克可溶性重組抗原和腹膜內(nèi)注射MPL+TDM佐劑中的20微克可溶性重組抗原。收獲脾細胞前一天，給這些小鼠再靜脈注射20微克可溶性重組抗原。在收獲脾細胞前3天，腹膜內(nèi)給予小鼠#22231MPL+TDM佐劑中的10e7經(jīng)洗滌的BW-huCTLA-4CD3ζ-3#12細胞，然后在融合前2天，腹膜給予無佐劑的107經(jīng)洗滌的BW-huCTLA-4CD3ζ-3#12細胞。
融合。在3個獨立實驗中，采用標準方法(Harlow和Lane，1988，Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor New York；Kennett等，1980，Monoclonal Antibodies，HybridomasA New Dimension in Biological Analysis.Plenum，New York；Oi和Herzenberg，1980，Immunoglobulin Producing Hybrid Cell Lines，inSELECTED METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY，Mishell和Shiigi編著，pp.357-372.Freeman，San Francisco；Halk，1984，Methods inEnzymologyPlant Molecular Biology，Weissbach和Weissbach編著，pp.766-780，Academic Press，Orlando，F(xiàn)L)，將得自小鼠#22227、22230和22231的脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞(系P3 X63 Ag8.6.53，ATCC CRL1580，或SP2/0-Ag14，ATCC CRL 1581)融合。細胞培養(yǎng)在DMEM、10％FBS、OPI(Sigma O-5003)、BME(Gibco 21985-023)和3％OrigenHybridoma Cloning Factor(Igen IG50-0615)中。在最初的生長和選擇期間，向培養(yǎng)基中加入HAT或HT補充物。
雜交瘤篩選。為了鑒定分泌抗原反應性人IgG抗體的雜交瘤，ELISA板(Nunc MaxiSorp)用100μl孔含0.2μg/ml人CD152 Mu-Ig融合體(Ancel#501-820)的PBS于4℃包被過夜。洗滌板，用含有1％BSA的100μl/孔PBS-Tween封閉。加入50μl細胞培養(yǎng)上清液，然后孵育1-2小時。洗滌板，然后將其與100μl/孔與堿性磷酸酶綴合的山羊抗人γ重鏈(抗人γ(fc)AP Jackson#109-056-098)一起孵育1小時。每個步驟之間用PBS-Tween洗滌板3次。鑒定出76個分泌γ陽性的抗原反應性抗體的雜交瘤。然后進一步分析這些克隆，以確定γ重鏈或輕鏈同種型以及污染性IgM分泌細胞的存在與否(表3)。
表3得自包含抗原反應性人IgG抗體的1°雜交瘤孔的重鏈同種型的分析

首先測試雜交瘤上清液中抗原反應性人IgG的存在情況。然后測試76個陽性上清液的抗原反應性人IgM、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、Igκ和小鼠Igλ。捕獲試劑人CD152μ-Ig融合體(Ancel#501-820)。檢測試劑抗人γ(fc)HRP(Jackson#109-036-098)；抗人κHRP(Bethyl#A80-115P)；抗人γ1 HRP(Southern Biotech#9050-05)；抗人γ2 HRP(Southern Biotech#9070-05)；抗人γ3 HRP(SouthernBiotech#9210-05)；抗人γ4 HRP(Southern Biotech#9200-05)；抗人μHRP(Southern Biotech#1060-05)。
所述76個IgG抗原陽性孔中的75個也是人κ輕鏈抗原反應性抗體陽性，而其中7個孔是含小鼠λ的雜種抗體陽性。然而，所述7個λ陽性孔中的6個孔也含有κ輕鏈，這3個孔中的3個是污染性IgM抗原反應性抗體陽性。因為這些污染性IgM抗體可能有影響，包括λ輕鏈，所以在總共76個IgG克隆中有3-7個IgGλ克隆。因此，內(nèi)源小鼠λ看來僅產(chǎn)生4-9％的所述IgG陽性抗原反應性雜交瘤。然后將所述76個陽性雜交瘤孔中的22個孔的細胞通過有限稀釋再接種，以亞克隆分泌各個單克隆抗體的雜交瘤。從22個所述1°雜交瘤中的19個中，獲得穩(wěn)定的抗原反應性人IgG亞克隆(參見以下表4)。
表4抗CTLA-4雜交瘤的亞克隆

因此，獲得86％的亞克隆效率。亞克隆時，發(fā)現(xiàn)所述1°雜交瘤中的一個包含2個具有不同IgG同種型的不同克隆(參見以下表5)。
表5人IgGκ抗CTLA-4亞克隆的同種型分析

因此，獲得20個不同的亞克隆。所有20個克隆都使用人κ輕鏈，并且是全人克隆。
從所述亞克隆的雜交瘤中的5個(1H5、4A9、4C1、8H4和10E1)分離單克隆抗體，并且測試其阻斷CTLA-4與B7.2結(jié)合的能力(圖12和13)。
簡言之，用0.7μg/ml(100μl/孔)的B7.2 Ig融合蛋白包被ELISA板(參見WO 01/14424，該文獻通過引用全部結(jié)合到本文中用于所有目的)。洗滌板，并用PBS-T+1％BSA封閉30分鐘。將抗體與等體積的0.2μg/ml生物素標記的CTLA-4Ig(Ancell#501-030)混合，于室溫預保溫1小時，然后轉(zhuǎn)移到B7.2包被的ELISA板中，保溫1小時。洗滌板，加入100μl/孔鏈霉抗生物素蛋白堿性磷酸酶(Kirkegaard and Perry Labs15-30-0)，保溫1小時。用pnpp底物讓板顯色。對生物素標記的CTLA-4與B7.2結(jié)合的抑制，以抗體濃度對405nm吸光度曲線作圖?？贵w10D1是一種CTLA-4特異性人IgG1，(參見WO 01/14424)。抗體同種型是1H5.1(γ1)、4A9.1(γ1)、4C1.1(γ4)、8H4.4(γ4)、10E1.1(γ4)和10D1(γ1)。
發(fā)現(xiàn)其中2種抗體(1H5和4A9)是封閉性抗體，發(fā)現(xiàn)其中3種抗體(4C1、8H4和10E1)是非封閉性抗體(圖12和13)。
給予抗CTLA-4可以增強T細胞介導免疫應答(Krummel，1995，J.Exp.Med.182459-465；Krummel等，1996，Int’l Immunol.8519-523)。因此可以用CTLA-4抗體作為佐劑，來增強另一因子的免疫原性。當給予抗CTLA-4抗體與另一因子時，這兩種可以以任一順序給予或者同時給予。所述方法可以用于增強的免疫應答對其有益的多種疫苗和治療。例如，傳染病和癌癥，包括黑素瘤、結(jié)腸癌、前列腺癌和腎癌。
CTLA-4抗體也可以用來負調(diào)節(jié)T細胞介導免疫應答。這一活性可以用抗CTLA-4抗體的多價制劑來獲得。例如，包被抗CTLA-4(用以增加抗體的價位)的膠乳微球可以抑制T細胞增殖和激活。具有同一抗體結(jié)合位點的因子，當作為Fab或可溶性IgG呈遞時，可以用作CTLA-4拮抗劑，而當高度交聯(lián)時，可以用作CTLA-4激動劑。因此，多價形式的抗CTLA-4抗體是可供免疫抑制用的有用的治療藥。
除與膠乳微球或其它不溶性顆粒連接之外，所述抗體可以相互交聯(lián)或者進行遺傳工程改造，以形成多聚體?？梢酝ㄟ^直接化學連接、或者通過間接連接如抗體-生物素-親和素復合物，進行交聯(lián)。交聯(lián)可以是共價的，其中利用化學連接基團，或者是非共價的，其中利用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)或其它蛋白質(zhì)-配體相互作用。連接的遺傳工程方法包括例如在IgM表達載體中重新表達高親和性IgG抗體的可變區(qū)或者任何蛋白質(zhì)部分(例如聚賴氨酸等)。將高親和性IgG抗體轉(zhuǎn)變?yōu)镮gM抗體，可以構(gòu)建具有極高親和力的十價復合物。IgA2表達載體也可以用來產(chǎn)生多價抗體復合物。IgA2可以與J鏈和分泌成分一起形成聚合物。IgA2可能具有附加的優(yōu)點，即它可以另外被嗜中性粒細胞、巨噬細胞和單核細胞上表達的IgA受體CD89交聯(lián)?；蛘?，因為從C20/KCo5雜種小鼠產(chǎn)生的雜交瘤中的大約2％是IgA，所以可以用這些動物直接產(chǎn)生人IgA同種型抗CTLA-4抗體。
使用某些包含CTLA-4上至少兩個非重疊表位的抗CTLA-4多克隆抗體的制劑，也可以獲得激動作用。在這種制劑中的一種含有兩個結(jié)合位點的抗體，可以與兩個分子的CTLA-4結(jié)合，形成一個小簇。然后，具有不同結(jié)合位點的第二抗體可以使這些小簇連接(聚集)，形成大簇，從而形成CTLA-4復合物(在細胞表面)，所述復合物可以將信號轉(zhuǎn)導給所述T細胞從而抑制、減弱或防止帶有(表達)CTLA-4的T細胞活化。因而，某些多克隆抗體制劑顯示出與上述多價制劑相似的激動作用。
因此，抗CTLA-4抗體的多價或多克隆制劑可用于激動CTLA-4受體，從而抑制在其它情況下由帶有CTLA-4受體的T細胞介導的免疫應答?？梢杂眠@種多價或多克隆抗體制劑治療的疾病的某些實例包括自身免疫病、移植排斥和炎癥。
實施例9抗人EGFR抗體的產(chǎn)生抗原。得自人癌A431細胞的純化可溶性上皮生長因子受體(EGFR)得自Sigma Chemical Co(E3641)。人癌A431細胞系得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC CRL-1555)。RibiMPL+TDM佐劑得自Sigma Chemical Co(M-6536)。
免疫。給兩只SC20/KCo5雜種小鼠(ID#22232和22239)分別腹膜內(nèi)(i.p.)注射107經(jīng)洗滌的人癌A431全細胞，進行免疫。1個月后在兩只小鼠中重復這一免疫步驟。第4個月，小鼠22239用MPL+TDM佐劑中的25μg可溶性EGFR腹膜內(nèi)免疫；休息11天，然后靜脈內(nèi)注射PBS中的10μg EGFR和腹膜內(nèi)注射MPL+TDM佐劑中的10μgEGFR進行免疫。2天后，小鼠22239再次靜脈內(nèi)接受PBS中的10μgEGFR，第二天，從小鼠22239收獲脾細胞用于融合。在前兩次注射A431細胞之后，讓小鼠22232休息3個月，然后腹膜內(nèi)注射與MPL+TDM佐劑混合的107A431細胞。4天后，從小鼠22232收獲脾細胞用于融合。
融合。在兩個獨立實驗中，將得自小鼠#22232和22239的脾細胞與或者P3 X63 Ag8.6.53(ATCC CRL 1580；小鼠#22239)或者SP2/0-Ag14(ATCC CRL 1581；小鼠#22232)骨髓瘤細胞系融合。采用實施例8中概述的標準方法進行融合。
雜交瘤篩選。EGFR雜交瘤的篩選方法與實施例8中用于CTLA-4的方法相似。用100μl/孔的1μg/ml可溶性EGFR抗原的PBS溶液包被ELISA板(Nunc MaxiSorp)過夜。洗滌板，并用含1％BSA的100μl/孔PBS-Tween封閉。加入50μl細胞培養(yǎng)上清液，然后保溫1-2小時。洗滌板，然后與100μl/孔的與堿性磷酸酶綴合的山羊抗人γ重鏈(抗人γ(fc)AP Jackson#109-056-098)一起保溫1小時。在每個步驟之間用PBS-Tween洗滌板3次。從小鼠22232和小鼠22239融合物中分別亞克隆了5個和2個分泌人IgGκ抗EGFR特異性抗體的雜交瘤。對所述EGFR特異性抗體重鏈和輕鏈的同種型分析包括4種IgG1κ、1種IgG2κ和1種IgG4κ抗體。
實施例10純化人IgGκ單克隆抗體的速率常數(shù)和平衡常數(shù)所述雜交瘤在含1％胎牛血清(低IgG)的eRDF中培養(yǎng)。用G蛋白柱純化人MAb。用BIAcore2000儀器測定純化G-CSF MAb和可溶性CD4 MAb的速率平衡締合常數(shù)。按照生產(chǎn)商的說明，將人G-CSF(120RU)或CD4Fc(1600 RU)通過氨基共價偶聯(lián)固定化至BIAcore2000(BIAcore)的傳感芯片表面。讓所述單克隆抗體流過所述抗原。芯片分別用甘氨酸-HCl緩沖液(pH 1.5)或4M MgCl2再生，以除去任何殘留的抗人G-CSF MAb或抗CD4 MAb。用不同濃度的MAb重復這一循環(huán)。用BIAevaluation 3.0軟件，測定與抗原的結(jié)合和解離。將k締合除以k解離，得到Ka。如以下表6所示，這些值與從鼠抗人G-CSF MAb、克隆3316.111(R&D)或者鼠抗CD4 MAb、Leu3a(Pharmingen)獲得的值相當。
表6純化人IgGκ MAb的速率常數(shù)和平衡常數(shù)

實施例11雜種(Fc)小鼠的產(chǎn)生眾所周知，免疫耐受避免了對自身抗原的反應性，通常阻止產(chǎn)生其氨基酸序列與鼠對應物氨基酸序列相似或相同的針對外源抗原的小鼠單克隆抗體。與人抗原及其鼠對應物之間共同表位結(jié)合的小鼠單克隆抗體可能是有用的，因為蛋白質(zhì)抗原活性部位中的氨基酸序列往往是很好保守的。另外，由于體內(nèi)給予這些抗體所帶來的任何效應可以容易地用小鼠模型來研究。然而，獲得針對這類共同表位的小鼠單克隆抗體也一直是困難的。如上所述，本發(fā)明的雜種小鼠可以用來獲得針對各種人抗原的人單克隆抗體。然而，在某些情況下，可能難以獲得有結(jié)合很好保守的人抗原的能力或者與鼠對應物交叉反應的人單克隆抗體。因此，在本發(fā)明的另一方面，提供其中Fcγ受體IIB已被失活的本發(fā)明的其它雜種小鼠。這些小鼠在本文中被稱為雜種(Fc)小鼠，可供用于產(chǎn)生與很好保守的抗原結(jié)合或者與其鼠對應物交叉反應的單克隆抗體。生物化學研究和遺傳學研究表明，免疫球蛋白(Ig)的IIB型低親和性受體(FcγRIIB)，抑制通過抗體或免疫復合物觸發(fā)的細胞活化，并且可能是防止出現(xiàn)自身免疫方面的重要組分(Takai，T.等，1996，Nature 379346-349)。FcγRIIB(即抑制性Fc受體)有缺陷的動物在所有抗體介導類別的過敏反應中有普遍性的增強抗體應答和加重的炎癥(Takai，T.等，1996，Nature 379346-349)。例如，不是野生型小鼠，而用牛IV型膠原(C-IV)免疫的突變型小鼠表現(xiàn)出升高的對小鼠C-IV的自身抗體應答(Nakamura，A.等，2000，J.Exp.Med.191899-905)。然而，尚無關(guān)于研究FcγRIIB突變型小鼠是否可以用來有效生產(chǎn)自身反應性單克隆抗體的報道。此外，沒有證明有效產(chǎn)生在小鼠體內(nèi)與人抗原和鼠對應物兩個均結(jié)合的人單克隆抗體的報道。
如下所述，將FcγRIIB突變培育到本發(fā)明的雜種小鼠中。用牛C-IV免疫所得雜種(Fc)小鼠，誘發(fā)針對牛C-IV和鼠C-IV兩者的人抗體應答。也可以產(chǎn)生分泌與牛C-Iv和鼠C-Iv兩者結(jié)合的人單克隆抗體的雜交瘤。因此，所述雜種(Fc)小鼠可供用于生產(chǎn)既可結(jié)合免疫外源抗原又可結(jié)合其鼠對應物的人單克隆抗體。所述雜種(Fc)小鼠也可以用來獲得針對很好保守的抗原的人單克隆抗體。FcγRIIB敲除純合型(Fc(-/-))小鼠(Takai，T.等，1996，Nature 379346-349)由Toshifumi Takai博士(Tohoku University，JAPAN)提供。讓Fc(-/-)雄性小鼠與雌性雜種小鼠交配(如實施例3中所述)。如實施例3中所述，通過ELISA和PCR檢查每個F1個體中KCo5轉(zhuǎn)基因和hCF(SC20)的保留情況。使用以下三種引物，通過PCR分析測定FcγRIIB敲除的基因型neo，5’-CTCGTGCTTTACGGTATCGCC(SEQ ID NO8)；5’EC1，5’-AAACTCGACCCCCCGTGGATC(SEQ ID NO9)；和3’EC1，5’-TTGACTGTGGCCTTAAACGTGTAG(SEQ ID NO10).
用AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin Elmer)，對從尾部活檢樣品制備的基因組DNA樣品進行PCR。在含有上述三種引物(各0.5pM)的標準反應混合物中，對樣品擴增35個循環(huán)94℃30秒、62℃30秒、72℃30秒(Gene Amp PCR system 9600，Perkin Elmer)。野生型等位基因和純合型等位基因給出的條帶大小分別為161bp和232bp。選擇基因型為KCo5/CMD或CM2D(-/+)/CKD或JKD(-/+)/Fc(-/+)的F1雄性和基因型為hCF(SC20)/KCo5/CMD或CM2D(-/+)/CKD或JKD(-/+)/Fc(-/+)的F1雌性，并用于進一步的育種。最后，獲得基因型為hCF(SC20)/KCo5/CMD或CM2D(-/-)/CKD或JKD(-/-)/Fc(-/-)的小鼠(雜種(Fc))。證實所述雜種(Fc)小鼠體內(nèi)人Igμ和κ的血清表達水平與雜種小鼠中的水平(參見實施例4)相當。
實施例12抗小鼠IV型膠原人單克隆抗體的產(chǎn)生抗原的免疫。牛C-IV(Cellmatrix IV)得自Nitta Gellatin，Inc。在用弗氏佐劑乳化之前，所述C-IV溶液(3.0mg/ml，在1mMHCl中，pH3.0)通過加入1mM NaOH(終濃度)進行中和。雜種小鼠和雜種(FC)小鼠在尾部基部用在含結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)菌株H37Rv的CFA(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)中乳化的150μg C-IV免疫。26天和48天后，小鼠在同一部位用150μg C-IV+IFA(Wako PureChemical Industries，Ltd.)加強(Nakamura，A.等，2000，J.Exp.Med.191899-905)。
小鼠體內(nèi)的體液應答。第58天收集血清。按照已經(jīng)描述并進行修改的方法(Nakamura，A.等，2000，J.Exp.Med.191899-905)，通過ELISA測量血清中抗原反應性人Igγ。在各孔用50μl/孔的20μg/ml牛C-IV的PBS溶液于4℃包被過夜的96孔小平板測定(Nunc，MaxiSorp)中檢測到抗牛C-IV抗體。利用BIOCOAT cellware小鼠C-IV 96孔板測定(Becton Dickinson Labware)，檢測抗小鼠C-IV抗體。以50μl/孔加入經(jīng)稀釋的血清(1∶20-1280)，讓其于4℃反應過夜。洗滌各孔，與同辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗人IgG(Fc)(Sigma，A0170)一起于4℃保溫2小時，洗滌，然后用50μl TMB底物(Sumitomo Bakelite，ML-1120T)于室溫顯色30分鐘。用小平板讀出儀(Arvo，Wallac Berthold Japan)讀出450nm的OD。在雜種(Fc)而非在雜種小鼠的血清中，觀察到抗小鼠C-IV的特異性人γ自身抗體應答。在雜種(Fc)小鼠血清中觀察到增強的抗牛C-IV應答(圖14)。
融合和雜交瘤篩選。66天后，給小鼠額外腹膜內(nèi)注射(KM#1雜種，F(xiàn)C#1雜種(Fc))或靜脈注射(KM#2雜種，F(xiàn)C#2雜種(Fc))150μg抗原，69天后收獲脾細胞。采用標準方法，使得自小鼠的脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞(Sp2/0-Ag14)融合。將細胞懸浮液以200,000脾細胞/孔接種到96孔板中。細胞培養(yǎng)在DMEM、10％FBS、胰島素、IL-6中。在初始生長和選擇期間，向培養(yǎng)基中加入HAT或HT補充物。通過ELISA篩選雜交瘤。為了鑒定分泌小鼠C-IV的雜交瘤，用50μl/孔的40μg/ml小鼠C-IV(Sigma，C0534)的PBS溶液，于4℃包被ELISA板(Nunc MaxiSorp)過夜。加入50μl細胞培養(yǎng)上清液。從雜種(Fc)小鼠獲得兩個分泌hγ陽性小鼠C-IV反應性抗體的雜交瘤，通過有限稀釋法，成功地亞克隆了所述兩個雜交瘤(參見以下表7)。
表7抗IV型膠原單克隆抗體的產(chǎn)生

該數(shù)據(jù)表明，所述雜種(Fc)小鼠可用于生產(chǎn)針對很好保守的抗原或表位的人單克隆抗體。
***
本發(fā)明的范圍并不限于所例舉的用來說明本發(fā)明各個方面的實施方案的范圍，功能上等同的任何克隆、DNA或氨基酸序列都在本發(fā)明范圍內(nèi)。實際上，根據(jù)上述描述和附圖，除本文所述的之外的本發(fā)明的各種修改對于本領域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。這類修改將落入所附的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。也不用說，所給出的核苷酸的所有堿基對的大小是大致的，用于說明。
以上引用的所有出版物和專利文件通過引用全部結(jié)合到本文中用于所有目的，其程度如同每個出版物或?qū)＠募为氈该鹘Y(jié)合到本文中一樣。
序列表<110>Tomizuka，KazumaIshida，IsaoLonberg，NilsHalk.Ed<120>用于生產(chǎn)人類抗體的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)染色體嚙齒動物<130>014643-012110US<140>待定<141>待定<150>US 60/250,340<151>2000-11-30<160>10<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>3881<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述κ輕鏈質(zhì)粒<220><223>pCK7-96<400>1tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 60tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 120aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 180tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 240tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 300cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 360agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 420tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 480aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 540ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 600cctaactacg gctacactag aaggacagta 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1.一種轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物，所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物包含兩個人免疫球蛋白基因座，其中所述兩個人免疫球蛋白基因座中的一個是人重鏈基因座，而另一個基因座是人輕鏈基因座；并且其中所述基因座中僅一個是轉(zhuǎn)染色體的。
2.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物，其中所述轉(zhuǎn)染色體是自主型的。
3.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物，其中所述人輕鏈基因座與內(nèi)源哺乳動物染色體相連。
4.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物，其中所述人重鏈基因座是轉(zhuǎn)染色體的，而所述人輕鏈基因座與內(nèi)源哺乳動物染色體相連。
5.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物，其中所述人輕鏈基因座是轉(zhuǎn)染色體的，而所述人重鏈基因座與內(nèi)源哺乳動物染色體相連。
6.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物，其中所述內(nèi)源哺乳動物重鏈基因座和至少一個哺乳動物輕鏈基因座被失活。
7.權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物，其中所述內(nèi)源哺乳動物重鏈基因座和κ輕鏈基因座被失活。
8.權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物，其中將所述人輕鏈基因座的至少一部分克隆到Y(jié)AC載體中。
9.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物，其中所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物是小鼠。
10.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物，其中所述轉(zhuǎn)染色體包含人類14號染色體的片段。
11.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物，其中所述人重鏈基因座包含在hCF(SC20)中，而所述人輕鏈基因座包含在人κ輕鏈基因座轉(zhuǎn)基因KCo5中。
12.一種產(chǎn)生多種表達人抗體序列的B細胞的方法，所述方法包括提供權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物；且免疫所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物，以產(chǎn)生多種表達人抗體序列的B細胞。
13.權(quán)利要求12的方法，所述方法還包括收集所述多種表達人抗體表達序列的B細胞。
14.權(quán)利要求13的方法，所述方法還包括使所述多種B細胞與無限增殖化細胞融合形成雜交瘤。
15.權(quán)利要求14的方法，所述方法還包括從所述雜交瘤收集所述人抗體序列。
16.權(quán)利要求15的方法，其中純化所述人抗體序列。
17.權(quán)利要求12的方法，所述方法還包括收集編碼人抗體的序列。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述編碼人抗體的序列是全長的。
19.權(quán)利要求18的方法，所述方法還包括在轉(zhuǎn)染細胞中表達所述序列。
20.權(quán)利要求12的方法，其中所述轉(zhuǎn)染色體是人類14號染色體的片段。
21.權(quán)利要求12的方法，其中所述人轉(zhuǎn)染色體是hCF(SC20)。
22.權(quán)利要求12的方法，其中所述人輕鏈基因座包含得自天然人κ輕鏈基因座的未經(jīng)重排的序列。
23.權(quán)利要求12的方法，其中所述人κ輕鏈基因座是插入的KCo5轉(zhuǎn)基因。
24.權(quán)利要求12的方法，其中所述多種B細胞至少包含第一B細胞，所述第一B細胞編碼具有選自以下的第一同種型的抗體IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述多種B細胞還至少包含第二B細胞，所述第二B細胞編碼具有選自以下的不同于所述第一同種型的第二同種型的抗體IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。
26.權(quán)利要求12的方法，其中所述多種B細胞包含至少5種B細胞，每種所述B細胞編碼具有不同同種型的抗體，其中所述抗體的同種型分別是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。
27.權(quán)利要求24的方法，其中所述IgA同種型是IgA1或IgA2。
28.權(quán)利要求24的方法，其中所述IgG同種型是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
29.一種產(chǎn)生與預定抗原結(jié)合的人序列抗體的方法，所述方法包括下述步驟用所述預定抗原免疫權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物；并且從所述免疫的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物收集所述人序列抗體。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述人序列抗體以至少為1010M-1的平衡締合常數(shù)(Ka)與預定抗原結(jié)合。
31.權(quán)利要求29的方法，其中所述人序列抗體以至少為109M-1的平衡締合常數(shù)(Ka)與預定抗原結(jié)合。
32.權(quán)利要求29的方法，其中所述人序列抗體以至少為108M-1的平衡締合常數(shù)(Ka)與預定抗原結(jié)合。
33.權(quán)利要求29的方法，其中所述人序列抗體是單克隆抗體。
34.權(quán)利要求29的方法，其中所述人序列抗體是F(ab’)2、Fab、Fv或Fd片段。
35.權(quán)利要求29的方法，其中所述人序列抗體是抗原特異性的。
36.一種產(chǎn)生分泌人序列抗體的抗原特異性雜交瘤的方法，所述方法包括用預定抗原免疫權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物；使得自所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物的淋巴細胞與無限增殖化細胞融合形成雜交瘤細胞；并且測定所述雜交瘤細胞所產(chǎn)生的抗體與所述預定抗原的結(jié)合。
37.權(quán)利要求36的方法，其中超過50％的所述抗原特異性雜交瘤克隆分泌具有人重鏈和人輕鏈的抗體。
38.一種產(chǎn)生與預定抗原結(jié)合的人序列抗體的方法，所述方法包括下述步驟用所述預定抗原免疫權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物；并且篩選所形成的存在抗原反應性抗體的雜交瘤細胞。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述雜交瘤細胞以超過20％的效率亞克隆。
40.權(quán)利要求38的方法，其中所述抗原反應性抗體由培養(yǎng)的雜交瘤分泌。
41.權(quán)利要求38的方法，其中所述抗原反應性抗體是基本純的。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述基本純的抗體配制用于治療用途。
43.一種產(chǎn)生重排免疫球蛋白序列的方法，所述方法包括提供權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物，并且從所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物中獲得所述重排人免疫球蛋白序列。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述獲得步驟包括從所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物收集含有所述重排免疫球蛋白序列的B淋巴細胞。
45.權(quán)利要求43的方法，其中所述獲得步驟包括從B淋巴細胞中分離和擴增mRNA，以產(chǎn)生cDNA。
46.權(quán)利要求45的方法，所述方法還包括從所述cDNA分離和擴增重鏈和輕鏈可變區(qū)序列。
47.一種分離的核酸，所述分離的核酸編碼權(quán)利要求46的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列。
48.一種分離的核酸，所述分離的核酸編碼權(quán)利要求46的重鏈可變區(qū)序列。
49.一種分離的核酸，所述分離的核酸編碼權(quán)利要求46的輕鏈可變區(qū)序列。
50.一種載體，所述載體包含權(quán)利要求47的核酸。
51.一種包含權(quán)利要求47的核酸的表達載體，其中所述核酸的重鏈可變區(qū)序列和輕鏈可變區(qū)序列與控制所述核酸在宿主細胞中表達的調(diào)節(jié)序列操作上連接。
52.一種宿主細胞或所述細胞的后代，所述宿主細胞包含權(quán)利要求47的核酸。
53.權(quán)利要求52的宿主細胞，所述宿主細胞是一種真核細胞。
54.權(quán)利要求43的方法，所述方法還包括在致使所述核酸被表達的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求52的宿主細胞；并且從所述培養(yǎng)的宿主細胞或其培養(yǎng)基中回收所述核酸。
55.一種產(chǎn)生人抗體展示文庫的方法，所述方法包括將免疫原導入權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物中；從所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物的淋巴細胞中分離編碼人抗體鏈的核酸群體；并且生成展示所述抗體鏈的展示包裝文庫，其中一個文庫成員包含編碼抗體鏈的核酸，并且所述抗體鏈從所述包裝展示。
56.權(quán)利要求55的方法，其中當進行所述分離步驟時，所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物缺乏對所述免疫原的可檢測效價。
57.權(quán)利要求55的方法，其中所述免疫原是一種核酸。
58.權(quán)利要求55的方法，其中所述核酸編碼一種膜結(jié)合受體。
59.一種產(chǎn)生與預定抗原結(jié)合的人序列抗體或其片段的方法，所述方法包括下述步驟用所述預定抗原免疫權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物；從所述經(jīng)免疫的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物中收集抗體V區(qū)序列；將所收集的V區(qū)克隆到DNA載體中，產(chǎn)生一個表達文庫；并且讓所述文庫表達，以鑒定編碼與所述預定抗原結(jié)合的抗體或其片段的V區(qū)序列。
60.一種產(chǎn)生與預定抗原結(jié)合的人序列抗體或其片段的方法，所述方法包括下述步驟用所述預定抗原免疫權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物；從所述經(jīng)免疫的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物的B細胞或從通過使所述B細胞與無限增殖化細胞融合產(chǎn)生的雜交瘤中，分離編碼至少一個人抗體V區(qū)的cDNA；將所述cDNA克隆到表達載體中；將所述載體導入宿主細胞中；培養(yǎng)所述宿主細胞；并且從所述宿主細胞或其培養(yǎng)基中收集所述人序列抗體或其片段。
61.權(quán)利要求60的方法，其中所述分離步驟通過PCR進行。
62.權(quán)利要求60的方法，其中所述分離步驟通過用至少一種DNA探針篩選cDNA文庫來進行。
63.權(quán)利要求60的方法，其中所述分離步驟通過噬菌體展示文庫篩選來進行。
64.權(quán)利要求60的方法，其中所述cDNA編碼全長人抗體序列。
65.權(quán)利要求60的方法，其中所收集的人序列抗體同種型不同于所述經(jīng)免疫的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物的抗體生產(chǎn)細胞的同種型。
66.一種改進表達與預定抗原反應的人抗體的轉(zhuǎn)染色體小鼠雜交瘤細胞的穩(wěn)定性的方法，所述方法包括讓第一小鼠和第二小鼠配種，第一小鼠包含轉(zhuǎn)染色體上的第一人免疫球蛋白基因座，而第二小鼠包含插入內(nèi)源小鼠染色體中的第二人免疫球蛋白基因座；從所述配種中獲得第三小鼠，所述第三小鼠既包含所述第一人免疫球蛋白基因座，又包含所述第二人免疫球蛋白基因座；用所述預定抗原免疫所述第三小鼠或其后代；從所述經(jīng)免疫的小鼠中收集B細胞；并且使所述B細胞與無限增殖化細胞融合，獲得表達與所述預定抗原反應的人抗體的雜交瘤細胞。
67.權(quán)利要求66的方法，所述方法還包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述雜交瘤細胞；測試所述培養(yǎng)基，以鑒定表達與所述預定抗原反應的人抗體的雜交瘤細胞的存在；稀釋所述雜交瘤細胞；并且培養(yǎng)所述經(jīng)稀釋的雜交瘤細胞，獲得表達與所述預定抗原反應的人單克隆抗體的克隆細胞系。
68.權(quán)利要求67的方法，其中從至少50％的所述經(jīng)鑒定的雜交瘤細胞獲得所述克隆細胞系。
69.一種分泌具有IgA同種型的人序列抗體的小鼠雜交瘤細胞，所述人序列抗體以至少1010M-1的平衡締合常數(shù)(Ka)與特定抗原結(jié)合。
70.一種具有IgA同種型的人序列抗體，所述人序列抗體以至少1010M-1的平衡締合常數(shù)(Ka)與特定抗原結(jié)合。
71.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物，所述非人類哺乳動物還包含基因突變，其中所述突變增強對自身抗原的免疫應答。
72.權(quán)利要求71的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物，其中所述突變是Fc-γIIB基因失活。
73.權(quán)利要求12的方法，所述方法還包括基因突變，其中所述突變增強對自身抗原的免疫應答。
74.權(quán)利要求73的方法，其中所述突變是Fc-γIIB基因失活。
75.權(quán)利要求29的方法，所述方法還包括基因突變，其中所述突變增強對自身抗原的免疫應答。
76.權(quán)利要求75的方法，其中所述突變是Fc-γIIB基因失活。
77.權(quán)利要求36的方法，所述方法還包括基因突變，其中所述突變增強對自身抗原的免疫應答。
78.權(quán)利要求77的方法，其中所述突變是Fc-γIIB基因失活。
79.權(quán)利要求38的方法，所述方法還包括基因突變，其中所述突變增強對自身抗原的免疫應答。
80.權(quán)利要求79的方法，其中所述突變是Fc-γIIB基因失活。
81.權(quán)利要求43的方法，所述方法還包括基因突變，其中所述突變增強對自身抗原的免疫應答。
82.權(quán)利要求81的方法，其中所述突變是Fc-γIIB基因失活。
83.權(quán)利要求55的方法，所述方法還包括基因突變，其中所述突變增強對自身抗原的免疫應答。
84.權(quán)利要求83的方法，其中所述突變是Fc-γIIB基因失活。
85.權(quán)利要求59的方法，所述方法還包括基因突變，其中所述突變增強對自身抗原的免疫應答。
86.權(quán)利要求85的方法，其中所述突變是Fc-γIIB基因失活。
87.權(quán)利要求60的方法，所述方法還包括基因突變，其中所述突變增強對自身抗原的免疫應答。
88.權(quán)利要求87的方法，其中所述突變是Fc-γIIB基因失活。
全文摘要
本發(fā)明提供能夠生產(chǎn)人序列抗體的新型轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物以及生產(chǎn)和使用這些抗體的方法。
文檔編號C12N15/09GK1487996SQ01822339
公開日2004年4月7日 申請日期2001年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月30日
發(fā)明者富 一磨, 富塚一磨, 石田攻, N·倫伯格, E·哈爾克 申請人:米德列斯公司, 麒麟麥酒株式會社