專利名稱：新型兔抗體人源化方法和人源化的兔抗體的制作方法
背景技術(shù)：
相關(guān)申請本申請涉及且要求臨時申請美國序列號60/924，550和60/924，551以及實用新 型專利申請美國序列號11/802，235的優(yōu)先權(quán)，所述專利各自于2007年5月21日提交，并 且其內(nèi)容通過引用整體合并入本文。此外，本申請要求下述PCT申請的優(yōu)先權(quán),并且通過 引用整體合并，該PCT申請于2008年5月21日提交，名稱為“IL-6antibodies and Use Thereof and TNF-Alpha Antibodies”，并且所述 PCT 申請以代理人案號 67858-701902 和 67858-701802 提交。本發(fā)明提供了基于氨基酸序列和同源性的新型和改良方法，用于修飾(人源化) 兔抗體氨基酸可變重鏈和輕鏈多肽序列或來自緊密相關(guān)的物種例如其他兔形目動物的抗 體。相對于親本抗體例如兔抗體,所得到的經(jīng)修飾的抗體序列在人中具有更少免疫原性或 無免疫原性,并且相對于經(jīng)修飾的(人源化)抗體序列所衍生來源的親本抗體,保留相同或 基本上相同的抗原結(jié)合親和力。本發(fā)明進(jìn)一步提供了衍生自通過此種方法產(chǎn)生的兔抗體的人源化的可變輕鏈和 可變重鏈。如下文所示,本發(fā)明的方法可重現(xiàn)地產(chǎn)生保留原始兔抗體的抗原特異性和親和 力的人源化抗體。本發(fā)明的操作一般而言依賴于兔抗體互補決定區(qū)(CDR)中包含的特定氨 基酸殘基(“選擇性決定殘基”)從兔抗體轉(zhuǎn)移到同源的人抗體可變重鏈和輕鏈多肽序列 上。在更具體的實施方案中，本發(fā)明例示了對于白介素 6(IL 6)或腫瘤壞死因子 a (下文“TNF-a ”)具有結(jié)合特異性的人源化抗體及其人源化抗體片段和變體,其使用
。然而，應(yīng)當(dāng)理解本文提供的新型人源化方案可應(yīng)用 目動物衍生抗體的人源化，所述抗體與任何所需抗原特異性結(jié)合。這包 染物(病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲等)，變應(yīng)原，人抗原例如酶、激素、自身 抗原、生長因子、細(xì)胞因子、受體、受體配體、免疫調(diào)整(immimoregularoty)和免疫調(diào)節(jié) (immunomodulatory)分子等的抗原特異的抗體。本發(fā)明還涉及使用根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的人源化抗體和抗體片段作為治療和用于診 斷用途例如用于體外和體內(nèi)篩選測定法的方法,用于檢測與此種抗原相關(guān)的疾病和病癥。 例如,這包括使用針對IL-6或TNF- a的抗體的體內(nèi)成像篩選方法,和通過施用所述人源化 抗體或其片段治療與TNF-a 抗體在免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。它們可以滅活病毒和細(xì)菌毒素，并且在召募補體 系統(tǒng)和各種類型的白血細(xì)胞以殺死侵入微生物和大型寄生蟲方面是必需的?？贵w專有地通 過B淋巴細(xì)胞合成，并且以數(shù)百萬種形式產(chǎn)生，各種具有不同的氨基酸序列和對于抗原的 不同結(jié)合位點?？贵w統(tǒng)稱為免疫球蛋白(Ig),屬于血液中最豐富的蛋白質(zhì)組分。Alberts等人，Molecular Biology of the Cell,第 2 片反，1989, GarlandPublishing, Inc。
典型的抗體是具有2條相同的重(H)鏈(各自包含約440個氨基酸)和2條相同 的輕(U鏈(各自包含約220個氨基酸)的Y形分子。4條鏈通過非共價和共價(二硫) 鍵的組合結(jié)合在一起。蛋白水解酶例如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶可以使抗體分子分成不同的 特征片段。木瓜蛋白酶產(chǎn)生各自具有1個抗原結(jié)合位點的2個分開且相同的Fab片段,和 1個Fc片段。胃蛋白酶產(chǎn)生1個F(ab' )2片段。Alberts等人，Molecular Biology of the Cell，第 2 片反，1989，GarlandPublishing, Inc。 L和H:鏈都具有在其氨基末端處的可變序列但在其羧基末端處的恒定序列。L鏈具 有長約110個氨基酸的恒定區(qū)和相同大小的可變區(qū)。H鏈也具有長約110個氨基酸的可變 區(qū)，但H鏈的恒定區(qū)長約330或440個氨基酸，依賴于H鏈的種類。Alberts等人，Molecular Biologyof the Cell，第 2 版，1989，Garland Publishing, Inc.在第 1019 頁。僅部分可變區(qū)直接參與抗原的結(jié)合。研究已顯示L和H鏈的可變區(qū)中的可變性大 部分限制于每條鏈中的3個小高變區(qū)(也稱為互補決定區(qū),或CDR)?？勺儏^(qū)的其余部分稱 為構(gòu)架區(qū)(FR)是相對恒定的。Alberts等人，Molecular Biology of the Cell，第2版， 1989, GarlandPublishing, Inc.在第 1019-1020 頁。天然免疫球蛋白已在測定法、診斷和至更有限程度的治療中使用。然而，特別是在 治療中的此種用途已受天然免疫球蛋白的多克隆性質(zhì)所阻礙。限定特異性的單克隆抗體的 出現(xiàn)增加用于治療用途的機(jī)會。然而，在用靶蛋白質(zhì)免疫接種嚙齒類動物宿主動物，以及產(chǎn) 生目的抗體的嚙齒類動物脾細(xì)胞與嚙齒類動物骨髓瘤細(xì)胞的后續(xù)融合后，產(chǎn)生大多數(shù)單克 隆抗體。因此,它們基本上是嚙齒類動物蛋白質(zhì),并且像這樣在人中是天然免疫原性的，常 常產(chǎn)生不希望有的免疫應(yīng)答稱為HAMA(人抗小鼠抗體)應(yīng)答。許多團(tuán)體已設(shè)計了減少治療性抗體的免疫原性的技術(shù)。傳統(tǒng)地，通過與供體抗體 的同源性程度選擇人模板,即將在可變區(qū)中與非人抗體最同源的人抗體用作模板用于人源 化?；驹硎菢?gòu)架序列用于使CDR保持在其正確的空間方向上用于與抗原相互作用，并 且構(gòu)架殘基有時甚至可以參與抗原結(jié)合。因此,如果所選擇的人構(gòu)架序列最類似于供體 構(gòu)架的序列，那么這將使親和力保留在人源化抗體的可能性達(dá)到最大。例如，Winter(EP No. 0239400)提出使用長寡核苷酸通過定點誘變產(chǎn)生人源化抗體，以便移植來自每個重鏈 和輕鏈可變區(qū)的3個互補決定區(qū)(CDR1、⑶R2和CDR3)。盡管這種方法已顯示出起作用，但 它限制了選擇支持供體CDR的最佳人模板的可能性。盡管人源化抗體在人中比其天然或嵌合配對物具有更少免疫原性，但許多團(tuán)體發(fā) 現(xiàn)CDR移植的人源化抗體可能顯示顯著降低的結(jié)合親和力(例如，Riechmann等人，1988， Nature 3 32:323-327)。例如，Reichmann和同事發(fā)現(xiàn)CDR區(qū)單獨的轉(zhuǎn)移在CDR移植的產(chǎn) 物中不足以提供滿意的抗原結(jié)合活性，并且還必須使人序列在位置27處的絲氨酸殘基轉(zhuǎn) 變成相對應(yīng)的大鼠苯丙氨酸殘基。這些結(jié)果指出對人序列在CDR區(qū)外的殘基的改變可能是 必須的，以獲得有效的抗原結(jié)合活性。即使如此，結(jié)合親和力仍顯著低于原始單克隆抗體的 那種。例如，Queen等人(美國專利號5, 530，101)描述了與白介素_2受體結(jié)合的人源 化抗體的制備，其通過使鼠類單克隆(抗Tac MAb)的CDR與人免疫球蛋白構(gòu)架和恒定區(qū)相 組合。選擇人構(gòu)架區(qū)以使與抗Tac Mab序列的同源性達(dá)到最大。此外，將計算機(jī)建模用于鑒定可能與CDR或抗原相互作用的構(gòu)架氨基酸殘基,并且在人源化抗體中的這些位置處使 用小鼠氨基酸。據(jù)報告獲得的人源化抗Tac抗體具有對于白介素-2受體(p55)3xl0_9 M—1 的親和力，這仍僅是鼠類Mb的親和力的約三分之一。其他團(tuán)體鑒定了在可變區(qū)的構(gòu)架內(nèi)的進(jìn)一步位置(即，在可變區(qū)的a)R和結(jié)構(gòu)環(huán) 外)，在其上殘基的氨基酸同注可能促成獲得具有滿意的結(jié)合親和力的CDR移植產(chǎn)物。參 見例如，美國專利號6，054，297和5，929，212。然而，可能無法預(yù)先了解特定CDR移植排列 對于任何給定目的抗體如何有效。l,eung(美國專利申請公開號US 2003/0040606)描述了構(gòu)架修補(patching)方 法，其中將免疫球蛋白的可變區(qū)劃分成FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4,并且通過非 人抗體和人抗體模板之間的最佳同源性選擇個別FR序列。然而，這種方法是勞動密集型 的，并且可能不容易鑒定最佳構(gòu)架區(qū)。隨著更多治療性抗體被開發(fā)并且持有更有希望的結(jié)果，能夠減少或消除所施用的 抗體引起的機(jī)體的免疫應(yīng)答是重要的。因此，允許有效和快速改造抗體成為人樣和/或允 許使抗體人源化的勞動減少的新方法提供極大的利益和醫(yī)學(xué)價值。本文參考文獻(xiàn)的引用或討論不應(yīng)解釋為這是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)的承認(rèn)。發(fā)明概述本發(fā)明部分基于用于產(chǎn)生人源化可變重區(qū)域和/或輕區(qū)域和包含此種人源化可 變重區(qū)域和輕區(qū)域的人源化抗體或抗體片段的新人源化策略，所述區(qū)域衍生自兔或其他兔 形目動物抗體。優(yōu)選地,用于人源化的這些兔或其他兔形目抗體衍生抗體衍生自得自免疫 接種兔的克隆B細(xì)胞群體。更具體而言,本發(fā)明提供了用于人源化衍生自兔或另一種兔形目動物抗體的抗體 可變輕鏈的新型人源化策略，其依賴于選擇合適的同源人輕鏈可變序列和保留兔輕鏈CDR 中包含的特定選擇性決定殘基作為人源化策略的部分?！斑x擇性決定殘基”在下文中更詳細(xì)地定義，但基本上對應(yīng)于兔a)R區(qū)中包含的特 定氨基酸殘基,與用于衍生人源化抗體的人種系CDR中包含的相對應(yīng)氨基酸殘基比較,基 于其結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)性質(zhì)，所述氨基酸殘基被認(rèn)為對抗原識別和/或抗原結(jié)合具有顯著影 響。此外,更具體而言，本發(fā)明提供了用于人源化衍生自兔或另一種兔形目動物抗體 的抗體可變重鏈的新型策略,其依賴于選擇合適的同源重鏈可變序列和保留特定選擇性決 定殘基作為人源化策略的部分。此外，更具體而言，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生包含人源化可變重鏈和/或輕鏈的人 源化抗體和抗體片段的新型人源化策略,所述鏈衍生自兔或另一種兔形目動物抗體可變重 鏈和輕鏈多肽。更具體而言，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生衍生自兔形目動物(兔)輕鏈抗體序列的人 源化輕鏈抗體序列的人源化策略，其包括下述步驟(1)從與所需抗原特異性結(jié)合的兔抗體獲得兔輕鏈抗體序列，并且鑒定跨越所包 括的構(gòu)架1(FR1)開始到構(gòu)架3(FR3)結(jié)束的氨基殘基；(i i)使用跨越FR1幵始到FR3結(jié)束序列的所述兔輕鏈抗體氨基酸序列進(jìn)行針對包 含人輕鏈抗體可變序列的文庫的同源性搜索，并且鑒定對其顯示基本序列同源性的人輕鏈抗體序列，即相對于文庫中的其他人輕鏈抗體可變序列，優(yōu)選與其具有至少80% -90%同 一性和/或在氨基酸水平上顯示最大的序列同一性；(iii)在兔和人輕鏈可變序列中鑒定對應(yīng)于FRl、TO2、ra3、CDRl、CDR2區(qū)域的排列 及其特定殘基,并且比對在兔和所選擇的人抗體輕鏈中的這些不連續(xù)區(qū)域；(iv)構(gòu)建DNA或氨基酸序列,其中將所選擇的同源人輕鏈序列的CDR1和CDR2區(qū) 域中至少不同于兔輕鏈CDR1和CDR2中的相對應(yīng)選擇性決定殘基的氨基酸殘基用兔CDR1 和CDR2區(qū)域中的相對應(yīng)選擇性決定殘基替代；(v)將編碼或包含兔CDR3輕鏈抗體序列的相對應(yīng)氨基酸殘基的DNA序列或多肽進(jìn) 一步附著至通過步驟(iv)獲得的DNA或氨基酸序列；(vi)進(jìn)一步選擇與兔輕鏈中包含的FR4同源且優(yōu)選與其相差至多2-4個氨基酸殘 基的人輕鏈構(gòu)架4區(qū)(FR4),并且使編碼所述人FR4的DNA序列或所述人FR4的相對應(yīng)氨基 殘基附著至在步驟(v)后獲得的DNA或氨基酸序列上；和(vii)合成編碼或包含步驟⑴到(vi)中得到的人源化的兔輕鏈序列的DNA或氨 基酸序列。此外，更具體而言，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生來自兔重鏈抗體序列的人源化重鏈抗 體序列的人源化策略,其包括下述步驟(i)從與所需抗原特異性結(jié)合的兔抗體獲得兔重鏈抗體序列，并且鑒定跨越所包 括的構(gòu)架1(FR1)幵始到構(gòu)架3(FR3)結(jié)束的氨基殘基；(ii)使用跨越FR1開始到FR3結(jié)束序列的所述兔重鏈抗體氨基酸序列進(jìn)行同源性 搜索(例如，通過包含人種系抗體序列的文庫的BLAST搜索)，并且鑒定與其同源的人重鏈 抗體序列，即相對于文庫中的其他人重鏈抗體可變序列,優(yōu)選在氨基酸水平上與其具有至 少80% -90%同一性和/或在氨基酸水平上顯示最大的序列同一性；(iii)在兔和人重鏈序列中鑒定對應(yīng)于FR1、FR2、FR3、CDR1、CDR2區(qū)域的排列及其 特定殘基，并且針對所選擇的同源人抗體重鏈的相對應(yīng)區(qū)域比對兔的這些不連續(xù)區(qū)域；(iv)構(gòu)建DNA或氨基酸序列,其中將所選擇的同源人重鏈序列的CDR1和CDR2區(qū) 域中至少不同于兔重鏈CDR1和CDR2區(qū)域中的相對應(yīng)選擇性決定殘基的氨基酸殘基用兔重 鏈序列的CDR1和CDR2區(qū)域中包含的相對應(yīng)選擇性決定殘基替代，并且進(jìn)一步任選用兔重 鏈FR1的相對應(yīng)末端1-3個氨基酸替換人重FR1區(qū)的末端1 3個氨基酸；和/或任選用兔 重鏈構(gòu)架2的相對應(yīng)末端氨基酸殘基替換人重鏈構(gòu)架2區(qū)域的末端氨基酸,和/或任選用 相對應(yīng)人CDR2殘基(一般是絲氨酸)替換來自兔重鏈CDR2的末端的第4個氨基酸(一般 是色氨酸)；(v)將編碼或具有兔重鏈⑶R3的相對應(yīng)氨基酸殘基的DNA序列進(jìn)一步附著至通過 步驟(iv)獲得的DNA或氨基酸序列,所述氨基酸殘基包含在相同的兔重鏈抗體序列中；并 且所述兔CDR3長度一般是5-19個氨基酸(并且其中所述CDR3 一般在殘基WGXG前并且進(jìn) 一步其中X—般是Q或P)；(vi)進(jìn)一步選擇與其同源的人重鏈構(gòu)架4區(qū)域(FR4)(優(yōu)選與人源化的兔抗體重 鏈序列中包含的FR4相差至多4個氨基酸殘基),并且使編碼所述所選擇的同源人FR4的 DNA序列或所述人FR4的相對應(yīng)氨基殘基附著至在步驟(v)后獲得的DNA或氨基酸序列上 (通常這種人FR4 DNA或多肽序列將編碼或包含WGQGTLVTVSS)；和
(vii)合成編碼或包含步驟⑴到(vi)中得到的人源化的兔重鏈序列的DNA或氨
基酸序列。此外，更具體而言，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生人源化抗體或抗體片段的人源化策略， 所述人源化抗體或抗體片段包含衍生自兔輕鏈抗體序列的至少一種人源化輕鏈抗體序列 和/或衍生自兔抗體重鏈的至少--種人源化重鏈序列，其中此種人源化輕鏈和/或重鏈序 列根據(jù)下述步驟衍生自兔重鏈和輕鏈(i)從對所需抗原特異的兔抗體獲得兔輕鏈抗體序列，并且鑒定跨越所包括的構(gòu) 架1 (FR1)開始到構(gòu)架3(FR3)結(jié)束的氨基殘基；(ii)使用跨越FR1開始到FR 3結(jié)束序列的所述兔輕鏈抗體氨基酸序列進(jìn)行針對 包含人輕鏈抗體序列的文庫的同源性搜索，并且鑒定與其同源的人輕鏈抗體序列，即相對 于文庫中的其他人輕鏈抗體可變序列,優(yōu)選在氨基酸水平上與其至少80% -90%等同和/ 或在氨基酸水平上顯示最大的序列同一性；(iii)在兔和人輕鏈序列中鑒定對應(yīng)于FR1、FR2、FR3、CDR1、CDR2區(qū)域的排列及其 特定殘基，并且比對兔輕鏈的這些不連續(xù)區(qū)域與所選擇的同源人輕鏈區(qū)的相對應(yīng)區(qū)域；(iv)構(gòu)建DNA或氨基酸序列，其中將所選擇的同源人輕鏈序列的CDR1和CDR2區(qū) 域中至少不同于兔可變輕鏈CDR1和CDR2區(qū)域中的相對應(yīng)選擇性決定殘基的氨基酸殘基用 兔輕鏈序列的兔CDR1和CDR2區(qū)域中的相對應(yīng)選擇性氨基酸殘基替代；(v)將編碼或具有兔輕鏈抗體序列中包含的CDR3的相對應(yīng)氨基酸殘基的DNA序列 進(jìn)一步附著至通過步驟(iv)獲得的DM或氨基酸序列；(vi)進(jìn)一步選擇與所述兔抗體輕鏈中包含的FR4同源且人FR4優(yōu)選與兔抗體輕 鏈序列的FR4相差至多2-4個氨基酸殘基的人輕鏈構(gòu)架4區(qū)(FR4),并且使編碼所述人FR4 的DNA序列或所述人FR4的相對應(yīng)氨基殘基附著至在步驟(v)后獲得的DNA或氨基酸序列 上；和(vii)合成編碼或包含步驟⑴到(vi)中得到的人源化的兔輕鏈序列的DNA或氨 基酸序列；和/或進(jìn)一步產(chǎn)生來自兔重鏈抗體序列的人源化重鏈抗體序列，其包括下述步(1)從對所需抗原特異的兔抗體獲得兔重鏈抗體序列，并且鑒定跨越所包括的構(gòu) 架1 (FR1)開始到構(gòu)架3(FR3)結(jié)束的氨基殘基；(ii)使用跨越FR1開始到FR3結(jié)束序列的所述兔重鏈抗體氨基酸序列進(jìn)行同源 性搜索，例如，通過包含人種系抗體序列的文庫的BLAST搜索，并且鑒定如下人重鏈抗體序 列，相對于文庫中包含的其他人重鏈抗體可變序列，所述人重鏈抗體序列在氨基酸水平上 與其至少85% -90%等同和/或在氨基酸水平上顯示最大的序列同--'性；(iii)在兔和人重鏈序列中鑒定對應(yīng)于FR1、FR2、FR3、CDR1、CDR2區(qū)域的排列及其 特定殘基，并且針對所選擇的同源人重鏈比對兔抗體的這些不連續(xù)區(qū)域；(iv)構(gòu)建DNA或氨基酸序列,其中所選擇的同源人重鏈序列的CDR1和CDR2區(qū)域 中至少不同于兔可變重鏈CDR1和CDR2區(qū)域中的相對應(yīng)選擇性決定殘基的氨基酸殘基用兔 重鏈序列的CDR1和CDR2區(qū)域中的相對應(yīng)選擇性決定殘基替代，和/或任選用兔重鏈FR1的 末端H個氨基酸替換人重FR1區(qū)域的最后個氨基酸；和/或任選用兔重鏈構(gòu)架2末端氨基酸殘基替換人重鏈構(gòu)架2區(qū)域的末端氨基酸；和/或進(jìn)一步任選用相對應(yīng)人CDR2 殘基(一般是絲氨酸)替換來自兔重鏈CDR2的末端的第4個氨基酸(一般是色氨酸)；(v)將編碼或相同兔重鏈抗體序列中包含的兔重鏈CDR3的相對應(yīng)氨基酸殘基的 DKA序列進(jìn)一步附著至通過步驟(iv)獲得的DNA或氨基酸序列；(所述CDR3長度一般是 5-19個氨基酸)(并且所述CDR3進(jìn)一步一般在WGXG前)；(vi)進(jìn)一步選擇與其同源的人重鏈構(gòu)架4區(qū)域(FR4)(即，優(yōu)選與人源化的兔抗體 重鏈序列中包含的FR4相差至多2-4個氨基酸殘基)，并且使編碼所述所選擇的同源人FR4
上(通常人FR4DNA或多肽序列將編碼或包含WGQGTLVTVSS)；和(vii)合成編碼或包含步驟⑴到(vi)中得到的人源化的兔重鏈序列的DNA或氨 基酸序列；并且使用如上所述產(chǎn)生的所述合成的人源化重鏈和輕鏈DNA或氨基酸序列，以產(chǎn) 生包含至少一條人源化的兔輕鏈和/或至少--條人源化的兔重鏈的人源化抗體或片段或 編碼DNA序列。此外,本發(fā)明提供了新型和改良的人源化抗體重鏈和輕鏈、以及包含通過主題人 源化方法產(chǎn)生的所述人源化重鏈和輕鏈的抗體、及其在治療和診斷方法中的用途。特別地,本發(fā)明提供了人源化抗體輕鏈,其包含下述(i)跨越FR1的第一個殘基 到FR 3的末端的氨基酸殘基，包括選擇自人種系序列文庫的人輕鏈種系序列的CDR1和 CDR2區(qū)域，所述選自基于其跨越FR1到FR3的氨基酸殘基(相對于文庫中的其他人輕鏈種 系序列，相對于跨越FR1到FR3的兔可變輕鏈中的所述區(qū)域，優(yōu)選在氨基酸水平上具有最大 序列同一'性百分比的序列)在氨基酸水平上與待人源化的對所需抗原具有特異性的親本 兔抗體輕鏈的相對應(yīng)氨基酸殘基的更大同源性(序列同一性)；和(ii)進(jìn)一步其中對應(yīng)于 相同親本兔抗體的輕鏈中的“選擇性決定殘基”的在CDR1和CDR2中的CDR殘基用相對應(yīng) 兔選擇性決定殘基替換；(iii)包含相同親本兔抗體的整個CDR3區(qū)域的氨基酸殘基；(iv) 基于其與相同親本兔抗體的輕鏈中包含的相對應(yīng)FR4區(qū)域的更大同源性(序列同-一性)，包 含衍生自人種系序列文庫的抗體輕鏈的整個FR4區(qū)域的氨基酸殘基；和(v)進(jìn)一步其中將 所選擇的同源人FR區(qū)域中的人FR1、FR2, FR3和FR4區(qū)域的少數(shù)或無FR殘基用相對應(yīng)兔 FR殘基替代(即，在人源化的親本兔輕鏈抗體序列中的一個或多個相對應(yīng)位點處存在的殘 此外，本發(fā)明提供了人源化抗體重鏈多肽，其包含至少下述(i)跨越FR1的第一 個殘基到FR3的末端的氨基酸殘基，包括選擇自人種系序列文庫的人種系序列的CDR1和 CDR2區(qū)域，所述選擇基于其跨越FR1到FR3的所選擇的氨基酸殘基(相對于文庫中的其他 人種系序列)與待人源化的對所需抗原具有特異性的親本兔抗體重鏈的相對應(yīng)氨基酸殘 基的更大同源性(在氨基酸水平上的序列同一性百分比)；和(ii)進(jìn)一步其中對應(yīng)于相同 親本兔抗體的重鏈的CDR1和CDR2區(qū)域中的“選擇性決定殘基”的在人重鏈的CDR1和CDR2 區(qū)域中的CDR殘基用兔重鏈的CDR1和CDR2區(qū)域中包含的相對應(yīng)重鏈選擇性決定殘基替 換；(iii)包含相同親本兔抗體的整個CDR3區(qū)的氨基酸殘基；(iv)基于其與相同親本兔抗 體的重鏈中包含的相對應(yīng)FR4區(qū)域的更大同源性(序列同一性)，衍生自人種系序列文庫 的FR4區(qū)域；和(V)其中人重FR1區(qū)域的最后1-3個氨基酸任選用相對應(yīng)兔重鏈FR1殘基
14的末端1-3個氨基酸替換；和/或人重鏈構(gòu)架2區(qū)域的末端氨基酸任選用兔重鏈構(gòu)架2的 相對應(yīng)末端氨基酸殘基替換；和/或來自兔重鏈CDR2的末端的第4個氨基酸(一般是色氨 酸)任選用相對應(yīng)人CDR2殘基(一般是絲氨酸)替換；和(Vi)其中所選擇的同源人FR區(qū) 域的少數(shù)或無其余FR殘基用相對應(yīng)兔冊殘基替代(即，在人源化的兔抗體重鏈中的一個 或多個相對應(yīng)位點處存在的FR殘基)。此外，本發(fā)明提供了包含前述人源化重鏈和輕鏈多肽的新型和改良的人源化抗 體，和編碼所述人源化重鏈和輕鏈多肽的核酸序列，和包含所述人源化重鏈和輕鏈的人源 化抗體,和載體，以及包含所述載體和核酸序列的宿主細(xì)胞,及其在治療和診斷方法和組合 物中的用途。本發(fā)明進(jìn)一步考慮了使所述人源化重鏈或輕鏈DNA或多肽與包含或編碼所需抗 體恒定結(jié)構(gòu)域優(yōu)選人抗體恒定結(jié)構(gòu)域的DNA或多肽序列附著，和/或在抗體多肽或核酸序 列的羧酸或氨基末端處與所需效應(yīng)物部分的附著(直接或間接)，所述效應(yīng)物部分例如毒 素、藥物、放射性核素、熒光團(tuán)、酶、細(xì)胞因子、或易位序列例如信號肽、和促進(jìn)親和力分離的 多肽。發(fā)明簡要概述如討論的,本發(fā)明提供了用于獲得衍生自兔抗體的人源化可變輕鏈和可變重鏈的 新型和改良方法，和通過此種方法產(chǎn)生的人源化重鏈和/或輕鏈多肽和編碼DNA。本發(fā)明的 方法可重現(xiàn)地產(chǎn)生這樣的人源化抗體，其在人中應(yīng)基本____丨二無免疫原性，并且保留親本兔抗 體的抗原特異性和基本上或完全地結(jié)合親和力。本發(fā)明的操作一般而言依賴于特定氨基酸 殘基從供體兔抗體(特別是假定在抗原識別和結(jié)合中起作用的選擇性決定殘基和必要時 少數(shù)構(gòu)架殘基)轉(zhuǎn)移到同源的受體人抗體可變重鏈和輕鏈多肽序列上。更具體而言，本發(fā)明涉及用于人源化衍生自兔抗體的抗體可變輕鏈的新型人源化 策略，其將不連續(xù)數(shù)目的在本文中稱為“選擇性決定殘基”的兔輕鏈CDR殘基和任選地?zé)o或 極少數(shù)構(gòu)架殘基摻入到同源的人抗體輕鏈序列上。此外，更具體而言,本發(fā)明提供了用于人源化衍生自兔抗體的抗體可變重鏈的新 型策略，其將無或極少數(shù)不連續(xù)數(shù)目的兔CDR摻入同源的人重鏈序列....丨二。此外，更具體而言，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生包含人源化可變重鏈和/或輕鏈的人源 化抗體和人源化抗體片段的新型和改良的人源化策略，所述可變重鏈和/或輕鏈衍生自兔 抗體可變重鏈和輕鏈多肽以及合適的同源人抗體可變重鏈和輕鏈多肽,從而使得在人重鏈 和輕鏈CDR中包含的至少不同于兔重鏈和輕鏈CDR(選擇性決定殘基)中的相對應(yīng)選擇性 決定殘基的特定殘基保留在人源化重鏈和/或輕鏈區(qū)域中，并且其中人輕鏈中的極少數(shù)或 無構(gòu)架殘基和人重鏈中的極少數(shù)構(gòu)架殘基用相對應(yīng)兔構(gòu)架殘基替代。此外,更具體而言,本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生衍生自供體兔輕鏈抗體序列和受體人輕 鏈抗體序列的人源化輕鏈抗體序列的人源化策略，其包括F述步驟(i)從與所需抗原特異性結(jié)合的兔抗體獲得兔輕鏈抗體序列，并且鑒定跨越所包 括的構(gòu)架1 (FR1)開始到構(gòu)架3(FR3)結(jié)束的氨基殘基；(ii)使用跨越FR1開始到FR3結(jié)束序列的所述兔輕鏈抗體氨基酸序列進(jìn)行針對包 含人輕鏈抗體可變序列的文庫的同源性搜索，并且鑒定對其顯示基本序列同源性的人輕鏈 抗體序列，即相對于包含人輕鏈抗體序列文庫中的其他序列，優(yōu)選在氨基酸水平上與其具有至少80% -90%同--'性和/或優(yōu)選在氨基酸水平上具有最大的序列同--'性百分比；(iii)在兔和人輕鏈序列中鑒定對應(yīng)于FR1、FR2、FR3、CDR1、CDR2區(qū)域的方向及其 特定殘基，并且比對兔和所選擇的人抗體輕鏈中的這些不連續(xù)區(qū)域；(iv)構(gòu)建DNA或氨基酸序列,其中所選擇的同源人輕鏈序列的CDR1和CDR2區(qū)域 中至少不同于兔輕鏈CDR1和CDR2區(qū)域中的相對應(yīng)選擇性決定殘基的殘基用兔輕鏈序列的 CDR1和CDR2區(qū)域中包含的相對應(yīng)選擇性決定殘基替代；(v)將編碼或包含兔CDR3輕鏈抗體序列的相對應(yīng)氨基酸殘基的DNA序列或多肽進(jìn) 一步附著至通過步驟(iv)獲得的DNA或氨基酸序列；(vi)進(jìn)一步選擇與兔輕鏈中包含的FR4同源且優(yōu)選與其相差至多2-4個氨基酸殘 基的人輕鏈構(gòu)架4區(qū)域(FR4)，并且使編碼所述人FR4的DNA序列或所述人FR4的相對應(yīng)氨 基殘基附著至在步驟(V)后獲得的DM或氨基酸序列上；和(vii)合成編碼或包含步驟⑴到(vi)中得到的人源化的兔輕鏈序列的DNA或氨 基酸序列。此外，更具體而言，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生來自兔重鏈抗體序列的人源化重鏈抗 體序列的人源化策略，其包括下述步驟(i)從與所需抗原特異性結(jié)合的兔抗體獲得兔重鏈抗體序列，并且鑒定跨越所包 括的構(gòu)架1(FR1)開始到構(gòu)架結(jié)束的氨基殘基；(ii)使用跨越FR1幵始到FR3結(jié)束序列的所述兔重鏈抗體氨基酸序列進(jìn)行同源性 搜索(例如，通過包含人種系抗體序列的文庫的BLAST搜索)，并且鑒定與其同源的人重鏈 抗體序列，即相對于包含人重鏈抗體序列的文庫中的其他序列,優(yōu)選在氨基酸水平上與其 具有至少85% -90%同--'性和/或優(yōu)選在氨基酸水平上具有最大的序列同--'性百分比；(iii)在兔和人輕鏈序列中鑒定其對應(yīng)于？1 1、[^2、？1 、001 1、0 2區(qū)域的殘基， 并且針對所選擇的同源人抗體重鏈的相對應(yīng)區(qū)域比對兔的這些不連續(xù)區(qū)域；(iv)構(gòu)建DNA或氨基酸序列，其中所選擇的同源人重鏈序列的⑶R1和CDR2區(qū)域 中至少不同于兔重鏈序列的CDR1和CDR2區(qū)域中的相對應(yīng)選擇性決定殘基的氨基酸殘基由 兔重鏈序列的CDR1和CDR2區(qū)域中包含的相對應(yīng)選擇性決定殘基替代，并且任選用兔重鏈 FR1的相對應(yīng)末端1-3個氨基酸替換人重FR1區(qū)域的末端1-3個氨基酸；和/或任選用兔 重鏈構(gòu)架2的相對應(yīng)末端氨基酸殘基替換人重鏈構(gòu)架2區(qū)域的末端氨基酸，和/或任選用 相對應(yīng)人CDR2殘基(一般是絲氨酸)替換來自兔重鏈CDR2的末端的第4個氨基酸(一般 是色氨酸)；(v)將編碼或具有兔重鏈CDR3的相對應(yīng)氨基酸殘基的DNA序列進(jìn)一步附著至通過 步驟(iv)獲得的DNA或氨基酸序列,所述氨基酸殘基包含在相同的兔重鏈抗體序列中；并 且所述兔CDR3長度一般是5-19個氨基酸(這個CDR3 —般在殘基WGXG前)；(vi)進(jìn)一步選擇與其同源的人重鏈構(gòu)架4區(qū)域(FR4)(優(yōu)選與人源化的兔抗體重 鏈序列中包含的FR4相差至多1-4個氨基酸殘基)，并且使編碼所述所選擇的同源人FR4的 DKA序列或所述人FM的相對應(yīng)氨基殘基附著至在步驟(v)后獲得的DNA或氨基酸序列上 (通常這種人FR4 DNA或多肽序列將編碼或包含WGQGTLVTVSS)；和(vii)合成編碼或包含步驟⑴到(vi)中得到的人源化的兔重鏈序列的DNA或氨 基酸序列。
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此外，更具體而言,本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生人源化抗體或抗體片段的人源化策略, 所述人源化抗體或抗體片段包含衍生自兔輕鏈抗體序列的至少一種人源化輕鏈抗體序列 和/或衍生自兔抗體重鏈的至少一種人源化重鏈序列，其中此種人源化輕和重鏈序列根據(jù) 下述步驟衍生自兔重鏈和輕鏈(i)從對所需抗原特異的兔抗體獲得兔輕鏈抗體序列，并且鑒定跨越所包括的構(gòu) 架1(FR1)幵始到構(gòu)架3(FR3)結(jié)束的氨基殘基；(i i)使用跨越FR1開始到FR3結(jié)束序列的所述兔輕鏈抗體氨基酸序列進(jìn)行針對包 含人輕鏈抗體序列的文庫的同源性搜索,并且鑒定與其同源的人輕鏈抗體序列，即相對于 包含人輕鏈抗體序列的文庫中的其他序列,優(yōu)選在氨基酸水平上與其至少80% -90%等同 和/或優(yōu)選在氨基酸水平上具有最大的序列同一性百分比；(iii)在兔和人輕鏈序列中鑒定對應(yīng)于FRl、TO2、ra3、CDRl、CDR2區(qū)域的方向及其 特定殘基,并且比對兔輕鏈的這些不連續(xù)區(qū)域與所選擇的同源人輕鏈區(qū)域的相對應(yīng)區(qū)域；(iv)構(gòu)建DNA或氨基酸序列,其中所選擇的同源人輕鏈序列的CDR1和CDR2區(qū)域 中包含的至少不同于兔CDR1和CDR2區(qū)域中包含的相對應(yīng)選擇性決定殘基的殘基用兔輕鏈 序列的相對應(yīng)CDR1和CDR2區(qū)域替代；(v)將編碼或具有兔輕鏈抗體序列中包含的CDR3的相對應(yīng)氨基酸殘基的DNA序 列(這個CDR3 --般包含9-15個氨基酸并且通常在FGGG殘基前)進(jìn)一步附著至通過步驟 (iv)獲得的DNA或氨基酸序列；(vi)進(jìn)一步選擇與所述兔抗體輕鏈中包含的FR4同源且人FR4優(yōu)選與兔抗體輕鏈 序列的FR4相差至多2-4個氨基酸殘基的人輕鏈構(gòu)架4區(qū)域(FR4)，并且使編碼所述人FR4 的DNA序列或所述人FR4的相對應(yīng)氨基酸殘基附著至在步驟(v)后獲得的DNA或氨基酸序 列上；和(vii)合成編碼或包含步驟⑴到(vi)中得到的人源化的兔輕鏈序列的DNA或氨 基酸序列；和/或從兔重鏈抗體序列進(jìn)一步產(chǎn)生人源化重鏈抗體序列,其包括下述步驟(i)從對所需抗原特異的兔抗體獲得兔重鏈抗體序列，并且鑒定跨越所包括的構(gòu) 架1 (FR1)開始到構(gòu)架3 (FR3)結(jié)束的氨基殘基；(ii)使用跨越FR1開始到FR3結(jié)束序列的所述兔重鏈抗體氨基酸序列進(jìn)行同源 性搜索,例如,通過包含人種系抗體序列的文庫的BLAST搜索,并且鑒定如下人重鏈抗體序 列，相對于包含人重鏈抗體序列的文庫中的其他序列，所述人重鏈抗體序列在氨基酸水平 上與其至少80% -90%等同和/或優(yōu)選在氨基酸水平上最大的序列同一性百分比；(i i i)在兔和人重鏈序列中鑒定其對應(yīng)于FR1、FR2、FR3、CDR1、CDR2區(qū)域的殘基， 并且針對所選擇的同源人重鏈比對兔抗體的這些不連續(xù)區(qū)域；(iv)構(gòu)建DNA或氨基酸序列，其中所選擇的同源人重鏈序列的CDR1和CDR2區(qū)域 中包含的至少不同于兔重鏈CDR1和CDR2區(qū)域中包含的相對應(yīng)選擇性決定殘基的殘基用兔 重鏈序列的相對應(yīng)CDR1和CDR2區(qū)域替代，和/或任選用兔重鏈FR1的末端1-3個氨基酸 替換人重FR1區(qū)域的最后1-3個氨基酸；和/或任選用兔重鏈構(gòu)架2的末端氨基酸殘基替 換人重鏈構(gòu)架2區(qū)域的末端氨基酸；和/或進(jìn)一步任選用相對應(yīng)人CDR2殘基(一般是絲氨 酸)替換來自兔重鏈CDR2的末端的第4個氨基酸(一般是色氨酸)；
(v)將編碼或相同兔重鏈抗體序列中包含的兔重鏈CDR3的相對應(yīng)氨基酸殘基的 DNA序列(所述CDR3長度一般是5-19個氨基酸并且一般在WGXG前)進(jìn)一步附著至通過步 驟(iv)獲得的DNA或氨基酸序列；；(vi)進(jìn)一步選擇與其同源的人重鏈構(gòu)架4區(qū)域(FR4)(即，優(yōu)選與人源化的兔抗體 重鏈序列中包含的FR4相差至多2-4個氨基酸殘基),并且使編碼所述所選擇的同源人FR4 的DNA序列或所述人FR4的相對應(yīng)氨基殘基附著至在步驟(v)后獲得的DNA或氨基酸序列 上(通常人FR4DNA或多肽序列將編碼或包含WGQGTLVTVSS)；和(vii)合成編碼或包含步驟⑴到(vi)中得到的人源化的兔重鏈序列的DNA或氨 基酸序列；和產(chǎn)生包含所述人源化輕鏈和重鏈中至少一條的核酸序列或多肽；和合成編碼人源化抗體或抗體片段的DNA或包含人源化抗體或抗體片段的多肽，所 述人源化抗體或抗體片段包含編碼根據(jù)前述步驟產(chǎn)生的至少人源化輕鏈序列和/或至少 一條人源化重鏈的DNA,或包含根據(jù)前述步驟產(chǎn)生的至少人源化輕鏈序列和/或至少一條 人源化重鏈的多肽。本發(fā)明進(jìn)一步考慮了使所述人源化抗體DNA或多肽與所需恒定結(jié)構(gòu)域優(yōu)選人恒 定結(jié)構(gòu)域附著，和/或在羧酸或氨基末端處與所需效應(yīng)物部分的附著(直接或間接)，所述 效應(yīng)物部分例如毒素、藥物、放射性核素、熒光團(tuán)、酶、細(xì)胞因子、易位序列例如信號肽、和促 進(jìn)親和力分離的多肽。在更具體的實施方案中，本發(fā)明涉及對于TNF-a或IL_6具有結(jié)合特異性的特定 人源化抗體及其片段，特別是具有特定表位特異性和/或功能性質(zhì)的人源化抗體。本發(fā)明的一個實施方案包含能夠與IL-6或TNF- a和/或TNF- a /TNFR或IL-6/ IL-6R復(fù)合物結(jié)合的特異性人源化抗體及其片段。本發(fā)明的另一個實施方案涉及具有小于50皮摩爾的結(jié)合親和力(Kds)和/或小 于或等于10 4 S 1的Km值的人源化抗體。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，這些人源化抗體和人源化抗體片段和變體將衍生自 兔免疫細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞)或較不優(yōu)選地分泌對所需抗原特異的兔抗體的雜交瘤。此外，用 于人源化的兔抗體可以基于其與人種系抗體序列的同源性(序列同一性)進(jìn)一步選擇。這 些抗體可以進(jìn)一步促進(jìn)在人源化后功能性質(zhì)的保留，因為當(dāng)使用主題人源化方法時,較少 的氨基酸被修飾。本發(fā)明的--個進(jìn)一步實施方案涉及根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的例如對IL-6或TNF- a特異 的人源化抗體片段，包含根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的人源化VH、VL和CDR多肽，例如衍生自通過兔免 疫細(xì)胞分泌的抗體和編碼其的多核苷酸，以及這些抗體片段和編碼其的多核苷酸在制備能 夠識別所需抗原例如丨丄-6、TNF a和/或TNF- a /TNFR或IL-6/IL-6R復(fù)合物的新型抗體 和多肽組合物中的用途。本發(fā)明還考慮了與一種或多種功能或可檢測部分綴合的主題人源化的兔抗體和 片段，例如人源化抗TNF- a或抗IL-6抗體及其結(jié)合片段的綴合物。本發(fā)明還考慮了制備所 述人源化抗TNF- a、IL-6或抗TNF- a /TNFR或抗IL-6/IL-6R復(fù)合物抗體及其結(jié)合片段的 方法。在一個實施方案中，結(jié)合片段包括但不限于人源化Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv和scFv 本發(fā)明的實施方案進(jìn)一步涉及對所需抗原特異的主題人源化抗體，例如人源化抗TNF-a或抗IL-6抗體用于診斷、評估和治療與特定抗原例如TNF_ a、IL-6或其異常表達(dá) 相關(guān)的疾病和病癥的用途。本發(fā)明還考慮了根據(jù)本發(fā)明的人源化抗體片段，例如人源化抗 TNF-a或抗IL-6抗體用于診斷、評估和治療與特定抗原例如IL-6、TNF-a或其異常表達(dá)本發(fā)明的其他實施方案涉及在重組宿主細(xì)胞、優(yōu)選二倍體酵母例如二倍體畢赤酵 母屬(Pichia)和其他酵母菌株中，衍生自兔抗體序列的根據(jù)新型和改良的人源化方案產(chǎn) 生的人源化抗體和人源化抗體片段的產(chǎn)生。附圖簡述

圖1包含示意性描述本發(fā)明兔抗體人源化方案的流程圖。圖2包含特定示例性可變輕鏈和可變重鏈多肽序列的比對，即，在人種系序列文 庫中鑒定的抗原特異性兔抗體可變輕鏈多肽和可變重鏈多肽序列和同源人序列，以及使用 本發(fā)明人源化方案產(chǎn)生的最終人源化序列。構(gòu)架區(qū)在其中標(biāo)識為FR1-FR4。互補決定區(qū) (CDR)標(biāo)識為CDR1-CDR3。氨基酸殘基如該圖中所示進(jìn)行編號且符合Kabat編號方案。最 初兔序列在該圖和下文中對于兔可變輕鏈和可變重鏈多肽序列分別稱為RbtVL和RbtVh。 在人種系序列文庫中鑒定的跨越FR1開始到FR 3結(jié)束的最相似人種系抗體序列中的3個 在兔序列下進(jìn)行比對。認(rèn)為與兔序列最相似的人序列緊挨在兔序列下。在本發(fā)明人源化策 略的這個例證中，最相似的人種系序列對于輕鏈?zhǔn)荓12A,并且對于重鏈?zhǔn)?-64-04。人CDR3 序列未顯示。最緊密的人構(gòu)架4序列在兔構(gòu)架4序列F進(jìn)行比對。垂直短劃線指出其中兔 殘基與在相同位置處的一個或多個人殘基等同。粗體殘基指出在該位置處的人殘基與在相 同位置處的兔殘基等同。最終的人源化序列對于可變輕序列和可變重序列分別稱為VLh和 VHh。在該圖中，下劃線的殘基指出該殘基與在該位置處的兔殘基相同,但不同于在3個比 對的人序列中該位置處的人殘基。圖3相似地包含衍生自IL-6特異性抗體的相同親本兔可變重鏈和輕鏈序列、同 源人種系序列、以及使用主題人源化策略由其產(chǎn)生的2個人源化可變重鏈和輕鏈序列的比 對。特別地，該圖包含原始兔輕鏈和重鏈序列、3個同源人種系序列和2個人源化重鏈序 列和2個人源化輕鏈序列，在其中稱為“aggres”和“consrv”。從比對中可以看出人源化 “aggres"和“consrv ”序列在特定兔構(gòu)架殘基的存在或不存在下彼此不同。圖4將衍生自對hIL 6和TNF-a特異的兔抗體的嵌合抗體與人源化抗體的解離 常數(shù)進(jìn)行比較,其使用本發(fā)明的人源化操作產(chǎn)生。圖5包含比較通過不同人源化抗體的IL-6依賴性T1165細(xì)胞增殖的拮抗的實驗， 所述人源化抗體使用本發(fā)明的人源化操作產(chǎn)生、衍生自特異性兔抗IL4抗體。圖6包含比較通過不同人源化抗體的hIL-6依賴性T1165細(xì)胞增殖的拮抗的實 驗,所述人源化抗體使用本發(fā)明的人源化操作產(chǎn)生、衍生自特異性兔抗hIL-6抗體。圖7包含比較通過嵌合抗TNF- a抗體與針對人源化抗體的抗體的hTNF- a依賴 性細(xì)胞毒性的拮抗的實驗，所述嵌合抗TNF-a抗體衍生自兔抗hTNF-a抗體，所述所述人 源化抗體根據(jù)本發(fā)明的人源化操作由其產(chǎn)生。優(yōu)選實施方案詳述定義為這些可以改變。還應(yīng)當(dāng)理解本文使用的術(shù)語僅用于描述特定實施方案，并且不意欲限制 僅受所附權(quán)利要求限制的本發(fā)明的范圍。如本文所使用的，除非上下文另有明確說明，單數(shù)形式“一”、“一個”和“一種”包 括復(fù)數(shù)指示物。因此’例如，提及“細(xì)胞”包括多個此種細(xì)胞,并且提及“蛋白質(zhì)”包括提及 --種或多種蛋白質(zhì)和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等價物，等等。除非另有明確說明，本文使用 的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。如本文所使用的，術(shù)語“受體”和“受體抗體”或“原始”或“親本”抗體指提供或編 碼用于根據(jù)本發(fā)明從兔抗體可變序列產(chǎn)生人源化抗體序列的序列的人抗體或核酸序列。一 般地,受體抗體將提供--個或多個構(gòu)架區(qū)的至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至 少96、97、98、99或100%氨基酸序列。在某些實施方案中，術(shù)語“受體”指提供或編碼一個或 多個恒定區(qū)的抗體或核酸序列。在另外一個實施方案中，術(shù)語“受體”指提供或編碼一個或 多個構(gòu)架區(qū)和恒定區(qū)的抗體或核酸序列。在一個具體實施方案中，術(shù)語“受體”指這樣的人 抗體或核酸序列，其提供或編碼一個或多個構(gòu)架區(qū)的至少80%、優(yōu)選至少85%、至少90%、 至少95%、至少96、97、98、99或100%氨基酸序列。依照這個實施方案，受體可以包含在人 抗體的一個或多個特定位置處不存在的至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個 或至少10個氨基酸殘基。受體構(gòu)架區(qū)和/或一個或多個受體恒定區(qū)可以例如衍生自或得 自種系抗體基因、成熟抗體基因、功能抗體(例如,本領(lǐng)域眾所周知的抗體、開發(fā)中的抗體、 或商購可得的抗體)。如本文所使用的，術(shù)語“抗體”指單克隆抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體、 駱駝化(caraelised)抗體、嵌合抗體、單鏈Fvs (scFv)、單鏈抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體、Fab片段、 Fab'片段、F(ab ' )2片段、二硫鍵連接的Fvs (sdFv)、抗獨特型(抗Id)抗體和任何上述的 表位結(jié)合片段。特別地，抗體包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即包 含抗原結(jié)合位點的分子。免疫球蛋白分子可以是任何類型(例如，IgG、IgE、IgM, IgD、IgA 和IgY),種類(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或亞類。如所述的,本發(fā)明一般 而言涉及通過使對所需抗原特異的兔供體抗體的特定殘基和同源人(受體)抗體序列相組 合產(chǎn)生的人源化抗體和人源化抗體片段。一般的抗體包含與2條輕鏈配對的2條重鏈。全長重鏈大小約50kD (長度約446 個氨基酸)，并且由重鏈可變區(qū)基因(約116個氨基酸)和恒定區(qū)基因編碼。在本發(fā)明中， 基本上將編碼人源化可變輕鏈序列和人源化可變重鏈序列的2個核酸或遺傳組分融合在 一起，以產(chǎn)生編碼人源化可變鏈的構(gòu)建體，所述序列包含所需抗原特異性和功能性質(zhì)的兔 抗體的特定CDR殘基并且可以簡稱為外顯子，當(dāng)這個構(gòu)建體在合適的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)時， 所述構(gòu)建體導(dǎo)致人源化可變區(qū)的表達(dá)。如果恒定區(qū)存在,那么主題人源化抗體將包含人恒定區(qū)。存在編碼不同同種型例 如a、Y (IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)、S、e和u序列的重鏈恒定區(qū)的不同恒定區(qū)基因。全 長輕鏈大小約25Kd (長度約214個氨基酸)，并且由輕鏈可變區(qū)基因(約110個氨基酸)和 k或、恒定區(qū)基因編碼。輕鏈和/或重鏈的可變區(qū)負(fù)責(zé)與抗原結(jié)合，并且恒定區(qū)負(fù)責(zé)抗體 -一般的效應(yīng)子功能。如本文所使用的，術(shù)語“類似物”在蛋白質(zhì)性質(zhì)試劑(例如，蛋白質(zhì)、多肽和肽，例 如抗體)的上下文中指這樣的蛋白質(zhì)性質(zhì)試劑，其具有與第二種蛋白質(zhì)性質(zhì)試劑相似或相同功能，但不一定包含第二種蛋白質(zhì)性質(zhì)試劑的相似或相同氨基酸序列，或具有第二種蛋 白質(zhì)性質(zhì)試劑的相似或相同結(jié)構(gòu)。具有相似氨基酸序列的蛋白質(zhì)性質(zhì)試劑指滿足F述至少 一種的第二種蛋白質(zhì)性質(zhì)試劑(a)具有與第二種蛋白質(zhì)性質(zhì)的氨基酸序列至少30%、至 少35 %、至少40 %、至少45 %、至少50 %、至少55 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少 75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少96、97、98、99或100%相同的氨基 酸序列的蛋白質(zhì)性質(zhì)試劑；(b)由如下核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)性質(zhì)試劑，所述核苷酸序 列在嚴(yán)格條件下與編碼第二種蛋白質(zhì)性質(zhì)試劑的核苷酸序列雜交，所述第二種蛋白質(zhì)性質(zhì) 試劑具有至少5個鄰接氨基酸殘基、至少10個鄰接氨基酸殘基、至少15個鄰接氨基酸殘 基、至少20個鄰接氨基酸殘基、至少25個鄰接氨基酸殘基、至少40個鄰接氨基酸殘基、至 少50個鄰接氨基酸殘基、至少60個鄰接氨基酸殘基、至少70個鄰接氨基酸殘基、至少80個 鄰接氨基酸殘基、至少90個鄰接氨基酸殘基、至少100個鄰接氨基酸殘基、至少125個鄰接 氨基酸殘基或至少150個鄰接氨基酸殘基；和(c)由如下核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)性質(zhì)試 劑，所述核苷酸序列與編碼第二種蛋白質(zhì)性質(zhì)試劑的核苷酸序列至少30%、至少35%、至 少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少 80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少96、97、98、99或100%相同。具有與第二種蛋 白質(zhì)性質(zhì)試劑相似的結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)性質(zhì)試劑指具有與第二種蛋白質(zhì)性質(zhì)試劑相似的二級、 三級或四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)性質(zhì)試劑。蛋白質(zhì)性質(zhì)試劑的結(jié)構(gòu)可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知 的方法進(jìn)行測定，包括但不限于，肽測序、X射線晶體學(xué)、核磁共振、圓二色性和結(jié)晶學(xué)電子 顯微鏡檢查。為了測定2個氨基酸序列或2個核酸序列的同一性百分比,序列就最佳比較目的 進(jìn)行比對(例如,可以將缺口引入第一個氨基酸或核酸序列的序列中用于與第二個氨基酸 或核酸序列的最佳比對)。隨后比較在相對應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置處的氨基酸殘基或 核苷酸。當(dāng)?shù)谝粋€序列中的位置由與第二個序列中的相對應(yīng)位置相同的氨基酸殘基或核苷 酸占據(jù)時，那么分子在那個位置處是相同的。2個序列之間的同一性百分比是由序列共享的 相同位置數(shù)目的函數(shù)(即，同-一性％ =相同重疊位置數(shù)目！位置總數(shù)目乘以100% )。在一 個實施方案中，2個序列是相同長度的。如所述的，本發(fā)明在其人源化策略中選擇與兔輕鏈 或重鏈可變區(qū)的相對應(yīng)可變區(qū)具有高序列同一性或同源性的人可變區(qū)，所述兔輕鏈或重鏈 可變區(qū)用于衍生相對應(yīng)“人源化”變體。一般地,所選擇的人可變區(qū)在包含⑶R1和CDR2區(qū) 域的可變區(qū)的特定部分上將與相對應(yīng)兔可變序列具有至少80%或更大的序列同--'性。理想 地，如通過合適方法例如BLAST搜索測定的，與包含人抗體可變區(qū)編碼序列的人種系序列 群體或文庫的所有其他成員比較，所選擇的人可變區(qū)與兔可變區(qū)將具有最大的同源性或序 列同一性。此外，主題人源化策略中使用的優(yōu)選或前導(dǎo)候選兔抗體可以基于其與人種系序 列的高同源性或序列同一性選自兔抗體群體(可比較親和力和/或功能特征)。這可能是 因為本發(fā)明在優(yōu)選實施方案中使用B細(xì)胞免疫接種方案產(chǎn)生其親本抗體，已發(fā)現(xiàn)所述B細(xì) 胞免疫接種方案產(chǎn)生對識別在抗原靶例如IL-6上的不同表位的靶特異的許多(例如，10種 或更多)高親和力抗體。在某些情況下,這個同一性可以基本上使得人源化抗體和親本抗 體可以在人受試者中具有相似的免疫原性性質(zhì)，已知與一般用于人源化的其他動物例如嚙 齒類動物和豚鼠比較，人和兔抗體之間的高序列同一性。2個序列之間的同一性百分比的測定也可以使用數(shù)學(xué)算法來完成。用于2個序列比較的數(shù)學(xué)算法的優(yōu)選、非限制性例子是Karl in和Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87 2264-2268,如在 Karl in 和 Altschul, 1993，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 5873-5877中修飾的算法。將此種算法并入Altschul等人，1990’ J. Mol. Biol. 215 403的 NBLAST和XBLAST程序內(nèi)。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST核苷酸程序參數(shù)組來執(zhí)行，例 如對于得分=100,字長=12獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質(zhì) 搜索可以用XBLAST程序參數(shù)組來執(zhí)行，例如對于得分-50，字長=3獲得與本發(fā)明的蛋白質(zhì) 分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的缺口比對 ，可以利用如Altschul等人， 1997，Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402 中所述的 Gapped BLAST。備選地，PSI-BLAST 可 以用于執(zhí)行檢測分子之間的距離關(guān)系的迭代搜索(同上)。當(dāng)利用BLAST.GappedBLAST和 PSI-Blast程序時，可以使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST的)缺省參數(shù)(參見，例如 NCBI網(wǎng)站)。用于序列比較的數(shù)學(xué)算法的另一個優(yōu)選、非限制性例子是Myers和Miller， 1988, CABI0S 4 :11-17的算法。將此種算法并入其為GCG序列比對軟件包的部分的ALIGN 程序(版本2.0)中。當(dāng)利用ALIGN程序用于比較氨基酸序列時,可以使用PAM120權(quán)重殘 基表、缺口長度罰分12和缺口罰分4。2個序列之間的同一性百分比可以使用類似于上文描述的技術(shù)進(jìn)行測定，允許或 不允許缺口。在計算同一性百分比中，一般僅計數(shù)確切匹配。如本文所使用的,術(shù)語“CDR”指在抗體可變序列內(nèi)的互補決定區(qū)。在重鏈和輕鏈 的每個可變區(qū)中存在3個CDR,對于每個可變區(qū)指定為CDR1、CDR2和CDR3。這些CDR的 確切邊界已根據(jù)不同系統(tǒng)進(jìn)行不同限定。由Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immuno1ogicalInterest(National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987)禾D (1991))描述的系統(tǒng)不僅提供可應(yīng)用于抗體的任何可變區(qū)的明確殘基編號系統(tǒng),還提供限 定3個CDR的精確殘基邊界。這些CDR可以稱為Kabat CDR。Chothia和同事(Chothia和 Leska,J. Mol Biol. 196 :901-917 (1987)和 Cho thia 等人，Nature 342:877-883(1989))發(fā) 現(xiàn)在Kabat CDR內(nèi)的特定亞部分采用接近相同的肽主鏈構(gòu)象,盡管在氨基酸序列水平上具 有很高的多樣性。這些亞部分指定為L1、L2和L3或H1、H2和H3,其中“L”和“H”分別指輕 鏈和重鏈區(qū)域。這些區(qū)域可以稱為Chothia CDR，其具有與Kabat CDR重疊的邊界。限定與 Kabat CDR重疊的 CDR 的其他邊界已由 Padlan(FASEB J. 9 :133-139 (1995))和MacCallum(J Mol Biol 262(5) :732-45 (1996))描述。另外的CDR邊界定義可能不嚴(yán)格遵循上述系統(tǒng)之 --，但仍將與Kabat CDR重疊,盡管根據(jù)特定殘基或殘基組或甚至整個CDR不顯著影響抗原 結(jié)合的預(yù)測或?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)，它們可能縮短或延長。本文使用的方法可以利用根據(jù)任何這些系 統(tǒng)限定的CDR，盡管優(yōu)選實施方案使用Kabat或Chothia限定的CDR。如下所述，這些CDR 包含稱為“選擇性決定殘基”被認(rèn)為在抗原結(jié)合或識別中重要的不連續(xù)殘基。在本發(fā)明中的表達(dá)“選擇性決定殘基”指兔可變重鏈和輕鏈多肽中包含的特定氨 基酸殘基，其被認(rèn)為明顯涉及抗原識別和/或抗原結(jié)合。在本發(fā)明的人源化策略中，兔CDR 區(qū)域中的這些選擇性決定殘基以經(jīng)驗為主如下進(jìn)行鑒定通過比較所有兔CDR殘基與所選 擇的同源人可變區(qū)中的相對應(yīng)殘基，并且基于這個比較鑒定假定的“選擇性決定殘基”。如 果根據(jù)Kabat編號方案特定CDR殘基基本上不同于相對應(yīng)人CDR殘基,那么它基本上被視 為選擇性決定殘基。“基本上”在本文中指兔和人種系CDR氨基酸殘基之間的顯著化學(xué)或結(jié) 構(gòu)差異，例如電荷、荷電對未荷電、大側(cè)鏈的存在或不存在中的差異等。例如,如果兔CDR氨基酸殘基包含大側(cè)鏈，并且相對應(yīng)人CDR氨基酸殘基不包含,那么兔CDR殘基將視為選擇性 決定殘基，并且將保留在人源化可變區(qū)中。此外，如果兔可變區(qū)中的CDR氨基酸殘基是堿性 氨基酸，并且人CDR中的相對應(yīng)氨基酸殘基是酸性氨基酸殘基,那么兔CDR中的這個殘基將 被確定為選擇性決定殘基，并且將保留在人源化可變區(qū)中。相比之下,如果兔CDR中的CDR 殘基和人CDR中的相對應(yīng)殘基都是酸性或都包含相似的大側(cè)鏈,那么殘基將被確定為不是 選擇性決定殘基，并且人CDR殘基在人源化可變區(qū)中將不被修飾。使兔CDR區(qū)中的特定殘 基分類為在本人源化策略中使用的“選擇性決定”或“非選擇性決定”以便選擇應(yīng)保留在人 源化可變區(qū)中的特定兔CDR殘基的這個方法，類似于在用于測定氨基酸置換修飾可以視為 保守還是非保守的蛋白質(zhì)誘變中使用的標(biāo)準(zhǔn)。然而,應(yīng)當(dāng)理解盡管基于這些殘基中的每個 在抗原識別和/或結(jié)合中起作用的推測，本發(fā)明在人源化可變區(qū)多肽中一般保留所有此種 選擇性決定殘基，但在某些情況下，可以在不同人源化可變鏈變體合成后確定，特別假定的 選擇性決定殘基的保留就包含人源化可變區(qū)的抗體的抗原結(jié)合而言是非必需的。例如，如 果親本兔抗體對于靶抗原具有極高的抗原親和力，那么所有假定的選擇性決定殘基的保留 可能對于衍生具有所需抗原結(jié)合識別和親和力的人源化抗體不是必需的。這可以通過合成 不同人源化可變區(qū)多肽以經(jīng)驗為主進(jìn)行確定。此外，特定CDR殘基作為選擇性決定或非選 擇性決定的鑒定可以依賴于所選擇的同源人可變區(qū)的一個或多個特定序列而變。表達(dá)“可變區(qū)”或“VR”指在抗體中的每對輕鏈和重鏈內(nèi)直接涉及抗體與抗原結(jié)合 的結(jié)構(gòu)域。每條重鏈在一個末端處具有可變結(jié)構(gòu)域(VH)，隨后為多個恒定結(jié)構(gòu)域。每條輕 鏈在一個末端處具有可變結(jié)構(gòu)域(VJ且在其另一個末端處具有恒定結(jié)構(gòu)域；將輕鏈的恒定 結(jié)構(gòu)域與重鏈的第一個恒定結(jié)構(gòu)域進(jìn)行比對，并且將輕鏈可變結(jié)構(gòu)域與重鏈的可變結(jié)構(gòu)域 進(jìn)行比對。表達(dá)“構(gòu)架區(qū)”或“FR”指在抗體的輕鏈和重鏈的可變區(qū)內(nèi)的一個或多個構(gòu)架區(qū) (參見 Kabat, E. A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md. , (1.987))。構(gòu)架區(qū)或FR包括插入抗體的輕鏈和重 鏈的可變區(qū)內(nèi)包含的CDR之間的氨基酸序列區(qū)。如本文所使用的，表達(dá)“典型(canonical)”殘基指在限定如由Chothia等人 (J. Mol Biol. 196 :901-907 (1987) ；Chothia 等人，J. Mol. Biol. 227 799 (1992)，兩者都通 過引用合并入本文)限定的特定典型CDR結(jié)構(gòu)的CDR或構(gòu)架中的殘基。根據(jù)Chothia等人， 許多抗體的CDR的關(guān)鍵位置具有幾乎相同的肽主鏈構(gòu)象,盡管在氨基酸序列水平上極大的 多樣性。每個典型結(jié)構(gòu)主要描述了關(guān)于構(gòu)成環(huán)的氨基酸殘基的鄰接區(qū)段的一組肽主鏈扭 如本文所使用的,在蛋白質(zhì)性質(zhì)試劑(例如，蛋白質(zhì)、多肽和肽，例如抗體)上下 文中的表達(dá)“衍生物”指包含氨基酸序列的蛋白質(zhì)性質(zhì)試劑,所述氨基酸序列已通過引入氨 基酸殘基置換、缺失和/或添加而被改變。如本文所使用的，表達(dá)“衍生物”也指已被修飾 的蛋白質(zhì)性質(zhì)試劑，即,通過任何類型分子與蛋白質(zhì)性質(zhì)試劑的共價附著。例如,但不限于， 抗體可以例如通過去糖基化、糖基化、乙?；?、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通過已知保護(hù)/ 阻斷基團(tuán)的衍生化、蛋白質(zhì)酶解切割、與細(xì)胞配體或其他蛋白質(zhì)連接等衍生化進(jìn)行修飾。優(yōu) 選地，抗體是去糖基化的。蛋白質(zhì)性質(zhì)試劑的衍生物可以通過化學(xué)修飾來產(chǎn)生，氣質(zhì)使用本 領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)，包括但不限于特定化學(xué)切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代謝合成等。此外,蛋白質(zhì)性質(zhì)試劑的衍生物可以包含一個或多個非典型氨基酸。蛋白質(zhì)性質(zhì)試 劑的衍生物具有與它由其衍生的蛋白質(zhì)性質(zhì)試劑相似或相同的功能。如本文所使用的，表達(dá)“病癥”或“疾病”對于受試者中的病狀可互換使用。如本文所使用的,表達(dá)“供體”或“供體抗體”指提供一個或多個CDR的抗體。在 --個優(yōu)選實施方案中，供體抗體是來自不同于構(gòu)架區(qū)由獲得或衍生來源的抗體的物種的抗 體。在人源化抗體的上下文中，術(shù)語“供體抗體”指 提供一個或多個CDR的非人(兔)抗體。如本文所使用的，表達(dá)“有效量”指如下治療量，其足以減少或改善病癥或其一種 或多種癥狀的嚴(yán)重度和/或持續(xù)時間，阻止病癥的進(jìn)展，引起病癥消退，阻止與病癥相關(guān)的 一種或多種癥狀復(fù)發(fā)、發(fā)展、發(fā)作或進(jìn)展,檢測病癥，或者增強(qiáng)或改善另-一種治療 例如,預(yù) 防或治療劑)的一種或多種預(yù)防或治療效應(yīng)。 如本文所使用的，表達(dá)“表位”指在動物中,優(yōu)選在哺乳動物中，且最優(yōu)選在人中具 有抗原或免疫原性活性的多肽或蛋白質(zhì)的片段。具有免疫原性活性的表位是在動物中引發(fā) 抗體應(yīng)答的多肽或蛋白質(zhì)的片段。具有抗原活性的表位是如通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知 的任何方法，例如通過免疫測定法測定的，抗體與之免疫特異性結(jié)合的多肽或蛋白質(zhì)的片 段?？乖砦徊灰欢ㄊ敲庖咴缘摹Ｈ缢龅?，本發(fā)明優(yōu)選產(chǎn)生針對特定靶抗原的兔抗體， 其中使用已發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生對抗原靶上的一系列不同表位具有高親和力的抗體的克隆B細(xì)胞免 疫接種方法。如本文所使用的，表達(dá)“融合蛋白”指如下多肽或蛋白質(zhì)(包括但不限于抗體)，其 包含第一種蛋白質(zhì)或多肽或其功能片段、類似物或衍生物的氨基酸序列,和異種蛋白質(zhì)、多 肽或肽(即，不同于第一種蛋白質(zhì)或其片段、類似物或衍生物的第二種蛋白質(zhì)或多肽或其 片段、類似物或衍生物)的氨基酸序列。在一個實施方案中，融合蛋白包含與異種蛋白質(zhì)、 多肽或肽融合的預(yù)防或治療劑。依照這個實施方案，異種蛋白質(zhì)、多肽或肽可以是或不是不 同類型的預(yù)防或治療劑。例如,具有免疫調(diào)節(jié)活性的2種不同蛋白質(zhì)、多肽或肽可以融合在 一起，以形成融合蛋白。在一個優(yōu)選實施方案中，相對于在與異種蛋白質(zhì)、多肽或肽融合前 的原始蛋白質(zhì)、多肽或肽的活性,融合蛋白保留或具有改善的活性。如本文所使用的，表達(dá)“片段”指包含如F氨基酸序列的肽或多肽(包括但不限于 抗體)，所述氨基酸序列具有另一種多肽或蛋白質(zhì)的至少5個鄰接的氨基酸殘基、至少10 個鄰接的氨基酸殘基、至少15個鄰接的氨基酸殘基、至少20個鄰接的氨基酸殘基、至少25 個鄰接的氨基酸殘基、至少40個鄰接的氨基酸殘基、至少50個鄰接的氨基酸殘基、至少60 個鄰接的氨基酸殘基、至少70個鄰接的氨基酸殘基、至少鄰接的80個氨基酸殘基、至少鄰 接的90個氨基酸殘基、至少鄰接的100個氨基酸殘基、至少鄰接的125個氨基酸殘基、至少 150個鄰接的氨基酸殘基、至少鄰接的175個氨基酸殘基、至少鄰接的200個氨基酸殘基或 至少鄰接的250個氨基酸殘基。在--個具體實施方案中，蛋白質(zhì)或多肽片段保留蛋白質(zhì)或 多肽的至少一種功能。如本文所使用的，表達(dá)“功能片段”指包含如下氨基酸序列的肽或多肽(包括但不 限于抗體)，所述氨基酸序列具有第二種、不同多肽或蛋白質(zhì)的氨基酸序列的至少5個鄰接 的氨基酸殘基、至少10個鄰接的氨基酸殘基、至少15個鄰接的氨基酸殘基、至少20個鄰接 的氨基酸殘基、至少25個鄰接的氨基酸殘基、至少40個鄰接的氨基酸殘基、至少50個鄰接 的氨基酸殘基、至少60個鄰接的氨基酸殘基、至少70個鄰接的氨基酸殘基、至少鄰接的80個氨基酸殘基、至少鄰接的90個氨基酸殘基、至少鄰接的100個氨基酸殘基、至少鄰接的 125個氨基酸殘基、至少150個鄰接的氨基酸殘基、至少鄰接的175個氨基酸殘基、至少鄰接 的200個氨基酸殘基或至少鄰接的250個氨基酸殘基，其中所述多肽或蛋白質(zhì)保留第二種、 不同多肽或蛋白質(zhì)的至少一種功能。在一個具體實施方案中，多肽或蛋白質(zhì)片段保留蛋白 質(zhì)或多肽的至少2、3、4或5種功能。優(yōu)選地,與特定抗原免疫特異性結(jié)合的抗體片段保留 與抗原免疫特異性結(jié)合的能力。 如本文所使用的，表達(dá)“種系抗體基因”或“基因片段”指由非淋巴樣細(xì)胞編碼的 免疫球蛋白序列，所述非淋巴樣細(xì)胞未經(jīng)歷導(dǎo)致用于表達(dá)特定免疫球蛋白的遺傳重排和 突變的成熟過程。(參見例如，Shapiro 等人，Crit Rev. Immunol. 22(3) 183-200 (2002)； Marchalonis等人，Adv Exp Med Biol. 484 :13_30 (2001))。由本發(fā)明的各種實施方案所提 供的優(yōu)點之一起源于下述認(rèn)識種系抗體基因比成熟抗體基因更可能保存物種中個體的必 需氨基酸序列結(jié)構(gòu)特征，因此當(dāng)在那個物種中在治療上使用時,更不可能識別為來自外來如本文所使用的，表達(dá)“關(guān)鍵”殘基指在可變區(qū)內(nèi)的特定殘基，其對抗體特別是人 源化抗體的結(jié)合特異性和/或親和力具有更多影響。這包括前述選擇性決定殘基,并且進(jìn) 一步包括但不限于下述一種或多種與CDR鄰近的殘基、潛在的糖基化位點(可以是N或0 聯(lián)糖基化位點)、罕見殘基、能夠與抗原相互作用的殘基、能夠與CDR相互作用的殘基、典型 殘基、在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間的接觸殘基、在Vernier帶內(nèi)的殘基、和在可變重鏈 CDR1的Chothia定義和第一個重鏈構(gòu)架的Kabat定義之間重疊的區(qū)域中的殘基。如本文所使用的，表達(dá)“腫瘤壞死因子-a ”或(TNF-cx )或TNF-a不僅包含可作 為GenBank蛋白質(zhì)登記號CAA26669 (智人TNF- a )獲得的下述233氨基酸序列MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLHFGVIGPQREEFPRDLSL ISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCP STHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEK(;DRLSAEINRPDYLDFAES GQVYFGIIAL (SEQ ID NO 1),還包含這個TNF- a氨基酸序列的任何前原、原、成熟、可溶和/ 或膜結(jié)合形式，以及這個序列的突變型(突變蛋白質(zhì)(mutien))、剪接變體、直向同源物、同 系物和變體。表達(dá)“白介素-6”或(IL-6)在本文中不僅包含可作為GenBank蛋白質(zhì)登記號 NP_00591獲得的下述212氨基酸序列MNSFSTSAFGPVAFSLGLLLVLPAAFPAPVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRYILDGISALRK
ETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMS TKVLIQFLQKKAKNIJ)AITTPI)PTTNAS]J.;ilLID NO
2),還包含這個IL-6氨基酸序列的任何前原、原和成熟形式，以及這個序列的突變型和變 體包括等位變體。表達(dá)“交配感受態(tài)酵母物種”在本文中意欲廣泛地包含可以在培養(yǎng)中穩(wěn)定維持的 任何二倍體酵母。此種酵母物種以單倍體和二倍體形式存在。在合適條件下,二倍體細(xì)胞 可以以二倍體形式增殖無限代。二倍體細(xì)胞還可以形成孢子以形成單倍體細(xì)胞。此外，順 次交配通過營養(yǎng)缺陷型二倍體的進(jìn)一步交配可以產(chǎn)生四倍體菌株。在本發(fā)明中，二倍體或 多倍體酵母細(xì)胞優(yōu)選通過交配或質(zhì)體融合產(chǎn)生。
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在本發(fā)明的--個實施方案中，交配感受態(tài)酵母是酵母菌科(Saccharomycetaceae) 成員，所述酵母菌科包括Arxiozyma ；Ascobotryozyma ；固囊酵母屬(Citeromyces)；德 巴利酵母屬(Debaryomyces)；德克酵母屬(Dekkera)；假囊酵母屬(Eremothecium)；伊 莎酵母屬(Issatchenkia) ；Kazachstania ；克魯維酉孝母屬(Kluyveromyces) ；Kodamaea ； 婁德羅酵母屬(Lodderomyces)；管囊酵母屬(Pachysolen)；畢赤酵母屬(Pichia)；酵母 屬(Saccharomyces) ；Saturnispora ；Tetrapisispora ； WillBf ^M (Torulaspora)；擬 威爾酵母屬(Williopsis)和接合酵母屬(Zygosaccharomyces)。在本發(fā)明中潛在有用 的其他類型的酵母包括子囊菌酵母屬(Yarrowia)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)、假 絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、Filobasium、Filobasidellla、鎖擲酵母 屬(Sporidiobolus)、布勒擲孢酵母屬(Bullera)、白冬孢酵母屬(Leucosporidium)和 Filobasidella。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，交配感受態(tài)酵母是畢赤酵母屬成員。在本發(fā) 明的一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，畢赤酵母屬的交配感受態(tài)酵母是下述物種之一巴斯 德畢赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)、和多形漢遜酵母 (IlansMulapolymorpha)(安格斯畢赤酵母(Pichia angusta))。在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選 的實施方案中，畢赤酵母屬的交配感受態(tài)酵母是物種巴斯德畢赤酵母。表達(dá)“單倍體酵母細(xì)胞”在本文中指具有其通常基因組(染色體)互補體的每個 基因的單個拷貝的酵母細(xì)胞。表達(dá)“多倍體酵母細(xì)胞”在本文中指具有其通常基因組(染色體)互補體的超過 一個拷貝的酵母細(xì)胞。表達(dá)“二倍體酵母細(xì)胞”在本文中指具有其通常基因組互補體的每個基因的二個 拷貝(等位基因)的酵母細(xì)胞，通常通過2個單倍體細(xì)胞的融合(交配)過程形成。表達(dá)“四倍體酵母細(xì)胞”在本文中指具有其通?；蚪M互補體的每個基因的四個 拷貝(等位基因)的細(xì)胞,通常通過2個單倍體細(xì)胞的融合(交配)過程形成。四倍體可 以攜帶2、3或4個不同盒。此種四倍體可以在釀酒酵母(S. cerevisiae)中通過選擇性交 配純合異宗配合的a/a和a/a或a/a 二倍體獲得，以及在畢赤酵母屬中通過單倍體的順 次交配以獲得營養(yǎng)缺陷型二倍體。例如[met his]單倍體可以與[ade his]單倍體交配， 以獲得二倍體[his]；并且[met arg]單倍體可以與[ade arg]單倍體交配，以獲得二倍體 [arg]；隨后二倍體Diis]X 二倍體[arg],以獲得四倍體原養(yǎng)型。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解 提及二倍體細(xì)胞的優(yōu)點和用途也可以應(yīng)用于四倍體細(xì)胞。表達(dá)“酵母交配”指通過其，2個單倍體酵母細(xì)胞天然融合以形成1個二倍體酵母 細(xì)胞的過程。表達(dá)“減數(shù)分裂”在本文中指通過其,二倍體酵母細(xì)胞經(jīng)歷減少的分裂以形成4個 單倍體孢子產(chǎn)物的過程。每個孢子隨后可以出芽并形成單倍體營養(yǎng)生長細(xì)胞系。表達(dá)“可選標(biāo)記”在本文中指可選標(biāo)記是對由于例如通過轉(zhuǎn)化事件對接受那種基 因的細(xì)胞賦予生長表型(物理生長特征)的基因或基因片段?？蛇x標(biāo)記允許細(xì)胞在選擇性 生長培養(yǎng)基中在其中未接受那種可選標(biāo)記的細(xì)胞無法生長的條件下存活且生長?？蛇x標(biāo)記 基因一般歸為幾個類型，包括陽性可選標(biāo)記基因例如當(dāng)2個ts突變型雜交或ts突變型轉(zhuǎn) 化時，賦予細(xì)胞針對抗生素或其他藥物，溫度的抗性的基因；陰性可選標(biāo)記基因例如賦予細(xì)胞在不含特定營養(yǎng)素的培養(yǎng)基中生長的能力的生物合成基因,所述特定營養(yǎng)素是沒有那種 生物合成基因的所有細(xì)胞所需要的，或賦予細(xì)胞沒有野生型基因的細(xì)胞無法生長的誘變的 生物合成基因。合適標(biāo)記包括但不限于:ZE0 ；G418 ；LYS3 ；MET1 ；MET3a ；ADE1 ；ADE3 ；URA3 ；表達(dá)“表達(dá)載體”在本文中指包含有助于靶宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源蛋白質(zhì)的操作的 元件的DNA載體。方便地，序列操作和用于轉(zhuǎn)化的DNA產(chǎn)生首先在細(xì)菌宿主例如大腸桿菌 (E. coli)中執(zhí)行，并且通常載體將包括有助于此種操作的序列，包括細(xì)菌的復(fù)制起點和合 適的細(xì)菌選擇標(biāo)記。選擇標(biāo)記編碼對于在選擇培養(yǎng)基中生長的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的存活或生長 所需的蛋白質(zhì)。未用包含選擇基因的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在培養(yǎng)基中將不存活。一般的選 擇基因編碼如下蛋白質(zhì)其(a)賦予針對抗生素或其他毒素的抗性，(b)補充營養(yǎng)缺陷型缺 陷，或(c)供應(yīng)從復(fù)合培養(yǎng)基中無法獲得的關(guān)鍵營養(yǎng)素。適合于在本發(fā)明的方法中使用的表達(dá)載體進(jìn)一步包括酵母特異性序列，包括用于 鑒定轉(zhuǎn)化的酵母菌株的可選營養(yǎng)缺陷型或藥物標(biāo)記。藥物標(biāo)記可以進(jìn)一步用于擴(kuò)增載體在 酵母宿主細(xì)胞中的拷貝數(shù)。目的多肽編碼序列與提供多肽在酵母細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列可操作 地連接。這些載體組分可以包括但不限于下述一種或多種增強(qiáng)子元件、啟動子和轉(zhuǎn)錄終止 序列。還可以包括用于多肽分泌的序列,例如信號序列等。酵母復(fù)制起點是任選的，因為表 達(dá)載體通常整合到酵母基因組內(nèi)。在本發(fā)明的一個實施方案中，目的多肽與提供多肽從酵母二倍體細(xì)胞中的優(yōu)化分 泌的序列可操作地連接或融合。與核酸序列結(jié)合的表達(dá)“可操作地連接”指這些序列放置在彼此的功能關(guān)系內(nèi)。 例如，編碼信號序列的DNA可以與關(guān)于多肽的DNA可操作地連接，如果它表達(dá)為參與多肽 分泌的前蛋白質(zhì)；啟動子或增強(qiáng)子與編碼序列可操作地連接，如果它影響序列的轉(zhuǎn)錄。一 般地，“可操作地連接”指被連接的DNA序列是鄰接的，并且在分泌前導(dǎo)區(qū)的情況下,鄰接且 在讀碼框中。然而,增強(qiáng)子不一定是鄰接的。連接通過在方便的限制位點處連接或備選地 經(jīng)由本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的PCR/重組方法(Gateway^ Technology ；Invitrogen, Carlsbad California)來完成。如果此種位點不存在，那么依照常規(guī)實踐使用合成寡核苷酸連接物或 接頭。表達(dá)“啟動子”指位于結(jié)構(gòu)基因(一般在100-1000bp內(nèi))的起始密碼子上游(5’) 的非翻譯序列，其控制與它們可操作地連接的特定核酸序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯。此種啟動子歸 為幾個種類誘導(dǎo)型、組成型和阻遏型啟動子(其響應(yīng)阻遏物的不存在而增加轉(zhuǎn)錄水平)。 誘導(dǎo)型啟動子可以響應(yīng)培養(yǎng)條件中的某些變化,例如營養(yǎng)素的存在或不存在或溫度中的改 變，起始來自在其控制下的DNA的轉(zhuǎn)錄水平增加。酵母啟動子片段也可以充當(dāng)用于同源重組和表達(dá)載體整合到酵母基因組中的相 同位點內(nèi)的位點；備選地，可選標(biāo)記用作用于同源重組的位點。畢赤酵母屬轉(zhuǎn)化在Cregg等 人(1985)Mo 1. Cell. Biol. 5 3376-3385 中描述。來自畢赤酵母屬的合適啟動子的例子包括A0X1和啟動子(Cregg等人(1989)joL Cell. Biol. 9 1316-1323) ；ICL1 啟動子(Menendez 等人(2003) Yeast 20(13) 1097-108)； 甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子(GAP) (Waterham 等人(1997)Genel86 (1) :37-44)；和 FLD1啟動子(Shen等人(1998)_ 216(1) :93_102)。GAP啟動子是強(qiáng)組成性啟動子,并且A0X 和FLD1啟動子是誘導(dǎo)型的。其他酵母啟動子包括ADIII、乙醇脫氫酶II、GAL4、PH03、PH05、Pyk和由以上衍生的 嵌合啟動子。此外，可以在本發(fā)明中使用非酵母啟動子，例如哺乳動物、昆蟲、植物、爬行動 物、兩棲動物、病毒和禽類啟動子。最一般地，啟動子將包含哺乳動物啟動子(對表達(dá)的基 因潛在內(nèi)源的)，或?qū)峁┰诮湍赶到y(tǒng)中的有效轉(zhuǎn)錄的酵母或病毒啟動子。目的多肽不僅可以直接重組產(chǎn)生，還可以作為與異源多肽的融合多肽產(chǎn)生，所述 異源多肽例如信號序列或在成熟蛋白質(zhì)或多肽的N末端處具有特定切割位點的其他多肽。 一般而言，信號序列可以是載體的組分,或它可以是插入載體內(nèi)的多肽編碼序列的部分。選 擇的異源信號序列優(yōu)選地是通過宿主細(xì)胞內(nèi)可用的標(biāo)準(zhǔn)途徑之一被識別且加工的信號序 列。已證明釀酒酵母a因子前原信號在從巴斯德畢赤酵母中分泌各種重組蛋白質(zhì)中有效。 其他酵母信號序列包括交配因子a信號序列、轉(zhuǎn)化酶信號序列和衍生自其他分泌的酵母 多肽的信號序列。此外,這些信號肽序列可以經(jīng)改造以在二倍體酵母表達(dá)系統(tǒng)中提供增強(qiáng) 的分泌。其他目的分泌信號還包括哺乳動物信號序列，這可以對于被分泌的蛋白質(zhì)是異源 的，或可以是關(guān)于被分泌蛋白質(zhì)的天然序列。信號序列包括前肽序列，并且在某些情況下可 以包括原肽序列。許多此種信號序列是本領(lǐng)域已知的,包括在免疫球蛋白鏈上發(fā)現(xiàn)的信號 序列,例如K28前原毒素序列、PHA-E、FACE、人MCP-1、人血清白蛋白信號序列、人Ig重鏈、 人 Ig 輕鏈等。例如，參見 Hashimoto 等人 ProteinEng 11(2)75(1998)；和 Kobayashi 等人 Therapeutic Apheresis2(4)257(1998)。轉(zhuǎn)錄可以通過將轉(zhuǎn)錄激活子序列插入載體內(nèi)得到增加。這些激活子是DNA的順式 作用元件，通常為約10-300bp,這作用于啟動子以增加其轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子是相對方向和位 置獨立的，已經(jīng)對于轉(zhuǎn)錄單位5’和3’、在內(nèi)含子內(nèi)、以及在編碼序列其自身內(nèi)發(fā)現(xiàn)。增強(qiáng)子 可以在對于編碼序列5’或3’的位置處剪接到表達(dá)載體內(nèi)，并且優(yōu)選位于來自啟動子5’的 位點處。在真核宿主細(xì)胞中使用的表達(dá)載體也可以包含轉(zhuǎn)錄終止和穩(wěn)定mRNA所需的序 列。此種序列通常在來自翻譯終止密碼子的3’、在真核或病毒DNA或cDNA的非翻譯區(qū)中獲 得。這些區(qū)域包含在mRNA的非翻譯部分中轉(zhuǎn)錄為多腺苷酸化片段的核苷酸區(qū)段。包含一個或多個上述組分的合適載體的構(gòu)建采用標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)或PCR/重組方 法。對分離的質(zhì)?；駾NA片段以所需形式進(jìn)行切割、加尾和連接，以產(chǎn)生所需質(zhì)粒,或經(jīng)由 重組方法。為了分析以證實在構(gòu)建質(zhì)粒中的正確序列，連接混合物用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并且 合適時通過抗生素抗性(例如，氨芐青霉素或Zeocin)選擇成功的轉(zhuǎn)化體。制備來自轉(zhuǎn)化 體的質(zhì)粒，并且通過限制性核酸內(nèi)切酶消化分析和/或測序。作為片段限制和連接的備選方案,基于att位點和重組酶的重組方法可以用于將 DNA序列插入載體內(nèi)。此種方法例如由Landy (1989)Ann. Rev. Biochem. 58 :913_949描述； 并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。此種方法利用由X和大腸桿菌編碼的重組蛋白質(zhì)的混 合物介導(dǎo)的分子間DNA重組。重組在相互作用DNA分子上的特定附著(att)位點之間發(fā) 生。關(guān)于 att.位點的描述，參見 Weisber g 禾口 Landy (1983) Site-Specific Recombination in Phage Lambda, in Lambda II，Weisberg，編輯(Cold Spring Harbor, NY :Cold Spring Harbor Press),第211—250頁。交換重組位點側(cè)面的DNA區(qū)段，從而使得在重組后，att位
att位點可以通過如下方式引入目的序列內(nèi)使目的序列連接到合適載體內(nèi)；通 過使用特定引物產(chǎn)生包含att B位點的PCR產(chǎn)物；產(chǎn)生克隆到包含att位點的合適載體內(nèi) 的cDNA文庫；等。如本文所使用的，折疊指多肽和蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，其中氨基酸殘基之間的相互 作用用于穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。盡管非共價相互作用在確定結(jié)構(gòu)中是重要的,但通常目的蛋白質(zhì)將具 有由2個半胱氨酸殘基形成的分子內(nèi)和/或分子間共價二硫鍵。對于天 然存在的蛋白質(zhì)和 多肽或其衍生物和變體，正確折疊一般是導(dǎo)致最佳生物活性的排列，并且可以通過關(guān)于活 性例如配體結(jié)合、酶促活性等的測定法方便地監(jiān)控。在某些情況下，例如當(dāng)所需產(chǎn)物是合成起源時，基于生物活性的測定法意義較小。 此種分子的正確折疊可以基于物理性質(zhì)、能量考慮、建模研究等進(jìn)行測定。表達(dá)宿主可以通過引入編碼--種或多種酶的序列而進(jìn)一步修飾,所述酶增強(qiáng)折疊 和二硫鍵形成，即折疊酶、伴侶蛋白等。此種序列可以如本領(lǐng)域已知的，使用載體、標(biāo)記等在 酵母宿主細(xì)胞中組成性或誘導(dǎo)性表達(dá)。優(yōu)選地，序列包括對于所需表達(dá)模式足夠的轉(zhuǎn)錄調(diào) 節(jié)元件,將其通過靶向方法穩(wěn)定整合到酵母基因組中。例如,真核PDI不僅是蛋白質(zhì)半胱氨酸氧化和二硫鍵異構(gòu)化的有效催化劑,還顯 示伴侶蛋白活性。PDI的共表達(dá)可以促進(jìn)具有多個二硫鍵的活性蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。還感興趣 的是BIP(免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白)；環(huán)孢素；等的表達(dá)。在本發(fā)明的一個實施方案中，單 倍體親代菌株各自表達(dá)不同的折疊酶,例如一種菌株可以表達(dá)BIP,并且另一種菌株可以表 達(dá)PDI或其組合。術(shù)語“所需蛋白質(zhì)”或“靶蛋白質(zhì)”可互換使用，并且一般指本文描述的人源化抗體 或其結(jié)合部分。在本發(fā)明中,用于產(chǎn)生抗體用作根據(jù)本發(fā)明的原材料的來源是兔。眾多抗體 編碼序列已得到描述；并且其他可以通過本領(lǐng)域眾所周知的方法產(chǎn)生。其例子包括嵌合抗 體、人抗體和其他非人哺乳動物抗體、人源化抗體、單鏈抗體(scFvs)、駱駝科抗體、SIMPS、 和抗體片段例如Fabs、Fab'、F(ab' )2等。例如，抗體或抗原結(jié)合片段可以通過基因工程產(chǎn)生。在這種技術(shù)中，與其他方法一 樣，使抗體生成細(xì)胞對所需抗原或免疫原致敏。從抗體生成細(xì)胞中分離的信使RNA用作模 板，以使用PCR擴(kuò)增制備cDNA。通過將擴(kuò)增免疫球蛋白cDNA的合適部分插入表達(dá)載體內(nèi)， 產(chǎn)生保留起始抗原特異性的各自包含一種重鏈基因和一種輕鏈基因的載體文庫。通過使重 鏈基因文庫與輕鏈基因文庫相組合構(gòu)建組合文庫。這導(dǎo)致共表達(dá)重鏈和輕鏈(類似抗體分 子的Fab片段或抗原結(jié)合片段)的克隆文庫。將攜帶這些基因的載體共轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞 內(nèi)。當(dāng)抗體基因合成在轉(zhuǎn)染宿主中誘導(dǎo)時，重鏈和輕鏈蛋白質(zhì)自我裝配，以產(chǎn)生可以通過用 抗原或免疫原篩選檢測的活性抗體。目的抗體編碼序列包括由天然序列編碼的核酸，以及由于遺傳密碼的簡并性在序 列中不同于公開核酸的核酸,及其變體。變體多肽可以包括氨基酸(aa)置換、添加或缺失。 氨基酸置換可以是保守氨基酸置換或消除非必需氨基酸的置換,例如以改變糖基化位點、 或通過置換或缺失對于功能不必需的一個或多個半胱氨酸殘基使錯誤折疊降到最低。可以 設(shè)計變體，以便保留或具有蛋白質(zhì)的特定區(qū)域(例如，功能結(jié)構(gòu)域、催化氨基酸殘基等)的增強(qiáng)生物活性。變體還包括本文公開的多肽的片段,特別是生物活性片段和/或與功能結(jié) 構(gòu)域相對應(yīng)的片段。用于克隆基因的體外誘變的技術(shù)是已知的。在本發(fā)明中還包括已使用 普通分子生物學(xué)技術(shù)修飾的多肽，以便改善其對蛋白酶解降解的抗性或優(yōu)化可溶性質(zhì)或使 得它們更適合于作為治療劑。嵌合抗體可以通過重組方法通過使從一個物種的抗體生成細(xì)胞獲得可變輕鏈和 重鏈區(qū)域0MnvH)相組合進(jìn)行制備，其具有來自另一個物種的恒定輕和重鏈區(qū)域。一般 地，嵌合抗體利用嚙齒類動物或兔可變區(qū)和人恒定區(qū)，以便產(chǎn)生具有占優(yōu)勢地人結(jié)構(gòu)域的 抗體。此種嵌合抗體的產(chǎn)生是本領(lǐng)域眾所周知的,并且可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法(如例如美國專 利號5, 624, 659中描述的,其通過引用整體合并入本文)來實現(xiàn)。進(jìn)一步考慮本發(fā)明的嵌 合抗體的人恒定區(qū)可以選自 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5、IgG6、IgG7、IgG8、IgG9、IgGlO、 IgGll、IgG12、IgG13、IgG14、IgG15、IgG16、IgG17、IgG18 或 IgG19 恒定區(qū)?！耙匝娱L時間穩(wěn)定表達(dá)或表達(dá)所需分泌異源多肽的多倍體酵母”指如下酵母培養(yǎng) 物，其在--般至少10-25mg/升和優(yōu)選基本上更大的閾值表達(dá)水平下，分泌所述多肽至少數(shù) 天到一周、更優(yōu)選至少一個月、更加優(yōu)選至少1-6個月、且甚至更優(yōu)選超過一年。表達(dá)“分泌所需量重組多肽的多倍體酵母培養(yǎng)物”指以穩(wěn)定或延長時期分泌至少 10 25mg/升異源多肽、更優(yōu)選至少50-500rag/升、且最優(yōu)選500-lOOOmg/升或更多的培養(yǎng) 物。如果多核苷酸序列依照遺傳密碼的翻譯產(chǎn)生多肽序列(即，多核苷酸“編碼”多肽 序列)，那么多核苷酸序列與多肽序列“相對應(yīng)”，如果2個序列編碼相同的多肽序列，那么 一個多核苷酸序列與另一個多核苷酸序列“相對應(yīng)”。表達(dá)DNA構(gòu)建體的“異源”區(qū)域或“異源結(jié)構(gòu)域”指在自然界中未發(fā)現(xiàn)與較大分子 相關(guān)的在較大DNA分子內(nèi)的DNA可鑒定區(qū)段。因此，當(dāng)異源區(qū)域編碼哺乳動物基因時，基因 通常側(cè)面是如下DNA,所述DNA不在來源生物體的基因組中的哺乳動物基因組DNA的側(cè)面。 異源區(qū)域的另一個例子是其中編碼序列本身在自然界中未發(fā)現(xiàn)(例如,其中基因組編碼序 列的cDNA包含內(nèi)含子,或具有不同于天然基因的密碼子的合成序列)的構(gòu)建體。等位基因 變體或天然存在的突變事件不產(chǎn)生如本文定義的DNA的異源區(qū)。表達(dá)“編碼序列”指(就遺傳密碼而言)對應(yīng)于或編碼蛋白質(zhì)或肽序列的密碼子 的框內(nèi)序列。如果序列或其互補序列編碼相同的氨基酸序列,那么2個編碼序列彼此相對 應(yīng)。與合適調(diào)節(jié)序列結(jié)合的編碼序列可以轉(zhuǎn)錄且翻譯成多肽。多腺苷酸化信號和轉(zhuǎn)錄終止 序列通常將位于編碼序列3’。表達(dá)“載體”在本文中指用于將外源物質(zhì)例如DNA、RNA或蛋白質(zhì)引入生物體或宿 主細(xì)胞內(nèi)的材料。一般的載體包括重組病毒(對于多核苷酸)和脂質(zhì)體(對于多肽)?！癉NA 載體”是另一個多核苷酸區(qū)段可以與之附著以便造成附著區(qū)段的復(fù)制的復(fù)制子,例如質(zhì)粒、 噬菌體或粘粒。在本文中，“表達(dá)載體”是如下DNA載體，其包含將指導(dǎo)通過合適宿主細(xì)胞的 多肽合成的調(diào)節(jié)序列。這通常指結(jié)合RNA聚合酶且起始mRNA轉(zhuǎn)錄的啟動子，以及核糖體結(jié) 合位點和起始信號以指導(dǎo)mRNA翻譯成一種或多種多肽。多核苷酸序列在合適位點處和在 正確讀碼框中摻入表達(dá)載體內(nèi)，隨后通過載體轉(zhuǎn)化合適宿主細(xì)胞,使得能夠生產(chǎn)由所述多 核苷酸序列編碼的多肽。在多核苷酸序列上下文中的術(shù)語“擴(kuò)增”是特定核酸序列的多個拷貝的體外產(chǎn)生。
30擴(kuò)增的序列通常為DNA的形式。用于執(zhí)行此種擴(kuò)增的多種技術(shù)在Van Brunt (1990, Bio/ Techno 1. ,8(4) 291-294)的綜述文章中描述。聚合酶鏈反應(yīng)或PCR是核酸擴(kuò)增的典型，并 且PCR在本文中的使用應(yīng)視為其他合適擴(kuò)增技術(shù)的示例。發(fā)明詳述主題人源化方法--般可應(yīng)用于人源化任何兔抗體或其可變區(qū)，即這些抗體可以與 不同所需抗原特異性結(jié)合。此外，主題人源化方法可以應(yīng)用于人源化其他物種抗體，例如來 自與兔緊密相關(guān)的動物例如在兔形目或兔科中的其他哺乳動物(其包括不同的兔和野兔) 的抗體。因為它們與馴養(yǎng)兔緊密相關(guān),所以這些哺乳動物應(yīng)具有與本文用作人源化的來源 或兔抗體的馴養(yǎng)兔物種緊密相關(guān)的可變序列。因此,下文與人源化抗TNF-a或抗IL-6抗 體合成相對應(yīng)的描述是示例性的。本發(fā)明人源化方案在圖1中示意性描述并且在F文中詳 細(xì)描述。對下文公開的方法的描述提供通常應(yīng)用的規(guī)則以及這些規(guī)則對作為例子在圖2中 所示的特定序列的應(yīng)用。本發(fā)明考慮了主題人源化策略產(chǎn)生人源化重鏈和輕鏈以及包含對任何所需抗原 特異的抗體和抗體片段的用途。合適抗原的例子包括人蛋白質(zhì)例如生長因子，細(xì)胞因子， 酶，激素，腫瘤特異性抗原,癌基因等，變應(yīng)原，來自傳染物例如細(xì)菌、病毒、真菌、酵母、寄生 蟲等的抗原,毒素等。下文的例子例示用于獲得對TNF-a和IL-6特異的人源化兔抗體的 方法,并且舉例說明本發(fā)明方法及其固有優(yōu)點。本發(fā)明還考慮了包括根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的一條或多條人源化重鏈或輕鏈的抗體片 段。本發(fā)明特別考慮了對于TNF-a或IL-6具有結(jié)合特異性的人源化抗體片段。此種抗體 片段可以以一種或多種下述非限制性形式存在Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv和單鏈Fv抗體如先前所述，在本發(fā)明的一個優(yōu)選和示例性實施方案中，在本文提及的人源化過 程起始前，用于人源化的抗體起始于或選自一種或多種克隆抗原特異性兔B細(xì)胞群體。如上所述,抗體及其片段可以進(jìn)行翻譯后修飾，以添加效應(yīng)物部分，例如化學(xué)接 頭,可檢測部分例如熒光染料、酶、底物、生物發(fā)光材料、放射性材料和化學(xué)發(fā)光部分,或功 能部分例如鏈霉親和素、抗生物素蛋白、生物素、細(xì)胞毒素、細(xì)胞毒素劑和放射性材料。關(guān)于可檢測部分，進(jìn)一步的示例性酶包括但不限于，辣根過氧化物酶、乙酰膽堿酯 酶、堿性磷酸酶、卩-半乳糖苷酶和螢光素酶。進(jìn)一步的示例性熒光材料包括但不限于,羅 丹明、熒光素、異硫氰酸熒光素、傘形酮、二氯三嗪基胺(dichlorotriazinylamine)、藻紅蛋 白和丹酰氯。進(jìn)一步的示例性化學(xué)發(fā)光部分包括但不限于魯米諾。進(jìn)一步的示例性生物發(fā) 光材料包括但不限于，螢光素和水母熒光素。進(jìn)一步的示例性放射性材料包括但不限于，碘 125 (1251)、碳 14 (14C)、硫 35 (35S)、氘(3H)和磷 32 (32P)。關(guān)于功能部分，示例性細(xì)胞毒素劑包括但不限于，氨甲蝶呤、氨基蝶呤、6-巰嘌 呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氮烯咪胺；烷化劑例如氮芥、thioepa苯丁酸氮 芥、美法侖、卡莫司汀(BSNU)、絲裂霉素C、羅莫司汀(CCNU)、1 甲基亞硝脲、環(huán)磷酰胺 (cyd.othospharai.de)、氮芥、白消安、二溴甘露醇、鏈脲霉素、絲裂霉素C、順鉬(II) (DDP)順 鉬和卡鉬(伯爾定)；蒽環(huán)類包括柔紅霉素(以前的道諾霉素)、多柔比星(doxorubicin) (阿霉素)、地托比星、洋紅霉素、伊達(dá)比星、表柔比星、米托蒽醌和比生群；抗生素包括更生 霉素(放線菌素D)、博來霉素、卡奇霉素、光輝霉素和氨茴霉素(AMC)；和抗有絲分裂試劑例如長春花生物堿、長春新堿和長春堿。其他細(xì)胞毒素劑包括紫杉醇(泰素)、蓖麻蛋白、假 單胞菌外毒素、吉西他濱、細(xì)胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙啶、依米丁、依托泊苷、替尼泊 苷(tenoposide)、秋水仙堿、二羥基蒽二酮、1-脫氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、 利多卡因、普萘洛爾、嘌呤霉素、丙卡巴胼、羥基脲、天冬酰胺酶、皮質(zhì)類固醇、mytotane(0, P' _(DDD))、干擾素、和這些細(xì)胞毒素劑的混合物。進(jìn)一步的細(xì)胞毒素劑包括但不限于，化學(xué)治療劑例如卡鉬、順鉬、紫杉醇、吉西他 濱、卡奇霉素、多柔比星、5-氟尿嘧啶、絲裂霉素C、放線菌素D、環(huán)磷酰胺、長春新堿和博來 霉素。來自植物和細(xì)菌的毒性酶例如蓖麻蛋白、白喉毒素和假單胞菌毒素可以與人源化 抗體或其結(jié)合片段綴合，以產(chǎn)生細(xì)胞類型特異性殺死試劑(Youle等人，Proc. Natl Acad. Sci.USA 77 =5483(1980) ;Gilliland 等人，Proc. Nat ' lAcad. Sci. USA 77:4539(1980); Krolick 等人，Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA 77:5419(1980))。其他細(xì)胞毒素劑包括細(xì)胞毒性核糖核酸酶，如由Go 1 denberg在美國專利號 6,653, 104中描述的。本發(fā)明的實施方案還涉及其中發(fā)出a或粒子的放射性核素與 抗體或其結(jié)合片段穩(wěn)定偶聯(lián)的放射免疫綴合物，其中使用或不使用復(fù)合物形成試劑。此 種放射性核素包括0 -發(fā)射體例如磷-32 (32P)、鈧-47 (47Sc)、銅-67 (67Cu)、鎵-67 (67Ga)、 釔-88 (88Y)、釔-90(9°Y)、碘-125 (1251)、碘-131 (1311)、釤-153 (153Sm)、鐠-177(mLu)、 錸-186 (186Re)或錸-188 (188Re)，以及 a -發(fā)射體例如砹-211 (21lAt)、鉛-212 (212Pb)、 鉍-212(212Bi)或-213(213Bi)或錒-225 (225Ac)。用于使抗體或其結(jié)合片段與可檢測部分等綴合的方法是本領(lǐng)域已知的，例如 由 Hunter 等人，Nature 144 945(1962) ；David 等人，Biochemis try 13 1014(1974)； Pain 等人,J. Immunol. Met.h. 40 219(1981)；禾口 Nygren, J. , Histochem. and Cytochem. 30 407(1982)描述的那些方法。本文描述的實施方案進(jìn)一步包括與本文闡述的抗體、抗體片段、多肽、可變區(qū)和 CDR基本上同源的變體和等價物。這些可以包含例如保守置換突變(即，一個或多個氨基 酸被相似氨基酸置換)。例如,保守置換指氨基酸由在相同一般種類內(nèi)的另一個置換,例如 一個酸性氨基酸由另一個酸性氨基酸置換，一個堿性氨基酸由另一個堿性氨基酸置換，或 一個中性氨基酸由另一個中性氨基酸置換。保守氨基酸置換的所指內(nèi)容是本領(lǐng)域眾所周知 的。在另一個實施方案中，本發(fā)明考慮了與本文闡述的抗體片段、可變區(qū)和CDR的任 何一個或多個人源化多肽序列具有至少90%或更大序列同源性的多肽序列。更優(yōu)選地，本 發(fā)明考慮了與根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的任何一個或多個人源化抗體片段具有至少95%或更大序 列同源性、更加優(yōu)選至少98%或更大序列同源性、并且更加優(yōu)選至少99%或更大序列同源 性的人源化多肽序列。本發(fā)明人源化方案的顯著優(yōu)點是根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的包含人源化可變序列的抗體 的結(jié)合親和力相對于親本兔抗體的結(jié)合親和力保持基本上完整(未改變的)。優(yōu)選地，通過 本發(fā)明產(chǎn)生的人源化抗體例如人源化抗IL-6或TNF a抗體及其片段將對于IL 6、TNF_ a 或在人治療中有用的另一種抗原具有結(jié)合特異性，并且將以小于或等于SxlO—V^lCTV、 SxlO—SM—^lO—SM—^SxlO—ll—^lOll—^SxlO—iaM—^lCn—^SxlO—nM—^lO—nM—^SxlOmM—^lO—WM—1、 5x10 10 ^^^SxlO 10 ^^^SxlO 15M 1 it 10 15M 1 的解離常數(shù)(KD)與其抗原結(jié)合優(yōu)選地,主題人源化抗體將以小于或等于SxlO^M—1的解離常數(shù)結(jié)合其抗原靶例如IL-6或 TNF- a抗體。在本發(fā)明的另一個實施方案中，由兔抗體產(chǎn)生的人源化抗體和片段將對于抗原 例如IL-6或TNF-a具有結(jié)合特異性，其離開速率小于或等于lO-nS-yxlO—S-1、 l(T6S]、5xl(T7S-1 或 1(T7S-1。在本發(fā)明的一個進(jìn)一步的實施方案中，本發(fā)明的主題人源化抗體及其片段的活性 將對于抗原例如TNF-a具有結(jié)合特異性，并且顯示激動或拮抗特定抗原的功能的活性。優(yōu) 選地抗原將是治療靶,并且人源化抗體將改善或減少與特定抗原例如IL-6或TNF或另一種 治療靶例如人腫瘤多肽、自身抗原、變應(yīng)原或?qū)魅疚锾禺惖目乖嚓P(guān)的疾病和病癥的癥B細(xì)胞篩選和分離如所述的,本發(fā)明提供了可應(yīng)用于有效人源化任何兔抗體，即對任何所需抗原特 異的--般方法。這些抗體可以衍生自雜交瘤細(xì)胞、血清、或衍生自分泌兔抗體或緊密相關(guān)物 種例如其他兔形目動物的抗體的免疫細(xì)胞。如果使用免疫細(xì)胞，那么優(yōu)選這些細(xì)胞構(gòu)成分 泌對所需靶抗原特異的抗體的B細(xì)胞,所述B細(xì)胞通過下述B細(xì)胞分離方案衍生。已發(fā)現(xiàn) 這個方案提供如下B細(xì)胞群體,其產(chǎn)生具有良好結(jié)合親和力的抗體的選擇,并且此外產(chǎn)生 抗體的完全儲庫或多樣性，即包括與廣泛多樣的不同表位結(jié)合的那些的抗體群體。在這個 優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了分離得自免疫兔的抗原特異性B細(xì)胞的克隆群體的方法， 所述免疫兔可以用于分離至少一種抗原特異性細(xì)胞。如所述和下文例示的,這些方法包含 可以分開、組合、順次、重復(fù)或周期使用的一系列培養(yǎng)和選擇步驟。優(yōu)選地，這些方法用于分 離至少一種抗原特異性細(xì)胞,其可以用于產(chǎn)生對所需抗原特異的單克隆抗體，或與此種抗 體相對應(yīng)的核酸序列?；旧希@些方法包括下述步驟a.制備包含至少一種抗原特異性B細(xì)胞的細(xì)胞群體；b.例如通過層析法富集細(xì)胞群體，以形成包含至少一種抗原特異性B細(xì)胞的富集 細(xì)胞群體；c.從富集的B細(xì)胞群體中分離單個B細(xì)胞；和d.測定單個B細(xì)胞是否產(chǎn)生對抗原特異的抗體。這些方法提供對分離單個、抗體生成B細(xì)胞的方法的改善,所述改善包括富集得 自宿主的B細(xì)胞群體，所述宿主已免疫接種或天然暴露于抗原，其中富集步驟在任何選擇 步驟前進(jìn)行，包括至少一個培養(yǎng)步驟，且得到產(chǎn)生對所述抗原特異的單個單克隆抗體的B 細(xì)胞的克隆群體。就優(yōu)選用于衍生分泌本申請自始至終的本發(fā)明人源化方法中使用的抗體的兔B 細(xì)胞的此種方法而言，“B細(xì)胞的克隆群體”指僅分泌對所需抗原特異的單個抗體的B細(xì)胞 群體。這就是說這些細(xì)胞僅產(chǎn)生對所需抗原特異的一個類型的單克隆抗體。在描述此種方法中，表達(dá)“富集”細(xì)胞群體的細(xì)胞指增加在混合細(xì)胞群體,例如衍 生自針對所需抗原免疫接種的宿主的含B細(xì)胞分離物中包含的所需細(xì)胞一般是抗原特異 性細(xì)胞的頻率。因此，富集的細(xì)胞群體包含由于富集步驟具有更高頻率的抗原特異性細(xì)胞 的細(xì)胞群體，但這個細(xì)胞群體可以包含并產(chǎn)生不同抗體。
在進(jìn)一步描述此種方法中，一般表達(dá)“細(xì)胞群體”包含富集前和后細(xì)胞群體,應(yīng)記 住當(dāng)執(zhí)行多個富集步驟時，細(xì)胞群體可以是富集前和后的。更優(yōu)選地，用于衍生抗原特異性 B細(xì)胞的克隆群體的這些方法將包括a.從免疫接種的宿主中收獲細(xì)胞群體，以獲得收獲的細(xì)胞群體；b.由收獲的細(xì)胞群體制備至少一種單細(xì)胞懸浮液；c.富集至少一種單細(xì)胞懸浮液，以形成第一種富集的細(xì)胞群體；d.富集第一種富集的細(xì)胞群體，以形成第二種富集的細(xì)胞群體；e.富集第二種富集的細(xì)胞群體，以形成第三種富集的細(xì)胞群體；和f.選擇由第三種富集的細(xì)胞群體的抗原特異性細(xì)胞產(chǎn)生的抗體。每種細(xì)胞群體可以在F—個步驟中直接使用，或它可以部分或完全冷凍用于長期 或短期貯存或用于稍后步驟。此外，來自細(xì)胞群體的細(xì)胞可以個別懸浮，以產(chǎn)生單細(xì)胞懸浮 液。單細(xì)胞懸浮液可以進(jìn)行富集,從而使得單細(xì)胞懸浮液充當(dāng)富集前細(xì)胞群體。隨后,一種 或多種抗體特異性單細(xì)胞懸浮液一起形成富集的細(xì)胞群體；抗原特異性單細(xì)胞懸浮液可以 集合在一起，例如再鋪板用于進(jìn)一步分析和/或抗體產(chǎn)生。抗原特異性可以就任何抗原而言進(jìn)行測量?？乖梢允强贵w與之結(jié)合的任何物 質(zhì),包括但不限于,肽、蛋白質(zhì)或其片段；碳水化合物；有機(jī)和無機(jī)分子；通過動物細(xì)胞、細(xì) 菌細(xì)胞和病毒產(chǎn)生的受體；酶；生物途徑的激動劑和拮抗劑；激素；和細(xì)胞因子。示例性抗 原包括但不限于，IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-18、IFN-a、IFN- y , BAFF、 CXCL13、IP-10、VEGF、EPO、EGF、HRG、MIF、和集落刺激因子、TPAs、干擾素、腫瘤相關(guān)抗原、 HIV抗原例如env和gag和po:[、流感抗原、禽流感抗原等。優(yōu)選的抗原包括IL-6、]丄-13、 TNF-a、VEGF-a、海帕西啶(hepcidin)和肝細(xì)胞生長因子以及對特定人癌癥特異的腫瘤 抗原。在利用超過一個富集步驟的方法中，在每個富集步驟中使用的抗原可以彼此相同或 不同。使用相同抗原的多個富集步驟可以產(chǎn)生抗原特異性細(xì)胞的大型和/或分散群體；使 用不同抗原的多個富集步驟可以產(chǎn)生對不同抗原具有交叉特異性的富集細(xì)胞群體。富集細(xì)胞群體可以通過本領(lǐng)域已知用于分離抗原特異性細(xì)胞的任何細(xì)胞選擇方 法來執(zhí)行。例如，細(xì)胞群體可以通過層析技術(shù)進(jìn)行富集，例如Miltenyi珠或磁珠技術(shù)。珠 可以與目的抗原直接或間接附著。在一個優(yōu)選實施方案中，富集細(xì)胞群體的方法包括至少 一個層析富集步驟。細(xì)胞群體還可以通過本領(lǐng)域已知的任何抗原特異性測定技術(shù)進(jìn)行富集,例如 ELISA測定法或暈圈測定法(halo assay) 0 ELISA測定法包括但不限于，選擇性抗原固定 (例如，使用鏈霉親和素、抗生物素蛋白或中性鏈親和素包被平板的生物素化抗原捕獲)、 非特異性抗原平板包被、和通過抗原疊加策略(例如，選擇性抗原捕獲隨后結(jié)合配體添加， 以產(chǎn)生異聚蛋白質(zhì)-抗原復(fù)合物)。抗原可以與固體基質(zhì)或支持物例如柱直接或間接附著。 暈圈測定法包括使細(xì)胞與抗原裝載的珠和對用于收獲B細(xì)胞的宿主特異的標(biāo)記抗宿主抗 體接觸。標(biāo)記可以是例如熒光團(tuán)。在一個實施方案中，對至少一種單細(xì)胞懸浮液執(zhí)行至少 一個測定富集步驟。在另一個實施方案中，富集細(xì)胞群體的方法包括至少一個層析富集步 驟和至少--個測定富集步驟。通過大小或密度“富集”細(xì)胞群體的方法是本領(lǐng)域已知的。這些步驟可以在本方 法中另外用于通過抗原特異性富集細(xì)胞群體。
在這些方法中使用的細(xì)胞群體將包含能夠識別抗原的至少--種細(xì)胞。抗原識別細(xì) 胞包括但不限于B細(xì)胞、漿細(xì)胞及其后代。一般地，這些方法將在產(chǎn)生包含單個類型的抗原 特異性B細(xì)胞的克隆細(xì)胞群體的條件下實現(xiàn)，即細(xì)胞群體產(chǎn)生對所需抗原特異的單個單克 隆抗體。在本發(fā)明中，這些抗原特異性B細(xì)胞一般將是兔的,或備選地B細(xì)胞來自緊密相關(guān) 的哺乳動物物種。認(rèn)為通過本文提供的新型培養(yǎng)和選擇方案獲得由占優(yōu)勢地抗原特異性、抗體分泌 細(xì)胞組成的克隆抗原特異性B細(xì)胞群體。在此種方法中，單個B細(xì)胞的分離可以通過在任何選擇步驟前富集得自宿主的細(xì) 胞群體來實現(xiàn)，例如,從細(xì)胞群體中選擇特定B細(xì)胞和/或選擇通過特定細(xì)胞生產(chǎn)的抗體。 富集步驟可以以1、2、3或更多個步驟來執(zhí)行。在一個實施方案中，在證實單個B細(xì)胞是否 分泌具有抗原特異性和/或所需性質(zhì)的抗體前，從富集的細(xì)胞群體中分離單個B細(xì)胞。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中,得自對所需抗原免疫接種的兔的富集細(xì)胞群體 在用于抗體產(chǎn)生和/或選擇的方法中使用，所述抗體是用于主題人源化策略的候選原材 料。該方法可以包括F述步驟制備包含至少一種抗原特異性細(xì)胞的細(xì)胞群體，通過分離至 少一種抗原特異性細(xì)胞富集細(xì)胞群體，以形成富集的細(xì)胞群體，并且誘導(dǎo)來自至少一種抗 原特異性細(xì)胞的抗體產(chǎn)生。在一個優(yōu)選實施方案中，富集的細(xì)胞群體包含超過一種抗原特 異性細(xì)胞。在一個實施方案中,在由其分離抗體生成細(xì)胞和/'或使用所述B細(xì)胞產(chǎn)生抗體, 或與在苯發(fā)明的人源化策略中使用的此種抗體相對應(yīng)的核酸序列前，在產(chǎn)生克隆抗原特異 性B細(xì)胞群體的條件下培養(yǎng)富集群體的每個抗原特異性細(xì)胞。與從具有低頻率的抗原特異 性細(xì)胞的細(xì)胞群體產(chǎn)生抗體的現(xiàn)有技術(shù)形成對比,本發(fā)明允許來自高頻率的抗原特異性細(xì) 胞中的抗體選擇。因為富集步驟在抗體選擇前使用，所以用于抗體產(chǎn)生的大多數(shù)細(xì)胞，優(yōu)選 基本上所有細(xì)胞是抗原特異性的。通過從具有增加頻率的抗原特異性的細(xì)胞群體產(chǎn)生抗 體，增加抗體的數(shù)量和品種，從而提供更多原材料用于人源化。當(dāng)使用這些抗體選擇方法用于衍生用于人源化的兔抗體時,優(yōu)選在產(chǎn)生抗原特異 性B細(xì)胞的克隆群體的富集步驟和培養(yǎng)步驟后選擇抗體。該方法可以進(jìn)一步包括測序來自 一種或多種分離的、抗原特異性細(xì)胞的所選擇抗體或其部分的步驟?？梢岳帽绢I(lǐng)域已知 用于測序的任何方法,并且可以包括測序重鏈、輕鏈、一個或多個可變區(qū)、和/或一個或多 個互補決定區(qū)(CDR)。除富集步驟外,用于抗體選擇的方法還可以包括就抗原識別和/或抗體功能性篩 選細(xì)胞群體的一個或多個步驟。例如，所需抗體可以具有特異性結(jié)構(gòu)特征，例如與特定表位 結(jié)合或?qū)μ囟ńY(jié)構(gòu)的模擬；拮抗劑或激動劑活性；或中和活性，例如抑制抗原和配體之間 的結(jié)合。在一個實施方案中，抗體功能性篩選是配體依賴性的。就抗體功能性篩選包括但 不限于,再創(chuàng)造抗原配體與重組受體蛋白質(zhì)的天然相互作用的體外蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作 用測定法；和配體依賴性且容易監(jiān)控的基于細(xì)胞的應(yīng)答(例如增殖應(yīng)答)。在一個實施方案 中，用于抗體選擇的方法包括通過測量抑制濃度(IC50)就抗體功能性篩選細(xì)胞群體的步 驟。在一個實施方案中，至少一種分離的、抗原特異性細(xì)胞產(chǎn)生具有小于約100、50、30、25、 10 u g/mL或其中的增量的IC50的抗體。除富集步驟外，用于抗體選擇的方法還可以包括就抗體結(jié)合強(qiáng)度篩選細(xì)胞群體 的一個或多個步驟?？贵w結(jié)合強(qiáng)度可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法(例如，Biacore)進(jìn)
35行測量。在一個實施方案中，至少--種分離的、抗原特異性細(xì)胞產(chǎn)生具有高抗原親和力 的抗體，例如小于約 SxlO-^-1、優(yōu)選約 lxio-1、-1 至 SxlO^VaxlO^M"1 至 7. SxlO^^f1, 1x10 nM 1至2x10 nM人或約1. 5x10 nM 1或其中的增量的解離常數(shù)(Kd)。在這個實施方 案中，抗體被說成親和力成熟的。在一個優(yōu)選實施方案中，用于本文人源化的抗體的親和 力可與下述任何一種的親和力相當(dāng)或高于下述任何一種的親和力:Panorex (依決 洛單抗)、Rituxan (利妥昔單抗)、Herceptin (曲妥珠單抗)、Mylotarg (gentuzumab)、Campa th (阿侖珠單抗)、ZeValinTM(替伊莫單抗)Jrbitux (西妥昔單 抗)、AVaStinTM(beViCiZumab) ,Raptiva (依法珠單抗)、Refilicad& (英夫利昔單抗)、 Humira (阿達(dá)木單抗)和Xolair (奧馬珠單抗)。優(yōu)選地，抗體的親和力可與Humira 的 親和力相當(dāng)或高于Humira 的親和力?？贵w的親和力還可以通過已知親和力成熟技術(shù)而得 到增加。在一個實施方案中，至少一種細(xì)胞群體就抗體功能性和抗體結(jié)合強(qiáng)度中的至少--種、優(yōu)選兩種進(jìn)行篩選。除富集步驟外，用于選擇候選物用于人源化的抗體選擇的方法也可以包括就抗體 序列同源性特別是人同源性篩選兔細(xì)胞群體的一個或多個步驟。在一個實施方案中，至少 一種分離的、抗原特異性細(xì)胞產(chǎn)生對人抗體具有約50% -約100%或其中的增量的同源性， 或超過約60%、70%、80%、85%、90%或95%同源性的抗體。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明還提供了根據(jù)上文就IC50、Kd和/或同源性而 言描述的任何實施方案從抗體產(chǎn)生的兔衍生的人源化抗體。與用于獲得抗體分泌B細(xì)胞和對所需靶抗原特異的單克隆抗體的其他方法比較, 本文公幵的B細(xì)胞選擇方案具有許多固有優(yōu)點，所述方案優(yōu)選用于鑒定產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞， 所述抗體具有使得其成為用于人源化的良好候選物的親和力和功能性質(zhì)。這些優(yōu)點包括但 不限于下述首先，已發(fā)現(xiàn)當(dāng)這些選擇操作與所需抗原例如IL-6或TNF- a 一起使用時,該方法 可重現(xiàn)地產(chǎn)生抗原特異性B細(xì)胞，例如衍生自能夠產(chǎn)生看起來是抗體的基本上全面互補體 的兔，即與抗原的各種不同表位結(jié)合的抗體。不受理論束縛，假定全面互補體可歸因于在起 始B細(xì)胞回收前執(zhí)行的抗原富集步驟。此外,這個優(yōu)點允許分離和選擇具有不同性質(zhì)的抗 體,因為這些性質(zhì)可能依特定抗體的表位特異性而變。這些抗體是用于本發(fā)明人源化策略 的理想原材料。其次，已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的B細(xì)胞選擇方案可重現(xiàn)地產(chǎn)生包含單個B細(xì)胞或其后代的 克隆B細(xì)胞培養(yǎng)物,其分泌一般以相對高的結(jié)合親和力與所需抗原結(jié)合的單個單克隆抗 體。相比之下,現(xiàn)有的抗體選擇方法趨于產(chǎn)生相對少數(shù)的高親和力抗體,并且因此需要廣泛 的篩選操作以分離具有治療潛力的抗體。不受理論束縛，假定本發(fā)明的方案導(dǎo)致宿主的體 內(nèi)B細(xì)胞免疫接種(初次免疫接種)，隨后為第二次體外B細(xì)胞刺激(二次抗原引發(fā)步驟)， 這可以增強(qiáng)回收的克隆B細(xì)胞分泌對抗原靶特異的單個高親和力單克隆抗體的能力和性 質(zhì)。第三，已觀察到本發(fā)明的B細(xì)胞選擇方案可重現(xiàn)地得到產(chǎn)生IgG的B細(xì)胞，所述 IgG平均起來,對所需靶具有高度選擇性(抗原特異性)。在基于其上的部分中，通過本發(fā) 明方法回收的抗原富集的B細(xì)胞被認(rèn)為包含能夠得到表位特異性的所需完全互補體的B細(xì)
36胞，如上文討論的。 第四，已觀察到這種B細(xì)胞選擇方案，即使與小抗原一起使用時，即100個氨基酸 或更少的肽，例如長5-50個氨基酸,也可重現(xiàn)地產(chǎn)生克隆B細(xì)胞培養(yǎng)物，其分泌針對小抗原 例如肽的單個高親和力抗體。這是卜分令人驚訝的，因為這一般是很難、勞力密集型的、且 有時甚至無法產(chǎn)生針對小肽的高親和力抗體。因此,這些方法可以用于產(chǎn)生理想候選物用 于衍生針對所需肽靶的人源化治療抗體，所述肽靶例如病毒、細(xì)菌或自身抗原肽，從而允許 產(chǎn)生具有非常分散的結(jié)合性質(zhì)的單克隆抗體、或甚至產(chǎn)生針對不同肽靶例如不同病毒毒株 的單克隆抗體混合物(cocktail)。在產(chǎn)生具有所需效價的治療或預(yù)防疫苗的背上下文中， 這個優(yōu)點可以是特別有用的，所述疫苗例如誘導(dǎo)針對不同HPV毒株的保護(hù)性免疫的HPV疫 第五
細(xì)胞選擇方案，特別是當(dāng)與衍生自兔的B細(xì)胞一起使用時，趨于可重 ㈣待異性抗體序列，其與內(nèi)源人免疫球蛋白非常相似(在氨基酸水平上約90% 相似)，并且包含具有非常類似于人免疫球蛋白的長度且因此需要很少的序列修飾或無序 列修飾的CDR( 一般如先前所述在親本抗體序列中至多僅需要修飾少數(shù)CDR殘基且不引入 構(gòu)架外源殘基)，以便消除潛在的免疫原性牽扯。特別地，優(yōu)選地重組抗體將僅包含抗原識 別所需的宿主(兔)⑶R1和⑶R2殘基和整個⑶R3,因為這似乎對于抗體親和力成熟是重要 的。因此，即使人源化時,根據(jù)本發(fā)明的B細(xì)胞和抗體選擇方案產(chǎn)> 原結(jié)合親和力也保持完整或基本上完整?？傊?，通過使用比先前已知更有效的方案，本發(fā)明方?jīng)] 表位顯示更高結(jié)合親和力的人源化抗體。在一個具體實施方案中,本發(fā)明提供了通過包括下述步驟的過程用于鑒定單個B 細(xì)胞的方法，所述B細(xì)胞分泌對所需抗原特異的抗體用于在本發(fā)明方案中人源化，并且任 選具有至少一種所需功能性質(zhì)例如親和力、親合力、細(xì)胞溶解活性等，a.針對抗原免疫接種宿主；b.從宿主中收獲B細(xì)胞；c.富集收獲的B細(xì)胞，以增加抗原特異性細(xì)胞的頻率；d.制備至少一種單細(xì)胞懸浮液；e.在有利于單個抗原特異性B細(xì)胞/培養(yǎng)孔存活的條件下，培養(yǎng)來自單細(xì)胞懸浮 液的亞群；f.從亞群中分離少于10-12個B細(xì)胞；和g.測定單個B細(xì)胞是否產(chǎn)生對所述抗原特異的抗體。本發(fā)明方法將進(jìn)一步整體或部分包括分離和測序編碼所需抗體的多肽和核酸序 列的另外步驟，以鑒定關(guān)鍵殘基例如選擇性決定殘基,并且以便使用這種序列作為BLAST 搜索的部分，來鑒定候選同源人可變序列以用于衍生其理想的人源化形式。這些序列或其 人源化形式或部分可以在所需宿主細(xì)胞中表達(dá)，以便產(chǎn)生針對所需抗原例如IL 6、TNF a、 肝細(xì)胞生長因子、海帕西啶等的重組抗體。如先前所述,認(rèn)為B細(xì)胞的克隆群體占優(yōu)勢地包含產(chǎn)生針對所需抗原的抗體的抗 體分泌B細(xì)胞。還認(rèn)為基于用幾種抗原和用不同B細(xì)胞群體獲得的實驗結(jié)果，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)
生的克隆產(chǎn)生的B細(xì)胞
細(xì)胞分泌如下單克隆抗體，與從培養(yǎng)的抗原特異性B細(xì)胞衍生單克隆抗體的其他方法比較，所述單克隆抗體一般具有相對 高的親和力，并且此外能夠有效且可重現(xiàn)地產(chǎn)生更大表位變異性的單克隆抗體的選擇。在 本發(fā)明中，在此種B細(xì)胞選擇方法中使用的免疫細(xì)胞群體將衍生自兔或與其緊密相關(guān)的動 物，例如另一個兔科物種。認(rèn)為兔或緊密相關(guān)的哺乳動物用作B細(xì)胞的來源可以增強(qiáng)單克 隆抗體的多樣性，所述單克隆抗體可以在本發(fā)明中用于衍生人源化形式。此外,根據(jù)本發(fā)明 衍生自兔的抗體序列一般具有如F序列，所述序列與人抗體序列具有高度序列同一性，使 得它們有利于在人中使用，因為它們應(yīng)產(chǎn)生具有很少抗原性的人源化變體。在人源化的過 程中，最終人源化抗體包含少得多的外源/宿主殘基含量，通常限制于由于其性質(zhì)與移植 中使用的人靶序列顯著不同的宿主CDR殘基的子集。這增強(qiáng)了在使用本發(fā)明的人源化策略 產(chǎn)生的人源化抗體蛋白質(zhì)中完全活性回收的可能性。使用本文公開的富集步驟的抗體選擇方法包括從免疫接種的宿主中獲得包含免 疫細(xì)胞的細(xì)胞群體的步驟。從免疫接種的宿主中獲得包含免疫細(xì)胞的細(xì)胞群體的方法是本 領(lǐng)域已知的，并且一般包括在宿主中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答,和從宿主中收獲細(xì)胞以獲得一種或多 種細(xì)胞群體?？梢酝ㄟ^針對所需抗原免疫接種宿主而引發(fā)應(yīng)答。備選地，用作此種免疫細(xì) 胞來源的宿主可以天然地暴露于所需抗原,例如已用特定病原體例如細(xì)菌或病毒感染的個 體,或者備選地已設(shè)定對個體所患有的癌癥的特異性抗體應(yīng)答。在本方法中，宿主是兔。如所述的，免疫應(yīng)答可以由于疾病天然地發(fā)生,或它可以通過使用抗原的免疫接 種而誘導(dǎo)。免疫接種可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法來執(zhí)行，例如，通過一次或多次注射抗 原連同或不連同增強(qiáng)免疫應(yīng)答的試劑，例如完全或不完全弗氏佐劑。作為體內(nèi)免疫接種宿 主動物的備選方案,該方法可以包括體外免疫接種宿主細(xì)胞培養(yǎng)物。允許用于免疫應(yīng)答(例如,如通過血清抗體檢測測量)的時間后，收獲宿主動物細(xì) 胞以獲得一種或多種細(xì)胞群體。在一個優(yōu)選實施方案中，就抗體結(jié)合強(qiáng)度和/或抗體功能 性篩選收獲的細(xì)胞群體。收獲的細(xì)胞群體優(yōu)選來自脾、淋巴結(jié)、骨髓和/或外周血單核細(xì)胞 (PBMC)中的至少一種。細(xì)胞可以從超過一個來源收獲且合并。特定來源對于特定抗原可 能是優(yōu)選的。例如,脾、淋巴結(jié)和PBMC對于IL-6是優(yōu)選的；并且淋巴結(jié)對于TNF是優(yōu)選的。 在免疫接種后約20到約90天或其中的增量，優(yōu)選約50到約60天收獲細(xì)胞群體。收獲的 細(xì)胞群體和/或來自其的單細(xì)胞懸浮液可以就抗體選擇進(jìn)行富集、篩選和/或培養(yǎng)。抗原 特異性細(xì)胞在收獲的細(xì)胞群體內(nèi)的頻率通常為約-約5%,或其中的增量。在--個實施方案中，來自收獲細(xì)胞群體的單細(xì)胞懸浮液優(yōu)選通過使用Miltenyi 珠進(jìn)行富集。來自具有約_約5%抗原特異性細(xì)胞的頻率的收獲細(xì)胞群體，從而衍生具 有接近100%抗原特異性細(xì)胞的頻率的富集細(xì)胞群體。使用富集步驟的抗體選擇方法包括從來自富集細(xì)胞群體的至少一種抗原特異性 細(xì)胞產(chǎn)生抗體的步驟。體外產(chǎn)生抗體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且可以采用任何合適 的方法。在一個實施方案中，將富集細(xì)胞群體，例如來自收獲細(xì)胞群體的抗原特異性單細(xì) 胞懸浮液，以多種細(xì)胞密度，例如50、100、250、500、或在1-1000個細(xì)胞之間的其他增量/ 孔進(jìn)行鋪平板。優(yōu)選地,亞群包含不超過約10，000個抗原特異性、抗體分泌細(xì)胞，更優(yōu)選 約50-10, 000、約50-5，000、約50-1, 000、約50-500、約50-250個抗原特異性、抗體分泌細(xì) 胞，或其中的增量。隨后，這些亞群用合適的培養(yǎng)基(例如，活化T細(xì)胞條件培養(yǎng)基，特別是 1-5%活化兔T細(xì)胞條件培養(yǎng)基)在飼養(yǎng)層上培養(yǎng)，優(yōu)選在有利于單個增殖抗體分泌細(xì)胞/培養(yǎng)孔存活的條件下。飼養(yǎng)層--般包含被照射的細(xì)胞物質(zhì),例如EL4B細(xì)胞,不構(gòu)成細(xì)胞群 體的部分。細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)足以用于抗體產(chǎn)生的時間，例如約1天到約2周、約 1天到約10天、至少約3天、約3到約5天、約5天到約7天、至少約7天、或其中的其他增 量。在一個實施方案中，同時培養(yǎng)超過一個亞群。優(yōu)選地,單個抗體生成細(xì)胞及其后代在每 個孔中存活,從而在每個孔中提供抗原特異性B細(xì)胞的克隆群體。在這個階段時,通過克隆 群體產(chǎn)生的免疫球蛋白G(IgG)與抗原特異性高度關(guān)聯(lián)。在一個優(yōu)選實施方案中，IgG顯示 出與抗原特異性超過約50 %，更優(yōu)選超過70 %、85 %、90 %、95 %、99 %，或其中的增量的關(guān) 聯(lián)。該關(guān)聯(lián)已通過在有限條件下建立B細(xì)胞培養(yǎng)物以產(chǎn)生單個抗原特異性抗體產(chǎn)物/孔得 到證實。比較抗體特異性與--般IgG合成。觀察到3個群體識別抗原(生物素化且直接 包被的)的單個甲酸鹽的IgG，與固定無關(guān)的可檢測IgG和抗原識別，和單獨的IgG產(chǎn)生。 IgG產(chǎn)生與抗原特異性高度關(guān)聯(lián)。任選收集包含抗體的上清液,這可以根據(jù)上文描述的步驟就抗體選擇進(jìn)行富集、 篩選和/或培養(yǎng)。在--個實施方案中，上清液就抗體功能性進(jìn)行富集(優(yōu)選通過抗原特異 性測定法，特別是ELISA測定法)和/或篩選。在另一個實施方案中，富集的、優(yōu)選克隆、抗原特異性B細(xì)胞群體(由其任選篩選 上文描述的上清液，以便檢測所需分泌的單克隆抗體的存在)用于分離少數(shù)B細(xì)胞,優(yōu)選單 個B細(xì)胞,其隨后在合適的測定法中進(jìn)行測試，以便證實單個抗體生成B細(xì)胞在克隆B細(xì)胞 群體中的存在。在一個實施方案中，從克隆B細(xì)胞群體中分離約1到約20個細(xì)胞，優(yōu)選小 于約15、12、10、5或3個細(xì)胞,或其中的增量，最優(yōu)選單個細(xì)胞。篩選優(yōu)選通過抗原特異性 測定法特別是暈圈測定法來完成。暈圈測定法可以用全長蛋白質(zhì)或其片段來執(zhí)行。包含抗 體的上清液也可以就下述至少一種進(jìn)行篩選抗原結(jié)合親和力；抗原_配體結(jié)合的激動或 拮抗、特定靶細(xì)胞類型增殖的誘導(dǎo)或抑制；靶細(xì)胞裂解的誘導(dǎo)或抑制，和涉及抗原的生物途 徑的誘導(dǎo)或抑制。衍生自兔宿主的鑒定的抗原特異性細(xì)胞可以用于衍生編碼所需單克隆抗體的相 對應(yīng)核酸序列，所述單克隆抗體可以在本發(fā)明的人源化方法中使用。(Alul消化可以證實僅 產(chǎn)生單個單克隆抗體類型/孔)。如上所述，這些序列隨后優(yōu)選通過本發(fā)明的人源化方案進(jìn) 行突變，以便使得它們更適合于在人藥物中使用。如所述的，在本發(fā)明過程中使用的來自兔的富集B細(xì)胞群體也可以根據(jù)上文描述 的步驟就抗體選擇進(jìn)行進(jìn)一步富集、篩選和/或培養(yǎng),所述步驟可以重復(fù)或以不同順序執(zhí) 行。在一個優(yōu)選實施方案中，富集的、優(yōu)選克隆、抗原特異性細(xì)胞群體的至少一個細(xì)胞進(jìn)行 分離、培養(yǎng)和用于抗體選擇。因此,在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了分離在主題人源化方法中使用的抗體 候選物的方法，其包括a.從免疫接種的兔宿主中收獲細(xì)胞群體，以獲得收獲的細(xì)胞群體；b.由收獲的細(xì)胞群體制備至少一種單細(xì)胞懸浮液；c.優(yōu)選通過層析法富集至少一種單細(xì)胞懸浮液，以形成第一種富集的細(xì)胞群體；d.優(yōu)選通過ELISA測定法富集第--種富集的細(xì)胞群體，以形成優(yōu)選是克隆的第二 種富集的細(xì)胞群體，即，它僅包含單個類型的抗原特異性B細(xì)胞；e.優(yōu)選通過暈圈測定法富集第二種富集的細(xì)胞群體，以形成包含單個或少數(shù)B細(xì)胞的第三種富集的細(xì)胞群體，所述B細(xì)胞產(chǎn)生對所需抗原特異的抗體；和f.選擇通過從第三種富集的細(xì)胞群體中分離的抗原特異性細(xì)胞產(chǎn)生的抗體。該方法可以進(jìn)一步包括就抗體結(jié)合強(qiáng)度(親和力、親合力)和/或抗體功能性篩 選收獲的細(xì)胞群體的一個或多個步驟。合適的篩選步驟包括但不限于，檢測下述的測定方 法由鑒定的抗原特異性B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體是否產(chǎn)生具有最低抗原結(jié)合親和力的抗體，抗 體是激動還是拮抗所需抗原與配體的結(jié)合；抗體是誘導(dǎo)還是抑制特定細(xì)胞類型的增殖；抗 體是否誘導(dǎo)或引發(fā)針對靶細(xì)胞的細(xì)胞溶解反應(yīng)；抗體是否與特定表位結(jié)合；和抗體是否調(diào) 節(jié)(抑制或激動)涉及抗原的一個或多個特定生物途徑。類似地,該方法可以包括就抗體結(jié)合強(qiáng)度和/或抗體功能性篩選第二種富集的細(xì) 胞群體的一個或多個步驟。該方法進(jìn)一步包括測序所選擇抗體的多肽序列或相對應(yīng)核酸序列，以鑒定關(guān)鍵殘 基且以便進(jìn)行用于在主題人源化方法中使用的合適同源人種系抗體序列的BLAST搜索的 步驟。該方法還包括使用所選擇抗體的序列、其片段、或遺傳修飾的人源化形式產(chǎn)生重組 抗體的步驟。這些人源化突變方法可以產(chǎn)生具有所需效應(yīng)子功能、免疫原性、穩(wěn)定性、去除 或添加糖基化等的重組抗體。本文描述的重組人源化抗體或人源化抗體片段可以通過任 何合適的重組細(xì)胞產(chǎn)生,所述重組細(xì)胞包括但不限于哺乳動物細(xì)胞，例如CHO、COS、BHK、 HEK-293,細(xì)菌細(xì)胞,酵母細(xì)胞,植物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞和兩棲動物細(xì)胞。在一個優(yōu)選實施方案 中，親本兔抗體和衍生自這些抗體的人源化抗體和同源人可變序列在多倍體酵母細(xì)胞，即 二倍體酵母細(xì)胞特別是畢赤酵母屬中表達(dá)?；旧?，該方法可以如下實現(xiàn)a.針對抗原免疫接種兔宿主，以產(chǎn)生兔抗體；b.就抗原特異性和中和篩選所獲得的兔抗體；c.從兔中收獲B細(xì)胞；d.富集收獲的兔B細(xì)胞，以制備具有增加頻率的抗原特異性細(xì)胞的富集細(xì)胞群 體；e.在有利于單個B細(xì)胞存活的條件下，培養(yǎng)來自富集細(xì)胞群體的一個或多個亞 群，以在至少一個培養(yǎng)孔中產(chǎn)生克隆群體；f.測定克隆群體是否產(chǎn)生對抗原特異的兔抗體；g.分離單個兔B細(xì)胞；和h.測序由單個B細(xì)胞產(chǎn)生的兔抗體的核酸序列和i.使用這個抗體序列，以便使用本發(fā)明的人源化策略衍生具有親本兔抗體的親和 力和任選其他性質(zhì)的人源化抗體。人源化抗體的方法如所述的，本發(fā)明提供了用于人源化兔抗體重鏈和輕鏈的新型和改良方法。本發(fā) 明的方法可以如下實現(xiàn)用于人源化兔抗體重鏈和輕鏈 1.鑒定其為信號肽序列后的第一個的氨基酸。這是構(gòu)架1的開始。信號肽在第 一個起始甲硫氨酸處幵始，并且對于兔輕鏈蛋白質(zhì)序列長度一般但不一定是22個氨基酸。 成熟多肽的開始也可以通過N末端蛋白質(zhì)測序進(jìn)行實驗測定，或可以使用預(yù)測算法進(jìn)行預(yù)
40測。這也是構(gòu)架1開始,如通常由本領(lǐng)域技術(shù)人員限定的。實例圖2中的RbtVL氨基酸殘基1，以‘AYDM...，開始。2.鑒定構(gòu)架3的結(jié)束。這一般是構(gòu)架1開始后的86-90個氨基酸，并且一般是2 個酪氨酸殘基后的半胱氨酸殘基。這是構(gòu)架3的結(jié)束，如通常由本領(lǐng)域技術(shù)人員限定的。實例圖2中的RbtVL氨基酸殘基88,以‘TYYC，結(jié)束。3.使用如上限定的從構(gòu)架1開始起始到構(gòu)架3結(jié)束的多肽的兔輕鏈序列，并且執(zhí) 行用于最相似的人抗體蛋白質(zhì)序列的序列同源性搜索。這一般將是在抗體成熟前針對人 種系序列的搜索，以便減少免疫原性的可能性,然而,可以使用任何人序列。一般地,程序 如BLAST可以用于就最同源搜索序列數(shù)據(jù)庫。人抗體序列的數(shù)據(jù)庫可以從各種來源例如 NCBI (國家生物技術(shù)信息中心(National Center forBiotechnology Information))發(fā)現(xiàn)。實例在圖2中從編號1到88的殘基的RbtVL氨基酸序列是針對人抗體種系數(shù)據(jù) 庫BLAST的。前3個獨特的返回序列在圖2中顯示為L12A、VI和Vx02o4. 一般地,最同源的人種系可變輕鏈序列隨后用作用于人源化的基礎(chǔ)。然而本領(lǐng) 域技術(shù)人員可以決定使用如通過同源性算法測定并非最高同源性的另一個序列，基于其他 因素包括序列缺口和構(gòu)架相似性。實例在圖2中，L12A是最同源的人種系可變輕鏈序列，并且用作用于RbtVL人源 化的基礎(chǔ)。5.測定關(guān)于用于輕鏈人源化的人同系物的構(gòu)架和CDR排列(FR1、FR2、FR3、CDR1 和CDR2)。這是使用如本領(lǐng)域描述的傳統(tǒng)布局。比對兔可變輕鏈序列與人同系物，同時維持 構(gòu)架和⑶R區(qū)的布局。實例在圖2中，將RbtVL序列與人同源序列L12A比對,并且指出構(gòu)架和CDR結(jié)構(gòu) 6.用來自兔序列的CDR1和CDR2序列替換人同源輕鏈序列CDR1和CDR2區(qū)域。如 果在兔和人CDR序列之間在長度方面存在差異，那么使用整個兔CDR序列及其長度。如果 執(zhí)行更小或更大的序列交換,或如果改變一個或多個特定殘基,那么所得到的人源化抗體 的特異性、親和力和/或免疫原性可能未改變，這是可能的，然而，如所述的交換已成功地實例在圖2中，用來自RbtVL兔抗體輕鏈序列的CDR1和CDR2氨基酸序列替換人 同源可變輕鏈L12A的CDR1和CDR2氨基酸殘基。人L12A構(gòu)架1、2和3未改變。所得到的 人源化序列在下面顯示為VLh從編號1到88的殘基。應(yīng)當(dāng)指出僅不同于L12A人序列的殘 基是有下劃線的，并且因此是兔衍生的氨基酸殘基。在這個實例中，88個殘基中僅8個不同 于人序列。在步驟6中制備新雜交序列的構(gòu)架3后，附著兔輕鏈抗體序列的整個CDR3。CDR3 序列可以具有各種長度，但長度一般為9-15個氨基酸殘基。常規(guī)限定并且可通過本領(lǐng)域技 術(shù)人員鑒定CDR3區(qū)和隨后構(gòu)架4區(qū)域的開始。一般地,構(gòu)架4的開始和因此在CDR3結(jié)束 后由序列‘FGGG... ’組成，然而,某些變化可能存在于這些殘基中。實例在圖2中，在指示為VLh的人源化序列中在構(gòu)架3結(jié)束后添加RbtVL的 CDR3 (編號89-100的氨基酸殘基)。 8.兔輕鏈構(gòu)架4用最近的人輕鏈構(gòu)架4同系物替換，通常來自種系序列，所述兔輕鏈構(gòu)架4 一般是可變輕鏈的最后11個氨基酸殘基,并且如上文步驟7中所示開始且一般以 氨基酸序列‘...VVKR’結(jié)束。通常，這種人輕鏈構(gòu)架4具有序列‘FGGGTKVEIKR’。可能可 以使用并非最同源或在其他方面不同的其他人輕鏈構(gòu)架4序列,而不影響所得到的人源化 抗體的特異性、親和力和/或免疫原性。將這種人輕鏈構(gòu)架4序列加入緊接來自上文步驟 7的CDR3序列的可變輕鏈人源化序列末端。這現(xiàn)在是可變輕鏈人源化氨基酸序列的末端。實例在圖2中，RbtVL兔輕鏈序列的構(gòu)架4 (FR4)顯示在同源人FR4序列....丨二面。將 人FR4序列加入到在上文步驟7中加入的CDR3區(qū)結(jié)束后右側(cè)的人源化可變輕鏈序列(VLh) 中。^MMmm^A^m1.鑒定其為信號肽序列后的第一個的氨基酸。這是構(gòu)架1的幵始。信號肽在第一 個起始甲硫氨酸處開始，并且對于兔重鏈蛋白質(zhì)序列長度一般是19個氨基酸。一般但不一 定地,兔重鏈信號肽的最后3個氨基酸殘基是‘...VQC，,隨后為構(gòu)架1的開始。成熟多肽的 開始也可以通過N末端蛋白質(zhì)測序進(jìn)行實驗測定,或可以使用預(yù)測算法進(jìn)行預(yù)測。這也是 構(gòu)架1幵始，如通常由本領(lǐng)域技術(shù)人員限定的。實例圖2中的Rb tVII氨基酸殘基1，以‘QEQL...，開始。2.鑒定構(gòu)架3的結(jié)束。這一般是構(gòu)架1開始后的95-100個氨基酸，并且一般是 ‘..CAR’(盡管丙氨酸也可以是纈氨酸)的最終序列。這是構(gòu)架3的結(jié)束,如通常由本領(lǐng)域 技術(shù)人員限定的。實例圖2中的Rb tVH氨基酸殘基98,以‘...FCVR，結(jié)束。3.使用如上限定的從構(gòu)架1開始起始到構(gòu)架3結(jié)束的多肽的兔重鏈序列，并且執(zhí) 行用于最相似的人抗體蛋白質(zhì)序列的序列同源性搜索。這一般將在抗體成熟前針對人種 系序列的數(shù)據(jù)庫，以便減少免疫原性的可能性，然而，可以使用任何人序列。一般地，程序 如BLAST可以用于就最同源搜索序列數(shù)據(jù)庫。人抗體序列的數(shù)據(jù)庫可以從各種來源例如 NCBI(國家生物技術(shù)信息中心)發(fā)現(xiàn)。實例在圖2中從編號1到98的殘基的RbtVH氨基酸序列是針對人抗體種系數(shù)據(jù) 庫BLAST的。前3個獨特的返回序列在圖2中顯示為3-64-04、3-66-04和3-53-02。4. 一般地,最同源的人種系可變重鏈序列隨后用作用于人源化的基礎(chǔ)。然而，本領(lǐng) 域技術(shù)人員可以決定使用如通過同源性算法測定并非最高同源性的另一個序列，基于其他 因素包括序列缺口和構(gòu)架相似性。實例在圖2中，3-64-04是最同源的人種系可變重鏈序列，并且用作用于RbtVH 人源化的基礎(chǔ)。5.測定關(guān)于用于重鏈人源化的人同系物的構(gòu)架和CDR排列(FR1、FR2, FR3, CDR1 和CDR2)。這是使用如本領(lǐng)域描述的傳統(tǒng)布局。比對兔重鏈序列與人同系物，同時維持構(gòu)架 和⑶R區(qū)的布局。實例在圖2中，將RbtVII序列與人同源序列3-64-04比對 ，并且指出構(gòu)架和CDR 結(jié)構(gòu)域。6.用來自兔序列的CDR1和CDR2序列替換人同源重鏈序列CDR1和CDR2區(qū)域。如 果在兔和人CDR序列之間在長度方面存在差異，那么使用整個兔CDR序列及其長度。此外， 可能必須用兔重鏈構(gòu)架1的最后3個氨基酸替換人重鏈構(gòu)架1區(qū)域的最后3個氨基酸。一般但不一定,在兔重鏈構(gòu)架1中，這3個殘基跟在絲氨酸殘基后的甘氨酸殘基之后。此外’ 可能必須用兔重鏈構(gòu)架2的最后氨基酸替換人重鏈構(gòu)架2區(qū)域的最后氨基酸。一般但不一 定，在兔重鏈構(gòu)架2中,這是在異亮氨酸殘基后的甘氨酸殘基。如果執(zhí)行更小或更大的序列 交換,或如果改變一個或多個特定殘基，那么所得到的人源化抗體的特異性、親和力和/或 免疫原性可能未改變,這是可能的,然而,如所述的交換已成功地使用，但不排除可以允許 其他改變的可能性。例如，色氨酸氨基酸殘基一般存在于兔重鏈CDR2區(qū)結(jié)束前4個殘基處， 而在人重鏈CDR2中，這個殘基一般是絲氨酸殘基。已證實將這個位置處的這個兔色氨酸殘 基改變成人絲氨酸殘基，對人源化抗體的特異性或親和力具有最低影響或無影響，并且因 此使人源化序列中兔序列衍生的氨基酸殘基含量進(jìn)一步降到最低。實例在圖2中，用來自RbtVH兔抗體輕鏈序列的CDR1和CDR2氨基酸序列替換人 同源可變重鏈的CDR1和CDR2氨基酸殘基，除加方框的殘基外，這在兔序列(位置編號63) 中是色氨酸,并且在人序列中在相同位置處是絲氨酸,并且保持為人絲氨酸殘基。除CDR1 和CDR2改變外,構(gòu)架1的最后3個氨基酸(位置28-30)以及構(gòu)架2的最后殘基(位置49) 保留為兔氨基酸殘基而不是人的。所得到的人源化序列在下面顯示為VHh從編號1到98 的殘基。應(yīng)當(dāng)指出僅不同于3-64-04人序列的殘基是有下劃線的，并且因此是兔衍生的氨 基酸殘基。在這個實例中,98個殘基中僅15個不同于人序列。7.在步驟6中制備新雜交序列的構(gòu)架3后，附著兔重鏈抗體序列的整個CDR3。 CDR3序列可以具有各種長度，但長度一般為5-19個氨基酸殘基。常規(guī)限定并且可通過本領(lǐng) 域技術(shù)人員鑒定CDR3區(qū)和隨后構(gòu)架4區(qū)的開始。一般地，構(gòu)架4的開始和因此在CDR3結(jié) 束后由序列WGXG...(其中X通常是Q或P)組成，然而,某些變化可能存在于這些殘基中。實例在指示為VHh的人源化序列中在構(gòu)架3結(jié)束后添加RbtVH的CDR3(編號 99-110的氨基酸殘基)。8.兔重鏈構(gòu)架4用最近的人重鏈構(gòu)架4同系物替換，通常來自種系序列，所述兔 重鏈構(gòu)架4 一般是可變重鏈的最后11個氨基酸殘基，并且如上文步驟7中所示開始且一般 以氨基酸序列‘...TVSS’結(jié)束。通常,這種人重鏈構(gòu)架4具有序列‘WGQGTLVTVSS’?？赡?可以使用并非最同源或在其他方面不同的其他人重鏈構(gòu)架4序列，而不影響所得到的人源 化抗體的特異性、親和力和/或免疫原性。將這種人重鏈構(gòu)架4序列加入緊接來自上文步 驟7的CDR3序列后的可變重鏈人源化序列末端。這現(xiàn)在是可變重鏈人源化氨基酸序列的 末端。實例在圖2中，RbtVH兔重鏈序列的構(gòu)架4 (FR4)顯示在同源人FR4序列....丨二面。將 人FR4序列加入到在上文步驟7中加入的CDR3區(qū)結(jié)束后右側(cè)的人源化可變重鏈序列(VHh)上述人源化方法提供超過現(xiàn)有人源化方法的顯著優(yōu)點。例如,本發(fā)明提供了用于 人源化來自兔抗體序列的抗體序列的方法，其用來自所選擇的同源比對的人抗體序列的人 抗體殘基替換非常大百分比的兔氨基酸殘基。因此，它們在人中較不可能是免疫原性的。此外，本發(fā)明方法僅依賴于初級序列的比較，并且不依賴于或需要(i)對供體 或受體抗體序列的三維結(jié)構(gòu)的理解；(ii)就表面與隱蔽殘基而言對殘基的定位的理解； (iii)試驗出在特定或隨機(jī)位點處不同形式或變化的不同構(gòu)架殘基備選物。因此，相對于更 復(fù)雜的人源化方法，本發(fā)明是高度有效的，無需關(guān)于所得到的人源化抗體的所需性質(zhì)的任何妥協(xié)，例如結(jié)合親和力和其他功能性質(zhì)。 此外且與前述有關(guān)，相對于親本兔抗體，通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的所得到的人源化此外,本發(fā)明方法不要求另外的“親和力成熟”,以便優(yōu)化或增強(qiáng)抗原親和力。相比 之下,在大多數(shù)其他人源化方法中，在人源化后必須通過實現(xiàn)“親和力成熟”方案的反復(fù)而 顯著增加抗原親和力(以在可用劑量下治療或診斷上有效)，所述方案通過篩選許多隨機(jī) 或限定的序列變體，以便鑒定具有增加的結(jié)合親和力的變體。因此，本發(fā)明比先前人源化方 法更簡單和更有效。再進(jìn)--步地,本發(fā)明的人源化方法是有利的，因為所得到的人源化可變輕鏈和重 鏈序列可以用于產(chǎn)生全長抗體以及人源化抗體片段或包含的融合蛋白。因此，這些人源化 抗體、人源化抗體片段和包含的融合蛋白，例如與治療或診斷劑附著的那些,充分適合于免 疫治療以及體內(nèi)免疫診斷和免疫預(yù)測，例如在腫瘤組織、轉(zhuǎn)移灶、粥樣硬化斑塊、炎性位點 等的成像中使用。重組產(chǎn)生本發(fā)明的人源化抗體及其片段的優(yōu)選方法本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本文描述的人源化的兔抗體或其片段的優(yōu)選方法。與本文 描述的抗體或其片段相對應(yīng)的重組多肽或其片段優(yōu)選由交配感受態(tài)酵母的多倍體、優(yōu)選二 倍體或四倍體菌株分泌。本發(fā)明涉及用于以延長時期產(chǎn)生分泌形式的這些重組多肽的方 法，其中使用包含多倍體酵母的培養(yǎng)物，即至少數(shù)天到1周、更優(yōu)選至少1個月或數(shù)個月、并 且更加優(yōu)選至少6個月到1年或更長。這些多倍體酵母培養(yǎng)物將表達(dá)至少10-25mg/升多 肽、更優(yōu)選至少50-25()mg/升、更加優(yōu)選至少500-l()()()rag/升、并且最優(yōu)選1克/升或更多 重組多肽。在本發(fā)明的一個實施方案中，用包含所需異源多聚蛋白質(zhì)亞單位的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化 一對遺傳標(biāo)記的酵母單倍體細(xì)胞。一種單倍體細(xì)胞包含第一個表達(dá)載體，并且第二種單倍 體細(xì)胞包含第二個表達(dá)載體。在另一個實施方案中,用一個或多個表達(dá)載體轉(zhuǎn)化二倍體酵 母細(xì)胞，所述表達(dá)載體提供由本發(fā)明提供的一種或多種重組人源化多肽的表達(dá)和分泌。在 另外一個實施方案中，單種單倍體細(xì)胞可以用一個或多個載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并且通過融合或 交配策略用于產(chǎn)生多倍體酵母。在另外一個實施方案中，二倍體酵母培養(yǎng)物可以用一個或 多個載體轉(zhuǎn)化,所述載體提供根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的所需人源化的兔重鏈或輕鏈或者抗體多肽 或多肽的表達(dá)和分泌。這些載體可以包含染色體外維持的質(zhì)粒,或可以包含隨機(jī)或通過同 源重組整合到酵母細(xì)胞的基因組內(nèi)的載體，例如線性化的質(zhì)粒。任選地，可以將另外的表達(dá) 載體引入單倍體或二倍體細(xì)胞內(nèi)；或第一個或第二個表達(dá)載體可以包含另外的編碼序列； 用于合成異源三聚體；異源四聚體；等。非相同多肽的表達(dá)水平可以單獨校正，并且通過合 適的選擇、載體拷貝數(shù)、啟動子強(qiáng)度和！或誘導(dǎo)等進(jìn)行調(diào)整。轉(zhuǎn)化的單倍體細(xì)胞遺傳上雜交 或融合。所得到的二倍體或四倍體菌株用于產(chǎn)生和分泌完全裝配和生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)、 本文描述的人源化抗體或其片段。使用二倍體或四倍體細(xì)胞用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)提供了意想不到的優(yōu)點?？梢耘囵B(yǎng)細(xì)胞 用于生產(chǎn)目的，即按比例放大,并且用于延長的時間段,在對單倍體細(xì)胞的生長有害的條件 下，所述條件 以包括高細(xì)胞密度；在最小培養(yǎng)基中生長；在低溫下生長；在不存在選擇壓 力的情況下穩(wěn)定生長；和隨著時間提供異源基因序列完整性的維持和高水平表達(dá)的維持。不希望由此束縛，本發(fā)明人建立理論這些優(yōu)點可能至少部分起于由2種不同的親本單倍 體菌株制備二倍體菌株。此種單倍體菌株可以包含眾多較少的自養(yǎng)突變，所述突變在二倍 體或四倍體中補充，使得能夠在高度選擇性條件下生長。轉(zhuǎn)化的交配感受態(tài)單倍體酵母細(xì)胞提供使得所需人源化抗體蛋白質(zhì)能夠亞單位 配對的一般方法。單倍體酵母菌株用2個表達(dá)載體的每--個進(jìn)行轉(zhuǎn)化,第一個載體指導(dǎo)一 條多肽鏈的合成，和第二個載體指導(dǎo)第二條、非相同多肽鏈，即人源化的兔重鏈和輕鏈多肽 的合成。使2種單倍體菌株交配，以提供二倍體宿主，在其中可以獲得優(yōu)化的靶蛋白質(zhì)(人 源化的兔抗體或人源化的兔抗體片段)產(chǎn)生。任選地,提供一種或多種另外的非相同編碼序列。此種序列可以存在于另外的表 達(dá)載體—丨二或在第一個或第二個表達(dá)載體中。如本領(lǐng)域已知的，多個編碼序列可以由個別啟 動子獨立表達(dá)；或可以通過包括“內(nèi)核糖體進(jìn)入位點”或“IRES”協(xié)調(diào)表達(dá)，所述IRES是促 進(jìn)直接內(nèi)核糖體進(jìn)入順反子(蛋白質(zhì)編碼區(qū))的起始密碼子例如ATG的元件,從而導(dǎo)致基 因的帽不依賴性翻譯。在酵母中起作用的IRES元件由Thompson等人(2001)P. N. A. S. 98 12866-12868 描述。 在本發(fā)明的一個實施方案中，抗體序列在與分泌J鏈的組合中產(chǎn)生，所述J鏈提供 增強(qiáng)的IgA穩(wěn)定性(參見美國專利號5，959，177 ；和5，202，422)。在--個優(yōu)選實施方案中，2種單倍體酵母菌株各自是營養(yǎng)缺陷的，并且需要補充培 養(yǎng)基用于單倍體細(xì)胞生長。營養(yǎng)缺陷型對是互補的，從而使得二倍體產(chǎn)物將在不存在單倍 體細(xì)胞所需的補充物的情況下生長。在酵母中的許多此種遺傳標(biāo)記是已知的，包括對氨基 酸(例如met、lyS、hiS、arg等)、核苷酸(例如ura3、adel等)；等的需求。氨基酸標(biāo)記對 于本發(fā)明的方法可能是優(yōu)選的。備選地,包含所需載體的二倍體細(xì)胞可以通過其他方法進(jìn) 行選擇，例如通過使用其他可選標(biāo)記，例如綠色熒光蛋白、各種顯性可選標(biāo)記等。2種轉(zhuǎn)化的單倍體細(xì)胞可以進(jìn)行遺傳雜交，并且通過其雜交營養(yǎng)需求選擇由這種 交配事件產(chǎn)生的二倍體菌株。備選地,使2種轉(zhuǎn)化的單倍體菌株群體形成原生質(zhì)體且融合， 并且再生且選擇二倍體后代。通過任一方法,可以鑒定并且選擇性培養(yǎng)二倍體菌株，因為， 與其單倍體親本不同，它們不具有相同的營養(yǎng)需求。例如，二倍體細(xì)胞可以在最小培養(yǎng)基中 生長。二倍體合成策略具有特定的優(yōu)點。二倍體菌株具有通過對潛在突變更廣泛的互補作 用產(chǎn)生增強(qiáng)水平的異種蛋白質(zhì)的潛力，所述突變可能影響重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和/或分泌。如上所述,在某些實施方案中，單倍體酵母可以用單種或多種載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化,并且 與未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞交配或融合，以產(chǎn)生包含一種或多種載體的二倍體細(xì)胞。在其他實施方案 中，二倍體酵母細(xì)胞可以用一種或多種載體轉(zhuǎn)化,所述載體提供通過二倍體酵母細(xì)胞的一 種或多種所需人源化的兔抗體多肽的表達(dá)和分泌。在本發(fā)明的--個實施方案中，2種單倍體菌株用多肽文庫進(jìn)行轉(zhuǎn)化,例如根據(jù)本發(fā) 明產(chǎn)生的人源化的兔抗體重鏈或輕鏈的文庫。使合成所述多肽的轉(zhuǎn)化的單倍體細(xì)胞與互補 的單倍體細(xì)胞交配。將所得到的二倍體細(xì)胞就功能蛋白質(zhì)進(jìn)行篩選。二倍體細(xì)胞提供快速、 方便和廉價地集合大量的多肽組合用于功能測試的方法。這種技術(shù)可特別應(yīng)用于產(chǎn)生異源 二聚蛋白質(zhì)產(chǎn)物,其中優(yōu)化的亞單位合成水平對于功能蛋白質(zhì)表達(dá)和分泌是關(guān)鍵的。在本發(fā)明的另一個實施方案中，調(diào)節(jié)2個亞單位的表達(dá)水平比，以便使產(chǎn)物產(chǎn)生 達(dá)到最大。先前已顯示異源二聚體亞單位蛋白質(zhì)水平影響最終產(chǎn)物產(chǎn)生(Simmons LC，JImmunol Methods. 2002May 1 ；263 (1-2) :133_47)。可以在交配步驟前通過就表達(dá)載體上存 在的標(biāo)記的選擇來實現(xiàn)調(diào)節(jié)。通過穩(wěn)定增加載體的拷貝數(shù)，可以增加表達(dá)水平。在某些情 況下，可能希望增加一條鏈相對于另一條的水平，以便達(dá)到多肽亞單位之間的平衡比例?？?生素抗性標(biāo)記對于這個目的有用，例如Zeocin抗性標(biāo)記、G418抗性等，并且通過選擇對高 水平的Zeocin或G418有抗性的轉(zhuǎn)化體,提供關(guān)于在菌株中包含表達(dá)載體的多個整合拷貝 的菌株的富集方法。亞單位基因合適的比例，例如1 丨丨2;等對于有效蛋白質(zhì)產(chǎn)生可 能是重要的。即使當(dāng)相同啟動子用于轉(zhuǎn)錄2個亞單位時，許多其他因素促成所表達(dá)蛋白質(zhì) 的最終水平，并且因此，增加一個編碼基因相對于另一個的拷貝數(shù)可能是有用的。備選地, 通過使2種單倍體菌株交配制備相對于單拷貝載體菌株產(chǎn)生更高水平的人源化抗體多肽 的二倍體菌株，所述2種單倍體菌株都具有表達(dá)載體的多個拷貝。宿主細(xì)胞用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，交配以形成二倍體菌株，并且在適當(dāng)修飾的常規(guī) 營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng),用于誘導(dǎo)啟動子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增編碼所需序列的基因。適合于酵 母生長的許多最小培養(yǎng)基是本領(lǐng)域已知的。需要時,這些培養(yǎng)基中的任何都可以補充有鹽 (例如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖劑(例如HEPES、磷酸鉀、磷酸鈉)、核苷(例如腺苷和 胸苷)、抗生素、微量元素和葡萄糖或等價能源。任何其他必需補充物也可以以合適濃度包 括在內(nèi)，這將是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。培養(yǎng)條件例如溫度、PH等是先前就表達(dá)選擇宿主 細(xì)胞使用的那些，并且對于普通技術(shù)人員將是顯而易見的。從培養(yǎng)基中回收分泌的蛋白質(zhì)。蛋白酶抑制劑例如苯甲基磺酰氯化物(PMSF)對 于抑制在純化過程中的蛋白酶解降解可能有用，并且可以包括抗生素以阻止偶發(fā)污染物的 生長。組合物可以使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行濃縮、過濾、透析等?？梢耘囵B(yǎng)本發(fā)明的二倍體細(xì)胞用于生產(chǎn)目的。此種生產(chǎn)目的希望包括在最小培養(yǎng) 基中生長，所述培養(yǎng)基缺乏預(yù)先形成的氨基酸和其他復(fù)雜生物分子，例如包含氨作為氮源、 和葡萄糖作為能源和碳源、和鹽作為磷酸鹽、鈣等的來源的培養(yǎng)基。優(yōu)選地，此種生產(chǎn)培養(yǎng) 基缺乏選擇劑，例如抗生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。二倍體細(xì)胞可以培養(yǎng)至高細(xì)胞密度,例 如至少約50g/'L ；更通常至少約100g/L ；并且可以是至少約300、約400、約500g/L或更多。在本發(fā)明的一個實施方案中，主題細(xì)胞用于生產(chǎn)目的的培養(yǎng)在低溫F執(zhí)行，所述 溫度可以在對數(shù)期過程中、在穩(wěn)定期過程中或兩者中降低。術(shù)語“低溫”指至少約15°C、更 通常至少約17°c,并且可以是約2(rc,并且通常不超過約25°C、更通常不超過約22°C。生 長溫度可以影響分泌的全長蛋白質(zhì)在生產(chǎn)培養(yǎng)物中的產(chǎn)生，并且降低培養(yǎng)生長溫度可以強(qiáng) 烈增強(qiáng)完整產(chǎn)物得率。降低的溫度似乎通過由宿主使用的折疊和翻譯后加工途徑幫助細(xì)胞 內(nèi)運輸以產(chǎn)生靶產(chǎn)物，連同減少細(xì)胞蛋白酶降解。本發(fā)明的方法提供分泌的、活性蛋白質(zhì),優(yōu)選哺乳動物蛋白質(zhì)的表達(dá)。在一個實施 方案中，如本文所使用的,分泌的、“活性蛋白質(zhì)”指至少2條正確配對鏈的正確折疊的多聚 體，其與其同源抗原正確結(jié)合?；钚缘鞍踪|(zhì)的表達(dá)水平通常是至少約10_50mg/升培養(yǎng)物、 更通常至少約100mg/升、優(yōu)選至少約500mg/升，并且可以是lOOOrng/升或更多。本發(fā)明的方法可以提供在生產(chǎn)過程中宿主和異源編碼序列增加的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性 例如通過高水平表達(dá)時間的維持得到證明，其中經(jīng)過約20次倍增、50次倍增、100次倍增或 更多，表達(dá)的起始水平減少不超過約20%、通常不超過10%，并且可以減少不超過約5%。菌株穩(wěn)定性也提供隨著時間異源基因序列完整性的維持,其中經(jīng)過約20次倍增、50次倍增、100次倍增或更多，活性編碼序列和必要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的序列在至少約99%的 二倍體細(xì)胞中，通常在至少約99. 9 %的二倍體細(xì)胞中，并且優(yōu)選在至少約99. 99 %的二倍 體細(xì)胞中得到維持。優(yōu)選地,基本上所有二倍體細(xì)胞維持活性編碼序列和必要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元 件的序列。使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的相同常規(guī)方法產(chǎn)生第二個表達(dá)載體,所述表 達(dá)載體包含操縱子和編碼抗體輕鏈的DNA序列，其中編碼抗體特異性所需的CDR的DNA序 列衍生自兔B細(xì)胞來源，而編碼抗體鏈其余部分的DNA序列衍生自人細(xì)胞來源。表達(dá)載體通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的常規(guī)技術(shù)轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞內(nèi)以產(chǎn) 生所述抗體多肽，所述轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的常規(guī)技術(shù)培宿主細(xì)胞可以用上文描述的2個表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染，第一個表達(dá)載體包含編碼操縱 子和人源化的兔輕鏈衍生多肽的DNA,和第二個載體包含編碼操縱子和人源化的兔重鏈衍 生多肽的DNA。2個載體包含不同的可選標(biāo)記,但優(yōu)選地實現(xiàn)基本上相等的重鏈和輕鏈多肽 的表達(dá)。備選地，可以使用單個載體，該載體包括編碼人源化的兔重鏈和輕鏈多肽的DNA。2種轉(zhuǎn)化的單倍體細(xì)胞可以進(jìn)行遺傳雜交,并且通過其雜交體營養(yǎng)需求和/或抗 生素抗性譜選擇這種交配事件產(chǎn)生的二倍體菌株。備選地,使2種轉(zhuǎn)化的單倍體菌株群體 形成原生質(zhì)體且融合，以及再生且選擇二倍體后代。通過任--方法,基于其在與其親本不同 的培養(yǎng)基中生長的能力，可以鑒定并且選擇性培養(yǎng)二倍體菌株。例如，二倍體細(xì)胞可以在包 括抗生素的最小培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。二倍體合成策略具有特定的優(yōu)點。二倍體菌株具有通 過對潛在突變更廣泛的互補作用產(chǎn)生增強(qiáng)水平的異種蛋白質(zhì)的潛力,所述突變可能影響重 組蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和/或分泌。此外,一旦已獲得穩(wěn)定菌株,任何抗生素就用于選擇不一定需 要連續(xù)存在于生長培養(yǎng)基中的那些菌株。用于表達(dá)抗體多肽的宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞例如大腸桿菌、或真核細(xì)胞。在本 發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案中，可以使用就此目的的明確定義類型的哺乳動物細(xì)胞, 例如骨髓瘤細(xì)胞或中國倉鼠卵巢(CH0)細(xì)胞系。通過其可以構(gòu)建載體的一般方法，產(chǎn)生宿主細(xì)胞所需的轉(zhuǎn)染方法和由所述宿主細(xì) 胞產(chǎn)生抗體多肽所需的培養(yǎng)方法都包括常規(guī)技術(shù)。盡管優(yōu)選地用于產(chǎn)生抗體的細(xì)胞系是哺 乳動物細(xì)胞系,但備選地可以使用任何其他合適的細(xì)胞系，例如細(xì)菌細(xì)胞系例如大腸桿菌 衍生的細(xì)菌菌株、或酵母細(xì)胞系。相似地，一旦產(chǎn)生，人源化的兔抗體多肽就可以根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行純化， 例如交叉流過濾、硫酸銨沉淀法、親和柱層析法等。本文描述的人源化抗體多肽也可以用于設(shè)計和合成對于與本發(fā)明的抗體多 肽相同的治療應(yīng)用有用的肽或非肽模擬物。參見例如，Saragobi等人，Science, 253 792-795(1991)，其內(nèi)容通過引用整體合并入本文。施用根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的人源化的兔抗體和片段和包含的融合物優(yōu)選用于人治療或用 于診斷方法,例如腫瘤位點的體內(nèi)成像。在本發(fā)明的--個實施方案中,本文描述的人源化抗 體、或其人源化結(jié)合片段、以及所述抗體片段的組合，以約0. 05-10. Omg/kg接受受試者體 重的濃度施用于受試者。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中,本文描述的人源化抗體、或其人
47源化結(jié)合片段、以及所述抗體片段的組合，以約0. 1-1. Omg/kg接受受試者體重的濃度施用 于受試者。在本發(fā)明的另一個實施方案中,本文描述的人源化的兔抗體、或其結(jié)合片段、以及 所述抗體片段的組合，在藥物制劑中施用于受試者。“藥物組合物”指適合于對哺乳動物施用的化學(xué)或生物組合物。此種組合物可 以經(jīng)特別配制用于經(jīng)由許多途徑中的一種或多種施用，所述途徑包括但不限于頰、表皮 (epicutaneous)、硬膜外、吸入、動脈內(nèi)、心內(nèi)、腦室內(nèi)、真皮內(nèi)、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、腹膜內(nèi)、脊 柱內(nèi)、鞘內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)口、腸胃外、經(jīng)由灌腸劑或栓劑經(jīng)直腸、皮下、真皮下、舌下、透皮和經(jīng) 粘膜。此外,施用可以借助于注射、粉劑、液體、凝膠劑、滴劑或其他施用方法發(fā)生?！八幬镔x形劑，，或“藥學(xué)上可接受的賦形劑”是在其中配制活性治療劑的載體，通 常為液體。在本發(fā)明的一個實施方案中，活性治療劑是對IL-6或TNF-a特異的人源化抗 體，或其一個或多個片段。賦形劑通常對制劑不提供任何藥理學(xué)活性，盡管它可以提供化學(xué) 和/'或生物學(xué)穩(wěn)定性、和釋放特征。示例性制劑可以例如在Remington' sPharmaceutical Sciences，第19版，Grennaro, A.，編輯，1995中發(fā)現(xiàn)，所述參考文獻(xiàn)通過引用合并。如本文所使用的，“藥學(xué)上可接受的載體”或“賦形劑”包括生理學(xué)相容的任何和所 有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑。在一個實施方案中，載體適 合于腸胃外施用。備選地,載體可以適合于靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)或皮下施用。藥學(xué)上可接 受的載體包括無菌水溶液或分散系和用于臨時制備無菌可注射溶液或分散系的無菌粉劑。 此種介質(zhì)和試劑用于藥學(xué)活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域眾所周知的。除非任何常規(guī)介質(zhì)或試劑 與活性化合物不相容,包括其在本發(fā)明的藥物組合物中的使用。補充性活性化合物也可以 摻入組合物內(nèi)。藥物組合物一般在制造和貯存條件下必須是無菌和穩(wěn)定的。組合物可以配制為溶 液、微乳劑、脂質(zhì)體、或適合于高藥物濃度的其他有序結(jié)構(gòu)。載體可以是包含例如水、乙醇、 多羥基化合物(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇)及其適當(dāng)混合物的溶劑或分散介質(zhì)。 合適的流動性可以如下得到維持例如通過使用包衣例如卵磷脂，在分散系的情況下通過 維持所需顆粒大小，和通過使用表面活性劑。在許多情況下，在組合物中將優(yōu)選包括等滲劑，例如，糖，多元醇例如甘露醇、山梨 糖醇,或氯化鈉?？勺⑸浣M合物的延長吸收可以通過在組合物中包括延遲吸收的試劑來達(dá) 到,所述試劑例如單硬脂酸鹽和明膠。此外,在時間釋放制劑中，例如在包括緩慢釋放聚合 物的組合物中，可以配制堿性多肽?；钚曰衔锟梢杂帽Ｗo(hù)化合物不快速釋放的載體制備， 例如控制釋放制劑，包括埋植劑和微囊遞送系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到?、生物相容的聚合 物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸、聚乙醇酸共聚 物(PLG)。用于制備此種制劑的許多方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。對于每個所述實施方案，化合物可以通過各種劑型施用。包括本領(lǐng)域普通技術(shù)人 員已知的任何生物學(xué)可接受的劑型及其組合。此種劑型的例子包括但不限于，可重構(gòu)粉 劑、酏劑、液體、溶液、懸浮液、？L劑、粉劑、粒劑、顆粒、微粒、分散粒劑、扁囊劑、吸入劑、氣溶 膠吸入劑、貼劑、粒子吸入劑、埋植劑、沉淀埋植劑、注射劑(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)和真皮 內(nèi))、浸劑及其組合。
0361]本發(fā)明各種舉例說明的實施方案的上述描述不意欲是詳盡的或使本發(fā)明限制于目的描述, 一文提供的
文教
公開的精確形式。盡管本發(fā)明的具體實施方案〗
但在本發(fā)明范圍內(nèi)的各種等價修飾是可能的，如相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到 本發(fā)明教導(dǎo)可以應(yīng)用于其他目的，除上文描述的例子外。根據(jù)上文詳述可以對本發(fā)明進(jìn)行這些和其他改變。一般而言,在下述權(quán)利要求中， 使用的術(shù)語不應(yīng)解釋為將本發(fā)明限制于說明書中公開的具體實施方案和權(quán)利要求。因此, 本發(fā)明不受公開內(nèi)容限制的，相反，本發(fā)明的范圍完全由下述權(quán)利要求決定。本發(fā)明可以以除前述說明書和例子中特別描述的那些外的方式進(jìn)行實施。根據(jù)上 爭,本發(fā)明的眾多修飾和變化是可能的,并且因此在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。 I與用于獲得抗原特異性B細(xì)胞的克隆群體的方法相關(guān)的特定教導(dǎo)公開于2006年5 曰提交的美國臨時專利申請?zhí)?0/801，412中，所述美國臨時專利申請?zhí)柕墓_內(nèi)容
i整體合并入本文。
與使用交配感受態(tài)酵母產(chǎn)生抗體或其片段相關(guān)的特定教導(dǎo)和相對應(yīng)方法 公開于2006年5月8日提交的美國專利申請?zhí)?1/429,053(美國專利申請公開號 US2006/0270045)中，所述美國專利申請?zhí)柕墓珟詢?nèi)容通過引用整體合并入本文。在發(fā)明背景、詳述和實施例中引用的每個文件(包括專利、專利申請、期刊論文、 摘要、手冊、書本或其他公開內(nèi)容)的完整公開內(nèi)容通過引用整體合并入本文。提出下述實施例，以便為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供如何制備和使用本發(fā)明的完整 公幵內(nèi)容和描述，并且不意欲限制視為本發(fā)明的范圍。已進(jìn)行努力以確保就使用的數(shù)字 (例如量、溫度、濃度等)而言的精確度，但應(yīng)允許某些實驗誤差和偏差。除非另有說明，份 是重量份,分子量是平均分子量,溫度是攝氏度
應(yīng)答。--般地,用于免疫接種的宿主是兔或其他宿主，其使用相似的成熟過程產(chǎn)生抗體，并 且提供產(chǎn)生可比較多樣性，例如表位多樣性的抗體的抗原特異性B細(xì)胞群體。起始抗原免 疫接種可以使用完全弗氏佐劑(CFA)進(jìn)行，并且用不完全佐劑實現(xiàn)后續(xù)加強(qiáng)。在免疫接種 后約50-60天時,優(yōu)選在第55天時,測試抗體滴度,并且如果確定合適滴度，那么起始抗體 選擇(ABS)過程。關(guān)于ABS起始的2個關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn)是在多克隆血清中的有效抗原識別和功能 修飾活性。在確定陽性抗體滴度時，處死動物且分離B細(xì)胞來源。這些來源包括脾、淋巴結(jié)、 骨髓和外周血單核細(xì)胞(PBMC)。產(chǎn)生單細(xì)胞懸浮液,并且洗滌細(xì)胞懸浮液，以使得它們適應(yīng) 低溫長期貯存。細(xì)胞隨后一般進(jìn)行冷凍。為了起始抗體鑒定過程，使小部分冷凍細(xì)胞懸浮液解凍、洗滌、且在組織培養(yǎng)基中 鋪平板。隨后使這些懸浮液與用于產(chǎn)生動物免疫應(yīng)答的生物素化形式的抗原混合，并且使 用Miltenyi磁珠細(xì)胞選擇方法回收抗原特異性細(xì)胞。使用鏈霉親和素珠進(jìn)行特異性富集。 回收富集群體并且進(jìn)展至特異性B細(xì)胞分離的下一個階段中。實施例2 包含克隆、抗原特異性B細(xì)胞的培養(yǎng)物的產(chǎn)生將根據(jù)實施例1產(chǎn)生的富集B細(xì)胞隨后在各種細(xì)胞密度下鋪平板在96孔微定板的每個孔中。一般地，這是50、100、250或500個細(xì)胞/孔,具有10塊平板/組。培 養(yǎng)基補充有4%活化的兔T細(xì)胞條件培養(yǎng)基，連同50K冷凍的被照射EL4B飼養(yǎng)細(xì)胞。這些 培養(yǎng)物不受擾亂51天,在這時收集包含分泌抗體的上清液,并且在分開的測定設(shè)置中就 靶性質(zhì)進(jìn)行評估。使其余上清液保持完整,并且將平板冷凍在 7(rc。在這些條件下,培養(yǎng) 過程--般產(chǎn)生包含混合細(xì)胞群體的孔,所述混合細(xì)胞群體包含抗原特異性B細(xì)胞的克隆群 體，即單個孔將僅包含對所需抗原特異的單個單克隆抗體。實施例3 :抗體上清液就所需特異性和/或功能性質(zhì)的單克隆抗體的篩選衍生自包含根據(jù)實施例2產(chǎn)生的克隆抗原特異性B細(xì)胞群體的孔的含抗體上清液 最初就抗原識別，使用ELISA方法進(jìn)行篩選。這包括選擇性抗原固定(例如,通過鏈霉親和 素包被的平板進(jìn)行生物素化抗原捕獲)，非特異性抗原平板包被，或備選地，通過抗原疊加 策略(例如，選擇性抗原捕獲后通過結(jié)合伴侶添加，以產(chǎn)生異聚蛋白質(zhì)-抗原復(fù)合物)?？?原陽性孔上清液隨后任選在嚴(yán)格依賴于配體的功能修飾測定法中進(jìn)行測試。一個此種例子 是體外蛋白質(zhì)_蛋白質(zhì)相互作用測定法,其再現(xiàn)抗原配體與重組受體蛋白質(zhì)的天然相互作 用。備選地，利用配體依賴性且容易監(jiān)控的基于細(xì)胞的應(yīng)答(例如，增殖應(yīng)答)。顯示顯著 抗原識別和效價的上清液視為陽性孔。衍生自最初陽性孔的細(xì)胞隨后過渡到抗體回收階實施例4 所需抗原特異性的單個、抗體生成B細(xì)胞的回收從包含抗原特異性B細(xì)胞的克隆群體(根據(jù)實施例2或3產(chǎn)生)的孔中分離少 數(shù)細(xì)胞，其分泌單個抗體序列。對分離的細(xì)胞隨后進(jìn)行測定，以分離單個、抗體分泌細(xì)胞。 Dyna!鏈霉親和素珠在緩沖介質(zhì)下用生物素化的靶抗原包被，以制備與細(xì)胞存活力相容 的含抗原微珠。接下來,使抗原裝載的珠、來自陽性孔的抗體生成細(xì)胞和異硫氰酸熒光素 (FITC)標(biāo)記的抗宿主H&L IgG抗體(如指出的，宿主可以是任何哺乳動物宿主，例如兔、小 鼠、大鼠等)一起在37°C下溫育。將這個混合物隨后以等分試樣再次吸取到載玻片上，從而 使得每個等分試樣平均具有單個、抗體生成B細(xì)胞。隨后通過熒光顯微鏡檢查檢測抗原特 異性、抗體分泌細(xì)胞。由于結(jié)合抗原，分泌抗體局部集中于鄰近珠上，并且基于強(qiáng)熒光信號 提供定位信息。經(jīng)由對分泌細(xì)胞鄰近的所形成抗體-抗原復(fù)合物的FITC檢測鑒定抗體分泌 細(xì)胞。隨后使用顯微操作器回收在這種復(fù)合物中心處發(fā)現(xiàn)的單個細(xì)胞。將細(xì)胞在eppendorf PGR管中速凍用于在 80°C下貯存,直至起始抗體序列回收。實施例5 從抗原特異性B細(xì)胞中分離抗體序列使用基于組合RT-PCR的方法，從根據(jù)實施例4產(chǎn)生的單個分離的B細(xì)胞中，或從 根據(jù)實施例2獲得的克隆B細(xì)胞群體中分離的抗原特異性B細(xì)胞中回收抗體序列。設(shè)計引 物以在靶免疫球蛋白基因(重和輕)，例如兔免疫球蛋白序列的保守和恒定區(qū)中退火，和使 用2步巢式PCR回收步驟以獲得抗體序列。對來自每個孔的擴(kuò)增子就回收和大小完整性進(jìn) 行分析。隨后用Alul消化所得到的片段，以采集序列克隆性的指紋。相同序列在其電泳分 析中顯示共同斷裂模式。明顯地，一般甚至在最初鋪平板至1000個細(xì)胞/孔的孔中觀察到 證明細(xì)胞克隆性的這個共同斷裂模式。最初的重鏈和輕鏈擴(kuò)增子片段隨后用Hindlll和 Xhol或Hindlll和BsiwI進(jìn)行限制性酶消化，以制備各自DNA的碎片用于克隆。所得到的 消化物隨后連接到表達(dá)載體內(nèi)，并且轉(zhuǎn)化到細(xì)菌內(nèi)用于質(zhì)粒繁殖和產(chǎn)生。選擇菌落用于序 列表征。
實施例6 所需抗原特異性和/或功能性質(zhì)的單克隆抗體的重組產(chǎn)生確定包含單個單克隆抗體的每個孔的正確全長抗體序列，并且使用Qiagen固相 方法制備小量制備DNA。這種DNA隨后用于轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞，以產(chǎn)生重組全長抗體。對粗 抗體產(chǎn)物就抗原識別和功能性質(zhì)進(jìn)行測試，以證實在重組抗體蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的最初特征。 合適時，完成大規(guī)模瞬時哺乳動物轉(zhuǎn)染,并且通過蛋白質(zhì)A親和層析法純化抗體。使用標(biāo)準(zhǔn) 方法(例如Biacore)評估Kd，以及在效價測定法中評估IC50。實施例7 結(jié)合所需抗原例如HuTNF a或IL 6的抗體的制備通過使用本文描述的抗體選擇方案，可以產(chǎn)生顯示TNF-a或?qū)τ贗L-6或另一 種所需抗原的有效功能拮抗的抗體集合。抗體闡明多種表位，并且因此可以提供關(guān)于抗 體的有用備選物或抗體的有用輔助，所述抗體靶向先前鑒定關(guān)于特定抗原的表位，例如在 HuTNF-a、tnf-a表位的情況下，例如Remieade (英夫利昔單抗)。在IL-6或TNF- a的特定情況下，可以采用篩選方法以鑒定結(jié)合備選IL-6或 TNF-a表位，同時保留顯著的功能拮抗的抗體。例如,在TNF-a的情況下,在初次抗原識 別篩選后，對陽性BCC孔可以就針對TNF-a的功能拮抗以及表位競爭進(jìn)行測試，例如與英 夫利昔單抗競爭。獨特的表位識別可以通過ForteBio Octet抗體-TNF-a結(jié)合競爭研究 來確定。追蹤顯示功能活性以及缺乏競爭的BCC孔,并且回收在這些孔中存在的抗體的編 碼序列。大多數(shù)回收序列將顯示最初靶特征有效抗原識別、功能拮抗和不同的表位識別。 因此，所得到的抗體集合確立了與有效功能拮抗相關(guān)的多個新型表位區(qū)域。在通過引用合 并入本文的臨時申請中用IL 6證實了相似結(jié)果。免疫接種策略:使用TNF- a _#210-TA)和人IL-6免疫接種兔，如2007年5月21日提交且通 過引用整體合并入本文的臨時專利申請美國序列號60/924，551和60/924, 551中描述的?？贵w選ff丨商Iti平估抗原識別測定法可以通過其中描述的方案對于TNF- a或人IL-6進(jìn)行測定。功能滴度評估可以如引用的臨時申請中所述的測定樣品的功能活性。例如，在分別地tnf-a的 情況下，在圓底96孔板中,加入以1 100稀釋(在所述培養(yǎng)基中)的血清樣品，隨后為跨 越平板的1 10稀釋(列2-10,列11僅是用于TNF-a對照的培養(yǎng)基)，50 11 :[/孔,5次重 復(fù)(行B-F,行G僅是用于本底對照的培養(yǎng)基)。將50 u 1/孔包含以最終EC50的4倍濃度 的TNF- a的培養(yǎng)基(濃度先前對于每個批次進(jìn)行測定)和1 U g/ml放線菌素D加入所有 樣品孔中，除行F外。使平板在37°C下溫育1小時。 在1小時,將50 11 1血清/kg復(fù)合物和對照轉(zhuǎn)移至包含50 11 1/孔以固定密度(終 體積100 u 1/孔)應(yīng)答細(xì)胞的96孔平底平板,并且在37°C下溫育24小時。(使列1和12 以及行A和H充滿200 u 1培養(yǎng)基，以防止蒸發(fā)及造成邊緣效應(yīng)。)在24小時，根據(jù)制造商方案，將20 u 1/孔CellTiter96試劑(Promega)加入所有 測試孔，并且使平板在37°C下溫育2小時。2小時后,使平板輕輕振蕩以允許測試孔中的均 勻。在490nm波長處對平板進(jìn)行讀數(shù)。使用Graph Pad Prizm(使用非線性S形劑量/應(yīng) 答曲線)繪制0D與稀釋度的比較，并且測定功能滴度。組織收獲
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如上文引用的臨時申請中所述收獲兔脾、淋巴結(jié)和全血，加工且冷凍。B mmmm (BCC)如通過引用合并的臨時專利申請中所述制備B細(xì)胞培養(yǎng)物。 抗原識別篩選急匕活.ft難如引用的臨時申請中所述執(zhí)行功能活性篩選。例如，在TNF-a的情況下，通過 WEH:[細(xì)胞毒性測定法對其進(jìn)行測定。對來自一塊或多塊主平板的上清液在TNF-a剌激的 WEHI細(xì)胞毒性測定法(如上文所述)中作為單個點進(jìn)行測試。與其中所述相同整潔的測試 上清液。對干重體的次級功能活件測丨定法誦1寸用huTNF-a孫理的HUVEC細(xì)朐陽.斷 丨丄-6表汰TNF-a或IL-6特定測定法可以如通過引用合并如本文的相同臨時專利申請中所 述來實現(xiàn)。例如，在TNF-a的情況下，將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)常規(guī)維持在內(nèi)皮生長 培養(yǎng)基(EGM)培養(yǎng)基和合適的HUVEC補充物(Cambrex)中。在測定當(dāng)天，通過臺盼藍(lán)測定 HUVEC存活力。將細(xì)胞以5E05/ml重懸浮于合適體積的測試所需的培養(yǎng)基中(100 u !/孔)。 使細(xì)胞鋪平板在96孔平底培養(yǎng)平板的中間孔中，并且將200 u 1培養(yǎng)基加入所有外部孔中， 以防止蒸發(fā)。使平板在37tTF溫育24小時。在24小時，在EGM中以4倍所需終濃度制備合適抗體稀釋物。(起始抗體濃度為 1 U g/ral ；跨越平板執(zhí)行1 3稀釋，除最后1行外。)將相同體積的在EGM中的rhuTNF- a (4 倍所需終濃度)加入孔中。使平板在37°C下溫育1小時，以形成抗體/抗原復(fù)合物。在1 小時，取出來自HUVEC培養(yǎng)平板的50 11 1培養(yǎng)基并棄去。加入50 11 1 Ab-Ag混合物，并且使 平板在37°C下溫育48小時。包括標(biāo)準(zhǔn)陽性和陰性對照在48小時,通過ELISA評估條件培養(yǎng)基丨丄-6水平。用1 u g/ml羊抗人huIL-6以 50u 1/孔包被Immulon平板,在4°C下過夜,或在室溫下1小時。將平板在PBS+0. 5% Tween 20中在平板洗滌器(200 11 1/孔；3次)中進(jìn)行洗滌。用200 u 1/孔FSG在室溫下封閉平板 1小時。抽吸封閉溶液,并印跡平板。設(shè)定huIL-6標(biāo)準(zhǔn)，以lyg/ml開始并跨越平板1 3 稀釋(所有稀釋在FSG中進(jìn)行)。將來自HUVEC培養(yǎng)的樣品加入在標(biāo)準(zhǔn)曲線下的孔中，并且 在室溫下溫育1小時。重復(fù)洗滌。將1 U g/ml人源化抗體(抗huIL-6)以50 u 1/孔加入 平板中，并且在室溫下溫育1小時。重復(fù)洗滌。將以1 5000稀釋的次級抗人IgG Fc HRP 以50 yl/孔加入，并且在室溫下溫育45分鐘。重復(fù)洗滌。測定用SOiil/孔3，3' ,5,5' 四乙基聯(lián)苯胺(TMB)顯色最少5分鐘。用50 u 1/孔HC1終止反應(yīng),并且平板在450膽處在 平板閱讀器中進(jìn)行讀數(shù)。使用Graph Pad Prizm分析數(shù)據(jù)。B細(xì)胞回收如上文引用的臨時中請中所述執(zhí)行關(guān)于huIL-6和huTNF- a的病灶方案。實施例8 根據(jù)本發(fā)明的示例性人源化兔抗體(對IL-6特異)的制備使用本文描述和圖1中示意性描繪的人源化策略人源化衍生自兔抗huIL-6抗體 的重鏈和輕鏈，所述重鏈和輕鏈如通過引用合并的臨時專利申請中所述且根據(jù)前述實施例 產(chǎn)生。使用BLAST針對人種系序列文庫篩選示例性兔抗IL 6抗體的可變輕鏈區(qū)(包含這種IL-6特異性抗體的FR1到FR3結(jié)束的區(qū)域),并且鑒定相對于這個文庫中的其他人種系 序列，與其具有顯著同源性的3個種系序列，即Vl-6、Vl-27和V1-5。發(fā)現(xiàn)種系序列V1-6顯 示與兔輕鏈可變序列最大的序列同一性，并且因此選擇作為原材料以產(chǎn)生2種人源化輕鏈 形式,在圖3中指定為“aggres”和“consrv”?；旧贤ㄟ^用如該圖頂部中所示的來自兔親 本抗IL-6CDR1和CDR2區(qū)域的特定選擇性決定殘基修飾V1-6人種系序列，并通過進(jìn)一步摻 入少數(shù)(consrv形式)或無供體(兔)FR殘基(aggres形式)，衍生這些序列。特別地，如 圖3中所示，產(chǎn)生1條人源化輕鏈(在該圖中稱為“aggres”)，其中不摻入兔FR殘基，并且 通過融合對于兔輕鏈CDR3的VI-6序列和與兔輕鏈FR4序列同源的人FR4序列。產(chǎn)生在相 同圖中描述的稱為“ consrv"的另一個形式,其包含來自兔輕鏈FR1的2個FR殘基。
使用相似的人源化方法和如圖1中示意性描繪的，將包含CDR1和CDR2以及相關(guān) FR區(qū)域的優(yōu)選抗IL-6抗體的可變區(qū)用于使用BLAST方法針對人種系序列文庫進(jìn)行篩選， 以便鑒定與其最同源的人種系序列。如該圖中所示,這個篩選鑒定了包含圖2中的序列的 3個同源的人種系序列V3-66、V3-53和V3-23。最同源的人種系序列V3-23再次用作原材 料，以產(chǎn)生通過摻入重鏈的CDR1和CDR2區(qū)域的特定選擇性決定殘基相似地修飾的2種人 源化形式，有利于相對應(yīng)人CDR1和CDR2殘基，進(jìn)一步摻入少數(shù)不連續(xù)的兔FR殘基且與兔 CDR3區(qū)域并融合同源人FR4區(qū)域。如圖3底部中所示,所得到的2種人源化重鏈再次被稱 為“aggres”和“consrv，，?；诒葘π蛄?可以看出這些人源化形式僅在"consrv"形式中 存在幾個兔FR3殘基的方面不同，所述殘基在“aggres”中不存在。與人種系序列比較，這 2種序列僅在相對少數(shù)的殘基處改變,并且因此在人中應(yīng)是基本上無免疫原性的。 發(fā)現(xiàn)包含“aggres”人源化重鏈和輕鏈以及"consrv"的人源化抗IL-6抗體具有 與親本兔抗體非常近似的IL-6結(jié)合親和力。這驗證了本發(fā)明的人源化策略的功效,并且進(jìn)實施例9 根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的示例性人源化兔抗體(對h IL-6和hTNF- a特異)的 保留親和力性質(zhì)如下文討論的，本發(fā)明的顯著優(yōu)點是主題人源化方法可重現(xiàn)地產(chǎn)生具有高親和力 的人源化抗體，即結(jié)合親和力與親本兔或由其衍生的嵌合抗體的結(jié)合親和力相當(dāng)。這通過 圖4中包含的解離常數(shù)舉例說明。在其中，2種不同兔嵌合抗hIL 6抗體的解離常數(shù)與由其 衍生的3和2種不同人源化抗體分別比較,所述人源化抗體都使用本發(fā)明方法產(chǎn)生。根據(jù) 該圖中包含的數(shù)據(jù)，可以看出從由其衍生的嵌合到人源化變體，解離常數(shù)在大多數(shù)情況下 大致未改變。在最壞的情況下，解離常數(shù)減少約3. 5倍。這與一般導(dǎo)致抗原結(jié)合親和力基 本喪失的其他人源化方法形成對比，即相對于人源化形式,與親本相差1個數(shù)量級或更多。此外,相同的圖4包含使2種不同嵌合兔抗hTNF-a抗體與使用本發(fā)明的人源化 方法由其衍生的人源化抗體的解離常數(shù)比較的數(shù)據(jù)。相似地，親本兔衍生的嵌合抗hTNF- a 抗體和人源化抗體的解離常數(shù)基本上相同。這些結(jié)果舉例說明主題人源化方法的重現(xiàn)性， 即它們用于人源化不同兔抗體序列和用于人源化對不同抗原特異的抗體的廣泛應(yīng)用性。實施例10 根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的示例性人源化兔抗體(對hIL-6和hTNF- a特異) 的保留功能性質(zhì)兔抗體相當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合常數(shù)?；诖?預(yù)測親本嵌合抗體和由其衍生的人源化變體的拮抗 性質(zhì)將同樣是相當(dāng)?shù)摹Ｊ聦嵣?，這些本發(fā)明人的預(yù)測已得到證實。如圖5和6中所示，本發(fā)明人使衍生自兔抗IL 6抗體的2種不同嵌合抗體分別與 衍生自每種的2種不同人源化抗體的拮抗性質(zhì)比較。在檢測這些抗hIL-6抗體對h:[L 6依 賴性細(xì)胞增殖的作用的測定法——用于檢測拮抗活性的公認(rèn)功能測定法中比較拮抗。從圖 5和6中的數(shù)據(jù)可以看出，對于由其衍生的嵌合和人源化抗體，對hIL-6依賴性細(xì)胞增殖的 抑制基本上相同。(細(xì)胞增殖數(shù)據(jù)曲線在不同抗體濃度下基本上重疊或非常相似。)此外，如圖7中所示,本發(fā)明人使衍生自兔抗hTNF-a抗體的對hTNF-a特異的嵌 合抗體與由其衍生的人源化抗體的拮抗性質(zhì)比較，所述人源化抗體使用主題人源化方法產(chǎn) 生。在檢測這些抗hTNF-a抗體對hTNF-a依賴性細(xì)胞毒性的作用的測定法——用于檢測 抗hTNF-a抗體拮抗活性的公認(rèn)功能測定法中比較拮抗。從圖7中的數(shù)據(jù)可以看出，對于 由其衍生的嵌合和人源化抗hTNF-a抗體,hTNF-a依賴性細(xì)胞毒性的抑制非常相似。(細(xì) 胞毒性數(shù)據(jù)曲線在不同抗體濃度下基本上重疊或非常相似。)這些實施例意欲是本發(fā)明及其固有優(yōu)點的示例。事實上，本發(fā)明的人源化方法可 以用于人源化對任何所需抗原具有特異性的任何兔抗體(或緊密相關(guān)物種的抗體)。優(yōu)選 地,這些抗體將對適合于人治療的靶抗原特異，并且對于該靶抗原具有高親和力。例如,此 種抗體可以特別包括2008年5月21日提交的美國序列號60/924，550和60/924, 551以及 PCT申請中公幵的任何兔抗體重鏈和輕鏈序列，所述臨時和PCT申請分別具有代理人案號 67858. 901902 和 67858. 701802,名稱為 IL-6Antibodies and Use Thereof and Anti-TNF Antibodies，所述臨時和PCT申請包括其中報告的所有抗體序列通過引用整體合并入本 文。此外，為了進(jìn)一步描述和示例請求保護(hù)的人源化方法和由此可獲得的人源化抗體產(chǎn)物， 關(guān)于這2個PCT申請的序列表在本文權(quán)利要求前。這些序列表包含本發(fā)明方法產(chǎn)生的對 IL-6和TNF-a特異的兔抗體序列和根據(jù)人源化形式。此外,本發(fā)明的人源化方案可以用于人源化任何可獲得的兔重鏈或輕鏈序列，即 針對任何所需抗原,例如肽、蛋白質(zhì)、糖蛋白、半抗原、碳水化合物等。優(yōu)選地,抗原是人抗原 或來自感染或引起或涉及人中的疾病的試劑的抗原。優(yōu)選地，兔抗體將衍生自通過前述ABC 篩選方案分離的兔B細(xì)胞。
權(quán)利要求
包含至少一個重鏈和輕鏈多肽的人源化抗體或抗體片段，其中所述輕鏈多肽是人源化輕鏈多肽，其包含至少下述(i)跨越FR1的第一個殘基到FR3的末端的氨基酸殘基，包括選擇自人種系序列文庫的人輕鏈種系序列的CDR1和CDR2區(qū)域，所述選擇基于其跨越FR1到FR3的所選擇的氨基酸殘基(相對于文庫中的其他人輕鏈序列)與待人源化的對所需抗原具有特異性的親本兔抗體輕鏈的相對應(yīng)氨基酸殘基的更大同源性(序列同一性百分比)；和(ii)進(jìn)一步其中相對應(yīng)相同親本兔抗體的輕鏈中的“選擇性決定殘基”在CDR1和CDR2中的CDR殘基用相對應(yīng)兔選擇性決定殘基替換；(iii)包含相同親本兔抗體的整個CDR3區(qū)域的氨基酸殘基；(iv)基于其與相同親本兔抗體的輕鏈中包含的相對應(yīng)FR4區(qū)域的更大同源性(序列同一性)，包含衍生自人種系序列文庫的抗體輕鏈的整個FR4區(qū)域的氨基酸殘基；和(v)其中所選擇的同源人FR區(qū)域中的人FR1、FR2、FR 3和FR4區(qū)域的少數(shù)或無FR殘基用相對應(yīng)兔FR殘基替代。
2.權(quán)利要求1的人源化抗體,其中所述親本兔抗體對人、病毒或細(xì)菌抗原特異。
3.權(quán)利要求2的人源化抗體,其中所述人抗原是細(xì)胞因子、生長因子、激素或癌抗原。
4.權(quán)利要求1的人源化抗體,其對IL-6、海帕西啶、肝細(xì)胞生長因子或TNF多肽特異。
5.核酸序列，其編碼權(quán)利要求1、2、3或4任一項中所述的人源化抗體中包含的人源化 抗體輕鏈。
6.載體,其包含根據(jù)權(quán)利要求5的核酸序列。
7.細(xì)胞,其包含根據(jù)權(quán)利要求6的載體。
8.權(quán)利要求7的細(xì)胞，其選自酵母、細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞。
9.權(quán)利要求8的細(xì)胞，其是二倍體酵母細(xì)胞。
10.權(quán)利要求9的細(xì)胞，其是畢赤酵母屬或其他甲醇利用二倍體酵母。
11.包含至少一個重鏈和輕鏈多肽的人源化抗體或抗體片段，其中所述重鏈多肽是人 源化重鏈多肽，其包含至少下述(i)跨越FR1的第一個殘基到FR3的末端的氨基酸殘基， 包括由選擇自人種系序列文庫的人種系序列編碼的CDR1和CDR2區(qū)域，所述選擇基于其跨 越FR1到FR3的所選擇的氨基酸殘基(相對于文庫中的其他人種系序列)與待人源化的對 所需抗原具有特異性的親本兔抗體重鏈的相對應(yīng)氨基酸殘基的更大同源性(序列同-一注 百分比)；和(ii)進(jìn)一步其中對應(yīng)于相同親本兔抗體的重鏈的CDR1和CDR2區(qū)域中的“選 擇性決定殘基”在人重鏈的CDR1和CDR2區(qū)域中的CDR殘基用兔重鏈的CDR1和CDR2區(qū)域 中包含的相對應(yīng)重鏈選擇性決定殘基替換；(iii)包含相同親本兔抗體的整個CDR3區(qū)域的 氨基酸殘基；(iv)基于其與相同親本兔抗體的重鏈中包含的相對應(yīng)FR4區(qū)域的更大同源性 (序列同一性)，衍生自人種系序列文庫的FR4區(qū)域；和(v)其中人重FR1區(qū)域的最后1-3個 氨基酸任選用相對應(yīng)兔重鏈FR1殘基的末端1-3個氨基酸替換；和/或人重鏈構(gòu)架2區(qū)域 的末端氨基酸任選用兔重鏈構(gòu)架2的相對應(yīng)末端氨基酸殘基替換；和/或來自兔重鏈CDR2 的末端的第4個氨基酸(一般是色氨酸)任選用相對應(yīng)人CDR2殘基(一般是絲氨酸)替 換；和(vi)其中所選擇的同源人FR區(qū)域的少數(shù)或無其余FR殘基用相對應(yīng)兔FR殘基替代。
12.權(quán)利要求11的人源化抗體，其中所述親本兔抗體對人、病毒或細(xì)菌抗原特異。
13.權(quán)利要求12的人源化抗體,其中所述人抗原是細(xì)胞因子、生長因子、激素或癌抗
14.權(quán)利要求11的人源化抗體，其對IL-6、海帕西啶、肝細(xì)胞生長因子或TNF多肽特
15.核酸序列，其編碼權(quán)利要求11、12、13或14任一項中所述的人源化抗體中包含的人 源化抗體重鏈。
16.載體,其包含根據(jù)權(quán)利要求15的核酸序列。
17.細(xì)胞,其包含根據(jù)權(quán)利要求16的載體。
18.權(quán)利要求17的細(xì)胞，其選自酵母、細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞。
19.權(quán)利要求18的細(xì)胞,其是二倍體酵母細(xì)胞。
20.權(quán)利要求19的細(xì)胞,其是畢赤酵母屬或其他甲醇利用二倍體酵母。
21.權(quán)利要求1的人源化抗體,其包含至少一個人源化輕鏈多肽且進(jìn)--步包含至少一 個重鏈多肽，其中所述至少一個重鏈?zhǔn)侨嗽椿劓湺嚯?，其包含至少下?i)跨越FR1的 第一個殘基到FR3的末端的氨基酸殘基,包括由選擇自人種系序列文庫的人種系序列編碼 的CDR1和CDR2區(qū)域,所述選擇基于其跨越FR1到FR3的所選擇的氨基酸殘基(相對于文 庫中的其他人種系序列)與待人源化的對所需抗原具有特異性的親本兔抗體重鏈的相對 應(yīng)氨基酸殘基的更大同源性(序列同一性百分比)；和(ii)進(jìn)一步其中對應(yīng)于相同親本兔 抗體的重鏈的CDR1和CDR2區(qū)域中的“選擇性決定殘基”在人重鏈的CDR1和CDR2區(qū)域中的 ⑶R殘基用兔重鏈的CDR1和⑶R2區(qū)域中包含的相對應(yīng)重鏈選擇性決定殘基替換；(iii)包 含相同親本兔抗體的整個CDR3區(qū)的氨基酸殘基；(iv)基于其與相同親本兔抗體的重鏈中 包含的相對應(yīng)FR4區(qū)域的更大同源性(序列同一性)，衍生自人種系序列文庫的FR4區(qū)域； 和Cv)其中人重FR1區(qū)域的最后1-3個氨基酸任選用相對應(yīng)兔重鏈FR1殘基的末端1-3個 氨基酸替換；和/或人重鏈構(gòu)架2區(qū)域的末端氨基酸任選用兔重鏈構(gòu)架2的相對應(yīng)末端氨 基酸殘基替換；和！或來自兔重鏈CDR2的末端的第4個氨基酸(一般是色氨酸)任選用相 對應(yīng)人CDR2殘基(一般是絲氨酸)替換；和(vi)其中所選擇的同源人FR區(qū)域的少數(shù)或無
22.權(quán)利要求21的人源化抗體,其對IL-6、海帕西啶、肝細(xì)胞生長因子或TNF多肽特
23.用于產(chǎn)生人源化輕鏈抗體序列的人源化策略，其包括F述步驟(i)從與所需抗原特異性結(jié)合的兔抗體獲得編碼兔輕鏈抗體序列的DNA，并且鑒定跨 越所包括的構(gòu)架1(FR1)開始到構(gòu)架3(PR3)結(jié)束的氨基殘基；(ii)使用跨越FR1開始到FR3結(jié)束序列的所述兔輕鏈抗體氨基酸序列進(jìn)行針對包含人 輕鏈抗體可變序列的文庫的同源性搜索，并且鑒定相對于其他人輕鏈抗體可變序列，對其 顯示基本序列同源性的人輕鏈抗體序列；(iii)在兔和人輕鏈序列中鑒定對應(yīng)于FRl、FR2、F:R3、a)Rl、CDR2區(qū)域的排列及其特定 殘基,并且比對在兔和所選擇的人抗體輕鏈中的這些不連續(xù)區(qū)域；(iv)構(gòu)建DNA或氨基酸序列，其中所選擇的同源人輕鏈序列的CDR1和CDR2區(qū)域用兔 輕鏈序列的CDR1和CDR2區(qū)域中包含的相對應(yīng)選擇性決定殘基替代；(v)將編碼或包含兔CDR3輕鏈抗體序列的相對應(yīng)氨基酸殘基的DNA序列或多肽進(jìn)一步 附著至通過步驟(iv)獲得的DNA或氨基酸序列；(vi)進(jìn)一步選擇與兔輕鏈中包含的FR4同源且優(yōu)選與其相差至多2-4個氨基酸殘基的 人輕鏈構(gòu)架4區(qū)域(FR4)，并且使編碼所述人FR4的DNA序列或所述人FR4的相對應(yīng)氨基殘基附著至在步驟(v)后獲得的DNA或氨基酸序列上；和(vii)合成編碼或包含步驟⑴到(vi)中得到的人源化的兔輕鏈序列的DNA或氨基酸 序列。
24.權(quán)利要求23的人源化策略，其中所述起始FR1的氨基酸是在所述兔輕鏈信號序列 后的第一個氨基酸。
25.權(quán)利要求23的人源化策略，其中所述信號序列包含約20-22個氨基酸殘基。
26.權(quán)利要求23的人源化策略，其中所述人輕鏈序列從包含人種系可變輕鏈序列的文 庫中鑒定。
27.權(quán)利要求23的人源化策略,其中所述兔序列中的FR1、FR2、FR3以及CDR1和CDR2 區(qū)域通過比對兔FR1、FR2、FR3以及CDR1和CDR2區(qū)域與相對應(yīng)人輕鏈FR1、FR2、FR3、CDR1、 CDR2區(qū)域而進(jìn)行鑒定。
28.權(quán)利要求23的人源化策略,其中所述兔CDR3區(qū)域包含9-1.5個氨基酸殘基。
29.權(quán)利要求23的人源化策略,其中所述兔輕鏈FR4區(qū)域包含11個氨基酸殘基。
30.權(quán)利要求23的人源化策略，其中所述FR3以YYC結(jié)束。
31.權(quán)利要求23的人源化策略，其中所述兔輕鏈中的FR4以FGGGG開始。
32.權(quán)利要求31的人源化策略,其中所述兔FM區(qū)域以WKR氨基酸序列開始。
33.權(quán)利要求23的人源化策略,其中所述所選擇的人FR4輕鏈序列包含F(xiàn)GGGTKVEIKR。
34.權(quán)利要求23的人源化策略，其中所述所得到的人源化的兔輕鏈在結(jié)合所需抗原的 人源化抗體或人源化抗體片段制造中使用。
35.人源化的兔輕鏈可變氨基酸序列或編碼其的DNA,其根據(jù)權(quán)利要求23-24中任一項 產(chǎn)生。
36.權(quán)利要求35的人源化的兔輕鏈可變氨基酸序列或DNA序列，其對選自微生物抗原、 人抗原、病毒抗原和變應(yīng)原的抗原特異。
37.權(quán)利要求36的人源化的兔輕鏈可變氨基酸或DNA序列,其中所述人抗原選自人自 身抗原、細(xì)胞因子、受體蛋白質(zhì)、酶、激素、受體配體、類固醇、生長因子和癌基因。
38.抗體或抗體片段，其包含根據(jù)權(quán)利要求23-24中任一項產(chǎn)生的人源化的兔輕鏈可 變序列。
39.根據(jù)權(quán)利要求23-24中任一項產(chǎn)生的人源化的兔輕鏈或包含其的抗體,其與效應(yīng) 物部分附著。
40.權(quán)利要求39的人源化的兔輕鏈多肽，其中所述效應(yīng)物部分選自藥物、毒素、酶、放 射性核素、熒光團(tuán)、細(xì)胞因子、親和標(biāo)記和易位肽。
41.根據(jù)權(quán)利要求23-24中任一項產(chǎn)生的人源化的兔輕鏈多肽或包含其的抗體或編碼 其的DNA,其衍生自特異性結(jié)合細(xì)胞因子、生長因子或腫瘤特異性多肽的兔抗體。
42.權(quán)利要求41的人源化的兔輕鏈多肽或包含其的抗體，其衍生自特異性結(jié)合IL-6、 TNF、VEGF、IL-12、海帕西啶或肝細(xì)胞生長因子的兔抗體。
43.用于從兔重鏈抗體序列產(chǎn)生人源化重鏈抗體序列的人源化策略，其包括下述步驟(i)從與所需抗原特異性結(jié)合的兔抗體獲得兔重鏈抗體序列，并且鑒定跨越所包括的 構(gòu)架1(FR1)開始到構(gòu)架結(jié)束的氨基殘基；(ii)使用跨越FR1開始到FR3結(jié)束序列的所述兔重鏈抗體氨基酸序列進(jìn)行同源性搜 索(例如，通過包含人種系抗體序列的文庫的BLAST搜索)，并且鑒定與其同源的人重鏈抗 體序列，即優(yōu)選在氨基酸水平上與其具有至少80% -90%同一性；(iii)在兔和人重鏈序列中鑒定對應(yīng)于FR1、FR2、FR3、CDR1、CD:R2區(qū)域的排列及其特定 殘基，并且針對所選擇的同源人抗體重鏈的相對應(yīng)區(qū)域比對兔的這些不連續(xù)區(qū)域；(iv)構(gòu)建DNA或氨基酸序列，其中所選擇的同源人重鏈序列的CDR1和CDR2區(qū)域中的 殘基用兔重鏈序列的相對應(yīng)CDR1和CDR2區(qū)域中包含的選擇性決定殘基替代,并且任選用 兔重鏈FR1的相對應(yīng)末端1-3個氨基酸替換人重FR1區(qū)域的末端1-3個氨基酸；和/或任 選用兔重鏈構(gòu)架2的相對應(yīng)末端氨基酸殘基替換人重鏈構(gòu)架2區(qū)域的末端氨基酸,和/或 任選用相對應(yīng)人CDR2殘基(一般是絲氨酸)替換來自兔重鏈CDR2的末端的第4個氨基酸 (一般是色氨酸)；(v)將編碼或具有兔重鏈CDR3的相對應(yīng)氨基酸殘基的DNA序列進(jìn)一步附著至通過步驟 (iv)獲得的DNA或氨基酸序列,所述氨基酸殘基包含在相同的兔重鏈抗體序列中；(vi)進(jìn)一步選擇與其同源的人重鏈構(gòu)架4區(qū)域(FR4)(優(yōu)選與人源化的兔抗體重鏈序 列中包含的FR4相差至多4個氨基酸殘基)，并且使編碼所述所選擇的同源人FR4的DNA序 列或所述人FM的相對應(yīng)氨基殘基附著至在步驟(v)后獲得的DNA或氨基酸序列上；和(vii)合成編碼或包含步驟(i)到(vi)中得到的人源化的兔重鏈序列的DNA或氨基酸 序列。
44.權(quán)利要求43的人源化策略，其中所述起始FR1的氨基酸是在所述兔重鏈信號序列 后的第一個氨基酸。
45.權(quán)利要求43的人源化策略，其中所述FR3的結(jié)束是在FR1的第一個殘基后約 95-100個氨基酸殘基。
46.權(quán)利要求43的人源化策略，其中所述信號序列包含不超過19個氨基酸殘基。
47.權(quán)利要求43的人源化策略,其中所述同源的人重鏈序列通過在抗體成熟前獲得的 人種系序列的BLAST搜索進(jìn)行鑒定。
48.權(quán)利要求43的人源化策略，其中所述所選擇的同源人重鏈與所述兔輕鏈的相對應(yīng) 區(qū)域具有至少90-95%序列同一性。
49.權(quán)利要求43的人源化策略,其中所述兔重鏈序列中的FR1、FR2,FR3以及CDR1和 CDR2區(qū)域通過比對兔FR1、FR2、FR3以及CDR1和CDR2區(qū)域與相對應(yīng)人重鏈FR1、FR2、FR3、 CDRUCDR2區(qū)域而進(jìn)行鑒定。
50.權(quán)利要求43的人源化策略，其中用所述兔FR1的相對應(yīng)3個殘基替換所述人FR1 的最后3個氨基酸殘基。
51.權(quán)利要求50的人源化策略,其中所述兔FR1中的3個殘基在ser-gly后。
52.權(quán)利要求43的人源化策略，其進(jìn)一步包括用兔FR2的相對應(yīng)末端氨基酸殘基替換 所述人FR2的末端氨基酸殘基。
53.權(quán)利要求52的人源化策略，其中所述末端兔FR2殘基包含任選在異亮氨酸殘基后 的甘氨酸。
54.權(quán)利要求43的人源化策略，其進(jìn)一步包括用絲氨酸殘基更換位于距離所述兔CDR2 的末端約4個殘基的色氨酸殘基。
55.權(quán)利要求43的方法,其中所述兔CDR3包含5-19個氨基酸殘基。
56.權(quán)利要求43的人源化策略，其中所述兔⑶R3隨后為殘基WG“X”G，其中“X”優(yōu)選 是Q或P。
57.權(quán)利要求43的人源化策略,其中所述兔FR4包含1.1個氨基酸殘基。
58.權(quán)利要求57的人源化策略,其中所述兔FR4包含WGQGTLVTVSS。
59.通過權(quán)利要求43-58中任一項產(chǎn)生的人源化的兔重鏈可變氨基酸序列或DNA序列， 其衍生自對選自微生物抗原、人抗原、病毒抗原和變應(yīng)原的抗原特異的兔抗體。
60.權(quán)利要求59的人源化的兔重鏈可變氨基酸序列或DNA序列,其對人抗原特異。
61.權(quán)利要求59的人源化的兔重鏈可變氨基酸序列或DNA序列,其中所述人抗原選自 人自身抗原、細(xì)胞因子、受體蛋白質(zhì)、酶、激素、受體配體、類固醇、生長因子和癌基因。
62.抗體或抗體片段,其包含根據(jù)權(quán)利要求43-58中任一項產(chǎn)生的人源化的兔重鏈可 變序列。
63.根據(jù)權(quán)利要求43-58中任一項產(chǎn)生的人源化的兔重鏈,其與效應(yīng)物部分附著。
64.權(quán)利要求63的人源化的兔重鏈多肽，其中所述效應(yīng)物部分選自藥物、毒素、酶、放 射性核素、熒光團(tuán)、細(xì)胞因子、親和標(biāo)記和易位肽。
65.根據(jù)權(quán)利要求43-58中任一項產(chǎn)生的人源化的兔重鏈多肽或編碼其的DNA,其衍生 自特異性結(jié)合細(xì)胞因子、生長因子或腫瘤特異性多肽的兔抗體。
66.權(quán)利要求65的人源化的兔重鏈多肽，其衍生自特異性結(jié)合IL-6、TNF_a、VEGF_ a、 IL-12、海帕西啶或肝細(xì)胞生長因子的兔抗體。
67.權(quán)利要求64的人源化的兔重鏈多肽,其是去糖基化的。
68.人源化的兔抗體,其包含根據(jù)權(quán)利要求23-34中至少--項產(chǎn)生的至少--條人源化 的兔輕鏈，和根據(jù)權(quán)利要求43-58中的一項產(chǎn)生的至少一條人源化的兔重鏈。
69.權(quán)利要求68的人源化的兔抗體，其包含人恒定結(jié)構(gòu)域。
70.權(quán)利要求69的人源化的兔抗體,其選自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。
71.權(quán)利要求68的人源化的兔抗體,其結(jié)合選自人抗原、細(xì)菌抗原、病毒抗原、病原體、 寄生蟲、酵母抗原和真菌抗原的抗原。
72.免疫治療或免疫診斷方法，其包括施用人源化抗體，其中所述改善包括施用根據(jù)權(quán) 利要求1 5、11 14、21或22中任一項的人源化抗體或抗體片段。
73.權(quán)利要求72的方法,其包括改善或減少與IL-6或TNF相關(guān)的疾病或病癥的癥狀。
74.權(quán)利要求73的方法，其中與IL-6或TNF-a相關(guān)的所述疾病或病癥是癌癥或炎性
75.權(quán)利要求73的方法,其中所述抗體是抗IL-6抗體，并且用于治療或診斷IL-6相關(guān) 的疲勞、惡病質(zhì)或關(guān)節(jié)炎的預(yù)后。
76.權(quán)利要求73的方法，其中與IL-6相關(guān)的所述疾病或病癥選自四肢無力、運動性 疲勞、癌癥相關(guān)性疲勞、炎性疾病相關(guān)性疲勞、慢性疲勞綜合征、癌癥相關(guān)性惡病質(zhì)、心臟 病相關(guān)性惡病質(zhì)、呼吸相關(guān)性惡病質(zhì)、腎相關(guān)性惡病質(zhì)、年齡相關(guān)性惡病質(zhì)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎、全身性紅斑狼瘡(SLE)、全身性幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、牛皮癬性關(guān)節(jié)病、強(qiáng)直性脊 柱炎、炎性腸病(IBD)、風(fēng)濕性多肌痛、巨細(xì)胞動脈炎、自身免疫性脈管炎、移植物抗宿主病 (GVHD)、Sjogren’ s綜合征、成人斯蒂爾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、佩吉特骨病、骨關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性骨髓瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏 淋巴瘤、前列腺癌、白血病、腎細(xì)胞癌、多中心性卡斯?fàn)柭?、卵巢癌、癌癥化學(xué)治療中的抗 藥性、癌癥化學(xué)治療毒性、缺血性心臟病、動脈粥樣硬化、肥胖癥、糖尿病、哮喘、多發(fā)性硬化 癥、阿爾茨海默氏病和腦血管疾病。
77.權(quán)利要求73的方法,其中與TNF相關(guān)的所述疾病或病癥選自四肢無力、運動性 疲勞、癌癥相關(guān)性疲勞、炎性疾病相關(guān)性疲勞、慢性疲勞綜合征、癌癥相關(guān)性惡病質(zhì)、心臟 病相關(guān)性惡病質(zhì)、呼吸相關(guān)性惡病質(zhì)、腎相關(guān)性惡病質(zhì)、年齡相關(guān)性惡病質(zhì)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎、全身性紅斑狼瘡(SLE)、全身性幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、牛皮癬性關(guān)節(jié)病、強(qiáng)直性脊 柱炎、炎性腸病(IBD)、風(fēng)濕性多肌痛、巨細(xì)胞動脈炎、自身免疫性脈管炎、移植物抗宿主病 (GVHD)、Sjogren’ s綜合征、成人斯蒂爾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、骨 關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、佩吉特骨病、骨關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性骨髓瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏 淋巴瘤、前列腺癌、白血病、腎細(xì)胞癌、多中心性卡斯?fàn)柭?、卵巢癌、癌癥化學(xué)治療中的抗 藥性、癌癥化學(xué)治療毒性、缺血性心臟病、動脈粥樣硬化、肥胖癥、糖尿病、哮喘、多發(fā)性硬化 癥、阿爾茨海默氏病和腦血管疾病。
78.權(quán)利要求72的方法，其中所述人源化抗體或抗體片段在多倍體酵母培養(yǎng)物中表 達(dá),所述多倍體酵母培養(yǎng)物在培養(yǎng)基內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)且分泌至少10-25mg/升所述抗體,所述方 法包括(i)將至少一種表達(dá)載體引入單倍體酵母細(xì)胞內(nèi)，所述表達(dá)載體包含與啟動子和信號 序列可操作地連接的編碼所述人源化抗體或片段的一種或多種異源多核苷酸；(ii)通過交配或質(zhì)體融合從所述第一種和/或第二種單倍體酵母細(xì)胞產(chǎn)生多倍體酵(iii)選擇穩(wěn)定表達(dá)所述人源化抗體或片段的多倍體酵母細(xì)胞；和(iv)從所述多倍體酵母細(xì)胞產(chǎn)生穩(wěn)定的多倍體酵母培養(yǎng)物，所述多倍體酵母細(xì)胞在培 養(yǎng)基內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)至少10-25rag/升所述人源化抗體或片段。
79.權(quán)利要求78的方法，其中所述酵母選自下述屬Arxiozyma；Ascobotryozyma ； 固囊酵母屬；德巴利酵母屬；德克酵母屬；假囊酵母屬；伊莎酵母屬；Kazachstania ；克魯 維酵母屬；Kodamaea ；婁德羅酵母屬；管囊酵母屬；畢赤酵母屬；酵母屬；Saturnispora ； Tetrapisispora ；有孢圓酵母屬；擬威爾酵母屬和接合酵母屬。
80.權(quán)利要求79的方法,其中所述酵母屬是畢赤酵母屬。
81.權(quán)利要求80的方法，其中所述畢赤酵母屬的物種選自巴斯德畢赤酵母、甲醇畢赤 酵母和多形漢遜酵母(安格斯畢赤酵母)。
82.包含通過根據(jù)權(quán)利要求23-34或43-58中任一項產(chǎn)生的人源化抗體多肽的人源 化抗體或抗體片段,其中所述人源化抗體或片段以小于或等于Sxio—V^icrUxicnr1、 1 (T8M 人 5x 1 (T9M-1、1 (T9M 人 5x 1 (r10M 人 10—M-1、5x 1 (T111、1 (T111、5x 1 (T12M-1、1 (T12M-1、5x 1 (T13M 人 lO13!1或SxlOl1的解離常數(shù)(Kd)與抗原結(jié)合。
83.權(quán)利要求82的人源化抗體，其中所述抗體以小于或等于SxKr^M—1的解離常數(shù)(Kd) 與抗原結(jié)合。
84.權(quán)利要求82的人源化抗體，其中所述抗體以小于或等于lO^S^SxlO、-1、^)、-1、 5x10 6S]、10 6S\5xl0 7S 1或10 7S 1的離開速率(Koff)與抗原結(jié)合。
85.權(quán)利要求82的人源化抗體,其中所述親本兔抗體源于--種或多種兔B細(xì)胞群體。
86.權(quán)利要求82的人源化抗體，其中所述抗體抑制IL-6與IL-6R或TNF與其受體的結(jié)合°
87.權(quán)利要求86的人源化抗體,其中所述IL-6R是可溶性IL-6R(sIL-6R)。
88.權(quán)利要求86的人源化抗體,其中所述TNF受體(TNFR)是可溶性的。
89.載體，其表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1-22或82-88中任一項的人源化的兔。
90.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求89的載體。
91.權(quán)利要求90的宿主細(xì)胞,其中所述宿主細(xì)胞是屬于畢赤酵母屬的酵母細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于人源化兔重和輕可變區(qū)的新型和改良方法。所得到的人源化的兔重鏈和輕鏈以及包含其的抗體和抗體片段良好適合于在免疫治療和免疫診斷中使用，因為它們保留親本抗體的抗原結(jié)合親和力，并且基于其與人抗體序列極高水平的序列同一性，在人中應(yīng)是基本上無免疫原性的。本發(fā)明示例了用于制造治療性人源化的抗人TNF-α和抗人IL-6抗體的方案。
文檔編號C07K16/00GK101868477SQ200880022859
公開日2010年10月20日 申請日期2008年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月21日
發(fā)明者B·科瓦瑟維奇, J·萊瑟姆 申請人:奧爾德生物制藥公司