專利名稱：基于ercc1表達(dá)確定化療方案的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及有效用于醫(yī)學(xué)，特別是癌癥化療中的預(yù)測(cè)方法。更特別是，本發(fā)明涉及評(píng)估患者中的腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)。通過(guò)檢測(cè)人類中參與DNA修復(fù)的基因表達(dá)的mRNA，測(cè)定用靶定于DNA的化療劑，特別是以鉑制劑的方式破壞DNA的試劑治療的患者的存活。
背景技術(shù)：
當(dāng)正常細(xì)胞經(jīng)歷致癌性轉(zhuǎn)化并成為惡性細(xì)胞時(shí)癌癥發(fā)生。轉(zhuǎn)化的(惡性)細(xì)胞逃離可規(guī)定細(xì)胞表型并抑制細(xì)胞增殖的正常生理控制。個(gè)體機(jī)體中的轉(zhuǎn)化細(xì)胞因此增殖，形成腫瘤。當(dāng)發(fā)現(xiàn)腫瘤時(shí)，臨床目標(biāo)是選擇性地破壞惡性細(xì)胞，同時(shí)減輕在個(gè)體進(jìn)行治療過(guò)程中對(duì)正常細(xì)胞的任何損害。
化療方案是以對(duì)癌細(xì)胞具有選擇毒性(細(xì)胞毒性)的藥物的使用為基礎(chǔ)的。人們已經(jīng)研制出了很多類化療藥物，包括干擾核酸合成，蛋白合成，及其它重要代謝過(guò)程的藥物。這些通常被稱作抗代謝藥物。其它類的化療藥物是損害細(xì)胞的DNA。這些類藥物通常被稱作是基因毒性的。然而，個(gè)體腫瘤對(duì)預(yù)期化療藥物或藥物聯(lián)合的敏感性常常只能在治療的試驗(yàn)期之后才能準(zhǔn)確地測(cè)定。在不成功試驗(yàn)期投入的時(shí)間會(huì)在臨床處理侵入性惡性腫瘤時(shí)造成重大的危險(xiǎn)。
對(duì)細(xì)胞DNA損傷的修復(fù)是由細(xì)胞的酶促DNA修復(fù)機(jī)制進(jìn)行的一種重要生物過(guò)程。細(xì)胞基因組中的未修復(fù)病變可以阻礙DNA復(fù)制，損害新合成DNA的復(fù)制保真性和/或阻礙細(xì)胞存活所需基因的表達(dá)。因此，一般認(rèn)為基因毒性藥物對(duì)涉及DNA合成的活躍分裂的細(xì)胞比對(duì)靜止、不分裂的細(xì)胞毒性更強(qiáng)。然而，許多機(jī)體組織的正常細(xì)胞更靜止，并且不經(jīng)常重新進(jìn)入細(xì)胞周期和分裂。細(xì)胞分裂的各輪之間的時(shí)間更長(zhǎng)，因此提供給由化療基因毒性導(dǎo)致的正常細(xì)胞中DNA破壞的修復(fù)。因此，殺滅癌細(xì)胞達(dá)到了一定的選擇性。許多治療方案中嘗試通過(guò)屬于兩種或更多這些類的化療藥的共同給藥而改進(jìn)選擇性。
因?yàn)閷?duì)實(shí)體瘤進(jìn)行有效的化療通常需要聯(lián)合給藥，而對(duì)每種單一藥物的敏感性或抗性決定因素的鑒定和測(cè)量成為設(shè)計(jì)個(gè)體聯(lián)合化療的重要工具。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)損害細(xì)胞DNA的廣泛使用的兩種基因毒性抗癌是順鉑(DDP)和卡鉑。目前順鉑和/或卡鉑用于治療選定的、各種上皮和間質(zhì)來(lái)源的腫瘤，包括呼吸道、胃腸道和生殖道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的癌和肉瘤，以及頭和頸的鱗狀細(xì)胞癌。順鉑和其它試劑的聯(lián)合目前優(yōu)選用于睪丸癌的控制，在許多情況下產(chǎn)生持續(xù)的緩解(Loehrer等，1984，100 Ann.Int.Med.704)。順鉑(DDP)通過(guò)形成鏈內(nèi)加合物而破壞DNA結(jié)構(gòu)。DDP等鉑制劑的抗性是由于對(duì)鉑加合物的耐受、藥物積聚減少、或DNA修復(fù)增加。盡管對(duì)DDP的抗性是多因素的，DNA修復(fù)機(jī)制的的改變可能起了重要作用。大的DNA加合物，如鉑制劑形成的加合物的切除修復(fù)似乎由參與DNA破壞識(shí)別和切除的基因介導(dǎo)。Cleaver等，Carcinogenesis 11875-882(1990)；Hoeijmaker s等，CancerCells 2311-320(1990)；Shivji等，Cell 69367-374(1992)。實(shí)際上，在酶促DNA修復(fù)機(jī)制的一個(gè)或多個(gè)元件中具有遺傳缺陷的細(xì)胞對(duì)順鉑極為敏感。Fraval等(1978)，51 Mutat.Res.121，Beck和Brubaker(1973)，116 J.Bacteriol 1247。
切除修復(fù)交叉互補(bǔ)(ERCC1)基因在DNA加合物的修復(fù)中是關(guān)鍵的。已經(jīng)克隆了人ERCC1。Westerveld等，Nature(London)310425-428(1984)；Tanka等，Nature 34873-76(1990)；(編號(hào)XM-009432，在此引入作為參考，SEO ID NO10)。一些研究使用了該基因缺陷的突變?nèi)撕蛡}(cāng)鼠細(xì)胞系，并且人腫瘤組織的研究表明，由ERCC1編碼的產(chǎn)物參與鉑-DNA加合物的切除修復(fù)。Dabholkar等，J.Natl.Cancer Inst.841512-1517(1992)；Dijt等，Cancer Res.486058-6062(1998)；Hansson等，Nucleic Acids Res.1835-40(1990)。
當(dāng)轉(zhuǎn)染到DNA修復(fù)缺陷的CHO細(xì)胞中時(shí)，ERCC1通過(guò)其修復(fù)鉑-DNA加合物的能力賦予了對(duì)基于鉑的化療的細(xì)胞抗性。Hansson等，Nucleic Acids Res1835-40(1990)。目前接受的切除修復(fù)模型表明，破壞識(shí)別/切除是切除修復(fù)過(guò)程的限速步驟。
已經(jīng)檢測(cè)了接受基于鉑的化療的癌癥患者的惡性細(xì)胞中ERCC1等切除修復(fù)基因表達(dá)的相對(duì)水平。Dabholkar等，J.Natl.Cancer Inst.841512-1517(1992)。已經(jīng)報(bào)道，用順鉑(DDP)/氟尿嘧啶化療方案治療時(shí)，胃癌患者中ERCC1的過(guò)量表達(dá)對(duì)腫瘤反應(yīng)和最終存活率具有負(fù)影響(Metzger等，J Clin Oncl 16309，1998)。最近的證據(jù)表明，吉西他濱(Gem)可以調(diào)節(jié)ERCC 1核苷酸切除修復(fù)(NER)活性。因此，ERCC1表達(dá)的腫瘤內(nèi)水平可以是確定DDP和GEM是否可以有效治療癌癥的主要預(yù)后因素。
絕大多數(shù)患者的病理樣品都是按常規(guī)固定且用石蠟包埋的(FPE)，然后用于組織學(xué)分析及隨后的存檔。因此，絕大多數(shù)活檢組織樣品都不能用于基因表達(dá)的分析，這是因?yàn)檫@種研究需要高度完整的RNA，才能進(jìn)行基因表達(dá)的準(zhǔn)確測(cè)量。目前，基因表達(dá)水平只能通過(guò)免疫組織化學(xué)染色在這種固定且包埋的樣品中定量監(jiān)測(cè)，從而監(jiān)測(cè)蛋白表達(dá)水平。
迄今為止，包括ERCC1和TS表達(dá)的定量基因表達(dá)研究都限于來(lái)自于新鮮和冷凍組織的RNA的逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增。Reed等的美國(guó)專利5,705336公開(kāi)了定量卵巢腫瘤組織中的ERCC1mRNA并確定該組織是否對(duì)基于鉑的化療敏感的方法。如Leichman等，Reed等的文章中所描述，定量冷凍腫瘤活檢物的mRNA。
由健康護(hù)理專業(yè)人員使用冷凍組織具有相當(dāng)大的不便。在設(shè)計(jì)任何一種基于RNA的定量遺傳標(biāo)記測(cè)定法時(shí)，迅速遞送活檢樣品，以避免組織及后來(lái)的mRNA降解是首先要考慮的。進(jìn)行活檢的健康護(hù)理專業(yè)人員必須把組織樣品迅速遞送到所裝備的設(shè)備上，從而在收到組織樣品后立即進(jìn)行RNA提取。如果沒(méi)有這種設(shè)備，臨床醫(yī)師必須迅速將樣品冷凍，從而防止mRNA降解。為了在組織和RNA降解之前使用診斷設(shè)備進(jìn)行有效的RNA提取，組織樣品必須保持冷凍，直到它到達(dá)診斷設(shè)備，但可以位于較遠(yuǎn)處。在轉(zhuǎn)移過(guò)程中，可使用帶有液氮和干冰的專用設(shè)備維持冷凍組織的完整性，但花費(fèi)較高。
常規(guī)的活檢樣品通常含有基質(zhì)和腫瘤組織的不均一混合物。與新鮮或冷凍組織不同，F(xiàn)PE活檢組織樣品可很容易地被顯微解剖，分成基質(zhì)和腫瘤組織，因此優(yōu)于使用新鮮或冷凍組織。而RNA從固定組織，特別是固定且石蠟包埋組織中的分離會(huì)產(chǎn)生高度降解的RNA，這通常被認(rèn)為不適于基因表達(dá)的研究。
現(xiàn)在有很多從生物樣品中純化RNA的技術(shù)，但還沒(méi)有一種可靠的從FPE樣品中分離RNA的方法。例如，Chomczynski(美國(guó)專利US5,346,994)描述了一種從組織中純化RNA的方法，它是以液相分離為基礎(chǔ)，使用苯酚和異硫氰酸胍進(jìn)行的。在苯酚和異硫氰酸胍的水溶液中勻化生物樣品，然后將勻漿與氯仿混合。離心后，勻漿分成有機(jī)相，中間相和水相。蛋白螯合在有機(jī)相中，DNA在中間相中，RNA在水相中。RNA可從水相中沉淀出來(lái)。不幸的是，該方法不適于固定且石蠟包埋的(FPE)組織樣品。
分離RNA的其它已知技術(shù)通常是利用胍鹽或苯酚提取，如Sambrook，J.等，(1989)pp.7.3-7.24，和Ausubel，F(xiàn).M.等，(1994)pp.4.0.3-4.4.7中實(shí)施例所述。同樣，在從石蠟包埋的組織樣品中分離RNA方面，還沒(méi)有一種已知方法能夠提供可再現(xiàn)的測(cè)量結(jié)果。
因此，特別需要一種從石蠟包埋組織中分離RNA的技術(shù)，從而研究腫瘤組織中的基因表達(dá)，然后將某些受體或酶的表達(dá)水平用于測(cè)定特定療法成功的可能性或適合性。
需要一種定量石蠟包埋的組織中ERCC1 mRNA的方法，以便提供基因毒性癌癥治療的早期預(yù)后。因此，本領(lǐng)域中還沒(méi)有成功獲得在固定和石蠟包埋(FPE)組織中定量ERCC1表達(dá)的方法。因此，本發(fā)明的目的是提供一種通過(guò)檢測(cè)患者腫瘤細(xì)胞中的ERCC1 mRNA量并且將其與預(yù)定的域表達(dá)水平進(jìn)行比較，從而評(píng)估固定并且石蠟包埋(FPE)組織中ERCC1水平，并且預(yù)測(cè)患者腫瘤對(duì)DNA破壞試劑的治療的可能抗性，確立由DNA鉑制劑引起的DNA損傷類型的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明一方面提供一種評(píng)估固定或固定且石蠟包埋(FPE)的腫瘤細(xì)胞中ERCC1 mRNA表達(dá)水平的方法。
本發(fā)明另一方面提供一種測(cè)量固定且石蠟包埋(FPE)的組織樣品中相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照的ERCC1 mRNA表達(dá)量的方法。該方法包括分離所述樣品的總mRNA，并測(cè)定相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照基因的mRNA量的ERCC1 mRNA的量。
在本發(fā)明這方面的其中一個(gè)實(shí)施方案中，提供具有ERCC1-504F(SEQ ID NO1)或ERCC1-574R(SEQ ID NO2)序列和具有基本上與其相同序列的寡核苷酸引物。本發(fā)明還提供這樣一種寡核苷酸引物，其序列在嚴(yán)格條件下可與SEQ ID NO1或SEQ ID NO2或它們的互補(bǔ)序列雜交。
本發(fā)明另一方面提供一種確定患者的化療方案的方法，包括從固定且石蠟包埋(FPE)的腫瘤樣品中分離RNA；測(cè)定樣品中ERCC1的基因表達(dá)水平；把ERCC1基因表達(dá)水平與ERCC1基因的預(yù)定閾水平進(jìn)行比較；根據(jù)ERCC1基因表達(dá)水平和預(yù)定閾水平的比較結(jié)果確定化療方案。
本發(fā)明還涉及一種標(biāo)準(zhǔn)化組織樣品中相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照基因的ERCC1的未校正基因表達(dá)(UGE)的方法，其中所述組織樣品是使用TaqMan技術(shù)分析的，所述方法是通過(guò)利用pre-TaqMan技術(shù)，相對(duì)于樣品的內(nèi)部對(duì)照，對(duì)已知的ERCC1表達(dá)水平進(jìn)行分析而進(jìn)行的。
圖1表示接受順鉑/Gem治療的患者的總體存活與NSCLC中校正的相對(duì)ERCC1表達(dá)。校正的相對(duì)ERCC1表達(dá)水平低于域值6.7×10-3的患者具有顯著更優(yōu)的存活。而校正的相對(duì)ERCC1表達(dá)水平高于域值6.7×10-3的患者具有顯著更差的存活(P＝0.009，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn))。
圖2是舉例說(shuō)明如何計(jì)算相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照基因的ERCC1表達(dá)的圖表。所述圖表包括用兩種試驗(yàn)樣品獲得的數(shù)據(jù)，(未知1和2)，并舉例說(shuō)明如何測(cè)定未校正基因的表達(dá)數(shù)據(jù)(UGE)。該圖表還舉例說(shuō)明了如何利用通過(guò)pre-TaqMan技術(shù)測(cè)定的已知相對(duì)ERCC1值，標(biāo)準(zhǔn)化TaqMan儀器所產(chǎn)生的UGE。這是通過(guò)用UGE乘以校正因子KERCC1完成的。圖中的內(nèi)部對(duì)照基因是β-肌動(dòng)蛋白，校準(zhǔn)RNA是人肝總RNA(Stratagene，目錄號(hào)735017)。
圖3是表示研究中的56名患者的腫瘤分期和細(xì)胞類型的人群統(tǒng)計(jì)詳細(xì)內(nèi)容。接受的治療周期的中值數(shù)為3(范圍1-6)。14名患者(25％)以前接受過(guò)化療，大多數(shù)(9名)采用單獨(dú)的紫杉烷治療或與DDP或卡鉑聯(lián)合。56名患者中的3名接受放療，5名患者進(jìn)行原發(fā)腫瘤的外科切除。
圖4表示校正的ERCC1表達(dá)水平低于域值的患者與校正的ERCC1表達(dá)水平高于域值的患者的20.4周(95％C.I.6.9，33.9周)相比，具有顯著更長(zhǎng)的中值存活，即61.6周(95％ C.I.42.4，80.7周)。對(duì)腫瘤周期進(jìn)行校正后，低或高ERCC1表達(dá)和總體存活之間的關(guān)聯(lián)的對(duì)數(shù)秩統(tǒng)計(jì)量為3.97，P值為0.046。圖中顯示了未校正的對(duì)數(shù)秩結(jié)果。也顯示了在使用Kaplan Meier生存曲線和對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)進(jìn)行的單變量分析中與總體存活顯著相關(guān)的因素。這些因素是預(yù)治療體重減輕的存在和ECOG狀態(tài)。患者年齡(P＝0.18)、性別(P＝0.87)、腫瘤分期(P＝0.99)、腫瘤細(xì)胞類型(P＝0.63)和胸膜滲出的存在(P＝0.71)不是總體存活的顯著預(yù)后因素。校正的相對(duì)ERCC1表達(dá)水平、ECOG表現(xiàn)狀態(tài)和體重減輕在Cox危險(xiǎn)比回歸模型多變量分析中仍然是存活的顯著預(yù)后因素。對(duì)腫瘤分析進(jìn)行分層的Cox回歸模型的P值是0.038，體重減輕為0.017，ECOG表現(xiàn)狀態(tài)為0.02(PS 0與1或2)。
發(fā)明詳述本發(fā)明部分依賴于腫瘤中ERCC1 mRNA的量與用DNA鉑制劑治療的患者的存活相關(guān)的發(fā)現(xiàn)。表達(dá)高水平ERCC1 mRNA的腫瘤被認(rèn)為可能對(duì)基于鉑的化療具有抗性，具有更低的存活水平。相反，表達(dá)低水平ERCC1mRNA的那些腫瘤可能對(duì)基于鉑的化療敏感并具有更高水平的存活?；颊吣[瘤的ERCC1 mRNA相對(duì)表達(dá)是通過(guò)把它與預(yù)定的閾表達(dá)水平進(jìn)行比較而確定的。
本發(fā)明提供一種測(cè)量固定且石蠟包埋(FPE)的組織中，ERCC1 mRNA相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照基因表達(dá)的表達(dá)量的方法。本發(fā)明人已經(jīng)開(kāi)發(fā)了可準(zhǔn)確評(píng)估固定且包埋組織中的ERCC1表達(dá)的寡核苷酸引物。本發(fā)明的寡核苷酸引物，ERCC1-504F(SEQ ID NO1)，ERCC1-574R(SEQ ID NO2)，或基本上與其相同的寡核苷酸引物，優(yōu)選與從固定且石蠟包埋(FPE)的腫瘤樣品中提取出來(lái)的RNA一起使用。然后可將ERCC1基因表達(dá)的這種測(cè)量值用于預(yù)測(cè)基于鉑的化療。
本發(fā)明的該實(shí)施方案包括，第一，一種確實(shí)可靠的，從FPE樣品中提取RNA的方法，第二，通過(guò)使用一對(duì)寡核苷酸引物，使用逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測(cè)定樣品中ERCC1 mRNA含量的方法，其中優(yōu)選寡核苷酸引物對(duì)ERCC1-504F(SEQ ID NO1)和ERCC1-574R(SEQ ID NO2)，或基本上與其相同的寡核苷酸。RNA是通過(guò)1999年12月20日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)09/469,338中描述的任意mRNA分離的方法從FPE細(xì)胞中提取的，該專利申請(qǐng)?jiān)诖艘米鳛閰⒖肌?br>
本發(fā)明的方法適用于患者的任意組織類型。對(duì)于檢驗(yàn)?zāi)[瘤組織的抗性，優(yōu)選檢驗(yàn)?zāi)[瘤組織。在優(yōu)選實(shí)施方案中，檢驗(yàn)得到腫瘤組織的患者的一部分正常組織。然后可以用更高量的化療組合物治療那些預(yù)計(jì)正常組織對(duì)基于鉑的化療化合物具有抗性，即表現(xiàn)出高水平ERCC1基因表達(dá)，但預(yù)計(jì)腫瘤組織對(duì)所述化合物敏感，即表現(xiàn)出低水平ERCC1基因表達(dá)的患者。
可以用更高量的化療組合物治療ERCC1基因表達(dá)水平低于域水平的患者，因?yàn)轭A(yù)計(jì)他們比腫瘤表達(dá)高于域水平的ERCC1基因的患者具有更好的存活。或者，醫(yī)生可以確定，腫瘤表達(dá)高于域水平的ERCC1基因的患者可能不會(huì)從化療中得到任何顯著優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗麄兊念A(yù)計(jì)存活很低。
本發(fā)明的方法適用于各種腫瘤類型。它可制備個(gè)體“腫瘤表達(dá)分布”，由此在個(gè)體患者的樣品中測(cè)定ERCC1的表達(dá)水平，并預(yù)測(cè)對(duì)各種化療的反應(yīng)。優(yōu)選，本發(fā)明的方法適用于實(shí)體瘤，最優(yōu)選非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)腫瘤。對(duì)于將本發(fā)明的一些實(shí)施方案用于特定的腫瘤類型，優(yōu)選證明ERCC1基因表達(dá)水平與存活力之間的關(guān)系，這是通過(guò)編輯在特定ERCC1表達(dá)和對(duì)基于鉑的化療的臨床抗性之間建立聯(lián)系的數(shù)據(jù)組而進(jìn)行的。
此處定義的ERCC1表達(dá)的“預(yù)定閾水平”是一種校正的ERCC1腫瘤表達(dá)相對(duì)水平，當(dāng)高于此水平時(shí)，腫瘤可能對(duì)基于鉑的化療方案有抗性。表達(dá)水平低于該域值的腫瘤可能對(duì)基于鉑的化療方案敏感。表示為ERCC1β-肌動(dòng)蛋白之比的相對(duì)ERCC1表達(dá)在反應(yīng)于基于鉑的化療方案的腫瘤中的范圍為低于約6.7×10-3。不反應(yīng)于基于鉑的化療方案的腫瘤中表示為ERCC1β-肌動(dòng)蛋白之比的相對(duì)ERCC1表達(dá)范圍為高于約6.7×10-3。見(jiàn)實(shí)施例4。
“預(yù)定閾水平”進(jìn)一步定義為腫瘤的校正的相對(duì)ERCC1表達(dá)水平，當(dāng)高于此水平時(shí)，接受基于鉑的化療方案的患者可能存活率低。當(dāng)接受基于鉑的化療方案的患者中腫瘤的校正的相對(duì)ERCC1表達(dá)水平低于此域水平時(shí)，與高患者存活率相關(guān)。表示為ERCC1β-肌動(dòng)蛋白之比的域校正相對(duì)ERCC1表達(dá)為約6.7×10-3。圖1，見(jiàn)實(shí)施例4。然而，本發(fā)明不限于用β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)部對(duì)照。
在進(jìn)行本發(fā)明該實(shí)施方案的方法時(shí)，優(yōu)選分離患者的腫瘤細(xì)胞。實(shí)體或淋巴瘤或其一部分是通過(guò)手術(shù)從患者切除下來(lái)的，或通過(guò)常規(guī)的活檢獲得。從冷凍或新鮮腫瘤樣品中分離出來(lái)的RNA是通過(guò)本領(lǐng)域任何一種典型的方法從細(xì)胞中提取出來(lái)的，例如Sambrook，F(xiàn)ischer和Maniatis，MolecularCloning，alaboratorymanual，(2nded.)，ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork，(1989)。優(yōu)選在提取過(guò)程中，注意避免RNA降解。
然而，患者的組織在活檢后常常被固定，例如，通常用福爾馬林(甲醛)或gluteraldehyde固定，或用醇浸漬。通常是使固定的生物樣品脫水，并將其包埋在石蠟或本領(lǐng)域那些技術(shù)人員已知的其它固體支持物中。見(jiàn)Plenat等，AnnPathol2001Jan；21(1)29-47。沒(méi)有包埋的固定組織及固定且包埋的組織都可用于本發(fā)明的方法中。將包埋固定組織的固體支持物設(shè)計(jì)為可用有機(jī)溶劑除去，隨后使保存的組織再水合。
RNA是通過(guò)1999年12月20日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)US09/469,338中描述的任何一種方法從FPE細(xì)胞中提取出來(lái)的，所述專利申請(qǐng)全部引入此處作為參考。此處所述固定且石蠟包埋(FPE)的組織是指可儲(chǔ)存或存檔的組織樣品。RNA可從存檔的病理樣品或活檢樣品中分離出來(lái)，其首先脫石蠟。代表性的脫石蠟方法包括用有機(jī)溶劑，如二甲苯洗滌石蠟包埋的樣品。脫石蠟樣品還可用低級(jí)醇的水溶液再水合。適宜的低級(jí)醇包括，例如甲醇，乙醇，丙醇和丁醇。脫石蠟樣品可用逐漸降低濃度的低級(jí)醇溶液連續(xù)洗滌而再水合?？蛇x擇地，樣品可同時(shí)脫石蠟和再水合。然后提取樣品中的RNA。
為了提取RNA，可利用機(jī)械，聲波或其它勻化工具勻化固定或固定且脫石蠟的樣品。再水合的樣品可在含有離液劑，如硫氰酸胍(也可作為異硫氰酸胍銷售)的溶液中勻化。將離液溶液中的勻化樣品加熱至約50-約100℃，所述離液溶液含有有效量的離液劑，如胍化合物。優(yōu)選的離液劑是硫氰酸胍。
“有效濃度的離液劑”的選擇是指從石蠟包埋的樣品中純化的RNA量比沒(méi)有離液劑情況下分離出來(lái)的RNA量高大約10倍。離液劑包括，如，胍化合物，脲，甲酰胺，碘化鉀，硫氰酸鉀及類似的化合物。本發(fā)明方法的優(yōu)選離液劑是胍化合物，如異硫氰酸胍(也作為硫氰酸胍銷售)和鹽酸胍。很多陰平衡離子都是有用的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可用這種適宜的陰離子制備多種胍鹽。本發(fā)明所用胍溶液的有效濃度通常約為1-5M，優(yōu)選約4M。如果RNA已存在于溶液中，那么胍溶液的濃度可以更高，這樣，樣品中獲得的最終濃度約為1-5M。優(yōu)選用適當(dāng)?shù)纳彌_液，如Tris-HCl把胍溶液緩沖至pH約3-6，更優(yōu)選約4。離液溶液還可含有還原劑，如二硫蘇糖醇(DTT)和β-巰基乙醇(BME)。離液溶液還可含有RNA酶抑制劑。
將離液溶液中的勻化樣品加熱至約50-約100℃，所述離液溶液含有有效量的離液劑，如胍化合物。優(yōu)選的離液劑是硫氰酸胍。
然后通過(guò)苯酚-氯仿萃取，離子交換色譜或大小排阻色譜回收離液溶液中的RNA。然后，利用提取，電泳，層析，沉淀技術(shù)或其它適宜技術(shù)進(jìn)一步純化RNA。
ERCC1 mRNA的定量?jī)?yōu)選使用本領(lǐng)域常用的逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)進(jìn)行，其中所述ERCC1 mRNA來(lái)源于新鮮，冷凍，或固定組織的純化總mRNA。定量ERCC1 mRNA的其它方法包括，例如，使用多重PCR中所用的分子指標(biāo)和其它標(biāo)記探針。此外，本發(fā)明還利用沒(méi)有PCR的系統(tǒng)測(cè)量ERCC1的mRNA，其中沒(méi)有PCR的系統(tǒng)使用的是與Invader測(cè)定(ThirdWave Technologies，Inc.)中使用的探針相似的熒光標(biāo)記探針。最優(yōu)選，ERCC1cDNA及內(nèi)部對(duì)照或管家基因(例如，β-肌動(dòng)蛋白)的定量是利用基于熒光的實(shí)時(shí)檢測(cè)法(ABIPRISM7700或7900 Sequence Detection System[TaqMan]，AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA.)或與Heid等(Genome Res 1996；6986-994)和Gibson等(Genome Res 1996；6995-1001)所述相似的系統(tǒng)進(jìn)行的。ABI7700(TaqManInstrument)的輸出量是以Ct’s或“循環(huán)閾”表示的。使用TaqMan系統(tǒng)，樣品中具有較高數(shù)量靶分子的高水平表達(dá)基因產(chǎn)生一種信號(hào)，并且PCR循環(huán)(較低的Ct)比具有較少靶分子(較高的Ct)的低水平相對(duì)表達(dá)的基因要少。
此處所用“管家”基因或“內(nèi)部對(duì)照”是任何一種組成型或全局型表達(dá)基因，它的存在可評(píng)估ERCC1 mRNA的水平。這種評(píng)估包括測(cè)定基因轉(zhuǎn)錄的總體組成型水平和RNA回收中變異的對(duì)照。“管家”基因或“內(nèi)部對(duì)照”包括，但不限制于親環(huán)蛋白基因，β-肌動(dòng)蛋白基因，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因，GAPDH基因等。最優(yōu)選內(nèi)部對(duì)照基因是β-肌動(dòng)蛋白基因，如Eads等，Cancer Research 1999；592302-2306所述。
RNA回收中變異的對(duì)照需要使用“校準(zhǔn)RNA”?！靶?zhǔn)RNA”可以是任何一種可得到的精確預(yù)定量的對(duì)照RNA。優(yōu)選使用人肝總RNA(Stratagene，目錄號(hào)735017)。
此處所用“未校正基因表達(dá)(UGE)”是指由TaqMan儀器產(chǎn)生的相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照基因的ERCC1表達(dá)的數(shù)字輸出。用于確定UGE的公式在實(shí)施例3中表示，并用圖2樣品計(jì)算結(jié)果舉例說(shuō)明。
本發(fā)明另一方面提供一種校準(zhǔn)化未校正基因表達(dá)(UGE)值的方法，所述未校正基因表達(dá)(UGE)值是利用源于非-TaqMan技術(shù)的“已知相對(duì)基因表達(dá)”值，從TaqMan儀器獲得的。優(yōu)選，已知源于非-TaqMan的相對(duì)ERCC1β-肌動(dòng)蛋白表達(dá)值是用源于TaqMan的組織樣品ERCC1 UGE值標(biāo)準(zhǔn)化的。
此處所用“校正的相對(duì)ERCC1表達(dá)”是指標(biāo)準(zhǔn)化的ERCC1表達(dá)，UGE乘以ERCC1特異性校正因子(KERCC1)得到一個(gè)值，該值可與ERCC1相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照基因的已知表達(dá)水平范圍相比較。實(shí)施例3和圖2詳細(xì)說(shuō)明了這些計(jì)算結(jié)果。這些數(shù)值可確定特定樣品的“校正相對(duì)ERCC1表達(dá)”是高于還是低于“預(yù)定閾”水平。相對(duì)于β-肌動(dòng)蛋白水平的校正的相對(duì)ERCC1表達(dá)的預(yù)定域水平為約6.7×10-3。ERCC1，內(nèi)部對(duì)照β-肌動(dòng)蛋白和校準(zhǔn)人肝總RNA(Stratagene，目錄號(hào)735017)的特異性KERCC1為1.54×10-3。
“已知的相對(duì)基因表達(dá)”值源于先前分析的組織樣品，且它是以靶基因的RT-PCR信號(hào)與組成型表達(dá)的內(nèi)部對(duì)照基因(例如，β-肌動(dòng)蛋白，GAPDH等)的比值為基礎(chǔ)的。優(yōu)選這種組織樣品是用福爾馬林固定并用石蠟包埋(FPE)的樣品，RNA是按照實(shí)施例1描述的方案從它們之中提取出來(lái)的。為了測(cè)量相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照的基因表達(dá)，使用了本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)定量RT-PCR技術(shù)。Pre-TaqMan技術(shù)PCR反應(yīng)進(jìn)行固定的循環(huán)數(shù)(即，30次)，并報(bào)告每份樣品的終點(diǎn)值。然后按照ERCC1表達(dá)與β-肌動(dòng)蛋白表達(dá)的比值報(bào)道這些值。見(jiàn)Reed等的美國(guó)專利5,705,336。
除了β-肌動(dòng)蛋白和/或不同于人肝總RNA(Stratagene，目錄號(hào)735017)的校準(zhǔn)RNA之外，還可測(cè)定其它內(nèi)部對(duì)照基因的KERCC1。為此，人們必須校準(zhǔn)內(nèi)部對(duì)照基因和校準(zhǔn)RNA，其中已經(jīng)測(cè)定了相對(duì)于特定內(nèi)部對(duì)照基因ERCC1的表達(dá)水平(即，“已知的相對(duì)基因表達(dá)”)。優(yōu)選這種組織樣品是福爾馬林固定且石蠟包埋的(FPE)樣品，RNA是按照實(shí)施例1和1999年12月20日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)09/469,338描述的方案從它們之中提取出來(lái)的，該專利申請(qǐng)?jiān)诖巳囊胱鳛閰⒖?。這種測(cè)定可使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)pre-TaqMan定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行。根據(jù)這種測(cè)定，這種樣品具有ERCC1的“已知相對(duì)基因表達(dá)”水平，可用于測(cè)定對(duì)實(shí)施例3所述的新內(nèi)部對(duì)照和/或校準(zhǔn)RNA特異的新KERCC1。
本發(fā)明的方法可適于各種組織和腫瘤類型，可用于評(píng)估患者的臨床治療，并作為各種癌癥，包括乳腺癌，頭頸癌，肺癌，食管癌，結(jié)腸直腸癌等的診斷或預(yù)后工具。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法適于非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的預(yù)后。
化療前治療腫瘤活檢樣品通常只對(duì)固定且石蠟包埋(FPE)的組織有效，這些組織通常只含有非常少量的不均一組織。這種FPE樣品可很容易經(jīng)過(guò)顯微解剖，這樣就可測(cè)定沒(méi)有污染非惡性基質(zhì)組織的腫瘤組織中的ERCC1基因表達(dá)。此外，比較還可在活檢組織樣品內(nèi)的非惡性基質(zhì)組織和腫瘤組織間進(jìn)行，因?yàn)檫@種樣品常常含有兩種類型的組織。
通常，與ERCC1基因的一個(gè)區(qū)側(cè)面連接的任何寡核苷酸對(duì)都可用于進(jìn)行本發(fā)明的方法。在嚴(yán)格條件下與ERCC1基因的一個(gè)區(qū)雜交，用于本發(fā)明的引物可擴(kuò)增20-1000個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選50-100個(gè)堿基對(duì)，最優(yōu)選少于100個(gè)堿基對(duì)的產(chǎn)物。
本發(fā)明提供特異性的寡核苷酸引物對(duì)和與其基本上相同的寡核苷酸引物，可利用FPE組織精確評(píng)估ERCC1表達(dá)。優(yōu)選寡核苷酸引物，ERCC1-504F(SEQ ID NO1)和ERCC1(SEQ ID NO2)，(此處也稱為寡核苷酸引物對(duì)ERCC1)和基本上與其相同的寡核苷酸引物。寡核苷酸引物ERCC1-504F(SEQ ID NO1)和ERCC1(SEQ ID NO2)顯示出對(duì)測(cè)量ERCC1 mRNA的水平特別有效，所述測(cè)量是使用通過(guò)任何一種mRNA分離方法從FPE細(xì)胞中提取出來(lái)的RNA進(jìn)行的，如實(shí)施例1和1999年12月20日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)09/469,338所述，該專利申請(qǐng)?jiān)诖艘胱鳛閰⒖肌?br>
“基本上相同”的核酸是指在嚴(yán)格條件下與靶雜交的核酸，及適當(dāng)比對(duì)時(shí)，與具有適當(dāng)核苷酸插入和缺失的核酸相比較時(shí)，至少約60％，優(yōu)選至少約70％，更優(yōu)選至少約80％，優(yōu)選至少約90％，更優(yōu)選至少約95-98％的核苷酸相同的核酸片段，或它們的互補(bǔ)鏈。當(dāng)選擇性高于特異性時(shí)，存在選擇性雜交。見(jiàn)，Kanehisa，NucleicAcidsRes.，12203-213(1984)。
本發(fā)明包括基本上相同的寡核苷酸，其在嚴(yán)格條件下(如此處所定義的)與ERCC1-504F(SEQ ID NO1)，其互補(bǔ)序列，或ERCC1-574R(SEQ ID NO2)，或其互補(bǔ)序列的核苷酸引物序列的全部或一部分雜交。
在嚴(yán)格的雜交條件下，只有高度互補(bǔ)的，即，與此處所定義的基本上相似的核酸序列才能進(jìn)行雜交。優(yōu)選，這種條件會(huì)阻礙20個(gè)連續(xù)核苷酸中有4個(gè)或更多錯(cuò)配，更優(yōu)選20個(gè)連續(xù)核苷酸中有2個(gè)或更多錯(cuò)配，最優(yōu)選20個(gè)相連核苷酸中有1個(gè)或更多錯(cuò)配的核酸進(jìn)行雜交。
核酸的雜交部分通常至少約為10個(gè)(例如，15個(gè))核苷酸長(zhǎng)。核酸進(jìn)行雜交的部分與寡核苷酸引物ERCC1-504F(SEQ ID NO1)，其互補(bǔ)序列，或ERCC1-574R(SEQ ID NO2)，或其互補(bǔ)序列的全部或一部分序列至少約80％，優(yōu)選至少約95％，或最優(yōu)選至少約98％相同。
寡核苷酸引物與核酸樣品在嚴(yán)格條件下的雜交在下面規(guī)定。核酸雙鏈體或雜交體的穩(wěn)定性是以解鏈溫度(Tm)表示的，它是探針從靶DNA解離下來(lái)的溫度。解鏈溫度可用于限定所需的嚴(yán)格條件。如果所要鑒定的序列與探針基本上相同，而不是相同，那么它可首先用于確定最低溫度，在最低溫度時(shí)，只有使用特殊濃度的鹽(例如，SSC或SSPE)才能進(jìn)行同源雜交。然后，假定1％錯(cuò)配導(dǎo)致Tm降低1℃，那么雜交反應(yīng)的最終洗滌溫度因此降低(例如，如果找到與探針的同一性＞95％的序列，那么最終的洗滌溫度降低5℃)。實(shí)際上，Tm在0.5℃-1.5℃/1％錯(cuò)配之間變化。
嚴(yán)格條件包括約68℃時(shí)，在5xSSC/5xDenhart’s溶液/1.0％SDS中雜交，室溫時(shí)，在0.2xSSC/0.1％SDS中洗滌。中度的嚴(yán)格條件包括約42℃時(shí)，在3xSSC中洗滌。改變鹽濃度和溫度參數(shù)，可在引物和靶核酸之間獲得最佳的同一性水平。有關(guān)這種條件的其它指導(dǎo)可在本領(lǐng)域中很容易地得到，例如，Sambrook，F(xiàn)ischer和Maniatis，MolecularCloning，a laboratory manual，(2nded.)，Cold Spring HarborLaboratory Press，NewYork，(1989)和F.M.Ausubel等編輯，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons(1994)。
此處公開(kāi)的寡核苷酸引物能夠精確評(píng)估固定或固定且石蠟包埋的組織，及冷凍或新鮮組織中的ERCC1基因表達(dá)。FPE樣品的RNA比新鮮或冷凍組織的RNA更破碎。因此，本發(fā)明的方法適用于測(cè)定所有組織中的ERCC1基因表達(dá)，而先前不存在利用固定組織測(cè)定ERCC1基因表達(dá)的方法。
根據(jù)在腫瘤中表達(dá)的ERCC1 mRNA量的測(cè)量結(jié)果，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進(jìn)行關(guān)于腫瘤對(duì)特定基因毒素的臨床抗性或接受特定基因毒素的患者的存活率的預(yù)后?；阢K的化療或誘導(dǎo)相似類型的DNA破壞的化療優(yōu)選是基因毒素。
基于鉑的化療導(dǎo)致DNA的“大加合物”，其中主要的作用是扭曲雙螺旋的三維構(gòu)象。所述化合物可以單獨(dú)給藥，或與吉西他濱(Gem)或5-氟尿嘧啶(5-FU)聯(lián)合給藥。
基于鉑的基因毒性化療包括形成共價(jià)DNA加合物的重金屬配位化合物。一般地，這些重金屬與DNA共價(jià)結(jié)合，在恰當(dāng)?shù)牟糠中纬身?1，2-鏈內(nèi)二核苷酸加合物。一般地，這一類的代表有順-二氨合二氯鉑(II)(順鉑)，并且包括順-二氨合-(1，1-環(huán)丁烷二羧基)鉑(II)(卡鉑)，順-二氨合-(1，2-環(huán)己基)二氯鉑(II)，以及順-(1，2-乙二胺)二氯鉑(II)。鉑制劑包括前述代表性化合物的類似物或衍生物。
目前可以用鉑配位化合物控制的腫瘤包括睪丸、子宮內(nèi)膜、宮頸、胃、鱗狀細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)和小細(xì)胞肺癌，以及成髓細(xì)胞瘤和成神經(jīng)細(xì)胞瘤。
反-二氨合二氯鉑(II)(反-DDP)在臨床上是無(wú)用的，這是因?yàn)檎J(rèn)為它的DNA加合物迅速修復(fù)。用反-DDP作為化療劑可能將在未選擇的細(xì)胞中提供低毒性，在選擇的細(xì)胞中提供高相對(duì)毒性。在優(yōu)選實(shí)施方案中，鉑化合物是順鉑。
許多化合物通常與基于鉑的化療劑一起給藥。例如，BEP(博萊霉素、依托泊苷產(chǎn)出、順鉑)用于睪丸癌，MVAC(氨甲喋呤、長(zhǎng)春堿、阿霉素、順鉑)用于膀胱癌，MVP(絲裂霉素C、長(zhǎng)春堿、順鉑)用于非小細(xì)胞肺癌治療。許多研究記錄了含有鉑的制劑之間的相互作用。例如，報(bào)道了可能包含在基于鉑的化療中的許多藥物的治療藥物協(xié)同性。對(duì)于該內(nèi)容的最近的參考文獻(xiàn)的很少的一些例子如下Okamoto等，Urology 2001；57188-192；Tanaka等，Anticancer Research2001；21313-315；Slamon等，Seminars in Oncology2001；2813-19；Lidor等，Journal of Clinical Investigation1993；922440-2447；Leopold等，NCI Monographs 1987；99-104；Ohta等，Cancer Letters 2001；16239-48；van Moorsel等，BritishJornal of Cancer 1999；80981-990。
其它基因毒性劑是形成持續(xù)基因組損傷的那些，優(yōu)選用于癌癥的臨床控制中的化療劑。基因毒素誘導(dǎo)的DNA破壞的細(xì)胞修復(fù)速度，以及通過(guò)細(xì)胞分裂周期進(jìn)行的細(xì)胞生長(zhǎng)影響了基因毒素治療的結(jié)果。細(xì)胞基因組中未修復(fù)的損傷可以妨礙DNA復(fù)制，妨礙新合成的DNA的復(fù)制保真性或阻礙細(xì)胞存活所需基因的表達(dá)。因此，基因毒性劑的細(xì)胞毒性(導(dǎo)致細(xì)胞死亡的傾向)的一個(gè)決定因素是由其形成的基因組損傷對(duì)細(xì)胞修復(fù)的抗性。形成持續(xù)的基因組損傷，如保持在基因組中至少到細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期的損傷的基因毒性劑，相對(duì)于形成瞬時(shí)的、容易修復(fù)的基因組損傷的試劑一般是更有效的細(xì)胞毒素。
一大類用于治療許多癌癥并且受ERCC1表達(dá)水平影響的基因毒性化合物是DNA烷基化試劑以及DNA嵌入劑。補(bǔ)骨脂素是已知用于皮膚病如牛皮癬、白癜風(fēng)、真菌感染的光化療中的基因毒性化合物。Harrison’s Principles of Internal Medicine，Part 2 CardinalManifestations of Disease，Ch.60(12thed.1991)。另一大類基因毒性化合物，包括合成和天然來(lái)源的抗生素，其成員可以烷基化或嵌入DNA。此處特別關(guān)注的是抗腫瘤性抗生素，包括但不限于由以下化合物代表的各類化合物安沙可林；放線菌素A，C，D(也稱作更生霉素)或F(或KS4)；氮絲氨酸；博萊霉素；卡美諾霉素(洋紅霉素)；柔紅霉素(紅比霉素)或14-羥基柔紅霉素(阿霉素或羥基紅比霉素)；絲裂霉素A，B或C；米托恩醌；plicamycin(光輝霉素)等。
另一大類常用的基因毒性劑是烷基化DNA的試劑，包括鹵代乙基亞硝基脲，特別是氯乙基亞硝基脲。該大類的代表性成員包括卡氮芥、氯脲菌素、福替目丁、羅氮芥、尼氮芥、雷尼氮芥和鏈脲霉素。鹵代乙基亞硝基脲試劑也可以是上述任意代表性化合物的類似物或衍生物。
另一大類基因毒性劑包括硫和氮芥，其成員烷基化DNA。這些化合物主要通過(guò)在鳥(niǎo)嘌呤的N7氮形成共價(jià)加合物而破壞DNA。該大類的代表性成員包括Chlorambucil，環(huán)磷酰胺，異環(huán)磷酰胺，美法蘭，methloroethamine，新氮芥，氯乙環(huán)磷酰胺等。如果需要選擇一個(gè)或多個(gè)預(yù)定的基因組靶作為基因組損傷的位點(diǎn)，也可以使用與選定細(xì)胞的基因組中的特定序列共價(jià)或非共價(jià)相互作用的寡核苷酸或其類似物作為基因毒性劑。
另一類試劑包括氮丙啶和甲基蜜胺類，其成員烷基化DNA。這些類包括，例如六甲基蜜胺，三亞乙基磷酰胺(TEPA)，三乙基硫代磷酰胺(硫代TEPA)。
其它類的DNA烷基化試劑包括磺酸烷基酯，代表為白消安；azinidines，代表為芐替哌；以及其它，代表為，例如丙米腙，米托恩醌和甲基芐肼。這些類都包括代表性化合物的類似物和衍生物。
上面描述了本發(fā)明，本發(fā)明的實(shí)際操作是通過(guò)下面給出的實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例舉例說(shuō)明的。技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到說(shuō)明實(shí)施例中使用的材料和方法可以各種方式進(jìn)行改進(jìn)。這種改進(jìn)也被認(rèn)為落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
實(shí)施例實(shí)施例1從FPE組織中分離RNARNA是通過(guò)下列一般過(guò)程從石蠟包埋組織中提取出來(lái)的。
A.切片的脫石蠟和水合(1)把約10μM的切片的一部分放在1.5mL塑料離心管中。
(2)加入600μL二甲苯，室溫(約20-25℃)用力振搖混合物約10分鐘。
(3)室溫時(shí)，以臺(tái)式離心機(jī)的最大速度(約10-20,000xg)將樣品離心約7分鐘。
(4)重復(fù)步驟2和3，直到絕大部分石蠟溶解。根據(jù)原始樣品部分所含的石蠟量，通常需要重復(fù)2次或更多次。
(5)用低級(jí)醇，優(yōu)選用100％乙醇(約600μL)用力振搖約3分鐘，除去二甲苯溶液。
(6)按照步驟(3)將試管離心約7分鐘。傾出并棄去上清液。顆粒狀物變?yōu)榘咨?br>
(7)用更稀釋的乙醇溶液首先用約95％乙醇，然后用約80％乙醇，最后用約70％乙醇連續(xù)重復(fù)步驟5和6。
(8)按照步驟(3)，室溫將樣品離心7分鐘。棄去上清液，室溫干燥顆粒狀物約5分鐘。
B.用苯酚-氯仿分離RNA(1)加入400μL含0.5％肌氨酸的異硫氰酸胍溶液和8μL二硫蘇糖醇。
(2)然后用組織勻漿器(Ultra-Turrax，IKA-Works，Inc.，Wilmington，NC)勻化樣品約2-3分鐘，速度從低速(速度1)到高速(速度5)逐漸升高。
(3)然后將樣品在大約95℃時(shí)加熱約5-20分鐘。優(yōu)選在加熱到95℃之前，用細(xì)針刺入含樣品的試管的管帽?？蛇x擇地，管帽可用塑料夾子或?qū)嶒?yàn)用薄膜固定。
(4)然后用pH4.0的50μL 2M醋酸鈉和600μL苯酚/氯仿/異戊醇(10∶1.93∶0.036)萃取樣品，其中苯酚/氯仿/異戊醇(10∶1.93∶0.036)是用18mL苯酚和3.6mL 1∶49的異戊醇∶氯仿溶液新制備的。用力振搖溶液約10秒，然后在冰上冷卻約15分鐘。
(5)以最大速度將溶液離心約7分鐘。將上層的(水)相轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的試管中。
(6)-20℃時(shí)，用約10μL糖原和400μL異丙醇沉淀RNA30分鐘。
(7)通過(guò)在臺(tái)式離心機(jī)中以最大速度離心約7分鐘，而使RNA成為顆粒狀物；傾出并棄去上清液；用大約500μL約70-75％的乙醇洗滌顆粒狀物。
(8)以最大速度將樣品再次離心7分鐘。棄去上清液，并將顆粒狀物風(fēng)干。然后將顆粒狀物溶解在適宜的緩沖液中，用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)(例如，50pL 5mM Tris氯化物，pH8.0)。
實(shí)施例2mRNA的逆轉(zhuǎn)錄和PCR
逆轉(zhuǎn)錄如實(shí)施例1中舉例說(shuō)明和1999年12月20日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)US09/469,338中的描述(全文引入此處作為參考)，RNA是從顯微解剖或非-顯微解剖的福爾馬林固定的石蠟包埋(FPE)組織中分離出來(lái)的。用乙醇沉淀并離心后，將RNA顆粒狀物溶解在50μL pH8.0的5mM Tris/Cl中。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶可延伸一種寡核苷酸引物，其在脫氧核苷酸存在的情況下與單鏈RNA或DNA模板雜交，產(chǎn)生互補(bǔ)鏈。所得RNA是用來(lái)源于Life Technologies的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)的六聚體逆轉(zhuǎn)錄的。逆轉(zhuǎn)錄是通過(guò)把25μLRNA溶液與25.5μL“逆轉(zhuǎn)錄混合物”混合進(jìn)行的(見(jiàn)下面)。將反應(yīng)物放在熱循環(huán)儀中，26℃時(shí)8分鐘(用于使隨機(jī)的六聚體與RNA結(jié)合)，42℃時(shí)45分鐘(用于M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶促反應(yīng))，95℃時(shí)5分鐘(用于DNA酶的熱滅活)。
“逆轉(zhuǎn)錄混合物”由以下成分組成10μl 5X緩沖液(250mMTris-HCl，pH8.3，375mM KCl，15mM MgCl2)，0.5μl隨機(jī)的六聚體(50O.D.溶解在550μl，pH7.5的10mM Tris-HCl中)，5μl 10mM dNTPs(dATP，dGTP，dCTP和dTTP)，5μl 0.1M DTT，1.25μl BSA(在pH7.5的10mM Tris-HCL中為3mg/ml)，1.25μl RNAGuard24，800U/ml(RNA酶抑制劑)(目錄號(hào)27-0816，AmershamPharmacia)和2.5μl MMLV 200U/μl(Life Tech目錄號(hào)28025-02)。
反應(yīng)組分的最終濃度是50mM Tris-HCl，pH8.3，75mM KCl，3mMMgCl2，1.0mM dNTP，1.0mM DTT，0.00375mg/ml BSA，0.62U/μl RNAGuard和10U/μl MMLV。
mRNA表達(dá)的PCR定量。ERCC1 cDNA和內(nèi)部對(duì)照或管家基因(例如β-肌動(dòng)蛋白)cDNA的定量是使用Heid等，(Genome Res1996；6986-994)；Gibson等，(Genome Res1996；6995-1001)所述的基于熒光的實(shí)時(shí)檢測(cè)法(ABI PRISM 7700或7900序列檢測(cè)系統(tǒng)[TaqMan]，Applied Biosystems，F(xiàn)osterCity，CA.)進(jìn)行的。簡(jiǎn)言之，該方法使用一種雙重標(biāo)記的產(chǎn)熒光TaqMan寡核苷酸探針，(ERCC1-530Tc(SEQ ID NO3)，Tm＝70℃)，其特異性地在正向和反向引物內(nèi)退火。含反應(yīng)混合物的加蓋孔內(nèi)的激光刺激引起3’猝滅劑染料(TAMRA)發(fā)射，直到探針在PCR延伸過(guò)程中被DNA聚合酶的5’-3’核酸酶活性裂解，引起5’報(bào)道染料(6FAM)的釋放。因此，擴(kuò)增子的產(chǎn)生引起熒光信號(hào)的發(fā)射，這是通過(guò)TaqMan’sCCD(電荷耦合器件)檢測(cè)照相機(jī)檢測(cè)的，PCR反應(yīng)純指數(shù)相內(nèi)，閾循環(huán)所產(chǎn)生的信號(hào)量可反映目標(biāo)序列的起始拷貝數(shù)。目標(biāo)序列起始拷貝數(shù)與內(nèi)部對(duì)照基因起始拷貝數(shù)的比較可提供相對(duì)基因表達(dá)水平。TaqMan分析了產(chǎn)率的水平，它是以兩個(gè)絕對(duì)測(cè)量值間的比值(目標(biāo)基因/內(nèi)部對(duì)照基因)表示的。
PCR反應(yīng)混合物由以下成分組成0.5μl含有如上制備的cDNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)物，600nM各寡核苷酸引物ERCC1-504F(SEQ ID NO1，Tm＝59℃)和ERCC1-574R(SEQ ID NO2，Tm＝58℃)，200nM TaqMan探針(SEQ ID NO3)，5U AmpliTaq Gold聚合酶，200μM各dATP，dCTP，dGTP，400μM dTTP，5.5mMMgCl2，和含有參考染料的1xTaqman緩沖液A，最終的體積小于或等于25μl(所有試劑，AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)。循環(huán)條件是，95℃10分鐘，然后是95℃15秒和60℃1分鐘循環(huán)45次。用于定量?jī)?nèi)部對(duì)照基因β-肌動(dòng)蛋白的寡核苷酸是β-肌動(dòng)蛋白TaqMan探針(SEQ ID NO4)，β-肌動(dòng)蛋白-592F(SEQ ID NO5)和β-肌動(dòng)蛋白-651R(SEQ IDNO6)。
用于上述反應(yīng)的寡核苷酸引物ERCC1-504F(SEQ ID NO1)和ERCC1-574R(SEQ ID NO2)將擴(kuò)增71bp的產(chǎn)物。
實(shí)施例3測(cè)定ERCC1的未校正基因表達(dá)(UGE)進(jìn)行兩對(duì)平行反應(yīng)?！霸囼?yàn)”反應(yīng)和“校準(zhǔn)”反應(yīng)。圖7。ERCC1擴(kuò)增反應(yīng)和β-肌動(dòng)蛋白內(nèi)部對(duì)照擴(kuò)增反應(yīng)是試驗(yàn)反應(yīng)。單獨(dú)的ERCC1和β-肌動(dòng)蛋白擴(kuò)增反應(yīng)是在校準(zhǔn)RNA模板上進(jìn)行的，被稱作校準(zhǔn)反應(yīng)。TaqMan儀器產(chǎn)生4個(gè)不同的循環(huán)閾(Ct)值試驗(yàn)反應(yīng)的CtERCC1和Ctβ-肌動(dòng)蛋白，和校準(zhǔn)反應(yīng)的CtERCC1和Ctβ-肌動(dòng)蛋白。兩種反應(yīng)的Ct差值是根據(jù)下列公式確定的ΔCt試驗(yàn)＝CtERCC1-Ctβ-肌動(dòng)蛋白(“試驗(yàn)”反應(yīng))ΔCt校準(zhǔn)＝CtERCC1-Ctβ-肌動(dòng)蛋白(“校準(zhǔn)”反應(yīng))下一步是按照下列公式計(jì)算2的負(fù)ΔCt次方。
2-ΔCt試驗(yàn)(“試驗(yàn)”反應(yīng))2-ΔCt校準(zhǔn)(“校準(zhǔn)”反應(yīng))
為了從TaqMan儀器獲得ERCC1的未校正基因表達(dá)，進(jìn)行了下列計(jì)算ERCC1的未校基因表達(dá)(UGE)＝2-ΔCt試驗(yàn)/2-ΔCt校準(zhǔn)用已知的相對(duì)ERCC1表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化UGE標(biāo)準(zhǔn)化的計(jì)算需要將UGE乘以對(duì)ERCC1和特定校準(zhǔn)RNA特異的校正因子(KERCC1)。還可測(cè)定任何一種內(nèi)部對(duì)照基因和任何一種精確預(yù)定量的校準(zhǔn)RNA的校正因子KERCC1。優(yōu)選，使用內(nèi)部對(duì)照基因β-肌動(dòng)蛋白和精確預(yù)定量的校準(zhǔn)RNA，人肝總RNA(Stratagene，目錄號(hào)735017)。已知這些試劑的校正因子KERCC1等于1.54×10-3。
標(biāo)準(zhǔn)化是使用ΔCt方法的改進(jìn)法進(jìn)行的，所述ΔCt方法由Applied Biosystems，TaqMan制造商，在UserBulletin#2中和上文描述。為了進(jìn)行該過(guò)程，使用上述TaqMan方法，分析了6個(gè)不同F(xiàn)PE試驗(yàn)組織的UGE的ERCC1表達(dá)。使用內(nèi)部對(duì)照基因β-肌動(dòng)蛋白和校準(zhǔn)RNA，人肝總RNA(Stratagene，目錄號(hào)735017)。
用各樣品AG221，AG222，AG252，成人肺，PC3，AdCol的已知相對(duì)ERCC1表達(dá)水平除以其相應(yīng)的源于TaqMan的UGE，得到不平均的校正因子K。
K不平均的＝已知的值/UGE接下來(lái)，求全部K值的平均值，從而確定對(duì)ERCC1，校準(zhǔn)RNA即Stratagene人肝總RNA(Stratagene，目錄號(hào)735017)和β-肌動(dòng)蛋白特異的單一KERCC1校正因子。
因此，為了成規(guī)模地測(cè)定與pre-TaqManERCC1表達(dá)研究一致的，未知組織樣品中的校正相對(duì)ERCC1表達(dá)，人們只需用源于TaqMan儀器的未校正基因表達(dá)數(shù)據(jù)(UGE)乘以KERCC1特異性校正因子，前提是使用相同的內(nèi)部對(duì)照基因和校準(zhǔn)RNA。
校正的相對(duì)ERCC1表達(dá)＝UGE×KERCC1KERCC1可使用任何一種精確預(yù)定量的校準(zhǔn)RNA或內(nèi)部對(duì)照基因測(cè)定。未來(lái)來(lái)源的精確預(yù)定量RNA可按照上述方法，相對(duì)于樣品用已知的相對(duì)ERCC1表達(dá)校準(zhǔn)或可相對(duì)于先前已經(jīng)校準(zhǔn)過(guò)的校準(zhǔn)RNA，如上述人肝總RNA(Stratagene，目錄號(hào)735017)校準(zhǔn)。
例如，如果隨后測(cè)定不同的內(nèi)部對(duì)照基因和/或不同的校準(zhǔn)RNA的KERCC1，則人們必須相對(duì)于組織樣品校準(zhǔn)內(nèi)部對(duì)照基因和校準(zhǔn)RNA，其中已經(jīng)測(cè)定了相對(duì)于特定內(nèi)部對(duì)照基因的ERCC1表達(dá)水平。這種測(cè)定可使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)pre-TaqMan，定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行。用這些樣品的已知表達(dá)水平除以它們相應(yīng)的UGE水平，可確定樣品的K值。然后根據(jù)已知樣品數(shù)，求K值的平均值，從而測(cè)定對(duì)不同內(nèi)部對(duì)照基因和/或校準(zhǔn)RNA特異的新KERCC1。
實(shí)施例4所有患者參與前瞻性多中心三方案隨機(jī)試驗(yàn)(GEPC/98-02，西班牙肺癌組III期順鉑/吉西他濱(CG)與順鉑/吉西他濱/長(zhǎng)春瑞濱(CGV)與序貫雙重吉西他濱/長(zhǎng)春瑞濱，然后是異環(huán)磷酰胺/長(zhǎng)春瑞濱(GV/IV)，在晚期NSCLC中進(jìn)行)中的順鉑/吉西他濱方案。所有患者每3周的第1、8天接受Gem 1250mg/m2，第1天加CDDP 100mg/m2。GECP/98-02的入選標(biāo)準(zhǔn)是可測(cè)量的IV期(如果無(wú)癥狀，腦轉(zhuǎn)移者可入選)或IIIB期(惡性胸膜和/或心包滲出和/或鎖骨上腺體病變)NSCLC以及東方合作組(ECOG)表現(xiàn)評(píng)分0-2。所有患者在進(jìn)入該研究前進(jìn)行胸部X線檢查和胸部及上腹部計(jì)算機(jī)體層攝影(CT)掃描，并且至少6周進(jìn)行一次重復(fù)評(píng)估。根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)將腫瘤反應(yīng)評(píng)估為完全反應(yīng)、部分反應(yīng)、穩(wěn)定疾病和進(jìn)展性疾病。用同樣的成像方法建立基線腫瘤測(cè)量值。
總mRNA是從顯微解剖的FPE預(yù)處理腫瘤樣品中分離的，如實(shí)施例2和3的描述用定量RT-PCR測(cè)量校正的相對(duì)ERCC1表達(dá)。從樣品分離mRNA的方法描述于實(shí)施例1中和1999年12月20日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)US09/469,338中的描述，在此全文引入此處作為參考。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用Mann-Whitney U檢驗(yàn)評(píng)估連續(xù)檢驗(yàn)變量，校正的相對(duì)ERCC1表達(dá)和二分變量(患者性別、高于中值年齡和低于中值年齡的年齡、體重減輕的存在、胸膜滲出的存在、腫瘤分期)之間的顯著關(guān)聯(lián)。用Kruskal-Wailis檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)多組內(nèi)校正的相對(duì)ERCC1表達(dá)的顯著差異(ECOG表現(xiàn)狀態(tài)、組織病理學(xué))。用Fisher精確檢驗(yàn)分析分類的臨床病理值，包括反應(yīng)和二分的校正的相對(duì)ERCC1表達(dá)值。
所有患者進(jìn)行第一研究治療，直到死亡或直到檢查數(shù)據(jù)。Kaplan-Meier存活曲線和對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)用于分析存活和無(wú)疾病存活的單變量分布。Miller和Sigmund(Miller等，Biometrics 381011-1016，1982)的最大卡方方法適于確定最有利于將患者二分成預(yù)后差和預(yù)后好(是否可能存活)的亞組的表達(dá)值，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)作為用于測(cè)量分組強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)方法。為了測(cè)定P值，其中所述P值被解釋為以最大卡方分析為基礎(chǔ)的相關(guān)強(qiáng)度的測(cè)量值，用1000引導(dǎo)指令樣刺激用于評(píng)估假設(shè)無(wú)關(guān)情況下的最大卡方統(tǒng)計(jì)量分布。(Biometrics 381017-1023，1982)。進(jìn)行單變量分析中顯著的因素的Cox危險(xiǎn)比模型分析，用于鑒定哪些因素可能對(duì)存活具有顯著影響。用SPSS 10.0.5版軟件(SPSSInc.Chicago I11.)進(jìn)行所有的統(tǒng)計(jì)分析。所有P值都是雙側(cè)的。
校正的相對(duì)ERCC1表達(dá)水平ERCC1 mRNA表達(dá)在所有56個(gè)分析的樣品中都是可檢測(cè)的。相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照管家基因β-肌動(dòng)蛋白的中值校正相對(duì)ERCC1表達(dá)為6.7×10-3(范圍0.8×10-3-24.6×10-3)。校正的相對(duì)ERCC1表達(dá)水平和以下任意因素年齡(P＝0.66)、性別(P＝0.18)、隨機(jī)化前6個(gè)月存在體重減輕(P＝0.74)、腫瘤分期(IIIB與IV，P＝0.39)、或胸膜滲出的存在(P＝0.25，均采用Mann-Whitney U檢驗(yàn))之間沒(méi)有顯著關(guān)聯(lián)。在具有不同的表現(xiàn)狀態(tài)分級(jí)(P＝0.48，Kruskal-Wallis檢驗(yàn))或不同的腫瘤類型(所有四種類型，P＝0.10，Kruskal-Wallis檢驗(yàn))的患者的校正的相對(duì)ERCC1表達(dá)水平之間沒(méi)有顯著差異，但SCC腫瘤的校正的相對(duì)ERCC1表達(dá)水平(中值8.6×10-3)與腺癌相比明顯更高(中值5.2×10-3，P＝0.015，Mann-Whitney檢驗(yàn))。
對(duì)化療的反應(yīng)47名可評(píng)價(jià)反應(yīng)的患者的腫瘤反應(yīng)如圖3所示?？傮w反應(yīng)率為44.7％。完全反應(yīng)和部分反應(yīng)，即“應(yīng)答”腫瘤的校正的相對(duì)ERCC1表達(dá)水平(中值4.3×10-3，范圍1.2×10-3-24.6×10-3)與穩(wěn)定疾病和進(jìn)展疾病，即“無(wú)應(yīng)答”腫瘤的水平(中值7.85×10-3，范圍0.8×10-3-24.3×10-3，P＝0.31，Mann-Whitney檢驗(yàn))無(wú)顯著差異。校正的相對(duì)ERCC1表達(dá)值高于和低于任何ERCC1水平的應(yīng)答和無(wú)應(yīng)答腫瘤的比例之間沒(méi)有顯著差異(所有都是Fisher精確檢驗(yàn))。具有低于域值的校正的相對(duì)ERCC1表達(dá)的腫瘤(“低表達(dá)”，52％應(yīng)答者)中的反應(yīng)率高于具有高于域值的校正的相對(duì)ERCC1表達(dá)的腫瘤(“高表達(dá)”，36.4％應(yīng)答者，F(xiàn)isher精確檢驗(yàn)，P＝0.38)。
患者總體存活與校正的相對(duì)ERCC1表達(dá)水平之間的關(guān)聯(lián)中值總體存活時(shí)間為36.6周(范圍0-113.4周)，到進(jìn)展的中值時(shí)間為24.4周(范圍0-102.9周)。用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)和最大卡方統(tǒng)計(jì)鑒定將患者分為預(yù)后差和預(yù)后好亞組的域校正相對(duì)ERCC1表達(dá)水平表明，判別值包括中值，因此將其用作存活分析的域值。因此，確定NSCLC的域校正相對(duì)ERCC1表達(dá)值為6.7×10-3。圖1表示腫瘤內(nèi)校正相對(duì)ERCC1表達(dá)水平高于和低于域校正相對(duì)ERCC1表達(dá)水平的患者的Kaplan-Meier存活曲線。如圖4所示，具有低于域值的校正相對(duì)ERCC1表達(dá)水平的患者與具有高于域值的校正相對(duì)ERCC1表達(dá)水平的患者的20.4周(95％C.I.6.9，33.9周)相比，具有顯著更長(zhǎng)的61.6周的中值存活(95％C.I.42.4，80.7周)。對(duì)腫瘤分期進(jìn)行校正后，低或高校正相對(duì)ERCC1表達(dá)和總體存活之間的關(guān)聯(lián)的對(duì)數(shù)秩統(tǒng)計(jì)量為3.97，P值為0.046。未校正的對(duì)數(shù)秩結(jié)果如圖4所示。
檢驗(yàn)了5.8×10-3的分離校正相對(duì)ERCC1表達(dá)域值，因?yàn)橐郧暗难芯勘砻鳎撝蹬c胃癌患者的總體存活相關(guān)。(Metzger等，J Clin Oncol1998；16309-316)。在該研究中，校正相對(duì)ERCC1水平低于5.8×10-3的NSCLC患者組的總體存活顯著低于ERCC1水平高于5.8×10-3的患者(對(duì)數(shù)秩統(tǒng)計(jì)量6.37，P＝0.011)，但更高的6.7×10-3的校正相對(duì)ERCC1表達(dá)域水平是更強(qiáng)的判別因素。
其它在使用Kaplan Meier存活曲線和對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)進(jìn)行的單變量分析中與總體存活顯著相關(guān)的因素是治療期體重減輕和ECOG表現(xiàn)狀態(tài)(表2)。患者年齡(P＝0.18)、性別(P＝0.87)、腫瘤分期(P＝0.99)、腫瘤細(xì)胞類型(P＝0.63)和胸膜滲出的存在(P＝0.71)都不是總體存活的顯著預(yù)后因素。校正的相對(duì)ERCC1表達(dá)水平、ECOG表現(xiàn)狀態(tài)和體重減輕在Cox危險(xiǎn)比回歸模型多變量分析中仍然是存活的顯著預(yù)后因素。對(duì)腫瘤分析進(jìn)行分層的Cox回歸模型的P值是0.038，體重減輕為0.017，ECOG表現(xiàn)狀態(tài)為0.02(PS 0與1或2)。
該研究發(fā)現(xiàn)了用基于鉑的化療治療癌癥患者后低ERCC1 mRNA表達(dá)水平與改進(jìn)的存活之間的關(guān)聯(lián)。
序列表<110>K.D.達(dá)南伯格等<120>基于ERCC1和TS表達(dá)確定化療方案的方法<130>11220/145<140>待定<141>- -<150>09/877,095<151>2001-06-11<150>09/796,491<151>2001-03-02<160>7<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>1gggaatttgg cgacgtaatt c21<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>2gcggaggctg aggaacag18<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>3cacaggtgct ctggcccagc acata25<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>4accaccacgg ccgagcgg18<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>5tgagcgcggc tacagctt18<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>6tccttaatgt cacgcacgat 20<210>7<211>1097<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>7aagtgctgcg agccctgggc cacgctggcc gtgctggcag tgggccgcct cgatccctct 60gcagtctttc ccttgaggct ccaagaccag caggtgaggc ctcgcggcgc tgaaaccgtg 120aggcccggac cacaggctcc agatggaccc tgggaaggac aaagaggggg tgccccagcc 180ctcagggccg ccagcaagga agaaatttgt gatacccctc gacgaggatg aggtccctcc 240tggagtggcc aagcccttat tccgatctac acagagcctt cccactgtgg acacctcggc 300ccaggcggcc cctcagacct acgccgaata tgccatctca cagcctctgg aaggggctgg 360ggccacgtgc cccacagggt cagagcccct ggcaggagag acgcccaacc aggccctgaa 420acccggggca aaatccaaca gcatcattgt gagccctcgg cagaggggca atcccgtact 480gaagttcgtg cgcaacgtgc cctgggaatt tggcgacgta attcccgact atgtggcggg 540ccagagcacc tgtgccctgt tcctcagcct ccgctaccac aacctgcacc cagactacat 600ccatgggcgg ctgcagagcc tggggaagaa cttcgccttg cgggtcctgc ttgtccaggt 660ggatgtgaaa gatccccagc aggccctcaa ggagctggct aagatgtgta tcctggccga 720ctgcacattg atcctcgcct ggagccccga ggaagctggg cggtacctgg agacctacaa 780ggcctatgag cagaaaccag cggacctcct gatggagaag ctagagcagg acttcgtctc 840ccgggtgact gaatgtctga ccaccgtgaa gtcagtcaac aaaacggaca gtcagaccct 900cctgaccaca tttggatctc tggaacagct catcgscgca tcaagagaag atctggcctt 960atgcccaggc ctgggccctc agaaagcccg gaggctgttt gatgtcctgc acgagccctt 1020cttgaaagta ccctgatgac cccagctgcc aaggaaaccc ccagtgtaat aataaatcgt 1080cctcccaggc caggctc 109權(quán)利要求
1.一種確定用于治療患者腫瘤的基于鉑的化療方案的方法，所述方法包括(a)獲得腫瘤的組織樣品并固定樣品，以獲得固定的腫瘤樣品；(b)從固定的腫瘤樣品分離mRNA；(c)使用在嚴(yán)格條件下與ERCC1基因的一個(gè)區(qū)雜交的寡核苷酸引物對(duì)擴(kuò)增mRNA，獲得擴(kuò)增樣品；(d)測(cè)定擴(kuò)增樣品中的ERCC1 mRNA的量；(e)比較步驟(d)的ERCC1 mRNA的量與內(nèi)部對(duì)照基因的mRNA量；并且(f)基于擴(kuò)增樣品中ERCC1 mRNA的量和ERCC1基因表達(dá)的預(yù)定域水平確定基于鉑的化療方案。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸引物由寡核苷酸引物對(duì)ERCC1，或基本上與其相同的寡核苷酸引物對(duì)組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述腫瘤是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)腫瘤。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述ERCC1基因表達(dá)的閾水平是內(nèi)部對(duì)照基因表達(dá)水平的約6.7×10-3倍。
5.一種用基于鉑的化療方案治療腫瘤的方法，包括(a)獲得腫瘤的組織樣品并固定樣品，以獲得固定的腫瘤樣品；(b)從固定的腫瘤樣品分離mRNA；(c)使用在嚴(yán)格條件下與ERCC1基因的一個(gè)區(qū)雜交的寡核苷酸引物對(duì)擴(kuò)增mRNA，獲得擴(kuò)增樣品；(d)測(cè)定擴(kuò)增樣品中的ERCC1 mRNA的量；(e)比較步驟(d)的ERCC1 mRNA的量與內(nèi)部對(duì)照基因的mRNA量；并且(f)當(dāng)測(cè)定的ERCC1基因的基因表達(dá)水平低于預(yù)定域值時(shí)，提供包含基因毒性劑的基于鉑的化療方案。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述腫瘤是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)腫瘤。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述基因毒性劑是吉西他濱、順鉑或其聯(lián)合。
8.一種測(cè)定固定且石蠟包埋的組織樣品中ERCC1表達(dá)水平的方法，包括(a)將組織樣品脫石蠟，獲得脫石蠟的樣品；(b)在存在有效量離液劑的條件下，分離脫石蠟樣品的mRNA；(c)使用在嚴(yán)格條件下與ERCC1基因的一個(gè)區(qū)雜交的寡核苷酸引物對(duì)擴(kuò)增mRNA，獲得擴(kuò)增樣品；(d)測(cè)定相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照基因mRNA量的ERCC1 mRNA量。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述寡核苷酸引物對(duì)由寡核苷酸引物對(duì)ERCC1或基本上與其相似的寡核苷酸引物對(duì)組成。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述內(nèi)部對(duì)照基因是β-肌動(dòng)蛋白。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中mRNA的分離是通過(guò)下列步驟進(jìn)行的(a)將含有有效濃度離液化合物的溶液中的組織樣品加熱至大約75℃-100℃，加熱約5-120分鐘；并且(b)回收離液溶液中的所述mRNA。
12.一種具有SEQ ID NO1序列的寡核苷酸引物或基本上與其相同的寡核苷酸。
13.一種具有SEQ ID NO2序列的寡核苷酸引物或基本上與其相同的寡核苷酸。
14.一種檢測(cè)ERCC1基因表達(dá)的試劑盒，其含有寡核苷酸對(duì)ERCC1或基本上與其相同的寡核苷酸對(duì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于醫(yī)學(xué)，特別是癌癥化療中的預(yù)測(cè)方法。本發(fā)明目的是提供一種通過(guò)檢測(cè)患者腫瘤細(xì)胞中ERCC1 mRNA的量，并把它預(yù)定閾表達(dá)水平進(jìn)行比較，從而評(píng)價(jià)固定或固定且石蠟包埋的組織中ERCC1的表達(dá)水平，并確定基于鉑的化療的方法。更特別是，本發(fā)明提供寡核苷酸引物對(duì)ERCC1，及使用它們檢測(cè)ERCC1 mRNA水平的方法。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1636069SQ01822442
公開(kāi)日2005年7月6日 申請(qǐng)日期2001年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月1日
發(fā)明者K·D·達(dá)南伯格 申請(qǐng)人:應(yīng)答遺傳公司