基于普魯士藍(lán)的光熱?化療聯(lián)合治療劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了基于普魯士藍(lán)的光熱?化療聯(lián)合治療劑及其制備方法，其特征在于：治療劑為類脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，是以普魯士藍(lán)納米粒子為內(nèi)核，在內(nèi)核外通過兩種不同的雙親性表面活性劑之間的疏水?疏水相互作用形成有載藥雙分子層，在載藥雙分子層內(nèi)包封有抗癌藥物。本發(fā)明基于普魯士藍(lán)的光熱?化療聯(lián)合治療劑是將普魯士藍(lán)與抗癌藥物聯(lián)合，以達(dá)到光熱?化療協(xié)同治療，不僅解決了化療藥物特異性差、人體利用率低的問題，同時也解決了光熱治療不徹底等不足，大大提高了治療效率，具有很好的臨床應(yīng)用前景。
【專利說明】
基于普魯士藍(lán)的光熱-化療聯(lián)合治療劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于納米材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于普魯士藍(lán)的光熱-化療聯(lián)合治療劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥一直是影響人類健康的重大疾病之一，眾多的科學(xué)家為癌癥的治愈做出了巨大的貢獻(xiàn)。眾所周知，化療與放射治療盡管對癌細(xì)胞有很強(qiáng)的殺傷作用，但因?yàn)檩^差的特異性，導(dǎo)致患者在治療過程中不可避免的出現(xiàn)嚴(yán)重的副作用。為了解決這個問題，科學(xué)家們提出了一種新的癌癥治療手段一光熱治療(Photothermal Therapy，PTT)。光熱治療是利用組織穿透性最強(qiáng)的近紅外光(波長650?950nm)對含有納米粒子的病變組織的定點(diǎn)照射，使病變組織升溫至42°C以上，而對正常組織幾乎沒有影響。光熱治療具有很高的特異性、低毒性，但為了避免過強(qiáng)的激光對人體正常組織造成傷害，光熱治療所用的近紅外激光強(qiáng)度較低，導(dǎo)致近紅外光在穿透人體組織到達(dá)病變部位時，無法完全殺死病變細(xì)胞。為了解決光熱治療無法完全殺死病變細(xì)胞的現(xiàn)象，科學(xué)家們提出了光熱-化療聯(lián)合治療的手段。通過納米粒子搭載抗癌藥物，使得抗癌藥物能夠隨納米粒子一起特異性的富集到病變部位，并協(xié)同光熱治療一起對病變細(xì)胞進(jìn)行徹底殺傷。
[0003]普魯士藍(lán)是一種具有近紅外吸收的MOF(Metal_oganic farmework)材料，其最初被廣泛用作染料，后經(jīng)過美國食品藥品管理局(U.S.Food and Drug Adminstrat1n)認(rèn)證為對人體無害的物質(zhì)，在醫(yī)用上作為鉈中毒的解毒劑。近十年人們發(fā)現(xiàn)普魯士藍(lán)對近紅外光具有很強(qiáng)的吸收，并且能高效的將吸收的光能轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮埽浔旧碛帜鼙蝗梭w完全排出，于是人們將普魯士藍(lán)制成納米粒子用來做光熱治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明是為解決上述光熱治療和化療在臨床應(yīng)用上的不足，提供一種基于普魯士藍(lán)的光熱-化療聯(lián)合治療劑及其制備方法，旨在使其同時具有光熱治療和化療能力，使兩種治療方法優(yōu)劣互補(bǔ)。
[0005]本發(fā)明為解決技術(shù)問題，采用如下技術(shù)方案:
[0006]本發(fā)明基于普魯士藍(lán)的光熱-化療聯(lián)合治療劑，其特點(diǎn)在于:所述治療劑為類脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，是以普魯士藍(lán)納米粒子為內(nèi)核，在所述內(nèi)核外通過兩種不同的雙親性表面活性劑之間的疏水-疏水相互作用形成有載藥雙分子層，在所述載藥雙分子層內(nèi)包封有抗癌藥物。
[0007]其中:所述抗癌藥物為已臨床使用的抗癌藥物，包括但不限于阿霉素、紫杉醇、吉西他濱、羥基喜樹堿、長春花堿或卡培他濱。
[0008]所述兩種不同的雙親性表面活性劑中的第一種選自雙十二烷基二甲基溴化胺、十六烷基三甲基溴化胺、脂肪酸鈉、油胺、油酸或2-乙基己基琥?酸酯磺酸鈉;第二種選自為二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇5000、甲氧基-聚乙二醇-氨基或甲氧基-聚乙二醇-巰基。
[0009]如圖1所示，上述基于普魯士藍(lán)的光熱-化療聯(lián)合治療劑的制備方法，包括如下步驟:
[0010](I)在水相中生成無保護(hù)的親水普魯士藍(lán)沉淀；
[0011](2)基于油包水法，利用第一種雙親性表面活性劑對無保護(hù)的親水普魯士藍(lán)沉淀進(jìn)行修飾，轉(zhuǎn)換為疏水普魯士藍(lán)納米粒子并溶于有機(jī)溶劑中，形成疏水普魯士藍(lán)納米粒子的分散液；
[0012](3)在疏水普魯士藍(lán)納米粒子的分散液中加入第二種雙親性表面活性劑和抗癌藥物，通過薄膜水化法，使疏水性普魯士藍(lán)納米粒子重新轉(zhuǎn)為親水性，并在普魯士藍(lán)納米粒子的外表面形成載藥雙分子層，同時使抗癌藥物包封在載藥雙分子層內(nèi)。
[0013]其中，步驟(I)中制備親水普魯士藍(lán)納米粒子的原料為氯化鐵和亞鐵氰化鉀、或氯化亞鐵和鐵氰化鉀、或硫酸亞鐵和鐵氰化鉀。
[0014]本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在:
[0015]1、本發(fā)明基于普魯士藍(lán)的光熱-化療聯(lián)合治療劑是將普魯士藍(lán)與抗癌藥物聯(lián)合，以達(dá)到光熱-化療協(xié)同治療，不僅解決了化療藥物特異性差、人體利用率低的問題，同時也解決了光熱治療不徹底等不足，大大提高了治療效率，具有很好的臨床應(yīng)用前景。
[0016]2、本發(fā)明克服了納米粒子對藥物的包封率低等缺陷，制備了具有高包封率的雙分子層結(jié)構(gòu)的普魯士藍(lán)納米粒子，大大提高了光熱-化療聯(lián)合治療的效率。
[0017]3、本發(fā)明基于普魯士藍(lán)的光熱-化療聯(lián)合治療劑制備過程簡單、溫和，同時可以適應(yīng)于大規(guī)模生成，具有工業(yè)應(yīng)用的潛力。
[0018]4、本發(fā)明的聯(lián)合治療劑所用的材料均為對人體安全的材料，人體均能排出或降解，無對人體的潛在毒性。
[0019]5、本發(fā)明制備得到的聯(lián)合治療劑具有良好的分散性、穩(wěn)定性，有利于臨床應(yīng)用。
[0020]6、本發(fā)明基于普魯士藍(lán)的光熱-化療聯(lián)合治療劑不僅可以在很低的濃度與激光強(qiáng)度下，達(dá)到殺死癌細(xì)胞的溫度，而且通過搭載抗癌藥物來實(shí)現(xiàn)抗癌藥物的局部富集，減少抗癌藥物對人體的副作用，促進(jìn)癌細(xì)胞對藥物的吸收。
【附圖說明】
[0021 ]圖1是本發(fā)明普魯士藍(lán)復(fù)合物的制作流程圖；
[0022]圖2是實(shí)施例1中磷脂修飾的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物的光熱穩(wěn)定性效果圖，其中圖2a對應(yīng)樣品I，圖2b對應(yīng)樣品2 ；
[0023]圖3a是實(shí)施例1中不同濃度的疏水普魯士藍(lán)納米粒子的甲苯分散液的紫外-可見吸收光譜圖；圖313是各濃度在808nm處吸收值的線性擬合圖；
[0024]圖4a是實(shí)施例1中不同濃度的磷脂修飾的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物的水分散液的紫夕卜-可見吸收光譜圖；圖4b是各濃度在808nm出吸收值的線性擬合圖；
[0025]圖5是實(shí)施例2中不同濃度的裝載藥物的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物的升溫曲線圖；
[0026]圖6是實(shí)施例2中游離阿霉素、磷脂修飾的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物與裝載藥物的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物的紫外-可見吸收光譜圖；
[0027]圖7是實(shí)施例2中裝載藥物的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物對人宮頸癌細(xì)胞的殺傷效果比較圖；
[0028]圖8a是實(shí)施例2中疏水性普魯士藍(lán)納米粒子(圖8a)和裝載藥物的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物(圖Sb)的透射電鏡圖；
[0029]圖9是實(shí)施例2中以MTT法表征照射前后游離阿霉素、未搭載藥物的磷脂修飾的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物、及載藥的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物對人體宮頸癌細(xì)胞存活率的影響圖，其中圖a為808nm激光下照射Omin;圖b為808nm激光下照射5min。
【具體實(shí)施方式】
[0030]實(shí)施例1制備磷脂修飾的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物的制備
[0031](I)稱取64.9mg的氯化鐵溶于20mL的去離子水中，攪拌至完全溶解后，再滴加含有76.1mg亞鐵氰化鉀的水溶液20mL，常溫?cái)嚢?分鐘使反應(yīng)完全，獲得無保護(hù)的親水普魯士藍(lán)沉淀的水溶液；
[0032](2)取22.5mg的油胺溶于15mL的甲苯中，渦旋至完全分散后，滴加到步驟(I)所獲得的溶液中，攪拌30分鐘，使親水普魯士藍(lán)納米粒子轉(zhuǎn)換為疏水普魯士藍(lán)納米粒子(也即圖1中的油胺修飾的疏水PB);
[0033]6000轉(zhuǎn)/min離心5分鐘，分層，疏水普魯士藍(lán)納米粒子充分溶解在上層甲苯中，形成疏水普魯士藍(lán)納米粒子的分散液；
[0034](3)取分散液lmL，與ImL 3.5mg/mL的二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)的氯仿溶液混合，用氮?dú)赓N壁持續(xù)鼓吹并勻速旋轉(zhuǎn)容器，直到溶液完全揮發(fā)并在瓶壁留下一層薄膜，加入3mL去離子水，水浴超聲使其完全分散，獲得磷脂修飾的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物(也即圖1中的磷脂修飾的親水PB)，記為樣品I。
[0035]為進(jìn)行對比，將上述樣品I的制備中的氯化鐵用量改為649mg，亞鐵氰化鉀用量改為761mg，油胺用量改為225mg，DSPE-PEG2000的濃度改為35mg/mL，其余不變，制得樣品2。
[0036]為進(jìn)行對比，將上述樣品I的制備中的油胺用量改為225mg，其余不變，制得樣品3。
[0037]圖2a為樣品I的光照穩(wěn)定性圖，其表征方法為:將3mL濃度為30yg/mL的步驟(3)所得磷脂修飾的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物水溶液(樣品I)置于808nm激光下照射lOmin，每間隔1s記錄一次溫度;停止激光照射后，每間隔1s記錄一次溫度直到溶液溫度降至起始溫度。此過程反復(fù)5次。得到的數(shù)據(jù)顯示樣品I每次照射能達(dá)到的溫度具有一致性，降溫至起始溫度所需要的時間也具有一致性，表現(xiàn)出很好的光照穩(wěn)定性。
[0038]圖2b為樣品3的光照穩(wěn)定性圖，其表征方法與樣品I相同，得到的數(shù)據(jù)顯示每次照射能達(dá)到的溫度均相比于前一次降低，說明了樣品3中油胺量的增加使得粒子的光照穩(wěn)定性下降。
[0039]樣品2與樣品I所得到的表征結(jié)果一致，說明各組分劑量比一定的情況下，各組分的量并不會對納米粒子的光照穩(wěn)定性有影響。
[0040]將步驟(2)所得疏水普魯士藍(lán)納米粒子的甲苯分散液稀釋至不同濃度(lOyg/mL、2(^8/11^、3(^8/1^、4(^8/1^、5(^8/1^、)，并測試其紫外-可見吸收光譜圖，結(jié)果如圖3所示。可以看出疏水性普魯士藍(lán)納米粒子在700nm左右具有一個強(qiáng)吸收，并且隨著濃度的增加，吸光度逐漸增加。圖3b為不同濃度的疏水普魯士藍(lán)納米粒子的甲苯溶液在808nm處吸收值的線性擬合，其線性相關(guān)度為0.9997。
[0041]將步驟(3)所得磷脂修飾的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物的水分散液稀釋至不同濃度(10μg/mL、20yg/mL、30yg/mL、40yg/mL、50yg/mL、)，并測試其紫外-可見吸收光譜圖，結(jié)果如圖4所示。可以看出磷脂修飾的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物在700nm左右具有一個強(qiáng)吸收，與疏水性普魯士藍(lán)納米粒子相同，表面所用表面活性劑并不會破壞普魯士藍(lán)的結(jié)構(gòu)。圖4b為普魯士藍(lán)納米復(fù)合物在808nm處吸收值的線性擬合，其線性相關(guān)度為0.9996。
[0042]實(shí)施例2基于普魯士藍(lán)的光熱-化療聯(lián)合治療劑的制備
[0043](I)稱取64.9mg的氯化鐵溶于20mL的去離子水中，攪拌至完全溶解后，再滴加含有76.1mg亞鐵氰化鉀的水溶液20mL，常溫?cái)嚢?分鐘使反應(yīng)完全，獲得獲得無保護(hù)的親水普魯士藍(lán)沉淀的水溶液；
[0044](2)取22.5mg的油胺溶于15mL的甲苯中，渦旋至完全分散后，滴加到步驟(I)所獲得的溶液中，攪拌30分鐘，使無保護(hù)的親水普魯士藍(lán)沉淀轉(zhuǎn)換為疏水普魯士藍(lán)納米粒子；
[0045]6000轉(zhuǎn)/min離心5分鐘，分層，疏水普魯士藍(lán)納米粒子充分溶解在上層甲苯中，形成疏水普魯士藍(lán)納米粒子的分散液；
[0046](3)取疏水普魯士藍(lán)納米粒子的分散液lmL，與ImL 3.5mg/mL的二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)的氯仿溶液、Iml 0.35mg/ml的阿霉素的甲醇-氯仿混合溶液(氯仿與甲醇的體積比為3:1)混合，用氮?dú)赓N壁持續(xù)鼓吹并勻速旋轉(zhuǎn)容器，直到溶液完全揮發(fā)并在瓶壁留下一層薄膜，加入3mL去離子水，水浴超聲使其完全分散，即獲得裝載藥物的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物，也即基于普魯士藍(lán)的光熱-化療聯(lián)合治療劑。
[0047]圖5為不同濃度的裝載藥物的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物的水分散液的升溫效果圖，其表征方式為:取3mL待測溶液置于808nm激光器下照射，照射時間為1min，激光強(qiáng)度為2W，間隔1s記錄一次溫度。數(shù)據(jù)結(jié)果說明隨著裝載藥物的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物的濃度增加，升溫效果更好。
[0048]圖6為50yg/mL的裝載藥物的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物的水分散液、5yg/mL的阿霉素水溶液、及50yg/mL的磷脂修飾的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物的水溶液(實(shí)施例1中的樣品I)的紫外-可見吸收光譜圖?？梢钥闯龃钶d藥物之后的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物在490nm左右的吸收較未搭載藥物的磷脂修飾的普魯士藍(lán)明顯增強(qiáng)，證明藥物已經(jīng)包封入納米復(fù)合物。
[0049]圖7為裝載藥物的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物對人宮頸癌細(xì)胞的殺傷效果比較。其中活細(xì)胞能被鈣黃綠素染色，死細(xì)胞則不能。圖7a的表征方式為將人體宮頸癌細(xì)胞置于光強(qiáng)2W的808nm激光下照射5min后，用鈣黃綠素染色，在熒光顯微鏡下拍照得到照片，可以看出全部的細(xì)胞都被染色，表明單獨(dú)的光強(qiáng)2W的808nm激光下照射5min對癌細(xì)胞殺傷能力很弱。圖7b的表征方式是將含有100yg/mL的裝載藥物的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物的人宮頸癌細(xì)胞置于808nm激光下照射5min后，用鈣黃綠素染色并拍照，照片顯示在激光照射區(qū)域沒有細(xì)胞被染色，表明細(xì)胞被完全殺死，即說明在此條件下，裝載藥物的普魯士藍(lán)納米粒子可以對癌細(xì)胞造成巨大的殺傷。
[0050]圖8a為步驟(2)所得疏水性普魯士藍(lán)納米粒子的透射電鏡圖，圖Sb為步驟(3)所得裝載藥物的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物的透射電鏡圖，從圖中可看出普魯士藍(lán)納米復(fù)合物的粒徑80nm左右。
[0051]圖9為以MTT法經(jīng)過808nm激光照射不同時間后，游離阿霉素、未搭載藥物的磷脂修飾的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物、及載藥之后的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物對人體宮頸癌細(xì)胞活性的影響。
[0052]具體測試方式為:將游離阿霉素的水溶液加入人體宮頸癌細(xì)胞的培養(yǎng)基中，得到培養(yǎng)基A;將磷脂聚乙二醇修飾的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物水溶液加入人體宮頸癌細(xì)胞的培養(yǎng)基中，得到培養(yǎng)基B;將裝載藥物的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物水溶液加入人體宮頸癌細(xì)胞的培養(yǎng)基中，得到培養(yǎng)基C;培養(yǎng)基A中阿霉素的濃度與培養(yǎng)基C中搭載的阿霉素的濃度一致，培養(yǎng)基B中磷脂聚乙二醇修飾的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物的濃度與培養(yǎng)基C中裝載藥物的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物的濃度一致。
[0053]圖9a中未經(jīng)過激光照射時，游離阿霉素與裝載藥物的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物對人體宮頸癌細(xì)胞活性影響相近，而磷脂聚乙二醇修飾的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物對人體宮頸癌細(xì)胞活性影響很小。
[0054]圖9b中經(jīng)過5min、2W的808nm激光照射后，載藥之后的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物比游離阿霉素對人體宮頸癌細(xì)胞活性殺傷更大，而磷脂聚乙二醇修飾的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物比游離阿霉素對人體宮頸癌細(xì)胞活性殺傷大但比裝載藥物的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物低，表明裝載藥物的普魯士藍(lán)納米復(fù)合物具有光熱-化療聯(lián)合治療的作用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.基于普魯士藍(lán)的光熱-化療聯(lián)合治療劑，其特征在于:所述治療劑為類脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，是以普魯士藍(lán)納米粒子為內(nèi)核，在所述內(nèi)核外通過兩種不同的雙親性表面活性劑之間的疏水-疏水相互作用形成有載藥雙分子層，在所述載藥雙分子層內(nèi)包封有抗癌藥物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于普魯士藍(lán)的光熱-化療聯(lián)合治療劑，其特征在于:所述抗癌藥物為阿霉素、紫杉醇、吉西他濱、羥基喜樹堿、長春花堿或卡培他濱。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于普魯士藍(lán)的光熱-化療聯(lián)合治療劑，其特征在于:所述兩種不同的雙親性表面活性劑中的第一種選自雙十二烷基二甲基溴化胺、十六烷基三甲基溴化胺、脂肪酸鈉、油胺、油酸或2-乙基己基琥珀酸酯磺酸鈉;第二種選自為二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇5000、甲氧基-聚乙二醇-氨基或甲氧基-聚乙二醇-巰基。4.一種權(quán)利要求1?3中任意一項(xiàng)所述基于普魯士藍(lán)的光熱-化療聯(lián)合治療劑的制備方法，其特征在于包括如下步驟: (1)在水相中生成無保護(hù)的親水普魯士藍(lán)沉淀； (2)基于油包水法，利用第一種雙親性表面活性劑對無保護(hù)的親水普魯士藍(lán)沉淀進(jìn)行修飾，轉(zhuǎn)換為疏水普魯士藍(lán)納米粒子并溶于有機(jī)溶劑中，形成疏水普魯士藍(lán)納米粒子的分散液； (3)在疏水普魯士藍(lán)納米粒子的分散液中加入第二種雙親性表面活性劑和抗癌藥物，通過薄膜水化法，使疏水性普魯士藍(lán)納米粒子重新轉(zhuǎn)為親水性，并在普魯士藍(lán)納米粒子的外表面形成載藥雙分子層，同時使抗癌藥物包封在載藥雙分子層內(nèi)。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于:步驟(I)中制備親水普魯士藍(lán)納米粒子的原料為氯化鐵和亞鐵氰化鉀、或氯化亞鐵和鐵氰化鉀、或硫酸亞鐵和鐵氰化鉀。
【文檔編號】A61K31/7068GK106039311SQ201610591422
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月25日 公開號201610591422.X, CN 106039311 A, CN 106039311A, CN 201610591422, CN-A-106039311, CN106039311 A, CN106039311A, CN201610591422, CN201610591422.X
【發(fā)明人】馬艷, 陳華健, 王咸文
【申請人】合肥工業(yè)大學(xué)