磁珠轉(zhuǎn)化普魯士藍(lán)的禽流感病毒免疫生物傳感器及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及納米材料科學(xué)及電化學(xué)生物傳感領(lǐng)域，尤其是一種磁珠轉(zhuǎn)化普魯士藍(lán) 的禽流感病毒免疫生物傳感器及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 磁性納米材料作為一種納米材料，不但具有比表面積大、生物相容性好、富含表面 功能基團(tuán)、表面自由能高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于高效固定大量生物分子，而且基于其獨(dú)特磁性在 磁分離富集和磁熱療等領(lǐng)域備受重視。然而，當(dāng)前磁珠涉及的應(yīng)用主要基于磁性，其本身化 學(xué)/電化學(xué)性質(zhì)的應(yīng)用鮮有開拓。
[0003] 生物傳感研究中，信號輸出和放大是決定檢測性能的最關(guān)鍵因素之一，當(dāng)前基于 納米材料優(yōu)異性質(zhì)而實(shí)現(xiàn)信號輸出和放大是研究前沿和應(yīng)用熱點(diǎn)。當(dāng)前研究中，磁性材料 常用于在樣品中快速和高效分離目標(biāo)物，在信號輸出方面應(yīng)用極少。其它納米材料，如貴金 屬納米顆粒、碳納米管/纖維和半導(dǎo)體量子點(diǎn)等，因具有優(yōu)異表面修飾功能和獨(dú)特的光、電、 熱等性質(zhì)而廣泛用于信號輸出，但前期修飾和功能化過程中涉及大量分離步驟，頻繁使用 離心、超濾和透析等手段，繁瑣而耗時(shí)。因此，可快速分離且信號輸出/放大功能豐富的新材 料和新方法可望顯著便利生物傳感器構(gòu)建與檢測，提升性能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種磁珠轉(zhuǎn)化普魯士藍(lán)的禽流感病毒免疫生物 傳感器及方法，基于磁珠標(biāo)記物高效放大信號進(jìn)行禽流H5N1生物傳感檢測。
[0005] 本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0006] -、一種磁珠轉(zhuǎn)化普魯士藍(lán)的禽流感病毒免疫生物傳感器：
[0007] 包括由磁珠轉(zhuǎn)化而成的普魯士藍(lán)和三電極系統(tǒng)，三電極系統(tǒng)以飽和甘汞電極為參 比電極，碳電極為對電極，Con A修飾磁珠標(biāo)記電極為工作電極。
[0008] 二、一種磁珠轉(zhuǎn)化普魯士藍(lán)的禽流感病毒免疫生物傳感器的制備方法：
[0009] 制備獲得作為參比電極的飽和甘汞電極和作為對電極的碳電極，所述Con A修飾 磁珠標(biāo)記電極和普魯士藍(lán)具體制備過程如下：
[0010] 1)處理磁珠水溶液制備獲得Con A修飾磁珠分散液；
[0011] 2)由Con A修飾磁珠分散液處理獲得Con A修飾磁珠標(biāo)記電極；
[0012] 3)將Con A修飾磁珠標(biāo)記電極置于鐵氰化鉀和硫酸鉀混合溶液中，采用三電極系 統(tǒng)，Con A修飾磁珠標(biāo)記電極為工作電極，甘汞電極為參比電極，碳棒為對電極，進(jìn)行多電位 階越（1.60V，450s; 0V，250s)掃描獲得普魯士藍(lán)。
[0013]本發(fā)明將普魯士藍(lán)在〇. 1M酸性K2S04溶液中-0.3V~0.5V掃循環(huán)伏安，根據(jù)普魯士 藍(lán)的氧化或還原峰電流定量樣品中禽流感病毒H5N1的濃度。
[0014]所述步驟1)具體如下：
[0015] 1.1)將磁珠水溶液在工作頻率為40kHz，功率為160W的超聲作用下分散5min，得到 分散均勾的磁珠分散液；
[0016] 1.2)將用于羧基化磁珠的檸檬酸與磁珠分散液混合，靜置于旋轉(zhuǎn)儀上12h過夜得 到羧基化磁珠分散液，檸檬酸的含量為0. lmmol-0.3mmol每毫克磁珠；
[0017] 1.3)將上述羧基化磁珠分散液依次進(jìn)行磁性分離、去除上清液，然后將磁珠用磷 酸鹽緩沖液清洗三次，然后分散于15mL MES緩沖液中，使得磁珠的最終濃度約為lmg/mL，4 °(：下保存；
[0018] 1.4)將EDC(2mg，10mM)和NHS(0.35mg，15mM)加入到lmL上述羧基化磁珠的MES分散 液中，常溫下攪拌反應(yīng)2小時(shí)，用磷酸緩沖液(pH 6.0)磁性分離、去除上清液，用磷酸鹽緩沖 液重復(fù)清洗三次，得到活化磁珠，分散在lmL磷酸緩沖液中；
[0019] 1.5)取活化磁珠與伴刀豆球蛋白A(Con A)于常溫下反應(yīng)，用磷酸緩沖液(pH 6.0) 磁性分離、去除上清液，用磷酸鹽緩沖液重復(fù)清洗三次，得到Con A修飾磁珠，分散在lmL磷 酸緩沖液中，在冰箱中4°C保存；
[0020] 所述步驟1)具體如下：
[0021] 2.1)將干凈的金磁電極在二硫雙琥珀酰亞胺基丙酸酯(DTSP)的丙酮溶液中浸泡， 丙酮洗3次，然后超純水洗3次，獲得DTSP修飾金磁電極；
[0022] 2.2)在DTSP修飾金磁電極上滴加伴刀豆球蛋白A溶液，常溫下反應(yīng)，用roS緩沖液 (pH 7.0)清洗，獲得蛋白A修飾金磁電極；
[0023] 2.3)在伴刀豆球蛋白A修飾金磁電極表面滴加禽流感病毒H5N1抗體溶液，常溫下 反應(yīng)，用PBS緩沖液(pH 7.0)清洗，獲得抗體修飾金磁電極；
[0024] 2.4)在抗體修飾金磁電極表面滴加牛血清白蛋白（BSA)溶液，常溫下反應(yīng)以封閉 非特異性結(jié)合位點(diǎn)，用PBS緩沖液(pH 7.0)清洗，最終獲得傳感電極；
[0025] 2.5)在傳感電極表面滴加禽流感病毒H5N1懸濁液，常溫下培育，用PBS緩沖液清 洗，獲得檢測電極；
[0026] 2.6)取Con A修飾磁珠分散液滴加到檢測電極表面，常溫反應(yīng)，用roS緩沖液清洗， 獲得Con A修飾磁珠標(biāo)記電極。
[0027] 所述的干凈的金磁電極采用以下方式清洗:金磁電極依次在砂紙、0.5μπι氧化鋁粉 末和0.05μπι氧化鋁粉末中打磨，打磨后經(jīng)充分清洗，再依次在超純水、乙醇和超純水中各超 聲5分鐘，配制Prihna溶液滴加5yL于電極表面，保持5分鐘，最后采用大量水進(jìn)行清洗。
[0028] 所述步驟1.2)中檸檬酸與磁珠分散液的配比為0. lmmol-0.3mmol每毫克磁性納米 料子。
[0029] 所述步驟1.5)中活化磁珠與Con A的質(zhì)量比為1: 5-1:10，時(shí)間為lh，反應(yīng)時(shí)間為 45_90min〇
[0030] 所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0 · 01M-0 · 05M，pH < 6 · 0 ;所述的MES，濃度為0.011_ 0.05M,pH<6.0〇
[0031] 所述步驟2.2)中0了3?濃度為1-5禮，反應(yīng)時(shí)間為4-1811。優(yōu)選的反應(yīng)時(shí)間是1211。 [0032] 所述步驟2.2)中伴刀豆球蛋白A溶液的濃度為0.1-0.5mg mL-1，反應(yīng)時(shí)間為45-90min〇
[0033] 所述步驟2.3)中禽流感病毒H5N1抗體溶液的濃度為0.1 -0.5mg ml/1，反應(yīng)時(shí)間為 45-90min〇
[0034] 所述步驟2.4)中用于封閉的牛血清白蛋白溶液的濃度為5%-10%，反應(yīng)時(shí)間為 45-90min〇
[0035] 所述步驟2.5)中禽流感病毒!15附的濃度為0.0025-0.16說1]，禽流感病毒!15附培育 時(shí)間為30_60min。
[0036] 所步驟2.6)中Con A修飾磁珠分散液用量為5-10yL，培育時(shí)間為30-60min。
[0037] 所述步驟3)種鐵氰化鉀和硫酸鉀混合溶液中鐵氰化鉀和硫酸鉀的濃度分別為 0.1-5m]\^P0.1M。
[0038] 所述多電位階躍采用以下參數(shù)：第一階段，電壓1.60V，時(shí)長450s;第二階段電壓 0V，時(shí)長250s。
[0039]所述多電位階躍替換為循環(huán)伏安法，循環(huán)伏安法參數(shù)為:高電位1.65V，低電位為-〇.3￥，所用溶液?!1<6.0。
[0040]本發(fā)明采用抗體修飾電極捕獲禽流感病毒H5N1，然后標(biāo)記磁珠;在磁場控制下，采 用電化學(xué)方法使磁珠標(biāo)記物轉(zhuǎn)化生成普魯士藍(lán);基于生成的普魯士藍(lán)的電化學(xué)還原峰定量 檢測禽流感病毒。
[0041] 本發(fā)明的有益效果是：
[0042] 采用本發(fā)明的方法可在前期基于磁分離而簡便修飾操作，檢測時(shí)通過原位電化學(xué) 轉(zhuǎn)化磁珠生成高電化學(xué)活性普魯士藍(lán)而顯著放大信號，實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物的便利和靈敏檢測。
[0043] 本發(fā)明的方法創(chuàng)新了磁性納米料子的新性質(zhì)，在充分利用磁珠的分離富集功能的 基礎(chǔ)上引入電化學(xué)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生電化學(xué)活性普魯士藍(lán)，獲得電化學(xué)信號輸出和放大功能。
[0044]本發(fā)明生物傳感技術(shù)可簡便、低成本和靈敏檢測禽流感病毒H5N1，并且在生物檢 測領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊。
【附圖說明】
[0045] 圖1為本發(fā)明中生物傳感器構(gòu)建和檢測原理示意圖。
[0046] 圖2為本發(fā)明中制備的Con A修飾磁珠的紅外表征圖。
[0047]圖中a、b和c三條曲線分別為羧基化磁珠 、Con A修飾磁珠和Con A的紅外表征曲 線。
[0048]圖3為本發(fā)明中不同修飾電極的掃描電鏡圖。
[0049] A、B、C分別表示電極表面捕獲禽流感病毒H5N1、標(biāo)記Con A修飾磁珠和電化學(xué)轉(zhuǎn)化 磁珠標(biāo)記物的掃描電鏡表征。
[0050] 圖4為本發(fā)明方法中不同禽流感病毒H5N1濃度時(shí)生物傳感器的循環(huán)伏安響應(yīng)曲線 和工作曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0051] 下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0052] 為了使本技術(shù)領(lǐng)域的人員更好地理解本發(fā)明技術(shù)方案，下面結(jié)合附圖和實(shí)施方式 對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0053]本發(fā)明的實(shí)施例如下：
[0054] 實(shí)施例1
[0055] 將15mL磁珠水溶液置于50mL離心管中，在工作頻率為40kHz，功率為160W的超聲作 用下分散5min，得到分散均勻的磁珠分散液。
[0056]再加入15mL濃度為0.4M的檸檬酸水溶液，超聲30min，常溫條件(25 °C )條件下旋轉(zhuǎn) 反應(yīng)20h。依次進(jìn)行磁性分離、去除上清液，將磁珠用磷酸鹽緩沖液清洗的步驟三次，然后分 散于15mL MES緩沖液中（磁珠的最終濃度約為lmg/mL)，4°C下保存。
[0057] 將EDC( 2mg，10mM)和NHS(0.35mg，15mM)加入到lm