富集t-2毒素的免疫磁珠及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及Τ-2毒素樣本的富集凈化處理工藝，具體涉及一種富集Τ-2毒素的免 疫磁珠及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] Τ-2毒素（T-2toxin)是A類單端孢霉烯族真菌毒素中毒性最強(qiáng)的一種，在自然 界中廣泛存在，其產(chǎn)生菌為鐮孢菌屬、木霉菌、膠枝霉菌和青霉菌等霉菌，主要污染小麥、大 麥、玉米等谷物及其制品。T-2毒素在動物體內(nèi)代謝緩慢，主要危害造血組織和免疫器官，可 造成免疫系統(tǒng)損傷及血液毒性，能夠抑制動物細(xì)胞DNA、RNA及蛋白質(zhì)合成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡， 引起白細(xì)胞缺乏等癥狀。人類誤食大量污染該類毒素的谷物后，除表現(xiàn)嘔吐、腹痛、腹瀉等 急性癥狀外，還可導(dǎo)致白細(xì)胞缺乏、壞死性咽峽炎、骨髓發(fā)育不良、食管和胃黏膜壞死等，嚴(yán) 重的可導(dǎo)致死亡。我國GB 21693-2008《配合飼料中T-2毒素的允許量》中規(guī)定豬配合飼 料和禽配合飼料中T-2毒素的允許量< lmg/kg。
[0003] 目前食品中T-2毒素的主要提取方法包括有機(jī)溶劑萃取法、免疫親和層析法等。 有機(jī)溶劑萃取法是目前最普遍的提取方法，但有機(jī)溶劑的萃取存在過程復(fù)雜、毒性大、所需 時間長等缺點(diǎn)，而且由于最終提取物中可能存在其他熒光物質(zhì)、色素、結(jié)構(gòu)類似物，從而對 檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾；免疫親和層析提高了試樣的凈化效果，同時可顯著減少有毒有害試劑 的使用，但樣品前處理較復(fù)雜，所用設(shè)備價格昂貴，對操作人員的技術(shù)要求也比較高，不適 合于大批量樣本檢測及大范圍推廣的應(yīng)用。
[0004] 免疫磁珠分離技術(shù)（Immunomagnetic bead-based separation，IMS)是近年來發(fā) 展起來的一項(xiàng)新的免疫學(xué)技術(shù)。免疫磁珠 （Immunomagnetic bead，IMB)既可結(jié)合活性蛋白 質(zhì)抗體，又可被磁鐵吸引，經(jīng)過處理后，可將抗體結(jié)合在磁珠上，使之成為抗體的載體，磁珠 上抗體與特異性抗原物質(zhì)結(jié)合后，則形成抗原-抗體-磁珠免疫復(fù)合物，這種復(fù)合物在磁力 作用下發(fā)生力學(xué)移動，使復(fù)合物與其它物質(zhì)分離，而達(dá)到分離特異性抗原的目的。免疫磁珠 (Hffi)是一個平臺，凡是利用抗原抗體結(jié)合原理進(jìn)行工作的領(lǐng)域都可以應(yīng)用，并且已在醫(yī)學(xué) 和生物學(xué)的骨髓移植、分離干細(xì)胞、細(xì)胞器、癌細(xì)胞、激素、病原菌以及毒素等方面取得了顯 著成績。近年來以其高度的敏感性和特異性被廣泛應(yīng)用于食品、水、生物樣品、環(huán)境等 標(biāo)本中真菌毒素的分離和檢測工作中，顯示出良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
[0005] 在分離真菌毒素方面，頂B可有效地收集、濃縮大量樣品中的少量真菌毒素，可避 免有機(jī)溶劑萃取法、免疫親和層析法提取時存在的缺點(diǎn)。對目的毒素的富集具有高分 離率、高特異性、高穩(wěn)定性、無污染、無毒性、操作簡便、樣品用量少且不會破壞毒素結(jié)構(gòu)等 優(yōu)點(diǎn)，與常規(guī)方法相比，不需要多加純化步驟去除雜質(zhì)，可直接對真菌毒素產(chǎn)生富集分離純 化的效果，并可在2-5h內(nèi)完成。并且磁珠上偶聯(lián)的抗體可準(zhǔn)確識別真菌毒素上的特征基 團(tuán)，從而減少漏檢，減少安全隱患。
[0006] 本發(fā)明利用磁珠與抗體的偶聯(lián)原理對可富集T-2毒素的免疫磁珠的制備工藝及 應(yīng)用條件進(jìn)行了優(yōu)化，大大提高了對T-2毒素的富集能力和檢測靈敏度，同時憑借免疫磁 珠自身的快速方便、價格低廉的特點(diǎn)，將其應(yīng)用于谷物及飼料中T-2毒素的分離與富集，可 以進(jìn)一步提尚快速檢測Τ_2毒素的效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種富集Τ-2毒素的免疫磁 珠及其制備方法和應(yīng)用，以解決Τ-2毒素樣品凈化分離操作復(fù)雜、分離效率低、存在較大安 全隱患的技術(shù)問題。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：提供一種富集Τ-2毒素的免疫 磁珠，所述免疫磁珠上偶聯(lián)有Τ-2毒素單克隆抗體；所述Τ-2毒素單克隆抗體是用Τ-2毒素 人工抗原免疫白鼠所得到的；所述Τ-2毒素人工抗原是Τ-2毒素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián) 物，其分子結(jié)構(gòu)式如式I所不：
[0010] 所述τ-2毒素人工抗原是按照如下方法制備得到的：
[0011] 將12mg T-2毒素半抗原溶于ImL N, N-二甲基甲酰胺（DMF)中，將30mg二環(huán)己基 碳二亞胺（DCC)和30mg N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)溶于0.2mL DMF后加入半抗原溶液中， 室溫攪拌24h，稱為A液；
[0012] 將50mg載體蛋白溶于3. 8mL PBS緩沖液（pH 7. 2)中，稱為B液；
[0013] 將A液加入到B液中，室溫攪拌24h，離心取上清液，將得到的產(chǎn)物透析，得到所述 T-2毒素人工抗原。
[0014] 所述T-2毒素半抗原的分子結(jié)構(gòu)式如式II所示：
[0016] 所述T-2毒素半抗原是按照如下方法制備得到的：I、將IOOmg T-2毒素加乙腈溶 解，再加入200 μ L乙酸和200mg重鉻酸吡啶鹽，70°C反應(yīng)4h，停止反應(yīng)，旋蒸，除去乙腈，加 水-乙酸乙酯萃取，干燥，蒸干，上硅膠柱，用三氯甲烷/甲醇（10:1)洗脫分離，得到中間產(chǎn) 物；II、將中間產(chǎn)物加3mL乙醇溶解后，再加入50mg碳酸鉀和5mL含有200mg氨基丙酸的水 溶液，60°C反應(yīng)12h，停止反應(yīng)，加水-乙酸乙酯萃取，除去有機(jī)相，水相加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH到 4,加乙酸乙酯萃取，除去水相，有機(jī)相干燥蒸干，乙醚重結(jié)晶，得到T-2毒素半抗原。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種上述免疫磁珠的制備方法，是以粒徑2. 8 μL?的羧基磁珠為 載體，羧基磁珠末端具有反應(yīng)活性的羧基基團(tuán)，在經(jīng)活化劑H)C-NHS組合處理后，活化磁珠 可與T-2毒素單克隆抗體進(jìn)行偶聯(lián)，制備成能夠富集凈化T-2毒素的免疫磁珠；
[0018] 上述免疫磁珠的制備方法具體描述如下：
[0019] (1)清洗：取IOOyL羧基磁珠于離心管中，用IOOyL含0.05%吐溫-20的ρΗ5·0、 25mmol/L的MES溶液洗滌2次，磁分離后移除上清；
[0020] (2)活化：用 4°C貯存的 pH5. 0、25mmol/L MES 溶液分別配制 50mmol/L 的 EDC、NHS 溶液；分別加入50 μ L新配制的EDC和NHS溶液到裝有磁珠的離心管中，渦旋混勾，室溫活 化30min，磁分離后移除上清，同（I)MES溶液洗滌2-3次；
[0021] (3)偶聯(lián)：將T-2毒素單克隆抗體溶解到60 μ L pH5. 0、25mmol/L MES溶液中，用 所述MES溶液調(diào)節(jié)總體積至100 μ L，輕柔加入到已活化磁珠中，室溫偶聯(lián)30min或4°C偶聯(lián) 2h，期間使磁珠保持混勻狀態(tài)；
[0022] ⑷封閉：磁分離后移除上清，加入100 μ L含50mmol/L乙醇胺的pH8. 0的PBS溶 液反應(yīng)15min封閉磁珠；
[0023] (5)保存：磁分離后移除上清，用IOOyL含0. 1 %-0.3 %牛血清白蛋白（BSA)、 0. 1 %吐溫-20的PBS溶液洗滌封閉好的磁珠3-5次，磁分離后移除上清，將磁珠復(fù)溶于含 0· 1% -0· 5% BSA、0. 01% -0· 1%吐溫-20、0· 02% NaN3的 PBS 溶液中，2-8°C保存?zhèn)溆谩?br>[0024] 本發(fā)明同時提供了上述免疫磁珠在富集凈化T-2毒素中的應(yīng)用。
[0025] 實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明富集T-2毒素的免疫磁珠對T-2毒素有很高的富集率和回收率， 對T-2毒素的富集率為40ng/mg (每毫克免疫磁珠可以捕獲40ng T-2毒素），對T-2毒素的 回收率達(dá)到85%以上。本發(fā)明富集T-2毒素的免疫磁珠可以高效、準(zhǔn)確、可靠、快速、簡便地 把待檢樣品中的T-2毒素富集起來，以便進(jìn)一步應(yīng)用于化學(xué)分析儀器檢測（HPLC，高效液相 色譜法）、酶聯(lián)免疫吸附法檢測和膠體金測試條的快速測試，具有濃縮待測樣品中T-2毒素 濃度、提高檢測下限、排除雜質(zhì)干擾、提高檢測準(zhǔn)確性和可靠性、減少樣品處理時間達(dá)到快 速檢測的優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0026] 圖I T-2毒素半抗原合成路線圖
[0027] 圖2 T-2毒素半抗原核磁共振氫譜圖
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn) 方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑 得到的試劑和材料。
[0029] 實(shí)施例1富集T-2毒素的免疫磁珠的制備
[0030] 本實(shí)施例給出了由T-2毒素單克隆抗體和含羧基的免疫磁珠偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物 作為富集Τ-2毒素的免疫磁珠的制備方法。該方法包括：
[0031] 一、Τ-2毒素單克隆抗體的制備
[0032] 1、Τ-2毒素半抗原的合成（合成路線見附圖1)及鑒定
[0033] 將IOOmg Τ-2毒素加乙腈溶解，再加入200 μ L乙酸和200mg重鉻酸吡啶鹽，70°C 反應(yīng)4h，停止反應(yīng)，旋蒸，除去乙腈，加水-乙酸乙酯萃取，干燥，蒸干，上硅膠柱，用三氯甲 烷/甲醇（10:1)洗脫分離，得到中間產(chǎn)物。
[0034] 將上述中間產(chǎn)物加3mL乙醇溶解后，再加入50mg碳酸鉀和5mL含有200mg氨基丙 酸的水溶液，60°C反應(yīng)12h，停止反應(yīng)，加水-乙酸乙酯萃取，除去有機(jī)相，水相加稀鹽酸調(diào) 節(jié)pH到4,加乙酸乙酯萃取，除去水相，有機(jī)相干燥蒸干，乙醚重結(jié)晶，得到T-2毒素半抗原 原。
[0035] 取上述半抗原經(jīng)核磁共振氫譜鑒定，結(jié)果見附圖2。1H-NMR(⑶Cl3, 300MHz) δ : 11.0(s，lH，TO0H)，5.37(d，lH，C = CH)，4.83(s，lH，CH-0)，4.43(s，lH，-CH-0-0C-)， 4· 13 (m，2H，CH2)，3· 9 (d，1H，CH)，3· 29 (m，1H，-CH-)，2· 59 (m，2H，-CH2-)，I. 69 (t，2H，-CH2-)， I. 04(s，3H，-CH3)。圖譜中化學(xué)位移δ = 11的為羧基氫，化學(xué)位移δ = I. 6、2. 3的為氨 基丙酸上的氫，說明間隔臂偶聯(lián)成功，T-2毒素半抗原結(jié)構(gòu)正確。
[0036] 2、T-2毒素人工抗原的合成及鑒定
[0037] 將 12mg T-2 毒素半抗原溶于 ImL DMF 中，將 30mg DCC 和 30mg NHS 溶于 0· 2mL DMF 后加入半抗原溶液中，室溫攪拌24h，稱為A液；
[0038] 將 50mg BSA 溶于 3. 8mL PBS 緩沖液（pH 7. 2)中，稱為 B 液；
[0039] 將A液逐滴緩慢滴加到B液中，室溫攪拌24h，離心取上清液轉(zhuǎn)移到透析袋中，用 0.0 lmol/L pH7. 2的PBS緩沖液于4°C透析3天，每天換3次透析液；透析后，離心除去殘余 的沉淀，取上清液得到T-2毒素人工抗原，分裝后-20°C保存。
[0040] 按合成T-2毒素人工抗原反應(yīng)所用半抗原、載體蛋白與偶聯(lián)產(chǎn)物的比例，進(jìn)行紫 外（200nm~400nm)掃描測定，通過比較三者分別在260nm和280nm的吸光值計算其結(jié)合 比。偶聯(lián)物T-2毒素半抗原-BSA的最大吸收峰與T-2毒素半抗原、BSA的最大吸收峰相比 發(fā)生了明顯的變化，表明T-2毒素半抗原-BSA的合成是成功的。經(jīng)計算，半抗原與BSA的 結(jié)合比為15:1。
[0041] 3、T-2毒素單克隆抗體的制備
[0042] (1)雜交瘤細(xì)胞的獲得
[0043] 1)首次免疫：將T-2毒素半抗原-BSA偶聯(lián)物（免疫原）與等量的弗氏完全佐劑 充分乳化，皮下注射6周齡的Balb/c小鼠，每只0. 2mL ;
[0044]