專利名稱：一種單克隆抗體的制備方法及該抗體的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗菌肽PR-39單克隆抗體的制備方法，以及用這種單克隆抗體建立ELISA檢測方法。

背景技術(shù)：
由于天然抗菌肽分子量小，含量低，直接提取純化的產(chǎn)品純度很低，而且成本昂貴，因此高純度的抗菌肽免疫原難以獲得，市場上缺乏抗菌肽的特異性單克隆抗體，導(dǎo)致對生物體內(nèi)抗菌肽表達(dá)水平的研究停留在基因轉(zhuǎn)錄水平，難以進行翻譯水平的研究。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種單克隆抗體的制備方法，采用該方法能獲得大量的特異性單克隆抗體。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種單克隆抗體的制備方法用化學(xué)合成的抗菌肽PR-39活性中心部分肽段PR-11免疫Balb/c小鼠，再用免疫鼠的脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)篩選克隆獲得分泌抗豬抗菌肽PR-39單克隆抗體的雜交瘤株，最終得到所需抗體。
作為本發(fā)明制備方法的改進該抗菌肽PR-39活性中心部分肽段PR-11為Phe-Phe-Pro-Pro-Arg-Leu-Pro-Pro-Arg-Ile-Pro。
本發(fā)明還提供了上述方法制備的單克隆抗體的用途，用于建立酶聯(lián)免疫吸附劑測定法，檢測乳鐵蛋白對骨髓細(xì)胞分泌PR-39水平的影響。
本發(fā)明以人工合成的豬抗菌肽PR-39活性中心部分肽段作為免疫原，應(yīng)用雜交瘤技術(shù)成功制備了抗PR-39的單克隆抗體，并應(yīng)用制備的單克隆抗體建立酶聯(lián)免疫吸附實驗。此外，還可以應(yīng)用制備的抗菌肽單克隆抗體建立親和層析法，為抗菌肽的分離純化提供了新的方法，解決了傳統(tǒng)分離純化方法存在的問題。



下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步詳細(xì)說明。
圖1是本發(fā)明的抗菌肽PR-39單克隆抗體效價圖； 圖2是乳鐵蛋白對豬抗菌肽PR-39基因表達(dá)的影響圖。

具體實施例方式 實施例1、人工免疫原的制備 人工合成含有豬抗菌肽PR-39活性中心20-26位氨基酸的兩個肽段17-27位的11個氨基酸肽段PR-11(Phe-Phe-Pro-Pro-Arg-Leu-Pro-Pro-Arg-Ile-Pro)和前26個氨基酸肽段PR-26(Arg-Arg-Arg-Pro-Arg-Pro-Pro-Tyr-Leu-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro-Pro-Pro-Phe-Phe-Pro-Pro-Arg-Leu-Pro-Pro-Arg-Ile)。用碳化二亞胺(EDC)法制備免疫原PR11-OVA，Bradford法測定偶聯(lián)后PR11-OVA的蛋白濃度后，分裝保存于-20℃。采用同樣的方法制備人工包被原PR11-BSA、PR26-BSA，分裝保存于-20℃。
取8-12周齡健康雌性Balb/c純系小鼠，采用兩次基礎(chǔ)免疫和一次加強免疫的方案，直接腹腔注射進行免疫。第1天用100μl PR11-OVA+100μl福氏完全佐劑進行基礎(chǔ)免疫，第16天用100μl PR11-OVA+100μl福氏不完全佐劑進行第二次基礎(chǔ)免疫，第31天直接給小鼠腹腔注射200-250μl的PR11-OVA進行加強免疫；第34天將免疫的Balb/c小鼠摘除眼球取血，收集血清作為陽性對照，放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 頸部脫臼處死放血后的Balb/c小鼠，75％乙醇消毒后放入超凈工作臺取出脾臟，剪成小塊，用組織研磨器制備脾細(xì)胞懸液，補加適量RPMI-1640培養(yǎng)液靜置3-5min后，洗細(xì)胞兩次，1000rpm離心5min，在用HAT培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后，計數(shù)備用。融合前兩周，取出凍存于液氮中的Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞用20％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液復(fù)蘇培養(yǎng)，長成單層后傳代；在準(zhǔn)備融合的前三天更換為含20％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，保證骨髓瘤細(xì)胞處于對數(shù)生長期。融合前，制備成骨髓瘤細(xì)胞懸液，用RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌兩次，1000rpm離心5min，懸浮于RPMI 1640培養(yǎng)液中，計數(shù)備用。
將制備的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞按照10∶1的細(xì)胞數(shù)量比例混合于50ml離心管內(nèi)，0.5ml的50％PEG作為融合劑進行細(xì)胞融合。取少量HAT培養(yǎng)液將細(xì)胞小心吹散，然后加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，放入37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。一般一只小鼠免疫脾細(xì)胞能接種10塊以上的96孔板。融合細(xì)胞培養(yǎng)3天后，用HAT培養(yǎng)液換掉1/2舊培養(yǎng)液，經(jīng)過HAT培養(yǎng)基的選擇作用，最終只有雜交瘤細(xì)胞能夠生存并不斷繁殖。7-10天后確認(rèn)骨髓瘤細(xì)胞全部死亡后漸次換成HT培養(yǎng)液，以后視克隆生長情況更換新的HT培養(yǎng)液。
當(dāng)雜交瘤細(xì)胞生長占孔底面積1/4、細(xì)胞生長良好時，建立間接ELISA方法，檢測上清液中的抗體，篩選出同時抗PR-11和PR-26的陽性孔。用人工包被原PR11-BSA或PR26-BSA包被酶標(biāo)反應(yīng)板，100μl/孔，4℃包被過夜。PBST洗滌3次后用1-5％脫脂奶粉封閉，150μl/孔，37℃孵育0.5-1h。PBST洗滌1次后加入待測孔培養(yǎng)上清，100μl/孔，37℃孵育1-2h。PBST洗滌3次后加入檢測抗體辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，100μl/孔，37℃孵育1-2h。PBST洗滌4次后用OPD-H2O2底物顯色，10-20min后用2mol/L H2SO4終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀讀取490nm的OD值，與陰性對照孔490nm的OD值比值大于2.1的為陽性。
通過上述方法篩選出的陽性上清含有PR-39部分肽段PR-11和PR-26的特異性抗體，進一步采用天然抗菌肽PR-39的抑制性ELISA實驗驗證該陽性上清能否與PR-39發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。豬骨髓細(xì)胞培養(yǎng)上清中含有天然抗菌肽PR-39，以骨髓細(xì)胞培養(yǎng)上清為抑制對象，用制備的陽性上清建立抑制性ELISA，檢測陽性上清與骨髓細(xì)胞培養(yǎng)上清中PR-39的反應(yīng)情況。通過穿刺從30日齡仔豬股骨抽取30ml骨髓置于RPMI 1640培養(yǎng)液(含10％胎牛血清)中，用槍頭抽吸使骨髓細(xì)胞分離為單個細(xì)胞，然后平鋪于等量比重為1.077g/mL的淋巴細(xì)胞分離液上，2000rpm離心30min后，取粒細(xì)胞層到一新離心管中，用RPMI1640培養(yǎng)液洗滌兩次以去除分離液，重新懸浮即得到骨髓粒細(xì)胞懸液。把所獲細(xì)胞以5×106個/ml接種于六孔培養(yǎng)板，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時后，將培養(yǎng)孔內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)液12000rpm離心5min，上清液即為所需的豬骨髓細(xì)胞培養(yǎng)上清，分裝凍存于-20℃冰箱備用。
用PR11-BSA或PR26-BSA以每孔100μl定量包被酶標(biāo)板，4℃孵育過夜；PBST洗滌后用脫脂奶粉封閉，37℃孵育0.5-1h；PBST洗滌1次后，每孔加入50μl骨髓細(xì)胞培養(yǎng)上清(對照孔加等量的PBS)，同時每孔加入50μl特異性陽性上清，37℃孵育1-2h，PBST洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37℃孵育1-2h；PBST洗滌后用OPD-H2O2底物顯色，10-20min后用2mol/L H2SO4終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀讀取490nm的OD值。與對照孔比較，如果試驗孔的顏色深度較對照孔淺，則表明所制備的特異性陽性上清含有骨髓細(xì)胞培養(yǎng)上清中天然抗菌肽PR-39的特異性抗體。
實施例2、陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆 用巴氏消毒管輕輕吹打要克隆的目標(biāo)孔細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中制備系列倍比細(xì)胞懸液，每孔0.2ml，細(xì)胞沉淀2-3h，倒置顯微鏡下挑選有合適細(xì)胞數(shù)目的孔。第一次克隆挑80-100個細(xì)胞/孔，第二次克隆挑60-80個細(xì)胞/孔。將所挑孔中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，然后加入10ml HT培養(yǎng)液，0.1ml/孔接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，即每孔約平均含有1個細(xì)胞?？寺?-10天后挑選單細(xì)胞克隆系，進行陽性檢測，獲得的陽性克隆孔進一步做第二次克隆、第三次克隆，直至克隆化后檢測上清的陽性率為100％且反應(yīng)程度基本一致時停止克隆，至此得到了產(chǎn)生抗豬抗菌肽PR-39抗體的陽性單細(xì)胞克隆系。挑選形態(tài)良好，抗體活性較高的細(xì)胞克隆進行擴大培養(yǎng)，收集對數(shù)生長期的陽性克隆孔雜交瘤細(xì)胞，用新鮮HT培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/ml以上，程序化凍存獲得的單克隆雜交瘤細(xì)胞系。
本發(fā)明單克隆抗體的檢測方法及結(jié)果如下 1、人工合成抗原的濃度。Brardford法測得人工免疫原PR11-OVA、人工包被原PR11-BSA和PR26-BSA的蛋白濃度分別為5.7mg/ml，4.2mg/ml，4.4mg/ml。
2、細(xì)胞融合率。免疫的Balb/C小鼠脾細(xì)胞和Sp2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞在50％PEG下融合，融合后的細(xì)胞共接種了7塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。用HAT培養(yǎng)基篩選，7塊培養(yǎng)板的細(xì)胞融合率均在90％以上。
3、PR-11陽性孔的篩選。以人工合成包被原PR11-BSA包被酶標(biāo)板，建立間接ELISA，篩選出四個抗PR-11的陽性孔。1B12、1D8、3H5、5H7四個孔內(nèi)細(xì)胞產(chǎn)生的上清液與PR11-BSA的反應(yīng)呈陽性，初步斷定這四個孔內(nèi)細(xì)胞分泌人工合成肽段PR-11的抗體。
4、與人工合成功能序列PR-26的交叉反應(yīng)。分別以PR11-BSA、PR26-BSA、PR11、PR-26作為包被原包被酶標(biāo)板，建立間接ELISA。實驗內(nèi)容如表1所示 表1、與PR-26交叉反應(yīng) 結(jié)果表明，1B12，1D8，3H5，5H7四個陽性孔分泌的上清既能與PR-11發(fā)生陽性反應(yīng)，又能與PR-26發(fā)生陽性反應(yīng)。這兩個合成肽段均含有豬天然抗菌肽PR-39的活性中心，所以初步推斷這四個陽性孔所分泌的抗體也是天然豬抗菌肽PR-39的陽性抗體。
5、與骨髓細(xì)胞培養(yǎng)上清的抑制試驗。應(yīng)用四個陽性孔中陽性最強的3H5、5H7的細(xì)胞上清液，以骨髓細(xì)胞培養(yǎng)上清作為抑制對象，建立抑制性ELISA，檢測陽性上清與骨髓細(xì)胞培養(yǎng)上清中PR-39的反應(yīng)。反應(yīng)內(nèi)容具體如表2所示 表2、與骨髓細(xì)胞培養(yǎng)上清的抑制性反應(yīng) 結(jié)果表明，骨髓細(xì)胞培養(yǎng)上清中的PR-39與包被原PR11-BSA發(fā)生了明顯的抑制反應(yīng)，由此可見，陽性孔3H5、5H7內(nèi)細(xì)胞所分泌的抗體為天然豬抗菌肽PR-39的抗體。
6、制備單抗腹水。將天然抗菌肽PR-39的兩株陽性細(xì)胞3H5、5H7采用有限稀釋法進行多次克隆化，直至陽性率為100％，即為陽性單細(xì)胞克隆系。得到的陽性單克隆細(xì)胞一部分凍存?zhèn)溆茫徊糠謹(jǐn)U大培養(yǎng)用于單抗腹水制備。取8周齡左右Balb/c小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷7-10天后，將擴大培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞用生理鹽水懸浮，每只小鼠腹腔注射5-10×105個雜交瘤細(xì)胞。接種雜交瘤細(xì)胞后7-12天，小鼠腹部明顯膨大時用無菌注射器針頭抽取腹水。每只小鼠1次可抽取腹水5-10ml，間隔2-3天待腹水再生積聚后可同法再取2-3次；混合收集的腹水，置離心管中3000rpm離心20min后收集上清，即得到高效價的單克隆抗體腹水。
7、單克隆抗體腹水純化。采用辛酸-硫酸銨鹽析法純化獲得的腹水，可得到純度達(dá)98％以上的單克隆抗體，分裝凍存。
8、單克隆抗體含量的測定。分別取少量經(jīng)提純后的抗體3H5、5H7，稀釋1000倍，用紫外分光光度儀測定260nm和280nm的吸光度，并用公式IgG含量(mg/ml)＝(1.45×OD280-0.74×OD260)×稀釋倍數(shù)估算IgG的含量。根據(jù)公式計算得知單克隆抗體3H5、5H7的IgG含量分別為28.463mg/ml和16.124mg/ml。
9、單克隆抗體效價測定。利用制備的單克隆抗體3H5和5H7，以PR11-BSA作為包被原，建立間接ELISA，檢測兩株單抗腹水的效價，兩種單抗腹水分別做1∶1000，1∶2000，1∶4000，1∶8000，1∶16000……稀釋。將抗原PR11-BSA按100μl/孔包被酶標(biāo)板，4℃過夜；PBST洗滌后用脫脂奶粉封閉，37℃孵育0.5-1h；PBST洗滌后將單克隆抗體做倍比稀釋加入包被孔，100μl/孔，37℃孵育1-2h；PBST洗滌后加入稀釋5000-8000倍的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，100μl/孔，37℃孵育1-2h；PBST洗滌后OPD-H2O2底物顯色，10-20min后2mol/L H2SO4終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀讀取490nm的OD值，以與陰性490nm的OD值比值大于2.1時的最大稀釋倍數(shù)為陽性單克隆抗體的效價。測定內(nèi)容如表3所示，測定結(jié)果如圖1所示，3H5、5H7兩株單克隆抗體在稀釋2.048×106倍時，OD值均為陰性對照的2.1倍以上(陰性對照OD值分別為0.099、0.094)，因此效價均達(dá)到2.048×106以上，其中3H5的效價最高。單克隆抗體3H5在2.048×106～4.096×106倍稀釋的范圍內(nèi)，OD值下降最明顯；5H7在2.56×105～5.12×105倍稀釋的范圍內(nèi)，OD值下降最明顯，由此確定3H5、5H7分別稀釋2×106和3×105倍為最佳檢測濃度，對應(yīng)的IgG含量分別為14.232ng/ml和5.375ng/ml。
表3、腹水效價的測定 10、單克隆抗體亞類鑒定。將純化的單克隆抗體與Sigma公司的標(biāo)準(zhǔn)抗Balb/c小鼠IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗體，做雙向瓊脂擴散試驗以鑒定單克隆抗體類型及亞類。配制1％的瓊脂，制備成瓊脂平板，用孔徑3mm-4mm的打孔器打梅花孔，孔距為4mm；在中央孔中滴加標(biāo)準(zhǔn)抗Balb/c小鼠IgG1抗體，其他六孔分別滴加適當(dāng)稀釋的純化單抗腹水3H5、5H7，標(biāo)準(zhǔn)抗Balb/C小鼠IgM、IgG2a、IgG2b、IgG3抗體。將瓊脂平板在37℃培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，18h-20h取出觀察沉淀線，判斷單克隆抗體的類型及亞類。結(jié)果表明，兩個細(xì)胞株分別分泌的單克隆抗體均只與IgG1亞類的羊抗鼠標(biāo)準(zhǔn)抗血清反應(yīng)，而不與其它的標(biāo)準(zhǔn)蛋白亞類發(fā)生反應(yīng)，在單克隆抗體和標(biāo)準(zhǔn)蛋白IgG1亞類之間形成白色的沉淀線，即它們均為IgG1亞類。
11、單克隆抗體特異性檢驗。豬抗菌肽PMAP-23與豬抗菌肽PR-39均是由豬骨髓細(xì)胞分泌的抗菌肽。碳化二亞胺(EDC)法制備人工包被原PMAP23-BSA；用PR11-BSA、PMAP23-BSA包被酶標(biāo)板，建立間接ELISA，檢測所制備的單克隆抗體3H5、5H7與抗菌肽PMAP-23是否有交叉反應(yīng)，即對3H5、5H7進行特異性檢驗。分別將適量人工包被原PR11-BSA、PMAP23-BSA用包被液稀釋，100μl/孔，4℃孵育過夜。PBST洗滌后用脫脂奶粉封閉，150μl/孔，37℃孵育0.5-1h；PBST洗滌后分別將所制備的單克隆抗體3H5、5H7按最佳檢測濃度加入包被孔，100μl/孔，每組3個重復(fù)，37℃孵育1-2h；PBST洗滌后加入稀釋5000-8000倍的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，100μl/孔，37℃孵育1-2h；PBST洗滌后加入OPD-H2O2底物顯色，10-20min后用2mol/L H2SO4終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀讀取490nm的OD值，或直接肉眼觀察3H5、5H7與上述兩種包被原的反應(yīng)現(xiàn)象。單克隆抗體特異性檢驗內(nèi)容如表4所示，所制備的單克隆抗體3H5、5H7僅與PR-11發(fā)生特異性反應(yīng)，而與PMAP-23無交叉反應(yīng)。說明所制得的單克隆抗體3H5、5H7對抗菌肽PR-39具有特異性。
表4、單克隆抗體特異性檢驗 以上實驗結(jié)果表明，本發(fā)明的兩種單克隆抗體3H5、5H7的IgG含量分別為28.463mg/ml和16.124mg/ml；效價均在106以上；3H5、5H7的最佳測定濃度分別為稀釋2×106和3×105倍；兩株單克隆雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體均為IgG1類型。
實施例3、PR-39單克隆抗體的應(yīng)用建立抑制性ELISA實驗方法，檢測乳鐵蛋白對骨髓細(xì)胞分泌PR-39水平的影響 豬骨髓細(xì)胞培養(yǎng)上清中含有天然抗菌肽PR-39，以骨髓細(xì)胞培養(yǎng)上清為抑制對象，用制備的陽性上清建立抑制性ELISA，檢測乳鐵蛋白對骨髓細(xì)胞培養(yǎng)上清中PR-39水平的影響。通過穿刺從30日齡仔豬股骨抽取30ml骨髓置于RPMI 1640培養(yǎng)液(含10％胎牛血清)中，用槍頭抽吸使骨髓細(xì)胞分離為單個細(xì)胞，然后平鋪于等量比重為1.077g/mL的淋巴細(xì)胞分離液上，2000rpm離心30min后，取粒細(xì)胞層到一新離心管中，用RPMI1640培養(yǎng)液洗滌兩次以去除分離液，重新懸浮即得到骨髓粒細(xì)胞懸液。把所獲細(xì)胞以5×106個/ml接種于六孔培養(yǎng)板，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時后，換為無血清培養(yǎng)液，向試驗孔中分別加入10μg/ml、100μg/ml和1000μg/ml乳鐵蛋白，使乳鐵蛋白的終濃度分別為。空白對照孔用等量的培養(yǎng)液代替，繼續(xù)培養(yǎng)3小時和6小時，每孔設(shè)3個重復(fù)；在相應(yīng)的時間點收集培養(yǎng)孔內(nèi)的細(xì)胞，12000r/min離心5min取上清液，即為所需的豬骨髓細(xì)胞培養(yǎng)上清，凍存于-20℃冰箱備用。
用PRll-BSA定量包被酶標(biāo)反應(yīng)板，100μl/孔，4℃過夜；PBST洗滌3次后用1-5％脫脂奶粉封閉，150μl/孔，37℃孵育0.5～1h；PBST洗滌1次后，將上述所得的骨髓細(xì)胞培養(yǎng)上清樣品依次加入對應(yīng)孔中，50μl/孔；同時加入抗豬抗菌肽PR-39的特異性單克隆抗體3H5(稀釋2×106倍)，50μl/孔，37℃孵育l～2h；PBST洗滌3次后加入稀釋5000～8000倍的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，100μl/孔，37℃孵育l～2h；PBST洗滌4次后用OPD-H2O2底物顯色，10～20min后用2mol/L H2SO4終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀讀取OD490值。檢測結(jié)果如圖2所示不同濃度乳鐵蛋白處理的豬骨髓細(xì)胞分別培養(yǎng)3h、6h后，隨著乳鐵蛋白濃度的增加，骨髓細(xì)胞培養(yǎng)上清中抗菌肽PR-39的含量有所升高，當(dāng)添加1000μg/ml乳鐵蛋白時，抗菌肽PR-39的表達(dá)量顯著升高(P＜0.05)。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種單克隆抗體的制備方法，其特征在于用化學(xué)合成的抗菌肽PR-39活性中心部分肽段PR-11免疫Balb/c小鼠，再用免疫鼠的脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)篩選克隆獲得分泌抗豬抗菌肽PR-39單克隆抗體的雜交瘤株，最終得到所需抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的制備方法，其特征是所述抗菌肽PR-39活性中心部分肽段PR-11為Phe-Phe-Pro-Pro-Arg-Leu-Pro-Pro-Arg-Ile-Pro。
3.如權(quán)利要求1所述方法制備的單克隆抗體的用途，其特征在于用于建立酶聯(lián)免疫吸附劑測定法，檢測乳鐵蛋白對骨髓細(xì)胞分泌PR-39水平的影響。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種單克隆抗體的制備方法，用化學(xué)合成的抗菌肽PR-39活性中心部分肽段PR-11免疫Balb/c小鼠，再用免疫鼠的脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)篩選克隆獲得分泌抗豬抗菌肽PR-39單克隆抗體的雜交瘤株，最終得到所需抗體。本發(fā)明還公開了按照上述方法制備的單克隆抗體的用途，用于建立酶聯(lián)免疫吸附劑測定法，檢測乳鐵蛋白對骨髓細(xì)胞分泌PR-39水平的影響。采用本發(fā)明的方法能獲得大量的特異性單克隆抗體。
文檔編號C07K16/18GK101225111SQ20081005934
公開日2008年7月23日 申請日期2008年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月25日
發(fā)明者汪以真, 韓菲菲, 安忠花, 王愛萍 申請人:浙江大學(xué)