一種基于二代測試平臺的中通量基因表達分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因表達分析技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種基于二代測試平臺的中通量基 因表達分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在后基因組學時代，基因組學研究重屯、已開始從掲示生命的所有遺傳信息轉(zhuǎn)移到 在分子整體水平對功能的研究上。研究者們通過分析基因表達水平，可從中獲取基因轉(zhuǎn)錄 基因調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路核酸和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能及其相互聯(lián)系等相關(guān)信息；掲示基因在時 間、空間上的表達及調(diào)控模式，為研究基因功能，闡釋復(fù)雜性狀提供新的方法。
[0003] 分析目的基因表達量的常用技術(shù)有如下幾種:傳統(tǒng)的Nodhern blot分析和核糖 核酸酶保護實驗（Ribonuclease protection assay)靈敏度低，過程繁瑣，通量低（Parker, R.M.&Barnes,N.M.(1999)Methods Mol.Biol.106,247-283&Hod,Y.(1992)BioTechniques 13,852-854);基因忍片表達譜(DNA chip)具有高通量的優(yōu)勢，但難W避免高成本，重復(fù)性 較差的缺點；通常來說，實時定量PCR(Real-time quantitative PCR)和競爭性PCR (competitive PCR)被認定為靈敏度最高的定量PCR方法化ivak，K.J.，F(xiàn)lood，S.J.， MarmaroJ. ,Giusti,W.&Deetz,K. (1995)PCR Methods Appl.4,357-362&Becke;r-Andre, M.&Hahlbrock，K.(1989)Nucleic Acids Res.17,9437-9446)。
[0004] 然而，在面對大量樣本時，Real-time PCR的實驗成本讓許多研究者難W接受；另 一個短處是Real-time PCR很難矯正在擴增期間管與管的差異，從而影響最終穩(wěn)定性 (Siebert，P. D.化arrick，J. W. (1992)NaUire 359，557-558)。競爭性PCR利用目標模板與內(nèi) 參照模板共用同一對引物的特點，實現(xiàn)了同引物在同條件下的競爭性擴增，有著更高的穩(wěn) 定性和低廉的價格化orena Zentilin，Mauro Giacca(2007)NATURE PROTOCOLS 2,2092-2104)。但是目前的競爭性PCR也存在一些弊端:利用瓊脂糖凝膠電泳定量產(chǎn)物時面臨動態(tài) 檢測范圍低，通量低，穩(wěn)定性差的問題(Bustin ,S.A. (2000) J. Mol. Endocrinol. 25,169-193);利用質(zhì)譜定量則要引進單堿基延伸反應(yīng)(base extension reaction)，增加了實驗成 本，并且多基因產(chǎn)物均一'性不好，對于低豐度的基因分辨率低（化unming Ding,畑arIes R.Cantor(2003)PNAS.100，3059-3064)。
[0005] 近十年來，高速發(fā)展的二代測序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于全基因組和擴增子(PCR產(chǎn)物） 測序中，與Sanger測序相比，數(shù)據(jù)量急劇上升，而成本大幅下降，2014年，Illumina公司的 化seq X平臺已經(jīng)實現(xiàn)了 1000美金一個人類基因組測序的目標，比十年前的30億美金降低 了300萬倍(Watson M.(2014)Genome Biology. 15(2))。在分析基因表達方面，二代測序平 臺也得到了應(yīng)用，例如基于轉(zhuǎn)錄組測序的數(shù)字基因表達譜(RNA-seq)，但是該技術(shù)序列數(shù) (Reads)的測序深度很難區(qū)別許多低豐度和中等豐度基因的差異化信息（Simon J.Furney, Malin Pedersen. (2013)CANCER DISCOVERY 10,1122-9)，并且，研究者往往只需對自己感 興趣的基因進行表達差異分析，因此，一種具有高準確度，通量適中，成本低廉的基因表達 分析方法亟待建立。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種基于二代測試平臺的中通量基因表達分 析方法，該方法通過多重競爭性PCR對目標基因CDNA構(gòu)建文庫，再基于二代測序平臺檢測的 中通量基因表達分析方法，W降低現(xiàn)有基因表達分析技術(shù)的成本，并具有較高的準確度和 穩(wěn)定性。
[0007] 本發(fā)明的一種基于二代測試平臺的中通量基因表達分析方法，包括：
[0008] (1)按照多個基因的相對表達量將基因相應(yīng)的PCR引物分為兩組，并在組內(nèi)調(diào)整引 物濃度比例;其中，多個基因包括看家基因和目標基因；
[0009] (2)將步驟（1)中每個基因的兩組逆轉(zhuǎn)錄引物A和B，W標準品RNA為模板分別進行 A，B兩組多重逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，構(gòu)建標準品A，B競爭性模板；W待測樣品RNA為模板進行B組多重 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，構(gòu)建待測樣品B競爭性模板；
[0010] (3)利用步驟(2)中的標準品A，B競爭性模板和待測樣品B競爭性模板進行S輪多 重競爭性PCR;
[0011] (4)混合所有步驟(3)中得到的第=輪反應(yīng)產(chǎn)物作為二代測試平臺文庫上機測序， 提取數(shù)據(jù)并計算測定序列數(shù)，根據(jù)標準品梯度比例數(shù)據(jù)繪制標準曲線，校準待測樣本數(shù)據(jù)， 將看家基因歸一化處理后，即可得到不同樣本間多個基因相對表達量差異。
[0012] 所述步驟(1)中多個基因為8個基因，包括5個目的基因和3個看家基因。
[0013] 所述步驟（1)中基因的相對表達量是通過Real-Time PCR檢測，根據(jù)Ct值的高低將 PCR引物分為兩組。
[0014] 所述步驟(1)中調(diào)整引物濃度比例滿足多個基因產(chǎn)物均一性為差異在35倍W內(nèi)。 [001引所述調(diào)整引物濃度為將相對表達量較高的基因特異性PCR引物濃度下調(diào)1倍至4 倍。
[0016] 所述步驟(2)中逆轉(zhuǎn)錄引物A和B中引入相鄰兩個位點單堿基突變，逆轉(zhuǎn)錄后得到 兩種單堿基差異的cDNA。
[0017] 所述基于二代測試平臺的中通量基因表達分析方法應(yīng)用于基因表達分析實驗中。
[0018] 所述步驟(3)中S輪多重競爭性PCR包括：
[0019] 將標準品A，B競爭性模板按體積梯度比例混合，將待測樣品B競爭性模板與標準品 A競爭性模板等體積混合，作為第一輪多重競爭性PCR模板，混入低表達基因?qū)?yīng)的引物，進 行第一輪多重競爭性PCR反應(yīng)；
[0020] 將第一輪多重競爭性PCR反應(yīng)得到的第一輪多重競爭性PCR產(chǎn)物原液作為第二輪 的模板，混入高表達基因?qū)?yīng)的引物，進行第二輪多重競爭性PCR反應(yīng)；
[0021] 將第二輪多重競爭性PCR產(chǎn)物原液作為模板，加入接頭引物和測序引物，進行第S 輪多重PCR反應(yīng)。
[0022] 所述梯度比例為化L 16化，化L 12化，化L ，1化^ ，1化^ 。
[0023] 所述待測樣本B競爭性模板與標準品A競爭性模板等體積比為化
[0024] 本發(fā)明設(shè)及的競爭性PCR模板的構(gòu)建方法，包括:針對目的基因設(shè)計各含有一個不 同突變位點的兩種逆轉(zhuǎn)錄引物，分別進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，得到兩種不同的單位點突變競爭 性CDNA模板。
[OO巧]本發(fā)明設(shè)及的S輪多重競爭性PCR方法，包括:按照ReaI-t ime PCR的Ct值對多個 基因分為表達量高低兩組，在組內(nèi)進行對應(yīng)引物濃度比例調(diào)整；向混有多個基因的不同競 爭性模板管中，加入低表達基因?qū)?yīng)的引物，進行第一輪有限PCR擴增；W第一輪PCR產(chǎn)物原 液為模板，加入高表達基因?qū)?yīng)的引物，進行第二輪有限PCR擴增；W第二輪PCR產(chǎn)物稀釋液 為模板，添加接頭引物和測序引物，進行第S輪PCR擴增。其中，S輪的PCR循環(huán)數(shù)優(yōu)選分別 為 10 輪(cycle), 20 輪，15 輪。
[0026] 具體而言，本發(fā)明包括：
[0027] 特異性PCR引物設(shè)計：針對基因cDNA序列化ttp : //asia . ensembl. org/)，利用 ?1'；[1116^在線軟件化1：19:/7；1^1'0(10.'\￥；[.111；[1：.6山1/91'；[1116^/)進行設(shè)計，并在上下游引物5'端 分別添加上下游通用序列，進而合成引物(2化P左右）。
[002引特異性逆轉(zhuǎn)錄引物A，B設(shè)計：參照CDNA序列，將上述特異性PCR引物3'端延伸14個 堿基(bp)，并分別在第3、4位進行堿基顛換突變，作為A，B兩種特異性逆轉(zhuǎn)錄引物。
[0029] 接頭引物設(shè)計:接頭引物包含=部分序列，從5'端開始依次是二代測序接頭引物、 條形碼(barcode)序列、通用序列。條形碼序列的作用是區(qū)分不同的樣本。
[0030] 引物分組:利用Real-time PCR檢測多個基因在標準品中表達差異，按照Ct值高低 將相應(yīng)PCR引物分為兩組。具體過程為：
[0031] (1)化g D化Se 1處理過的標準品RNA加入到11.5化逆轉(zhuǎn)錄酶體系中，其中逆轉(zhuǎn)錄 酶體系包含2mM dNTPs，5XRT buffer 2化，20011/化逆轉(zhuǎn)錄酶0.化LJOUAiL RNA酶抑制物 和0.任意一組特異性逆轉(zhuǎn)錄引物;反應(yīng)程序為：25 °C 5min; 42 °C 60min，70°C 5min，逆轉(zhuǎn)錄 完成后將cDNA置于4°C臨時保存?zhèn)溆?。上述體系和反應(yīng)程序可W依照常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件 或試劑盒進行適當調(diào)整。
[0032] (2)將上述CDNA稀釋5倍，針對每個基因分別取2.扣L作為模板，混入Real-time PCR 15化體系，包含特異性PCR引物8pM，dd出0 2.化L，10iiL Mix，0.化L Rox;反應(yīng)程