本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及右旋糖苷在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)雞鼻炎副雞嗜血桿菌中的應(yīng)用，還涉及含有右旋糖苷的試劑盒和檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

目前，原微生物的檢測(cè)方法主要有分離培養(yǎng)鑒定法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)法和熒光定量pcr(fq-pcr)法，但分離培養(yǎng)鑒定法操作繁瑣、費(fèi)時(shí)，pcr法和fq-pcr法需要昂貴的儀器和試劑，檢測(cè)成本高，不適合中小型單位和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)應(yīng)用。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)技術(shù)與其它核酸擴(kuò)增技術(shù)相比，可以在等溫條件下快速、高效、特異地?cái)U(kuò)增靶序列，且操作簡(jiǎn)便，不需要昂貴的儀器和試劑，成本低，已在病原微生物檢測(cè)領(lǐng)域顯示出廣闊的發(fā)展前景。但擴(kuò)增過程中仍需要價(jià)格較高的dna聚合酶，如果能減少dna聚合酶的使用量將對(duì)進(jìn)一步降低病原微生物檢測(cè)成本具有重要意義。

副雞嗜血桿菌為革蘭氏陰性桿菌，是重要的條件致病菌和醫(yī)源性感染菌之一。由其引起的雞鼻炎副雞嗜血桿菌病是危害雞、火雞和山雞等家禽和野禽的一種接觸性傳染病。該病發(fā)病率和死亡率通常在10～30％，但有的雞場(chǎng)感染雞鼻炎副雞嗜血桿菌的病雞死亡率高達(dá)75％。一旦某地區(qū)的雞群發(fā)生雞鼻炎副雞嗜血桿菌感染，該病就會(huì)成為地方性疾病，很難徹底根除，并且經(jīng)常反復(fù)爆發(fā)，帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。雞鼻炎副雞嗜血桿菌感染以引起慢性萎縮性鼻炎，有惡臭，以及敗血癥、泌尿系感染等為主要病理特征，在病理學(xué)上很難與其它細(xì)菌性鼻炎感染進(jìn)行區(qū)別。因此有必要建立一種低成本的檢測(cè)雞鼻炎副雞嗜血桿菌病的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供右旋糖苷在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增中降低聚合酶使用量或/和縮短反應(yīng)時(shí)間中的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之二在于提供含有右旋糖苷的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的檢測(cè)試劑盒，靈敏度高，特異性好，操作簡(jiǎn)便快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，檢測(cè)成本低，適合中小型單位和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)應(yīng)用；本發(fā)明的目的之三在于提供所述的試劑盒在雞鼻炎副雞嗜血桿菌基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)中的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之四在于提供基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)雞鼻炎副雞嗜血桿菌的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下檢測(cè)方案：

1、右旋糖苷在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)雞鼻炎副雞嗜血桿菌中降低聚合酶使用量或/和縮短反應(yīng)時(shí)間中的應(yīng)用。

2、含有右旋糖苷的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)雞鼻炎副雞嗜血桿菌的試劑盒，包括如下組分：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增內(nèi)引物和外引物，嗜熱乳酸枯草芽孢桿菌dna聚合酶、10×熱聚合反應(yīng)緩沖液、三磷酸堿基脫氧核苷酸混合物、硫酸鎂、甜菜堿、右旋糖苷和熒光染料賽博綠?。凰?0×熱聚合反應(yīng)緩沖液由濃度為150-250mmol/l、ph為8.5-8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、濃度為50-100mmol/l的氯化鉀、濃度為50-100mmol/l的硫酸銨、濃度為15-20mmol/l的硫酸鎂和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5-1％的曲拉通x-100組成；所述三磷酸堿基脫氧核苷酸混合物由三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸組成；所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增內(nèi)引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示；所述外引物序列如seqidno.3和seqidno.4所示。

優(yōu)選的，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增內(nèi)引物濃度分別為5μmol/l；所述外引物濃度分別為20μmol/l。

優(yōu)選的，所述嗜熱乳酸枯草芽孢桿菌dna聚合酶濃度為4u/μl、所述三磷酸堿基脫氧核苷酸混合物各組分濃度為10mmol/l、硫酸鎂濃度為100mmol/l、甜菜堿濃度為2mol/l、右旋糖苷濃度為4mol/l和熒光染料賽博綠ⅰ質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％。

優(yōu)選的，所述10×熱聚合反應(yīng)緩沖液由濃度為250mmol/l、ph為8.8的tris–hcl、濃度為100mmol/l的氯化鉀、濃度為100mmol/l的硫酸銨、濃度為20mmol/l的硫酸鎂和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的tritonx-100組成。

2、所述的試劑盒在基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)雞鼻炎副雞嗜血桿菌中的應(yīng)用。

3、基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)雞鼻炎副雞嗜血桿菌的方法，包括以下步驟：

a、提取待檢樣品的細(xì)菌dna作為模板dna，控制模板dna水溶液的od260/od280值為1.6～2.0，濃度為10～100ng/μl；

b、雞鼻炎副雞嗜血桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增：在反應(yīng)管中配制環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系，各組分終濃度如下：濃度各為0.1-0.2μmol/l的內(nèi)引物，濃度各為0.5-0.8μmol/l的外引物，3～4u嗜熱乳酸枯草芽孢桿菌dna聚合酶，1×熱聚合反應(yīng)緩沖液，濃度各為0.5-1mmol/l的三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸，濃度為2-3mmol/l的硫酸鎂，濃度為0.5-1mol/l的甜菜堿，濃度為0.1～0.5mol/l的右旋糖苷，待檢模板dna水溶液0.5-1μl，余量為水；將反應(yīng)管于60～65℃水浴中保溫反應(yīng)20～30分鐘，再于80～95℃水浴中保溫3～5分鐘終止反應(yīng)；所述內(nèi)引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示；所述外引物序列如seqidno.3和seqidno.4所示；

c、顯色檢測(cè)：在反應(yīng)管中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的熒光染料賽博綠ⅰ水溶液0.5-1μl，用肉眼觀察顏色變化，如果顏色為黃色，說明待檢樣品中不含有雞鼻炎副雞嗜血桿菌；如果顏色變?yōu)榫G色，說明待檢樣品中含有雞鼻炎副雞嗜血桿菌。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明首次將右旋糖苷用于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，能夠顯著提高酶的熱穩(wěn)定性的，使用濃度不大于0.5m時(shí)(以葡萄糖計(jì))，可部分替代普通lamp試劑盒中(一半左右)價(jià)格昂貴的“聚合酶”和“甜菜堿”，可很好的促進(jìn)高含量gc片段的擴(kuò)增，可以將檢測(cè)反應(yīng)時(shí)間減少到20-30分鐘，不僅節(jié)約成本，還縮短檢測(cè)周期，對(duì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增具有重要意義。本發(fā)明還公開含有右旋糖苷的試劑盒，該試劑盒雞鼻炎副雞嗜血桿菌16srrna(genbankaccessionno.eu376364)保守區(qū)的六個(gè)特異區(qū)域設(shè)計(jì)了兩條特異性內(nèi)引物和兩條特異性外引物，從而保證了檢測(cè)結(jié)果的可靠性；本發(fā)明基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)雞鼻炎副雞嗜血桿菌，由四條引物對(duì)靶序列的六個(gè)特異區(qū)域進(jìn)行識(shí)別，特異性強(qiáng)；在等溫條件下擴(kuò)增，不會(huì)因溫度改變而造成時(shí)間損失，耗時(shí)短，在1小時(shí)內(nèi)即可將靶序列擴(kuò)增至10⁹倍，而且受非靶序列的影響小，與pcr法相比靈敏度更高，檢測(cè)限僅為幾個(gè)拷貝；此外，該技術(shù)不需要特殊、昂貴的儀器和試劑，擴(kuò)增產(chǎn)物不需要進(jìn)行凝膠電泳，直接用熒光染料顯色即可憑肉眼判斷結(jié)果，操作簡(jiǎn)便快速，檢測(cè)成本低。本發(fā)明的試劑盒及方法特別適合中小型單位和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)應(yīng)用。

附圖說明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進(jìn)行說明：

圖1為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)雞鼻炎副雞嗜血桿菌結(jié)果(1：空白對(duì)照；2：對(duì)比檢測(cè)1；3：實(shí)驗(yàn)組；4：對(duì)比檢測(cè)2)。

圖2為特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1：綠膿桿菌；2：金黃色葡萄球菌；3：沙門氏菌；4：雞鼻炎副雞嗜血桿菌)。

圖3為敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(p：陰性對(duì)照；1：10^-1；2：10^-2；3：10^-3；4：10^-4；5：10^-5；6：10^-6；7：10^-7；8：10^-8；9：10^-9；10：10^-10)。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1、基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)病原微生物的方法

基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)病原微生物的方法，本實(shí)施例以雞鼻炎副雞嗜血桿菌為例，其使用試劑如下：

a、濃度各為5μmol/l的上游內(nèi)引物fip水溶液和下游內(nèi)引物bip水溶液，濃度各為20μmol/l的上游外引物f3水溶液和下游外引物b3水溶液：引物序列如下：

上游內(nèi)引物fip：5’-cagtagcttcccaaggggctggtgtagcggtgaaatgcgt-3’(seqidno.1)；

下游內(nèi)引物bip：5’-cgctcatgtgcgaaagcgtgccccaaatcgacagcgttta-3’(seqidno.2)；

上游外引物f3：5’-agggaggggtagaattccac-3’(seqidno.3)；

下游外引物b3：5’-caccaagcctaaagcccaat-3’(seqidno.4)；

b、濃度為8u/μl的bstdna聚合酶水溶液；

c、10×熱聚合反應(yīng)緩沖液：由濃度為250mmol/l、ph為8.8的tris–hcl、濃度為100mmol/l的氯化鉀、濃度為100mmol/l的硫酸銨、濃度為20mmol/l的硫酸鎂和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的tritonx-100組成；

d、濃度為10mmol/l的dntps水溶液：由濃度各為10mmol/l的datp、dgtp、dctp和dttp組成；

e、濃度為100mmol/l的硫酸鎂水溶液；

f、濃度為2mol/l的甜菜堿水溶液；

g、濃度為4mol/l的右旋糖苷；

h、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的熒光染料sybrgreeni水溶液。

使用上述試劑利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)雞鼻炎副雞嗜血桿菌，包括如下步驟：

(1)提取待檢樣品的細(xì)菌dna作為模板dna：本實(shí)施例同時(shí)設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組，其中實(shí)驗(yàn)組為雞鼻炎副雞嗜血桿菌，來源于重慶市畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所；采用dna提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取各組細(xì)菌dna，按照試劑盒說明書操作，實(shí)驗(yàn)組所得細(xì)菌dna水溶液的od260/od280值為1.8，濃度為20ng/μl。

(2)雞鼻炎副雞嗜血桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增：在反應(yīng)管中配制總體積為25μl的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系：加入濃度均為5μmol/l的上游內(nèi)引物fip水溶液和下游內(nèi)引物bip水溶液各1μl，濃度均為20μmol/l的上游外引物f3水溶液和下游外引物b3水溶液各1μl，濃度為8u/μl的bstdna聚合酶水溶液0.5μl，10×熱聚合反應(yīng)緩沖液2.5μl，濃度為10mmol/l的dntps水溶液2.5μl，濃度為100mmol/l的硫酸鎂水溶液0.75μl，濃度為2mol/l的甜菜堿水溶液12.5μl，濃度為4mol/l的右旋糖苷2.5μl，用無dna酶的水稀釋至24μl，再加入模板dna水溶液1μl，混合均勻，即得；將反應(yīng)管于60～65℃水浴中保溫反應(yīng)25分鐘，再于80℃水浴中保溫5分鐘終止反應(yīng)；

(3)顯色檢測(cè)：在反應(yīng)管中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的熒光染料賽博綠ⅰ水溶液1μl，振搖均勻，用肉眼觀察顏色變化。

結(jié)果如圖1所示，結(jié)果顯示，空白對(duì)照組的顏色為黃色，說明不含有雞鼻炎副雞嗜血桿菌；實(shí)驗(yàn)組的顏色變?yōu)榫G色，說明含有雞鼻炎副雞嗜血桿菌，與預(yù)期結(jié)果一致。

對(duì)比檢測(cè)1：按照與上述相同的方法，區(qū)別在于反應(yīng)中不添加右旋糖苷，結(jié)果如圖1中所示。結(jié)果顯示，在不添加右旋糖苷的條件下顏色為黃色，不能檢測(cè)出含有雞鼻炎副雞嗜血桿菌。

對(duì)比檢測(cè)2：按照與上述相同的方法，區(qū)別在于反應(yīng)中不添加右旋糖苷，聚合酶添加量增加至1μl，保溫反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至60min，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，在不添加右旋糖苷的條件下，增加甜菜堿的使用量和延長(zhǎng)保溫反應(yīng)時(shí)間能夠檢測(cè)出雞鼻炎副雞嗜血桿菌。

為了證明上述檢測(cè)試劑及方法對(duì)雞鼻炎副雞嗜血桿菌檢測(cè)的準(zhǔn)確性，進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)和靈敏度實(shí)驗(yàn)，具體如下：

a、lamp的特異性實(shí)驗(yàn)

將肺炎克雷伯氏菌與實(shí)驗(yàn)鼠常發(fā)的非肺炎克雷伯氏菌(綠膿桿菌，金黃色葡萄球菌，沙門氏菌)的基因組dna以及大小鼠基因組dna按照上述反應(yīng)體系和條件建立lamp檢測(cè)方法，進(jìn)行特異性試驗(yàn)。設(shè)置肺炎克雷伯氏菌基因組dna為陽性對(duì)照，超純水為陰性對(duì)照，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，只有肺炎克雷伯氏菌基因組出現(xiàn)陽性反應(yīng)，其余均呈陰性反應(yīng)。

b、lamp敏感性試驗(yàn)

將肺炎克雷伯氏菌基因組dna進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別為10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9和10^-10(2拷貝)，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照(超純水)，按照上述反應(yīng)體系和條件建立lamp檢測(cè)方法，以確定檢測(cè)方法的敏感性，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明：建立的鼠肺炎克雷伯氏菌lamp檢測(cè)方法可檢測(cè)樣品中5.6拷貝數(shù)/反應(yīng)的肺炎克雷伯氏dna。

從上述結(jié)果可以看出，lamp擴(kuò)增方法較常規(guī)pcr和熒光pcr方法具有：

特異性強(qiáng)：僅通過是否擴(kuò)增即可判定目的基因的存在與否，從而完成細(xì)苗和病毒的定性檢測(cè)。

靈敏度高：常規(guī)pcr檢測(cè)方法靈敏度為100pg/反應(yīng)(l00拷貝數(shù)/反應(yīng))數(shù)量級(jí)，采用本發(fā)明檢測(cè)方法，檢測(cè)下限為13.5fg/反應(yīng)(5.6拷貝數(shù)/反應(yīng))。

操作和鑒定簡(jiǎn)便快捷：常規(guī)pcr整個(gè)過程在2-4個(gè)小時(shí)才能出結(jié)果，熒光定量pcr也需耍1-1.5個(gè)小時(shí)，本發(fā)明提供的檢測(cè)方法在20～30分鐘即可出現(xiàn)陽性結(jié)果，并且操作簡(jiǎn)便，對(duì)儀器要求低，僅需要普通水浴鍋，并可以通過染料直接觀測(cè)結(jié)果，省去了電泳的步驟，在基層檢測(cè)雞鼻炎副雞嗜血桿菌的實(shí)踐中有廣泛的應(yīng)用前景。

最后說明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。

序列表

<110>重慶市畜牧科學(xué)院

<120>右旋糖苷在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)雞鼻炎副雞嗜血桿菌中的應(yīng)用及其試劑盒和檢測(cè)方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>1

cagtagcttcccaaggggctggtgtagcggtgaaatgcgt40

<210>2

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>2

cgctcatgtgcgaaagcgtgccccaaatcgacagcgttta40

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>3

agggaggggtagaattccac20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>4

caccaagcctaaagcccaat20