本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種用于檢測抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的方法，特別涉及一種轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的側(cè)翼序列、檢測用引物對及檢測方法。
背景技術(shù)：
：目前在植物轉(zhuǎn)基因育種中所應(yīng)用的外源基因如bt、epsps等，大多來自原核生物，由于原核生物基因自身的特點，如1)at含量較高，超過60％，造成基因表達的mrna在植物體內(nèi)極易被降解；2)存在類似真核基因的內(nèi)含子切點、轉(zhuǎn)錄終止子序列，造成轉(zhuǎn)錄不完整、mrna異常剪切等；3)密碼子與植物密碼子存在較大差異，造成蛋白翻譯效率降低；4)其結(jié)構(gòu)與植物等真核生物差異顯著，如不含有真核生物基因的5’-utr序列和3’末端的polya加尾序列，導(dǎo)致基因在植物體內(nèi)往往表達水平較低。例如，來自于蘇云金芽孢桿菌的野生型殺蟲蛋白基因在植物中的表達量非常低，其表達的毒蛋白只占總蛋白的0.001％或者幾乎檢測不到。玉米螟是世界性的主要玉米害蟲，每年因玉米螟危害造成玉米產(chǎn)量損失在5％左右。我國是玉米螟的多發(fā)和重發(fā)區(qū)，20世紀70年代以來，幾乎每兩年就大發(fā)生一次，年損失玉米380-640萬噸，相當(dāng)于一個中等玉米省的產(chǎn)量。由于玉米的內(nèi)源抗蟲性是受多基因控制的，且心葉期靶標害蟲和穗期靶標害蟲基因各自獨立遺傳，用常規(guī)育種方法培育抗螟雜交種不僅周期長，而且很難獲得兼抗兩個世代玉米螟的親本。同時，玉米抗螟基因很有可能與高產(chǎn)性狀呈負相關(guān)，20年來各國抗螟育種均未取得明顯進展。本發(fā)明的發(fā)明人所在團隊在前期工作中，將耐草甘膦基因g2-aroa和抗蟲基因cry1ah經(jīng)過密碼子優(yōu)化，后轉(zhuǎn)入玉米中，獲得轉(zhuǎn)基因玉米，并經(jīng)實驗證實與密碼子優(yōu)化前相比，密碼子優(yōu)化后的轉(zhuǎn)基因玉米整體表現(xiàn)出g2-aroa和cry1ah蛋白的表達量明顯提高，且對草甘膦的耐受性以及抗蟲性也明顯提高(中國專利申請，申請?zhí)?01510845655.3)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的側(cè)翼序列、檢測用引物對及檢測方法。在本發(fā)明中，所述轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c具體為保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)的保藏編號為cgmccno.14334的玉米株系。本發(fā)明所提供的轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c外源插入片段的側(cè)翼序列，具體為如下(1)或(2)或(3)：(1)3’側(cè)翼序列；(2)5’側(cè)翼序列；(3)由所述3’側(cè)翼序列和所述5’側(cè)翼序列組成；所述3’側(cè)翼序列的核苷酸序列為序列表中序列1，或者在轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的基因組中至少含有序列表中序列1，并且沿著轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的基因組的方向向3’端延伸后所得的序列；所述5’側(cè)翼序列為序列表中序列2，或者在轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的基因組中至少含有序列表中序列2，并且沿著轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的基因組的方向向5’端延伸后所得的序列。所述側(cè)翼序列在如下任一中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍：a)檢測或輔助檢測待測玉米是否為轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c；b)檢測或輔助檢測待測樣本中是否含有轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c。本發(fā)明提供了用于檢測或輔助檢測轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的引物對或引物對組或單鏈dna組。所述引物對為引物對1或引物對2。所述引物對組由所述引物對1和所述引物對2組成。所述單鏈dna組為如下(i)或(ii)或(iii)：(i)由所述引物對1和單鏈探針1組成的單鏈dna組1；(ii)由所述引物對2和單鏈探針2組成的單鏈dna組2；(iii)由所述單鏈dna組1和所述單鏈dna組2組成的單鏈dna組3。其中，所述引物對1的上游引物可根據(jù)所述3’側(cè)翼序列中的t-dna插入序列設(shè)計獲得，下游引物可根據(jù)所述3’側(cè)翼序列中的玉米基因組固有序列設(shè)計獲得。所述引物對2的上游引物可根據(jù)所述5’側(cè)翼序列中的玉米基因組固有序列設(shè)計獲得，下游引物可根據(jù)所述5’側(cè)翼序列中的t-dna插入序列設(shè)計獲得。相應(yīng)的，所述單鏈探針1可根據(jù)所述3’側(cè)翼序列設(shè)計，且在所述3’側(cè)翼序列中所述單鏈探針1的識別區(qū)域位于所述引物對1的上游引物的識別區(qū)域和下游引物的識別區(qū)域之間；所述單鏈探針1的5’端標記有熒光報告基團，3’端標記有熒光淬滅基團。所述單鏈探針2可根據(jù)所述5’側(cè)翼序列設(shè)計，且在所述5’側(cè)翼序列中所述單鏈探針2的識別區(qū)域位于所述引物對2的上游引物的識別區(qū)域和下游引物的識別區(qū)域之間；所述單鏈探針2的5’端標記有熒光報告基團，3’端標記有熒光淬滅基團。進一步，當(dāng)所述3’側(cè)翼序列為序列表中序列1時，所述引物對1的上游引物可根據(jù)序列表中序列1的第1-294位設(shè)計獲得，下游引物可根據(jù)序列表中序列1的第295-712位設(shè)計獲得；所述單鏈探針1可根據(jù)序列表中序列1設(shè)計，且在序列1中所述單鏈探針1的識別區(qū)域位于所述引物對1的上游引物的識別區(qū)域和下游引物的識別區(qū)域之間。當(dāng)所述5’側(cè)翼序列為序列表中序列2時，所述引物對2的上游引物可根據(jù)序列表中序列2的第1-319位設(shè)計獲得，下游引物可根據(jù)序列表中序列2的第320-393位設(shè)計獲得；所述單鏈探針2可根據(jù)序列表中序列2設(shè)計，且在序列2中所述單鏈探針2的識別區(qū)域位于所述引物對2的上游引物的識別區(qū)域和下游引物的識別區(qū)域之間。在本發(fā)明中，所述引物對1具體為如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈dna分子組成的引物對；(a2)由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈dna分子組成的引物對。所述引物對2具體為由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈dna分子組成的引物對。所述單鏈dna組具體由序列表中序列7和序列8所示兩條單鏈dna分子組成的引物對，以及序列表中序列9所示的單鏈探針(5’端標記有熒光報告基團，3’端標記有熒光淬滅基團)組成。在本發(fā)明的具體實施例中，所述熒光報告基團具體為fam；所述熒光淬滅基團具體為bhq1。在本發(fā)明中，所述引物對或所述引物對組或所述單鏈dna組中的各單鏈dna可分別單獨包裝，也可等摩爾混合包裝。所述引物對或引物對組或單鏈dna組在制備用于檢測或輔助檢測轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明提供了用于檢測或輔助檢測轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的試劑盒。本發(fā)明所提供的用于檢測或輔助檢測轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的試劑盒，包含有所述引物對或引物對組或單鏈dna組。所述引物對或引物對組或單鏈dna組或所述試劑盒在如下任一中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍：a)檢測或輔助檢測待測玉米是否為轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c；b)檢測或輔助檢測待測樣本中是否含有轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c。本發(fā)明提供了檢測或輔助檢測待測玉米是否為轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的方法。本發(fā)明所提供的檢測或輔助檢測待測玉米是否為轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的方法，可為如下任一：(a)包括如下步驟：(a1)以所述待測玉米的基因組dna為模板，采用所述引物對1或所述引物對2進行pcr擴增，獲得pcr產(chǎn)物；(a2)根據(jù)所述pcr產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定所述待測玉米是否為轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c：若所述pcr產(chǎn)物中含有預(yù)期大小的dna片段，則所述待測玉米為或候選為轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c；反之，則所述待測玉米不為或候選不為轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c。(b)包括如下步驟：(b1)以所述待測玉米的基因組dna為模板，采用所述引物對1和所述引物對2分別進行pcr擴增，獲得pcr產(chǎn)物；(b2)根據(jù)所述pcr產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定所述待測玉米是否為轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c：若所述引物對1和所述引物對2各自所對應(yīng)的所述pcr產(chǎn)物中均含有預(yù)期大小的dna片段，則所述待測玉米為或候選為轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c；反之，則所述待測玉米不為或候選不為轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c。(c)包括如下步驟：(c1)以所述待測玉米的基因組dna為模板，采用所述單鏈dna組1或所述單鏈dna組2進行實時熒光定量pcr擴增；(c2)根據(jù)所述實時熒光定量pcr擴增結(jié)果，按照如下方法確定所述待測樣本中是否含有轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c：若ct值小于38，則所述待測樣本中含有或候選含有轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c；反之若ct值大于等于38或不能顯示，則所述待測樣本中不含有或候選不含有轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c。(d)包括如下步驟：(d1)以所述待測玉米的基因組dna為模板，采用所述單鏈dna組1和所述單鏈dna組2分別進行實時熒光定量pcr擴增；(d2)根據(jù)所述實時熒光定量pcr擴增結(jié)果，按照如下方法確定所述待測玉米是否為轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c：若采用所述單鏈dna組1和所述單鏈dna組2分別進行的兩個實時熒光定量pcr擴增過程中ct值均小于38，則所述待測玉米為或候選為轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c；反之，則所述待測玉米不為或候選不為轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c。本發(fā)明提供了檢測或輔助檢測待測樣本中是否含有轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的方法。本發(fā)明所提供的檢測或輔助檢測待測樣本中是否含有轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的方法，可為如下任一：(a)包括如下步驟：(a1)從所述待測樣本中提取基因組dna為模板，采用所述引物對1或所述引物對2進行pcr擴增，獲得pcr產(chǎn)物；(a2)根據(jù)所述pcr產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定所述待測樣本中是否含有轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c：若所述pcr產(chǎn)物中含有預(yù)期大小的dna片段，則所述待測樣本中含有或候選含有轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c；反之，則所述待測樣本中不含有或候選不含有轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c。(b)包括如下步驟：(b1)從所述待測樣本中提取基因組dna為模板，采用所述引物對1和所述引物對2分別進行pcr擴增，獲得pcr產(chǎn)物；(b2)根據(jù)所述pcr產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定所述待測樣本中是否含有轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c：若所述引物對1和所述引物對2各自所對應(yīng)的所述pcr產(chǎn)物中均含有預(yù)期大小的dna片段，則所述待測樣本中含有或候選含有轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c；反之，則所述待測樣本中不含有或候選不含有轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c。(c)包括如下步驟：(c1)從所述待測樣本中提取基因組dna為模板，采用所述單鏈dna組1或所述單鏈dna組2進行實時熒光定量pcr擴增；(c2)根據(jù)所述實時熒光定量pcr擴增結(jié)果，按照如下方法確定所述待測樣本中是否含有轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c：若ct值小于38，則所述待測樣本中含有或候選含有轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c；反之若ct值大于等于38或不能顯示，則所述待測樣本中不含有或候選不含有轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c。(d)包括如下步驟：(d1)從所述待測樣本中提取基因組dna為模板，采用所述單鏈dna組1和所述單鏈dna組2分別進行實時熒光定量pcr擴增；(d2)根據(jù)所述實時熒光定量pcr擴增結(jié)果，按照如下方法確定所述待測樣本中是否含有轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c：若采用所述單鏈dna組1和所述單鏈dna組2分別進行的兩個實時熒光定量pcr擴增過程中ct值均小于38，則所述待測樣本中含有或候選含有轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c；反之，則所述待測樣本中不含有或候選不含有轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c。在上述兩種方法的所述(a)和所述(b)中，當(dāng)所述引物對1為由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈dna分子組成的引物對時，所述預(yù)期大小的dna片段為712bp的dna片段；當(dāng)所述引物對2為由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈dna分子組成的引物對時，所述預(yù)期大小的dna片段為393bp的dna片段。進一步，所述712bp的dna片段具體為序列表中序列1所示dna片段；所述393bp的dna片段具體為序列表中序列2所示dna片段。本發(fā)明根據(jù)轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的側(cè)翼序列設(shè)計得到由序列表中序列3和序列4所示的引物對1，由序列表中序列5和序列6所示的引物對2，以及有序列7-9所示的引物對和探針。實驗證明，利用該引物對1和引物對2通過普通pcr，或者利用序列7-9所示的引物對和探針通過實時熒光定量pcr的方法可檢測待測玉米是否為轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c，以及待測樣本中是否含有轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c，且該方法準確率高、特異性強、靈敏度高。附圖說明圖1為轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的3’側(cè)翼序列特異性pcr檢測圖譜。1：d2000marker；2：空白對照；3：受體材料(陰性對照)；4：其它轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因轉(zhuǎn)化事件玉米5-6：轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c。圖2為轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的5’側(cè)翼序列特異性pcr檢測圖譜。1：d2000marker；2：受體材料(陰性對照)；3-4：轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c；5：其它轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因轉(zhuǎn)化事件玉米。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的獲得及性狀鑒定一、轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的獲得按照本發(fā)明的發(fā)明人所在團隊前期申請的中國專利申請(申請?zhí)?01510845655.3)的實施例2進行操作，獲得若干個轉(zhuǎn)入mg2-aroa和mcry1ah基因的t6代轉(zhuǎn)基因玉米株系，將其中一個株系記為gh5112e-117c。二、轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的性狀鑒定對步驟一獲得的若干個轉(zhuǎn)入mg2-aroa和mcry1ah的t6代轉(zhuǎn)基因玉米株系進行草甘膦抗性和抗蟲性鑒定。a.草甘膦抗性鑒定的具體操作如下：1、試驗設(shè)計：5m行長、3行區(qū)，3次重復(fù)，密度：60×35cm。2、試驗處理：按照約6倍推薦使用草甘膦濃度—1200ml/畝的用量噴施農(nóng)達(roundup，含41％的草甘膦，田間推薦使用劑量為150-250ml/畝)。3、試驗處理時期：5-6葉期。7天后開始觀察實驗結(jié)果。每個株系觀察至少20株。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c生長正常，而其他轉(zhuǎn)入mg2-aroa和mcry1ah基因的t6代轉(zhuǎn)基因玉米株系有不同草甘膦危害。b.抗蟲性鑒定的具體操作如下：1、試驗設(shè)計：5m行長、3行區(qū)，3次重復(fù)，密度：60×35cm2、試驗處理：將供試植株接蟲，每株接人工飼養(yǎng)的初孵幼蟲(玉米螟)30～40頭，用毛筆接種到玉米心葉中，接蟲3天后，第2次接蟲，接蟲數(shù)量同第1次。14天后調(diào)查玉米葉片受玉米螟的危害程度和幼蟲存活數(shù)，調(diào)查按玉米抗蟲性鑒定技術(shù)規(guī)范ny/t1248.5執(zhí)行。3、試驗處理時期：在玉米植株發(fā)育至8-10葉期(小喇叭口期)時進行人工接蟲，接蟲時間選擇在清晨或傍晚。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的食葉級別為0級，而其他轉(zhuǎn)入mg2-aroa和mcry1ah基因的t6代轉(zhuǎn)基因玉米株系的食葉級別為3級。本發(fā)明的發(fā)明人進一步將gh5112e-117c株系于大田種植，對除草甘膦抗性和抗蟲性外的其他農(nóng)藝性狀進行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)gh5112e-117c株系在其他農(nóng)藝性狀上，如生育期、株高、產(chǎn)量、籽粒的營養(yǎng)成分等，均與轉(zhuǎn)基因受體—玉米品種基本一致，無統(tǒng)計學(xué)差異。綜上，可見gh5112e-117c株系不僅表現(xiàn)出了極強的草甘膦抗性和抗蟲性，而且也很好的保持了受體親本的優(yōu)良農(nóng)藝性狀。本發(fā)明的發(fā)明人將該gh5112e-117c株系于2017年8月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，參椐的生物材料(株)為gh5112e-117c，建議的分類命名為玉米(zeamays)，其保藏編號為cgmccno.14334。實施例2、檢測轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的試劑盒的制備一、轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的側(cè)翼序列的克隆采用genomewalking的方法分離得到了轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的兩個如下側(cè)翼序列。具體參照genomewalking試劑盒(takaracode：d316)說明書進行操作。1、3'端側(cè)翼序列其核苷酸序列如序列表中序列1所示。該3'端側(cè)翼序列由轉(zhuǎn)化載體上t-dnalb序列片段和玉米基因組序列片段兩部分組成。具體的，序列1的第1-294位為轉(zhuǎn)化載體上t-dnalb序列片段，第295-712位為玉米基因組序列片段。2、5'端側(cè)翼序列其核苷酸序列如序列表中序列2所示。該5'端側(cè)翼序列由玉米基因組序列片段和轉(zhuǎn)化載體上t-dnarb序列片段兩部分組成。具體的，序列2的第1-319位為玉米基因組序列片段，第320-393位為轉(zhuǎn)化載體上t-dnarb序列片段。二、檢測轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的試劑盒的制備a.根據(jù)步驟一獲得的轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的兩個側(cè)翼序列，設(shè)計篩選特異性的引物對，用于制備普通pcr試劑盒。普通pcr試劑盒由如下兩個特異引物對以及pcr所需常規(guī)試劑組成。針對3'端側(cè)翼序列(序列1)設(shè)計的引物對1：m3z4：5’-gcctccctgacgattctggt-3’(序列3)；c10f2：5’-ccaagcaacaaaatgaaacaaaac-3’(序列4)。理論上，采用引物對1對轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的基因組dna進行pcr擴增會得到大小為712bp的目的條帶，即得到序列1的所示dna片段。針對5'端側(cè)翼序列(序列2)設(shè)計的引物對2：c2f2：5’-ttagtgttgagcacatttcctg-3’(序列5)；m3z2：5’-tcgacccaggtacattaaaaacgt-3’(序列6)。理論上，采用引物對2對轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的基因組dna進行pcr擴增會得到大小為393bp的目的條帶，即得到序列2的所示dna片段。b.根據(jù)步驟一獲得的轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的3’側(cè)翼序列，設(shè)計篩選特異性的引物對和探針，用于制備實時熒光定量pcr試劑盒。引物f：5’-tctgaggcagatgggtgtc-3’(序列7)；引物r：5’-gttagggtttgtttggtttgct-3’(序列8)；探針：5’-(fam)accggatgacacgagctatggttaa(bhq1)-3’(序列9)。理論上，采用引物對f/r對轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的基因組dna進行pcr擴增會得到大小為111bp的目的條帶，即得到序列2的第257-367位所示dna片段。實施例3、檢測轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的試劑盒的特異性和靈敏度檢測一、檢測轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的普通pcr試劑盒的特異性檢測供試樣本：轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c、實施例1獲得的其他轉(zhuǎn)入mg2-aroa和mcry1ah基因的t6代轉(zhuǎn)基因玉米株系，以及轉(zhuǎn)化受體玉米品種hiii。用實施例2得到的普通pcr試劑盒中兩個特異性引物對(引物對1和引物對2)分別對各供試樣本進行檢測，以驗證引物對1和引物對2的特異性。每個樣品采用相同的檢測方法，具體如下：分別從各供試樣本中提取基因組dna，作為模板，采用實施例2得到的普通pcr試劑盒中兩個特異性引物對(引物對1和引物對2)分別進行pcr擴增。兩個引物對所采用的反應(yīng)體系一致。反應(yīng)體系(20μl)：2×easytaqpcrsupermix10μl，上下游引物各0.5μl(用量均為250nm)，模板dna1μl(100ng)，ddh2o8μl。其中，2×easytaqpcrsupermix為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為as111-13。采用引物對1的反應(yīng)程序為：94℃5min；94℃40s，56℃30s，72℃40s，35個循環(huán)；72℃10min。采用引物對2的反應(yīng)程序為：94℃5min；94℃40s，54℃30s，72℃40s，35個循環(huán)；72℃10min。反應(yīng)結(jié)束后，將pcr產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳。實驗同時設(shè)置以水代替模板dna的空白對照。結(jié)果如圖1和圖2所示，采用兩個特異性引物對(引物對1和引物對2)進行pcr擴增，均只有轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c擴增得到了目的條帶(采用引物對1擴增得到大小為712bp的目的條帶；采用引物對2擴增得到了大小為393bp的目的條帶)，而其他的轉(zhuǎn)入mg2-aroa和mcry1ah基因的t6代轉(zhuǎn)基因玉米株系，以及轉(zhuǎn)化受體玉米品種hiii均未得到目的條帶。本發(fā)明的發(fā)明人進一步將擴增得到的大小為712bp的目的條帶和大小為393bp的目的條帶膠回收后送樣測序，結(jié)果表明712bp的目的條帶確實如序列表中序列1所示，393bp的目的條帶確實如序列表中序列2所示。以上結(jié)果表明實施例2得到的普通pcr試劑盒中的引物對1和引物對2具有較強的特異性。二、檢測轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的實時熒光定量pcr試劑盒的特異性和檢測線鑒定供試樣本：轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c、實施例1獲得的2個其他轉(zhuǎn)入mg2-aroa和mcry1ah基因的t6代轉(zhuǎn)基因玉米株系(分別記為823c和743c)，以及大豆及水稻(大豆和水稻葉片采自中國農(nóng)科院作科所)。用實施例2得到的實時熒光定量pcr試劑盒中引物對和探針分別對各供試樣本進行檢測，以驗證該引物對和探針的特異性。每個樣品采用相同的檢測方法，具體如下：1、模板dna的提取表1ctab提取緩沖液配方(1)取50ml離心管，加入20mlctab提取緩沖液(表1)，在65℃恒溫烘干箱中預(yù)熱30min；(2)稱取2.0g葉片，在研缽中加入液氮充分研磨成粉末狀；(3)將粉末小心刮入離心管的液體中，混勻。在65℃恒溫烘干箱中保溫30min～1h，其間輕搖數(shù)次；(4)取出離心管，冷卻至室溫后加入15ml酚/氯仿/異戊醇(25:24:1，體積比)，輕微而徹底地混合，將混合的勻漿轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，8000rpm低溫離心10min；(5)將上清液轉(zhuǎn)移到新的50ml離心管中，加入三分之二體積的異丙醇混勻，使核酸沉淀呈絮狀；(6)3000rpm離心2min，棄上清，離心管中加入10ml70％乙醇，室溫放置10min以上；(7)低速離心后去上清，讓核酸沉淀在65℃烘干箱中烘干或用真空干燥器抽干；(8)加800μl無菌水(含100μg/mlrnasea)，37℃保溫60min以上溶解沉淀，充分混勻，并消化rna。(9)將消化后的溶液轉(zhuǎn)移到2ml離心管中，用酚/氯仿/異戊醇(25:24:1，體積比)和氯仿/異戊醇(24:1，體積比)各抽提一次，如果蛋白殘留仍很多，可用上述變性液再多次抽提直至蛋白抽提干凈。每次在加入變性液(苯酚等)后要柔和而徹底地混合，放置10min以上后，12,000rpm常溫離心10min，吸出上清。(10)在上清中加入1/10體積的乙酸銨(濃度3m)，然后加入2/3體積的異丙醇，低溫下放置10min以上，4℃，12,000rpm離心10min，棄上清；(11)在沉淀中加入1ml70％乙醇，用手輕彈幾下，放置20min以上；12,000rpm離心10min，棄上清；在超凈臺上吹干沉淀，用無菌水200μl溶解dna沉淀；(12)取1μldna溶液，用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢查dna質(zhì)量，并紫外分光光度計測量dna含量，將提取的dna于-20℃或-80℃冷藏備用。2、實時熒光定量pcr檢測反應(yīng)體系如表2所示。表2實時熒光定量pcr反應(yīng)體系反應(yīng)程序：95℃5min；95℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，共45個循環(huán)。本實施例中采用的是bio-rad生產(chǎn)的cfx96tmtouchreal-timesystemqpcr儀，試劑primixextaqtm購自takara公司的產(chǎn)品cat#rr390a，探針與引物在英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。3、繪制標準曲線首先將提取的轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的基因組dna定量(500ng/μl)，再以1:39(體積比)稀釋，然后按倍半稀釋法稀釋成7個濃度梯度，使稀釋的dna提取液中待擴增序列的拷貝數(shù)依次為(4438、2219、1109、555、277、139、69個)，然后以這些稀釋的dna為擴增模板取1μl進行qpcr擴增，實驗重復(fù)三次，制作的標準曲線見表3：表3三次重復(fù)的標準曲線標準曲線擴增效率r2y＝-3.371x+39.860.980.999y＝-3.500x+39.930.930.998y＝-3.565x+40.550.950.998標準曲線中，y表示ct值，x表示log10(拷貝數(shù))。4、對檢測方法進行驗證(1)檢測極限將提取的轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的基因組dna稀釋355倍(500個拷貝)、3550倍(50個拷貝)和35500倍(5個拷貝)，取1μl進行qpcr擴增，并計算檢測的準確性。結(jié)果見表4。該結(jié)果表明檢測極限已經(jīng)達到5個拷貝，即若提取的檢測樣品dna中，含有抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的dna模板量為0.014ng/μl，利用該檢測方法即可檢測出所測樣品中含有g(shù)h5112e-117c轉(zhuǎn)化事件。表4將dna模板稀釋成500個拷貝、50個拷貝和5個拷貝檢測的拷貝數(shù)模板重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3檢測拷貝數(shù)偏差稀釋355倍(500個拷貝)520.4578.0533.7544.0±27.08.8％稀釋3550倍(50個拷貝)54.158.154.255.5±2.010.9％稀釋35500倍(5個拷貝)5.34.64.84.9±1.72.2％(2)定量極限將提取的轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的基因組dna稀釋成含100個拷貝的擴增模板，取1μl進行qpcr擴增。擴增ct值見表5。該結(jié)果表明定量檢測極限達到100個拷貝，即若提取的檢測樣品dna中，含有抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的dna模板量為0.28ng/μl，利用該檢測方法即可準確定量出檢測樣品中g(shù)h5112e-117c的含量。表5將dna模板稀釋成100個拷貝qpcr檢測的拷貝數(shù)(3)檢測特異性a.同物種的不同轉(zhuǎn)化體提取轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c，以及實施例1獲得的2個其他轉(zhuǎn)入mg2-aroa和mcry1ah基因的t6代轉(zhuǎn)基因玉米株系(分別記為823c和743c)，的基因組dna，定量后，均稀釋到擴增模板5個拷貝，取1μl進行qpcr擴增。結(jié)果顯示，該引物和探針只能特異性檢測轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c，而對823c和743c均無擴增，擴增ct值見表6。b.不同的物種提取轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c，以及大豆及水稻的基因組dna，均定量后稀釋到擴增模板5個拷貝，取1μl進行qpcr擴增。結(jié)果顯示，該引物和探針只能特異性檢測轉(zhuǎn)mg2-aroa和mcry1ah基因抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c，而對大豆和水稻基因組dna均無擴增，擴增ct值見表6。表6驗證試驗的ct值注：樣品濃度和ct值成反比，ct值大于等于38或不能顯示可判定為陰性，反之可判定為陽性。<110>北京奧瑞金種業(yè)股份有限公司<120>檢測抗蟲耐除草劑玉米gh5112e-117c的方法<130>gncln171179<160>9<170>patentinversion3.5<210>1<211>712<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1gcctccctgacgattctggtccgcatgtcggacactccactccacctcgcctggaccagg60agccctgtaccttgtcgtcccagaagacggttacggtgacgccacccaacttcccgttga120ctgggaaggtcgctccacctggctccaagtccatcaccaaccgtgcactgttgctggctg180cgttggccaaagggaccagtcggttgagcggtgcgctcaagtcggatgacactcgccaca240tgtcggtggctctgaggcagatgggtgtcacgatcgacgaaccggatgacacgagctatg300gttaagcagaaaagttagacacattgtgacgtcttagctagcaaaccaaacaaaccctaa360ctatgatacatttttaagttttttttccattttttgttgttagtgcatacatttcataaa420tccttataggttaagttaaagatctatgtttttttaaatattttccatttttctgttata480agtcggcatcattttatttcctactcgacaatgaacaaagcaggttttagcttatagcat540cgctgtacgaccaaataacgaataccaataaaatcatacttccacatatatatcatgtgc600gcctgtagctcagtggatagagcgtctgtttcctaagcagaaggtcgtaggttcgacccc660tatctggcgcgtttttatttgaaaatttgttttgtttcattttgttgcttgg712<210>2<211>393<212>dna<213>人工序列<220><223><400>2ttagtgttgagcacatttcctgtgagcttgcatatctatttctgacttgaactgtatcac60ctcttcattcaggtgaggattttgaccagaggatcatggaatacttcatcaagttgatca120agaagaagtacagcaaggacatcggcaaggacaaccgtgctcttggaaagctgaggaggg180aagctgagcgtgccaagagagcccttagcaaccagcaccaggtccgagttgagatcgagt240ccctctttgacgggaccgacttctcggagccgctgacccgtgccaggtttgaggagctga300acaacgatctgttccgcaaattgtggtgtaaacaaattgacgcttagacaacttaataac360acattgcggacgtttttaatgtacctgggtcga393<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223><400>3gcctccctgacgattctggt20<210>4<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223><400>4ccaagcaacaaaatgaaacaaaac24<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>5ttagtgttgagcacatttcctg22<210>6<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223><400>6tcgacccaggtacattaaaaacgt24<210>7<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223><400>7tctgaggcagatgggtgtc19<210>8<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>8gttagggtttgtttggtttgct22<210>9<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223><400>9accggatgacacgagctatggttaa25當(dāng)前第1頁12