本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2013年2月1日，申請(qǐng)?zhí)枮?01380018760.9，發(fā)明名稱(chēng)為“多路生化測(cè)定中信號(hào)的編碼和解碼”的申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。交叉引用本申請(qǐng)要求2012年2月3日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/594,480,及2012年9月19日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/703,093的利益，其各自通過(guò)引用其全文并入本文。序列表本即時(shí)申請(qǐng)包含經(jīng)由efs-網(wǎng)頁(yè)以ascii格式提交的序列表，且通過(guò)引用將其全文并入本文。所述ascii副本，建立于2013年2月14日，被命名為38075-716.601_sl.txt，且大小為9,240字節(jié)。本發(fā)明涉及多路生化測(cè)定中信號(hào)的編碼和解碼。
背景技術(shù)：
：相比傳統(tǒng)的單路反應(yīng)，多路反應(yīng)提供了顯著的優(yōu)點(diǎn)，包括在相同樣品上執(zhí)行并行的多個(gè)反應(yīng)，使用相同的室執(zhí)行更多個(gè)反應(yīng)，以及以快速且有效的方式從樣品中提取豐富信息的能力。然而，為了實(shí)現(xiàn)這些優(yōu)點(diǎn)，多路測(cè)定通常需要復(fù)雜的報(bào)告機(jī)制，即光譜上可分辨的熒光或化學(xué)發(fā)光(例如，pcr、elisa)、空間上可分辨的信號(hào)(例如，微陣列、凝膠電泳)、時(shí)間上可分辨的信號(hào)(例如，毛細(xì)管電泳)或其組合(例如，sanger測(cè)序)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：對(duì)可以在單一的溶液中執(zhí)行的多路反應(yīng)是有需求的。本公開(kāi)提供了用于分析物的多路檢測(cè)的方法、組合物、系統(tǒng)和試劑盒。在一些情況下，本公開(kāi)提供測(cè)定，所述測(cè)定能夠不執(zhí)行固定化(immobilization)、分離、質(zhì)譜法、或解鏈(melting)曲線(xiàn)分析而明確地檢測(cè)單一樣品體積中的、以存在或不存在的任意組合形式的至少7種分析物中的每種分析物的存在或不存在。在一些實(shí)例中，每種分析物被編碼為信號(hào)的一個(gè)(或至少一個(gè))分量的值。在一些實(shí)例中，本公開(kāi)提供的測(cè)定能夠明確地檢測(cè)以存在或不存在的任意組合形式的、m種分析物的存在或不存在，其中m＝log2(f+1)，且f是當(dāng)所有分析物存在時(shí)的信號(hào)的一個(gè)分量(例如，強(qiáng)度)的最大累積值。在一些情況下，每種分析物被編碼為信號(hào)的第一分量中的至少一個(gè)第一值(例如，至少一個(gè)強(qiáng)度或強(qiáng)度范圍)和信號(hào)的第二分量中的至少一個(gè)第二值(例如，至少一個(gè)波長(zhǎng)或波長(zhǎng)范圍)。在一些實(shí)例中，每種分析物被編碼為在信號(hào)的第二分量中的多個(gè)第二值中的每個(gè)第二值的信號(hào)的第一分量中的第一值(例如，在多個(gè)波長(zhǎng)或多個(gè)波長(zhǎng)范圍中的每個(gè)波長(zhǎng)或每個(gè)波長(zhǎng)范圍的信號(hào)強(qiáng)度或信號(hào)強(qiáng)度范圍)。在一些實(shí)例中，本文提供的測(cè)定能夠明確地檢測(cè)以存在或不存在的任意組合形式的、m種分析物的存在或不存在，其中m＝c*log2(f+1)，其中c是用于編碼分析物的第二值的數(shù)目，且f是在所有分析物存在時(shí)的、關(guān)于任意第二值的信號(hào)的第一分量的最大累積值。在一些情況下，本公開(kāi)提供的測(cè)定能夠明確地檢測(cè)以存在或不存在的任意組合形式的、m種分析物的存在或不存在，其中m＝(p*t)+1，其中p是編碼方案中每層代碼的數(shù)目，且t是層的數(shù)目。在一些情況下，層的數(shù)目t＝log4(f+1)，且f是在所有分析物存在時(shí)的、關(guān)于任意第二值的信號(hào)的第一分量的最大累積值。在一些實(shí)例中，第一值是強(qiáng)度或強(qiáng)度范圍。在一些情況下，編碼方案包括至少三個(gè)強(qiáng)度或強(qiáng)度范圍。在一些情況下，第二值是波長(zhǎng)或波長(zhǎng)范圍。在一些實(shí)例中，編碼方案包括至少五個(gè)波長(zhǎng)或波長(zhǎng)范圍。在一些實(shí)施例中，信號(hào)是電磁信號(hào)。在一些情況下，電磁信號(hào)是熒光發(fā)射信號(hào)。在一些實(shí)施例中，測(cè)量了在至少四個(gè)波長(zhǎng)或波長(zhǎng)范圍處的熒光發(fā)射信號(hào)的強(qiáng)度。在一些情況下，本文提供的測(cè)定利用在使用之前被凍干的試劑執(zhí)行。在一些情況下，利用包括雜交探針的試劑執(zhí)行檢測(cè)步驟。在一些實(shí)例中，雜交探針的數(shù)目大于分析物的數(shù)目。在一些情況下，雜交探針組包括專(zhuān)門(mén)用于不同分析物的一個(gè)或更多個(gè)雜交探針，且包括相同的熒光團(tuán)或熒光團(tuán)的組合。在一些實(shí)例中，樣品與至少18個(gè)所述雜交探針接觸。在一些實(shí)例中，利用包括至少一對(duì)引物的試劑執(zhí)行檢測(cè)步驟。在一些情況下，至少一對(duì)引物能夠擴(kuò)增與至少三個(gè)所述雜交探針互補(bǔ)的區(qū)域。在一些實(shí)例中，在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間產(chǎn)生被測(cè)量的信號(hào)。在一些情況下，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)選自以下所構(gòu)成的組：終點(diǎn)(end-point)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、及其組合。在一些實(shí)例中，針對(duì)溶液執(zhí)行至少一個(gè)累積測(cè)量。在一些實(shí)例中，至少一種分析物是通過(guò)至少一個(gè)額外的值(即，至少兩個(gè)值一起)編碼的，其中，至少一個(gè)額外的值選自以下所構(gòu)成的組：來(lái)自信號(hào)的至少一個(gè)額外的分量的值，來(lái)自不同的信號(hào)的至少一個(gè)分量的值，及其組合。例如，至少一個(gè)額外的值可選自以下所構(gòu)成的組：熒光發(fā)射強(qiáng)度、熒光發(fā)射波長(zhǎng)、共振能量轉(zhuǎn)移(fret)發(fā)射強(qiáng)度、fret發(fā)射波長(zhǎng)、電化學(xué)信號(hào)、化學(xué)發(fā)光波長(zhǎng)、化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度、熒光漂白率、化學(xué)發(fā)光漂白率、及其組合。在一些情況下，色譜被構(gòu)建。通過(guò)繪制每個(gè)分析物的陽(yáng)性對(duì)照(positivecontrol)樣品的第一值和第二值的所有可能的組合可構(gòu)建色譜。在一些實(shí)例中，至少一個(gè)分析物包括多核苷酸。在一些情況下，多核苷酸來(lái)自選自以下所構(gòu)成的組的來(lái)源：動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌、寄生物和病毒。在一些實(shí)例中，多核苷酸來(lái)自選自以下所構(gòu)成的組的來(lái)源：人類(lèi)免疫缺陷病毒、單純性皰疹病毒、人類(lèi)乳頭瘤病毒、瘧原蟲(chóng)、分枝桿菌、登革熱病毒、肝炎病毒和流感病毒。在一些情況下，多核苷酸選自以下所構(gòu)成的組；人類(lèi)免疫缺陷病毒多蛋白酶(polyprotease)、人類(lèi)免疫缺陷病毒p17、人類(lèi)乳頭瘤病毒e6、及人類(lèi)乳頭瘤病毒e7。在一些情況下，樣品選自以下所構(gòu)成的組：臨床樣品、食品樣品、環(huán)境樣品、藥物樣品、及來(lái)自消費(fèi)產(chǎn)品的樣品。在一些實(shí)例中，關(guān)于分析物存在或不存在的信息通過(guò)計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)傳輸。在一些情況下，向醫(yī)生提供關(guān)于分析物存在或不存在的信息。在一些實(shí)例中，臨床決定是基于此類(lèi)信息做出的。在一些實(shí)例中，本文提供的方法的至少一個(gè)步驟是使用計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上的指令執(zhí)行的。在一些情況下，指令位于遠(yuǎn)程服務(wù)器上。在一些實(shí)例中，指令位于熱循環(huán)儀上。在一些情況下，指令位于與熱循環(huán)儀通信的計(jì)算機(jī)上。在一些情況下，至少一個(gè)分析物是陽(yáng)性對(duì)照分析物。在一些實(shí)例中，編碼方案是非簡(jiǎn)并的。在一些情況下，編碼方案被設(shè)計(jì)為非簡(jiǎn)并的。在一些實(shí)例中，通過(guò)枚舉可以從編碼方案獲得的每個(gè)合理的結(jié)果、鑒定是簡(jiǎn)并的每個(gè)合理的結(jié)果、并消除來(lái)自編碼方案的至少一個(gè)潛在的分析物代碼以消除簡(jiǎn)并性，編碼方案被做成非簡(jiǎn)并的。在一些情況下，本文提供的測(cè)定是終點(diǎn)測(cè)定。在一些實(shí)例中，本公開(kāi)提供的測(cè)定在通過(guò)儀器的檢測(cè)極限設(shè)定的循環(huán)的閾值數(shù)結(jié)束。在一些實(shí)例中，本文提供的測(cè)定是液相測(cè)定。在一些情況下，本文提供的測(cè)定是定量的。在一些情況下，本公開(kāi)提供了檢測(cè)多個(gè)分析物中的每個(gè)分析物存在或不存在的方法，所述方法包括：(a)將每個(gè)所述分析物編碼為信號(hào)的第一值，由此產(chǎn)生編碼方案，其中每個(gè)所述分析物在所述編碼方案中由所述第一值表示，其中所述編碼是以消除簡(jiǎn)并性的方式執(zhí)行的；(b)提供包括或可能包括至少一個(gè)所述分析物的樣品；(c)將所述樣品與如所述編碼方案中表示的在每個(gè)所述分析物存在時(shí)產(chǎn)生所述第一值的分析物特異性試劑接觸；(d)累積地測(cè)量所述樣品中所述信號(hào)的所述第一值，從而提供累積測(cè)量結(jié)果；及(e)基于所述累積測(cè)量結(jié)果和所述編碼方案，確定每個(gè)所述分析物是存在還是不存在。在一些實(shí)例中，在先前段落描述的方法能夠明確地檢測(cè)以存在或不存在的任意組合的m種分析物的存在或不存在，其中m＝log2(f+1)，且f是當(dāng)所有分析物存在時(shí)的第一值的最大累積值。在一些情況下，第一值是強(qiáng)度或強(qiáng)度范圍。在一些實(shí)例中，第一值具有在編碼方案中的最小值，所述最小值選自以下所構(gòu)成的組：至少1、至少2、至少4、至少8、至少16、至少32和至少64。在一些情況下，第一值通過(guò)等于所述先前第一值的累積最大值的加一的量在編碼方案中增加。在其它情況下，第一值通過(guò)大于先前第一值的累積最大值加一的量在編碼方案中增加。在一些情況下，本公開(kāi)提供了檢測(cè)多個(gè)分析物中的每個(gè)分析物存在或不存在的方法，所述方法包括：(a)以至少一個(gè)第一值和至少一個(gè)第二值編碼每個(gè)所述分析物，其中所述第一值是來(lái)自信號(hào)的第一分量的值且所述第二值是來(lái)自所述信號(hào)的第二分量的值，從而產(chǎn)生編碼方案，其中每個(gè)所述分析物在所述編碼方案中通過(guò)所述至少一個(gè)第一值和所述至少一個(gè)第二值表示，其中所述編碼以減少或消除簡(jiǎn)并性的方式執(zhí)行；(b)提供包括或可能包括至少一種所述分析物的樣品；(c)將所述樣品與所述編碼方案中表示的在每個(gè)所述分析物存在時(shí)產(chǎn)生所述至少一個(gè)第一值和至少一個(gè)所述第二值的分析物特異性試劑接觸；(d)累積地測(cè)量所述樣品中的所述第一值和所述第二值，從而提供累積測(cè)量結(jié)果；及(e)基于所述累積測(cè)量結(jié)果和所述編碼方案，確定每個(gè)所述分析物是存在還是不存在，其中，當(dāng)簡(jiǎn)并性被消除時(shí)，在每個(gè)所述試劑僅產(chǎn)生一個(gè)第二值時(shí)，所述方法能夠明確地檢測(cè)單一體積中的、以存在或不存在的任意組合形式的、至少6個(gè)分析物的每個(gè)分析物的存在或不存在。在一些情況下，在先前段落描述的方法中的每個(gè)分析物被編碼為在信號(hào)的第二分量中的多個(gè)第二值中的每個(gè)第二值的信號(hào)的第一分量中的第一值。在一些情況下，當(dāng)簡(jiǎn)并性被消除時(shí)，該方法使用4個(gè)第二值能夠明確地檢測(cè)單一體積中的至少7個(gè)分析物中的每個(gè)分析物的存在或不存在。在一些實(shí)例中，當(dāng)簡(jiǎn)并性被消除時(shí)，編碼方案包括t個(gè)非簡(jiǎn)并層，其中t＝log4(f+1)，且f是當(dāng)所有分析物存在時(shí)，關(guān)于任意第二值的信號(hào)的第一分量的最大累積值。在一些情況下，當(dāng)簡(jiǎn)并性被消除時(shí)，方法能夠明確地檢測(cè)以存在或不存在的任意組合形式的、m種分析物的存在或不存在，其中m＝(p*t)+1，且p是每層代碼的數(shù)目。在一些實(shí)例中，當(dāng)簡(jiǎn)并性被消除時(shí)，方法能夠明確地檢測(cè)以存在或不存在的任意組合形式的、m種分析物的存在或不存在，其中m＝c*log2(f+1)，c是編碼方案中第二值的數(shù)目，且f是當(dāng)所有分析物存在時(shí)，關(guān)于任意第二值的信號(hào)的第一分量的最大累積值。本公開(kāi)還提供了非簡(jiǎn)并編碼方案，所述非簡(jiǎn)并編碼方案能夠不執(zhí)行固定化、分離、質(zhì)譜法、或解鏈曲線(xiàn)分析而明確地編碼單一樣品體積中的、以存在或不存在的任意組合的至少7個(gè)分析物中的每個(gè)分析物的存在或不存在。在一些實(shí)例中，本公開(kāi)的非簡(jiǎn)并編碼方案是通過(guò)包括以下步驟的方法產(chǎn)生的：(a)產(chǎn)生用于每個(gè)潛在分析物的代碼，其中每個(gè)潛在的分析物通過(guò)信號(hào)的至少一個(gè)分量的至少一個(gè)值編碼；(b)枚舉對(duì)存在或不存在的每個(gè)分析物的所有可能組合的每個(gè)合理的累積結(jié)果；(c)鑒定每個(gè)合理的簡(jiǎn)并的結(jié)果；及(d)消除至少一個(gè)代碼，以消除簡(jiǎn)并性。在一些情況下，編碼方案可通過(guò)增加額外的代碼擴(kuò)大，所述額外的編碼比所述信號(hào)的至少一種分量中的所有先前的代碼的總和大至少一個(gè)單位。在一些情況下，編碼方案通過(guò)由結(jié)構(gòu)保證非簡(jiǎn)并性的數(shù)學(xué)迭代的方法產(chǎn)生。在一些情況下，本公開(kāi)提供了用于檢測(cè)多個(gè)分析物中的每個(gè)分析物存在或不存在的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：(a)編碼每個(gè)所述分析物為信號(hào)的第一值，由此產(chǎn)生編碼方案，其中每個(gè)所述分析物在所述的編碼方案中由所述第一值表示，其中所述編碼是以消除簡(jiǎn)并性的方式執(zhí)行的；(b)提供包括或可能包括至少一個(gè)所述分析物的樣品；(c)將所述樣品與如在所述編碼方案中表示的、當(dāng)每個(gè)所述分析物存在時(shí)產(chǎn)生所述第一值的分析物特異性試劑接觸；(d)累積地在所述樣品中測(cè)量所述信號(hào)的所述第一值，從而提供累積測(cè)量結(jié)果；及(e)基于所述累積測(cè)量結(jié)果和所述編碼方案，確定每個(gè)所述分析物是存在還是不存在。在一些情況下，本公開(kāi)提供了用于檢測(cè)多個(gè)分析物中的每個(gè)分析物存在或不存在的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：(a)以至少一個(gè)第一值和至少一個(gè)第二值編碼每個(gè)所述分析物，其中所述第一值是來(lái)自信號(hào)的第一分量的值且所述第二值是來(lái)自所述信號(hào)的第二分量的值，從而產(chǎn)生編碼方案，其中每個(gè)所述分析物在所述編碼方案中通過(guò)所述至少一個(gè)第一值和所述至少一個(gè)第二值表示，其中所述編碼以減少或消除簡(jiǎn)并性的方式執(zhí)行；(b)提供包括或可能包括至少一種所述分析物的樣品；(c)將所述樣品與在所述編碼方案中表示的、當(dāng)每個(gè)所述分析物存在時(shí)產(chǎn)生所述至少一個(gè)第一值和所述至少一個(gè)第二值的分析物特異性試劑接觸；(d)累積地測(cè)量所述樣品中的所述第一值和所述第二值，從而提供累積測(cè)量結(jié)果；及(e)基于所述累積測(cè)量結(jié)果和所述編碼方案，確定每個(gè)所述分析物是存在還是不存在，其中，當(dāng)簡(jiǎn)并性被消除時(shí)，在每個(gè)所述試劑僅產(chǎn)生一個(gè)第二值時(shí)，所述方法能夠明確地檢測(cè)在單一體積中的、以存在或不存在的任意組合形式的、至少6個(gè)分析物的每個(gè)分析物的存在或不存在。在一些情況下，本公開(kāi)提供了用于第三團(tuán)體的檢測(cè)多個(gè)分析物中的每個(gè)分析物存在或不存在的方法，所述方法包括：(a)從團(tuán)體獲得每個(gè)所述分析物的標(biāo)識(shí)；(b)將每個(gè)所述分析物編碼為信號(hào)的第一值，由此產(chǎn)生編碼方案，其中每個(gè)所述分析物在所述的編碼方案中由所述第一值表示，其中所述編碼以消除簡(jiǎn)并性的方式執(zhí)行；(c)向所述團(tuán)體提供如在所述編碼方案中表示的、當(dāng)每個(gè)所述分析物存在時(shí)產(chǎn)生所述第一值的分析物特異性試劑，所述團(tuán)體：(i)將包括或可能包括至少一個(gè)所述分析物的樣品與所述試劑接觸；及(ii)累積地測(cè)量所述樣品中的所述第一值，從而提供累積測(cè)量結(jié)果；及(d)從所述團(tuán)體獲得所述累積測(cè)量結(jié)果；(e)基于所述累積測(cè)量結(jié)果和所述編碼方案，確定每個(gè)所述分析物是存在還是不存在；及(f)將關(guān)于每個(gè)所述分析物存在或不存在的信息提供給所述團(tuán)體。在一些情況下，本公開(kāi)提供了用于第三團(tuán)體的檢測(cè)多個(gè)分析物中的每個(gè)分析物存在或不存在的方法，所述方法包括：(a)從團(tuán)體獲得每個(gè)所述分析物的標(biāo)識(shí)；(b)將每個(gè)所述分析物編碼為至少一個(gè)第一值和至少一個(gè)第二值，其中，所述第一值是來(lái)自信號(hào)的第一分量的值，且所述第二值是來(lái)自所述信號(hào)的第二分量的值，由此產(chǎn)生編碼方案，其中每個(gè)所述分析物在所述的編碼方案中由所述至少一個(gè)第一值和所述至少一個(gè)第二值表示，其中所述編碼以減少或者消除簡(jiǎn)并性的方式執(zhí)行；(c)向所述團(tuán)體提供如所述編碼方案中表示的在每個(gè)所述分析物存在時(shí)產(chǎn)生所述至少一個(gè)第一值和所述至少一個(gè)第二值的分析物特異性試劑，所述團(tuán)體：(i)將包括或可能包括至少一個(gè)所述分析物的樣品與所述試劑接觸；及(ii)累積地測(cè)量所述樣品中所述第一值及所述第二值，從而提供累積測(cè)量結(jié)果；及(d)從所述團(tuán)體獲得所述累積測(cè)量結(jié)果；(e)基于所述累積測(cè)量結(jié)果和所述編碼方案，確定每個(gè)所述分析物是存在還是不存在；及(f)將關(guān)于每個(gè)所述分析物存在或不存在的信息提供給所述團(tuán)體。在一些情況下,本公開(kāi)提供了用于檢測(cè)多個(gè)分析物中的每個(gè)分析物的存在或不存在的組合物，所述組合物包括分析物特異性試劑，每個(gè)試劑產(chǎn)生包括第一值的信號(hào)，其中所述試劑能夠在不執(zhí)行固定化、分離、質(zhì)譜法、或解鏈曲線(xiàn)分析的情況下，明確地檢測(cè)單一樣品體積中的、以存在或不存在的任意組合形式的、至少7個(gè)分析物的每個(gè)分析物的存在或不存在。在一些情況下，本公開(kāi)提供了用于檢測(cè)多個(gè)分析物中的每個(gè)分析物的存在或不存在的組合物，所述組合物包括分析物特異性試劑，每個(gè)試劑產(chǎn)生包括至少一個(gè)第一值和至少一個(gè)第二值的信號(hào)，所述至少一個(gè)第一值是來(lái)自所述信號(hào)的第一分量的值且所述至少一個(gè)第二值是來(lái)自所述信號(hào)的第二分量的值，其中，當(dāng)每個(gè)所述試劑僅產(chǎn)生一個(gè)第二值時(shí)，所述試劑能夠檢測(cè)在單一體積中的、以存在或不存在的任意組合形式的、至少6個(gè)分析物的每個(gè)分析物的存在或不存在。在一些情況下，本公開(kāi)提供了用于檢測(cè)多個(gè)分析物中的每個(gè)分析物的存在或不存在的試劑盒，所述試劑盒包括分析物特異性試劑、包裝、及說(shuō)明書(shū)，每個(gè)試劑產(chǎn)生包括第一值的信號(hào)，其中所述試劑盒能夠在不執(zhí)行固定化、分離、質(zhì)譜法、或解鏈曲線(xiàn)分析的情況下，明確地檢測(cè)單一樣品體積中的、以存在或不存在的任意組合形式的、至少7個(gè)分析物的每個(gè)分析物的存在或不存在。在一些實(shí)例中，本公開(kāi)提供了用于檢測(cè)多個(gè)分析物中的每個(gè)分析物的存在或不存在的試劑盒，所述試劑盒包括分析物特異性試劑、包裝、及說(shuō)明書(shū)，每個(gè)試劑產(chǎn)生包括至少一個(gè)第一值和至少一個(gè)第二值的信號(hào)，所述至少一個(gè)第一值是來(lái)自所述信號(hào)的第一分量的值且所述至少一個(gè)第二值是來(lái)自所述信號(hào)的第二分量的值，其中，當(dāng)每個(gè)所述試劑僅產(chǎn)生一個(gè)第二值時(shí)，所述試劑盒能夠檢測(cè)在單一體積中的、以存在或不存在的任意組合形式的、至少6個(gè)分析物中的每個(gè)分析物的存在或不存在。在一些情況下，本公開(kāi)提供了用于檢測(cè)多個(gè)分析物中的每個(gè)分析物存在或不存在的試劑盒，所述試劑盒包括盒體601、布置在盒體中用于放置瓶的卡接槽口、包括用于分析物的檢測(cè)的探針的瓶602、包括用于擴(kuò)增的引物的瓶603、及包括用于擴(kuò)增的試劑的瓶604、其中，所述試劑盒能夠在不執(zhí)行固定化、分離、質(zhì)譜法、或解鏈曲線(xiàn)分析的情況下，明確地檢測(cè)單一樣品體積中的、以存在或不存在的任意組合形式的至少7個(gè)分析物中的每個(gè)分析物的存在或不存在。在一些實(shí)例中，本公開(kāi)提供了用于檢測(cè)多個(gè)分析物中的每個(gè)分析物存在或不存在的試劑盒，包括：盒體601、布置在盒體中用于放置瓶的卡接槽口、包括用于分析物的檢測(cè)的探針的瓶602、包括用于擴(kuò)增的引物的瓶603、及包括用于擴(kuò)增的試劑的瓶604，每個(gè)探針產(chǎn)生包括至少一個(gè)第一值和至少一個(gè)第二值的信號(hào)，所述至少一個(gè)第一值是來(lái)自所述信號(hào)的第一分量的值且所述至少一個(gè)第二值是來(lái)自所述信號(hào)的第二分量的值，其中，當(dāng)每個(gè)所述探針僅產(chǎn)生一個(gè)第二值時(shí)，所述試劑盒能夠檢測(cè)在單一體積中的、以存在或不存在的任意組合形式的至少6個(gè)分析物中的每個(gè)分析物的存在或不存在。引用并入在本說(shuō)明書(shū)中提到的所有的出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)?jiān)诖送ㄟ^(guò)引用以相同程度并入，如同每個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)被具體地和單獨(dú)地表明通過(guò)引用并入。附圖說(shuō)明本發(fā)明的新穎特征在所附權(quán)利要求書(shū)中特別陳述。將通過(guò)參考以下的詳細(xì)描述的說(shuō)明性實(shí)施方案的陳述獲得對(duì)本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)更好地理解，其中本發(fā)明的原理被利用，且其中的附圖是：圖1顯示了以四個(gè)顏色檢測(cè)四個(gè)分析物的傳統(tǒng)的編碼方法，及以四個(gè)顏色能夠檢測(cè)16個(gè)或更多個(gè)序列的本發(fā)明的編碼方法之間的比較。顏色由b、g、y和r指示，其分別指示藍(lán)色、綠色、黃色和紅色。圖2顯示了表示以四個(gè)顏色對(duì)6個(gè)分析物(包括對(duì)照)檢測(cè)的示意圖。使用連接到熒光團(tuán)(b、g、y、r；分別為藍(lán)色、綠色、黃色和紅色)和猝滅劑(標(biāo)有“x”的橢圓形)的雜交探針檢測(cè)分析物。對(duì)照序列和五個(gè)其它序列(登革熱＝登革熱病毒；結(jié)核?。浇Y(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis)；p17＝hivp17；瘧疾＝惡性瘧原蟲(chóng)(plasmodiumfalciparum)；和皰疹＝單純性皰疹病毒2)均使用標(biāo)有藍(lán)色熒光團(tuán)的探針檢測(cè)。每個(gè)非對(duì)照分析物分別使用1-3個(gè)額外的探針檢測(cè)。例如，登革熱病毒的分析物使用三個(gè)具有綠色、黃色和紅色熒光團(tuán)的額外的探針檢測(cè)；單純性皰疹病毒2的分析物使用具有紅色熒光團(tuán)的額外的探針檢測(cè)；等等。圖3顯示了如實(shí)施例2中描述得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的色譜。圖4顯示了本發(fā)明的示例性的實(shí)施方案，其中使用計(jì)算機(jī)執(zhí)行本文提供的方法的一個(gè)或更多個(gè)步驟。圖5顯示了檢測(cè)光信號(hào)，例如熒光發(fā)射信號(hào)的波長(zhǎng)和強(qiáng)度的兩個(gè)不同的方法的示意圖。圖6顯示了示例性的試劑盒的示意圖。圖7顯示了如實(shí)施例3中描述得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的色譜。圖8顯示了合理的結(jié)果(上圖)和不合理的結(jié)果(下圖)的示意圖。具體實(shí)施方式由于幾個(gè)理想的特性，包括與生化測(cè)定的相容性、熒光標(biāo)記相對(duì)小的尺寸、綴合感興趣的分子的簡(jiǎn)單的手段、可負(fù)擔(dān)性、低毒性、穩(wěn)定性、魯棒性、利用廉價(jià)光學(xué)系統(tǒng)的可檢測(cè)性、及與空間陣列相結(jié)合的能力，熒光檢測(cè)已經(jīng)是多路測(cè)定優(yōu)選的技術(shù)。然而，標(biāo)準(zhǔn)的熒光具有廣泛的發(fā)射光譜。因此，為了避免光譜重疊(即，為了保持光譜分辨率)僅相對(duì)少量數(shù)目的顏色(例如，4至6種)通常在多路熒光測(cè)定中同時(shí)使用。多路熒光測(cè)定的傳統(tǒng)編碼方法一直以單一的顏色編碼每個(gè)分析物；即，m＝n，其中m是可檢測(cè)的分析物的數(shù)目，且n是光譜可分辨的熒光探針的數(shù)目。每當(dāng)需要更高的多路因子時(shí)(即，m>n)，熒光通常結(jié)合其它技術(shù)技術(shù)，如等分、空間陣列、或順序處理。這些額外的處理步驟是勞動(dòng)密集的，并經(jīng)常需要相對(duì)昂貴和復(fù)雜的光學(xué)和機(jī)械系統(tǒng)(例如，光譜儀、機(jī)械化顯微鏡鏡臺(tái)、微流體、液滴生成器、掃描儀、及類(lèi)似系統(tǒng))。這種系統(tǒng)在某些環(huán)境中配置往往是不切實(shí)際的，特別是定點(diǎn)護(hù)理(point-ofcare)和低資源設(shè)置。因此，對(duì)可提供廉價(jià)的多路的手段，同時(shí)避免使用昂貴的額外的處理步驟的多路編碼和解碼方法有顯著需求。本公開(kāi)提供了用于樣品中的多個(gè)分析物的檢測(cè)的方法、系統(tǒng)、組合物和試劑盒。本文呈現(xiàn)了基于編碼、分析和解碼方法對(duì)分析物進(jìn)行檢測(cè)。在一些實(shí)例中，待檢測(cè)的每個(gè)分析物被編碼為信號(hào)(例如，強(qiáng)度)的值，其中值被分配，使得測(cè)定的結(jié)果明確地指示被測(cè)定的分析物存在或不存在。在其它實(shí)例中，待檢測(cè)的每個(gè)分析物被編碼為在信號(hào)的至少兩個(gè)分量(例如，強(qiáng)度和波長(zhǎng))的每個(gè)中的值。信號(hào)的至少兩個(gè)分量可以是正交的。類(lèi)似地，如本公開(kāi)中在其他地方更全面地描述的，可以使用多個(gè)正交信號(hào)，例如熒光信號(hào)和電化學(xué)信號(hào)的組合。分析物可以是任何合適的分析物，例如多核苷酸、蛋白質(zhì)、小分子、脂質(zhì)、碳水化合物、或其混合物。信號(hào)可以是任何合適的信號(hào)，例如電磁信號(hào)、光信號(hào)、熒光發(fā)射信號(hào)、電化學(xué)信號(hào)、化學(xué)發(fā)光信號(hào)、及其組合。信號(hào)的至少兩個(gè)分量可以是任何合適的兩個(gè)分量，例如振幅和頻率，或強(qiáng)度和波長(zhǎng)。編碼分析物之后，樣品被提供，其中樣品包括或可包括編碼的分析物中的至少一個(gè)。樣品與在編碼方案中對(duì)每個(gè)分析物指定的在分析物存在時(shí)、產(chǎn)生特定的信號(hào)的、一個(gè)或多個(gè)分析物特異性試劑接觸。試劑可以是任何合適的試劑，其能夠在其相應(yīng)的分析物存在時(shí)產(chǎn)生這樣的信號(hào)，例如，連接到熒光團(tuán)和猝滅劑的寡核苷酸探針(例如，taqman探針)。如果試劑是連接到熒光團(tuán)和猝滅劑的寡核苷酸探針，可執(zhí)行產(chǎn)生信號(hào)的核酸擴(kuò)增。添加試劑后，信號(hào)被定量。在一些情況下，通過(guò)測(cè)量信號(hào)的一個(gè)分量(例如，熒光強(qiáng)度)，及基于用于編碼每種分析物的存在的值、及信號(hào)的累積值，確定某些分析物存在和不存在，執(zhí)行這種定量。在一些情況下，對(duì)樣品累積地測(cè)量信號(hào)的至少兩個(gè)分量(例如，強(qiáng)度和波長(zhǎng))。例如，這種測(cè)量可以通過(guò)測(cè)量在特定波長(zhǎng)的強(qiáng)度，或特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的強(qiáng)度執(zhí)行。然后可以基于信號(hào)的至少兩個(gè)分量中的每個(gè)分量的值與用于編碼分析物的存在的值(即，在編碼方案中的那些值)確定分析物的存在或不存在。編碼可以以減少或消除通過(guò)該方法獲得的可能的簡(jiǎn)并(例如，不明確的)結(jié)果的數(shù)目的方式執(zhí)行。如本說(shuō)明書(shū)中其他地方所描述的，特定編碼方案的完整編碼能力可被枚舉，且某些潛在的分析物代碼可從編碼方案消除，以減少或消除簡(jiǎn)并性。同樣地，編碼方案可被設(shè)計(jì)成非簡(jiǎn)并的，使得簡(jiǎn)并性的減少或消除是沒(méi)有必要的。可以構(gòu)建解碼矩陣以對(duì)應(yīng)于累積信號(hào)測(cè)量結(jié)果的構(gòu)成信號(hào)，將累積信號(hào)測(cè)量結(jié)果(例如，強(qiáng)度或在特定波長(zhǎng)的強(qiáng)度)解釋為某些分析物存在或不存在。i.定義本文所用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述特定實(shí)施方案的目的，并不旨在限制。如本文所用，單數(shù)形式的“一(a)”、“一(an)”、和“該(the)”除非上下文另有明確地指示，也旨在包括復(fù)數(shù)形式。此外，針對(duì)術(shù)語(yǔ)“包括(including)”、“包括(includes)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“有(with)”、“例如(suchas)”、或其變體的范圍，在說(shuō)明書(shū)和/或權(quán)利要求書(shū)中使用時(shí)，這些術(shù)語(yǔ)不是限制的，且旨在以類(lèi)似術(shù)語(yǔ)“包括(comprising)”的方式被包括。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“約”，一般是指比特定用法的上下文中規(guī)定的數(shù)值增加15％或減少15％的范圍。例如，“約10”將包括從8.5到11.5的范圍。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“維”和“分量”，當(dāng)涉及信號(hào)時(shí)，一般是指可被定量的信號(hào)的方面。例如，如果是由熒光分子產(chǎn)生的信號(hào)，其可以依據(jù)其波長(zhǎng)(例如，第一維或第一分量)及其強(qiáng)度(例如，第二維或第二分量)被量化。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“解碼”，一般是指確定哪個(gè)分析物存在的方法，其基于累積信號(hào)和能夠?qū)⒗鄯e信號(hào)轉(zhuǎn)換為關(guān)于一個(gè)或更多個(gè)分析物存在或不存在的信息的編碼方案或解碼矩陣。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“編碼”，一般是指表示分析物的處理，使用包括信號(hào)的值(例如強(qiáng)度)、或在一個(gè)信號(hào)或多個(gè)信號(hào)的至少兩個(gè)分量中的每個(gè)分量的值(如波長(zhǎng)和強(qiáng)度)的代碼。術(shù)語(yǔ)“連接到熒光團(tuán)和猝滅劑的寡核苷酸探針”和“taqman探針”通常是指在多核苷酸擴(kuò)增測(cè)定中用于檢測(cè)分析物存在的水解探針。這些探針包括連接到熒光團(tuán)和猝滅劑的寡核苷酸探針。只要猝滅劑和熒光團(tuán)接近，猝滅劑就會(huì)猝滅由光源激發(fā)熒光團(tuán)所發(fā)射的熒光。寡核苷酸探針的序列被設(shè)計(jì)為互補(bǔ)于分析物中存在的多核苷酸序列，并因此，能夠與分析物中存在的多核苷酸序列雜交。寡核苷酸探針的雜交在包括引物的核酸擴(kuò)增反應(yīng)(例如，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))中執(zhí)行。通過(guò)dna聚合酶延伸引物后，聚合酶的5'至3'外切酶活性降解探針，釋放熒光團(tuán)和猝滅劑至介質(zhì)中。熒光團(tuán)和猝滅劑之間的接近被破壞，且來(lái)自熒光團(tuán)的信號(hào)不再猝滅。因此，檢測(cè)到的熒光的量是分析物存在的量的函數(shù)。如果沒(méi)有分析物存在，探針將不與分析物雜交，且熒光團(tuán)和猝滅劑將保持極為接近。很少信號(hào)或沒(méi)有信號(hào)會(huì)產(chǎn)生。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“正交”，一般是指可以獨(dú)立地或近似獨(dú)立地改變的信號(hào)的至少兩個(gè)分量(如，波長(zhǎng)和強(qiáng)度)，或至少兩個(gè)不同的信號(hào)(如，熒光發(fā)射信號(hào)和電化學(xué)信號(hào))。例如，當(dāng)使用熒光分子時(shí)，波長(zhǎng)和強(qiáng)度被認(rèn)為是正交的或近似正交的。除其它因素外，熒光發(fā)射的波長(zhǎng)將取決于熒光分子的組合物，并且熒光的強(qiáng)度將取決于存在的分子的量。雖然波長(zhǎng)和強(qiáng)度是可以近似獨(dú)立地被改變的信號(hào)的兩個(gè)分量的實(shí)例，但是本文描述的方法不限于可以獨(dú)立地或近似獨(dú)立地被改變的分量。也可以使用非獨(dú)立地改變的信號(hào)的分量、或多個(gè)信號(hào)，只要足夠良好地確定分量或信號(hào)的特征，以能夠編碼、測(cè)量和解碼。例如，如果一個(gè)分量或信號(hào)中的變化影響另一個(gè)分量或信號(hào)中的變化，只要理解變化之間的關(guān)系，仍可以使用這兩個(gè)分量或信號(hào)。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”、“寡核苷酸”、或“核酸”，在本文中用于指包括多個(gè)核苷酸的生物分子。示例性的多核苷酸包括脫氧核糖核酸、核糖核酸、及其合成的類(lèi)似物，包括肽核酸。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“探針”一般是指在特定的分析物存在下能夠產(chǎn)生信號(hào)的試劑。探針通常具有至少兩個(gè)部分：能夠特異性識(shí)別分析物，或其一部分的部分；及能夠在分析物，或其一部分存在下，產(chǎn)生信號(hào)的部分。如上文和本公開(kāi)中其他地方描述的，探針可以是連接到熒光團(tuán)和猝滅劑的寡核苷酸探針。探針還可以是在分析物存在下，產(chǎn)生信號(hào)的任何試劑，如檢測(cè)分析物的抗體，具有因抗體結(jié)合至分析物而發(fā)射或被猝滅的熒光標(biāo)記。任何合適的探針可以以本公開(kāi)中提出的方法使用，只要探針在分析物存在下產(chǎn)生可定量的信號(hào)。例如，探針的分析物特異性部分可以與酶耦合，在分析物存在下，所述酶轉(zhuǎn)化不帶電荷的底物為帶電荷的產(chǎn)物，從而隨著時(shí)間的推移提高了介質(zhì)中的導(dǎo)電率。在此情況下，不同的分析物可以以不同比例通過(guò)耦合探針(如雜交探針或抗體)的分析物特異性部分至酶被編碼。介質(zhì)中增加的導(dǎo)電率的產(chǎn)生速率將對(duì)介質(zhì)中存在的所有分析物累積。根據(jù)本文提供的方法，編碼分析物能夠?qū)?dǎo)電率測(cè)量結(jié)果轉(zhuǎn)換為明確的(即，非簡(jiǎn)并的)的結(jié)果，提供了關(guān)于特定分析物存在或不存在的信息。類(lèi)似地，探針可包括從底物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光產(chǎn)物的酶?；瘜W(xué)發(fā)光的量可隨后被用于編碼特定分析物的存在。ii.編碼和解碼方法a.傳統(tǒng)熒光編碼和解碼方法確定分析物存在的常用的方法是使用4個(gè)光譜可分辨的熒光分子指示四個(gè)分析物的存在或不存在。圖1的左手側(cè)表示了這種方法的實(shí)例。圖1的左手側(cè)顯示了編碼方法，其中四個(gè)分析物(序列1、序列2、序列3和序列4)每個(gè)分別由單一顏色(分別為藍(lán)色、綠色、黃色和紅色)編碼。顏色表示連接到還包括猝滅劑的寡核苷酸探針的熒光團(tuán)。在圖1的左手側(cè)所示的系統(tǒng)中，有四種不同的寡核苷酸探針，每種包括單一的熒光團(tuán)(藍(lán)色、綠色、黃色、或紅色)和猝滅劑。分析物的存在或不存在是基于在特定的顏色中信號(hào)的存在或不存在確定的。圖1的左手側(cè)的圖表顯示了包含兩個(gè)分析物：序列1和序列3，的假定樣品的強(qiáng)度對(duì)顏色。這些分析物的存在是基于藍(lán)色信號(hào)(對(duì)應(yīng)于序列1)和黃色信號(hào)(對(duì)應(yīng)于序列3)的測(cè)量結(jié)果確定的。不存在序列2和序列4是通過(guò)不存在綠色和紅色信號(hào)指示的。表1顯示了這種編碼方案的二進(jìn)制格式的解釋。每個(gè)分析物被編碼為在熒光信號(hào)的兩個(gè)分量中的每個(gè)分量的值：(1)顏色(也稱(chēng)為波長(zhǎng)；或波長(zhǎng)范圍)和(2)的強(qiáng)度(由表中的數(shù)字指示)。例如，a(例如，序列1)具有藍(lán)色的顏色和1的強(qiáng)度；b(例如，序列2)具有綠色的顏色和1的強(qiáng)度；等等。如本文所述的定量每個(gè)顏色范圍內(nèi)的信號(hào)的強(qiáng)度，例如，通過(guò)測(cè)量由帶通濾波器確定的特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的信號(hào)的強(qiáng)度。1000的結(jié)果指示僅分析物a存在；1100結(jié)果指示分析物a和b存在；等等。表1.具有四個(gè)探針的四個(gè)分析物的傳統(tǒng)編碼，每個(gè)探針具有單一顏色，且每個(gè)分析物一個(gè)探針。藍(lán)色綠色黃色紅色a1000b0100c0010d0001b.每種分析物使用一種以上的顏色的編碼方法上文描述的傳統(tǒng)方法經(jīng)受其由光譜可分辨的熒光團(tuán)的數(shù)目限制的事實(shí)。更具體地，可檢測(cè)的分析物的數(shù)目等于光譜可分辨的熒光團(tuán)的數(shù)目。因此，分析物的數(shù)目?jī)H可通過(guò)增加光譜可分辨的熒光團(tuán)的數(shù)目增加。本公開(kāi)提供了克服這種限制的方法。更具體地，在一些情況下，通過(guò)在編碼過(guò)程中，利用信號(hào)的至少兩個(gè)分量，本文描述的方法可用于檢測(cè)每個(gè)熒光團(tuán)一個(gè)以上的分析物。例如，使用本文提供的方法，每個(gè)熒光團(tuán)可檢測(cè)1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50個(gè)分析物。在一些情況下，本文提供的方法可用于檢測(cè)，每個(gè)熒光團(tuán)可檢測(cè)至少1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50個(gè)分析物。在一些情況下，本文提供的方法可用于檢測(cè)每個(gè)熒光團(tuán)1.5-2、2-4、1.5-4、4-6、2-6、6-10個(gè)分析物。在一些情況下，本公開(kāi)提供的方法可包括使用對(duì)照顏色。對(duì)照顏色可連接到一個(gè)或更多個(gè)探針，在樣品中，所述探針結(jié)合陽(yáng)性對(duì)照分析物，及待檢測(cè)的每個(gè)分析物。如果在陽(yáng)性對(duì)照分析物和待檢測(cè)的每個(gè)分析物中出現(xiàn)相同的序列，也可以使用單一的對(duì)照探針。如果陽(yáng)性對(duì)照分析物和待檢測(cè)的每個(gè)分析物中不出現(xiàn)相同的序列，可以使用不同的探針，但每個(gè)探針仍可連接到對(duì)照顏色。例如，建立在上文描述的傳統(tǒng)方法上，一種顏色(例如藍(lán)色)可用于編碼始終存在于樣品中的對(duì)照分析物的存在。對(duì)照分析物可被加入到樣品中，或者可以是固有地存在于樣品中。剩余的顏色(例如，綠色、黃色、紅色)可用于編碼額外的分析物的存在。表2顯示了一個(gè)這樣的方法的實(shí)例。表2.以四個(gè)顏色且每個(gè)分析物最多兩個(gè)顏色編碼四個(gè)分析物(包括對(duì)照)。藍(lán)色綠色黃色紅色對(duì)照(p)1000a1001b1010c1100在表2中，對(duì)照組(p)的存在由1000的結(jié)果指示。對(duì)照和分析物a的存在由2001的結(jié)果指示。對(duì)照和所有其它三個(gè)分析物的存在由4111的結(jié)果指示。對(duì)照顏色(藍(lán)色)提供了測(cè)定正常運(yùn)行的指示。藍(lán)色顏色的強(qiáng)度報(bào)告了測(cè)試樣品中存在的分析物的數(shù)目。當(dāng)然，任何顏色都可以被用于對(duì)照顏色。本領(lǐng)域技術(shù)的一名人員將認(rèn)識(shí)到，某些實(shí)際考慮可能使其優(yōu)選使用一種顏色而不使用另一種顏色作為對(duì)照顏色。例如，如果一種顏色在特定的光學(xué)系統(tǒng)(或熒光團(tuán)系統(tǒng))中被更好地檢測(cè)，那么可能實(shí)際上優(yōu)選使用該顏色作為對(duì)照顏色。表2中所示的編碼方案使用一個(gè)對(duì)照顏色和一個(gè)額外的顏色(每個(gè)分析物最多2個(gè)探針)編碼每個(gè)分析物。然而，如下所示，當(dāng)每個(gè)分析物使用多達(dá)4個(gè)顏色時(shí)，可被編碼的分析物的數(shù)目增加。表3顯示了示例性的編碼方案，其中每個(gè)分析物由最多4個(gè)顏色編碼。表3所示的方案中，對(duì)照顏色(藍(lán)色)在對(duì)照序列和其它七個(gè)分析物(a-g)的每個(gè)分析物的存在下產(chǎn)生。其它七個(gè)分析物的每個(gè)由一至三個(gè)額外的顏色的存在編碼。顏色可能被不同的探針(例如，連接到熒光團(tuán)和猝滅劑的寡核苷酸探針)或相同的探針(其可以具有多個(gè)熒光團(tuán)和多個(gè)猝滅劑)所包含。表3.以四個(gè)顏色且每個(gè)分析物最多四個(gè)顏色編碼八個(gè)分析物(包括對(duì)照)。藍(lán)色綠色黃色紅色對(duì)照(p)1000a1001b1010c1100d1011e1101f1110g1111在表3中，對(duì)照和所有其它七個(gè)分析物的存在由8444的結(jié)果指示。三個(gè)分析物(a、b和c)由兩個(gè)顏色編碼。三個(gè)分析物(d、e和f)由三個(gè)顏色編碼，且一個(gè)分析物(g)由四個(gè)顏色編碼。對(duì)照(p)的存在由1000的結(jié)果指示。對(duì)照和分析物a的存在由2001的結(jié)果指示。對(duì)照和分析物g的存在由2111的結(jié)果指示。這些結(jié)果表達(dá)每個(gè)顏色中信號(hào)的累積強(qiáng)度。例如，結(jié)果2111在藍(lán)色通道中具有2x的信號(hào)強(qiáng)度，而結(jié)果1000在藍(lán)色通道中僅具有1x的信號(hào)強(qiáng)度。使用表3，依據(jù)顏色(藍(lán)色、綠色、黃色、紅色)和強(qiáng)度(0-8)，每個(gè)可能的累積測(cè)定結(jié)果可被枚舉。表4顯示了通過(guò)基于在表3中所示的編碼方法，對(duì)每個(gè)可能的累積測(cè)定結(jié)果進(jìn)行枚舉，并且根據(jù)在樣品中存在的分析物提供每個(gè)測(cè)定的相應(yīng)的解碼結(jié)果，產(chǎn)生“解碼矩陣”。通過(guò)基于編碼方案枚舉每個(gè)可能的累積測(cè)定結(jié)果，及根據(jù)在樣品中存在的(或不存在的)分析物提供每個(gè)測(cè)定的相應(yīng)的解碼結(jié)果，可以產(chǎn)生用于本文描述的任何編碼方案的類(lèi)似的解碼矩陣。在一些情況下，如以下所述，一個(gè)或更多個(gè)分析物可從編碼方案除去，以減少或消除簡(jiǎn)并性。表4.表3所示的編碼方法的解碼矩陣。使用兩個(gè)假定構(gòu)建的表4中提供了解碼矩陣。首先，解碼矩陣假定陽(yáng)性對(duì)照(p)總是產(chǎn)生陽(yáng)性的結(jié)果。第二，解碼矩陣假定，每個(gè)顏色中，無(wú)論信號(hào)可來(lái)自哪個(gè)探針，強(qiáng)度都以與改變探針濃度相同的方式添加和衡量。這本質(zhì)上意味著信號(hào)是加性的和數(shù)字的。這些假定所依據(jù)的條件可以通過(guò)適當(dāng)準(zhǔn)備測(cè)定得到滿(mǎn)足。如在本文所提供的實(shí)施例中證明的，如果使用熒光信號(hào)，強(qiáng)度僅需近似是的加性的和數(shù)字的。表4允許熒光波長(zhǎng)的四個(gè)范圍中強(qiáng)度(即，每個(gè)顏色范圍中的信號(hào)強(qiáng)度)的累積測(cè)量轉(zhuǎn)換為樣品中存在的相應(yīng)的分析物。例如，4321的結(jié)果指示存在p、c、f和g，且其它分析物不存在。此結(jié)果被稱(chēng)為“合理”的結(jié)果，因?yàn)槠湓诮獯a矩陣中出現(xiàn)。相比之下，4000的結(jié)果，雖然可能測(cè)量到，但未在解碼矩陣出現(xiàn)。更具體地，4000的結(jié)果不能通過(guò)添加來(lái)自表3的對(duì)照代碼和分析物代碼的任意組合被實(shí)現(xiàn)。該結(jié)果被稱(chēng)為“不合理”的結(jié)果。不合理的結(jié)果可能指示測(cè)定故障。因此，對(duì)照(p)和解碼矩陣提供了驗(yàn)證測(cè)定是否正常運(yùn)行的手段。表4窮舉了產(chǎn)生4個(gè)可分辨發(fā)射光譜(例如，顏色)的熒光團(tuán)的任意組合。術(shù)語(yǔ)“秩(rank)”用于描述檢測(cè)的包括對(duì)照的分析物的數(shù)目。在上文提供的實(shí)例中，如果測(cè)定正常運(yùn)行，那么秩等于藍(lán)色信號(hào)的值。例如，秩8指示對(duì)照及所有其它七個(gè)分析物(a-g)存在。秩2指示存在對(duì)照及僅有的一個(gè)分析物。最低的秩是秩1，這指示僅存在對(duì)照。在每個(gè)秩的可能性的數(shù)目可被枚舉。例如，繼續(xù)參考在表3-4中描述的編碼和解碼方法，對(duì)于秩2有7個(gè)可能性。在秩3的可能性的數(shù)目可以以7取2的組合計(jì)算或者說(shuō)有7！/(5！*2！)＝21個(gè)可能性。更普遍地，可能性的數(shù)目是n取k的組合，即為n！/((n-k)！*k！)。類(lèi)似地，在秩4、5、6、7和8，可能性的數(shù)目分別是35、35、21、7和1。參照表4顯示了表與理論預(yù)測(cè)一致。因此，表4是對(duì)表3中提供的編碼方法的窮舉的解碼矩陣。c.減少或消除簡(jiǎn)并性如本文使用的術(shù)語(yǔ)“簡(jiǎn)并”和“簡(jiǎn)并性”，通常描述合理的結(jié)果是不明確的情況，因?yàn)橐罁?jù)分析物存在或不存在，其可以指示一個(gè)以上的可能性。例如，參照表4，結(jié)果5233是簡(jiǎn)并的，因?yàn)樗梢员唤獯a為padfg或pbdeg。類(lèi)似地，結(jié)果4222是簡(jiǎn)并的，因?yàn)樗梢员唤獯a為以下任一個(gè)：pcdg、pafg、pbeg、pdef。相比之下，結(jié)果3110只能指示pbc，且因此是非簡(jiǎn)并的。本公開(kāi)提供了減少或消除簡(jiǎn)并性的方法，從而提高了通過(guò)其檢測(cè)到分析物的置信度。在一個(gè)實(shí)施方案中，消除簡(jiǎn)并度的方法包括：(i)將待檢測(cè)的每個(gè)潛在分析物編碼為信號(hào)的值，并且可選地，編碼為信號(hào)的至少兩個(gè)分量的每個(gè)分量中的值；(ii)枚舉可以從編碼方案獲得的每個(gè)合理的結(jié)果；(iii)鑒定是簡(jiǎn)并的每個(gè)合理的結(jié)果；及(iv)從編碼方案消除至少一個(gè)潛在分析物(或潛在的分析物代碼)，其中消除該至少一個(gè)潛在的分析物減少或消除簡(jiǎn)并性。例如，參照表3中描述的編碼方案，及在表4中描述的解碼矩陣(枚舉每個(gè)合理的結(jié)果)，消除分析物d、e和f的任意兩個(gè)，消除了簡(jiǎn)并性。消除分析物d、e和f中的任意一個(gè)不會(huì)消除簡(jiǎn)并性，但會(huì)減少它。繼續(xù)參照表3中描述的編碼方案，從編碼方案消除分析物d、e和f的任意兩個(gè)，產(chǎn)生僅使用4個(gè)顏色，以無(wú)簡(jiǎn)并性可以分析6個(gè)分析物(包括對(duì)照)的方案。相比之下，多路常規(guī)方法使用4種顏色將僅允許報(bào)告3個(gè)分析物和1個(gè)對(duì)照。因此，通過(guò)使用本文提供的方法可被分析的分析物的數(shù)目接近加倍。圖2顯示了本發(fā)明的示例性實(shí)施方案，其中使用4個(gè)顏色檢測(cè)五個(gè)分析物和一個(gè)對(duì)照。分析物是來(lái)自登革熱病毒(“登革熱”)、結(jié)核分枝桿菌(“結(jié)核病”)、人類(lèi)免疫缺陷病毒(hiv)p17(p17)、瘧原蟲(chóng)(“瘧疾”)、和單純性皰疹(“皰疹”)的核酸。在此實(shí)例中“顏色”是連接到還包括猝滅劑的寡核苷酸探針的熒光團(tuán)。寡核苷酸探針通常將對(duì)不同的分析物不同，而顏色是相同的。例如，指定為探針1的所有探針具有藍(lán)色顏色，但通常會(huì)具有不同的寡核苷酸序列。當(dāng)然，如果互補(bǔ)序列在每個(gè)分析物中存在，指定為探針1的探針也可以具有相同的寡核苷酸序列。本公開(kāi)中其他地方描述了用這些探針檢測(cè)的機(jī)制。探針1(藍(lán)色)雜交包括對(duì)照的所有6個(gè)分析物。探針2(綠色)雜交來(lái)自登革熱病毒、分歧桿菌和hivp17的分析物。探針3(黃色)雜交來(lái)自登革熱病毒和瘧原蟲(chóng)的分析物。探針4雜交來(lái)自登革熱病毒、分歧桿菌和單純性皰疹的分析物。通過(guò)這些探針定義的編碼方案被示于表5。參照表3，潛在的分析物d(1011)和f(1110)已經(jīng)從編碼方案消除。因此，表5中所示的編碼方案是非簡(jiǎn)并的，且來(lái)自測(cè)定的每個(gè)合理的結(jié)果對(duì)應(yīng)于樣品中分析物的唯一的組合的存在或不存在。表5.如圖2所示例的，用于檢測(cè)登革熱病毒、分枝桿菌、hiv、瘧原蟲(chóng)和單純性皰疹的編碼方案。上文所示的用于編碼和解碼的方法，包括用于消除簡(jiǎn)并性的方法，都同樣地適用于使用額外的顏色的編碼方法。例如，表3可以通過(guò)包括額外的顏色和額外的強(qiáng)度擴(kuò)大(下面進(jìn)一步描述)。然后如上所述，枚舉可以從編碼方案獲得的每個(gè)合理的結(jié)果產(chǎn)生解碼矩陣?？梢詾楸竟_(kāi)中描述的任何編碼方案構(gòu)建類(lèi)似于表4中提供的解碼矩陣的解碼矩陣。然后鑒定簡(jiǎn)并的合理的結(jié)果，且至少一個(gè)潛在的分析物代碼從編碼方案消除，以減少或消除簡(jiǎn)并性。消除簡(jiǎn)并性的方法可以使用在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上的軟件、或使用執(zhí)行該方法的硬件配置(例如，微芯片)執(zhí)行。雖然簡(jiǎn)并性可由以上、及在本公開(kāi)中其他地方描述的方法減少或消除，本公開(kāi)還提供了通過(guò)設(shè)計(jì)的非簡(jiǎn)并的編碼方案。例如，消除表3中描述的編碼方案的簡(jiǎn)并性后，編碼方案可無(wú)限地以非簡(jiǎn)并的方式擴(kuò)大，其中非簡(jiǎn)并性是通過(guò)設(shè)計(jì)(參見(jiàn)例如，表6中示例的編碼方案，下文更充分地描述)。類(lèi)似地，本公開(kāi)提供通過(guò)設(shè)計(jì)的完全非簡(jiǎn)并的編碼方案，且因此不需要任何簡(jiǎn)并性減少或消除(參見(jiàn)例如，表8中示例的編碼方案，下文更充分地描述)。因此，本公開(kāi)提供的編碼方案可能已經(jīng)通過(guò)設(shè)計(jì)減少或消除了簡(jiǎn)并性，或通過(guò)設(shè)計(jì)是非簡(jiǎn)并的。d.使用一個(gè)以上的顏色和一個(gè)以上的強(qiáng)度的編碼方法上文描述的編碼方法(例如，表3-5)可以通過(guò)允許由大于1的強(qiáng)度編碼分析物被進(jìn)一步擴(kuò)大。例如，表5中提供的編碼方案中的編碼的每個(gè)分析物是由1或0的熒光強(qiáng)度編碼的。在至少一個(gè)顏色中允許較高的信號(hào)強(qiáng)度值進(jìn)一步增加了可以通過(guò)本公開(kāi)中提供的任何方法編碼的分析物的數(shù)目。在一些實(shí)例中，為了保持對(duì)照顏色的分析物計(jì)數(shù)能力，這些較高的強(qiáng)度值可被分配除了對(duì)照顏色的任何顏色。表6顯示了利用四個(gè)顏色和多強(qiáng)度的示例性編碼方案的最前面的三層。表6的第1層是表3的復(fù)制，顯示了使用四個(gè)顏色的七個(gè)分析物和一個(gè)對(duì)照的編碼。如上文描述的，潛在的分析物d、e和f的任何兩個(gè)可從編碼方案消除，以便產(chǎn)生非簡(jiǎn)并的編碼方案。表6的第1層指示潛在的分析物d(1011)和f(1110)已經(jīng)從編碼方案消除，以消除簡(jiǎn)并性。因此，如上文描述的，表6的第1層所示的編碼方案能夠使用四個(gè)顏色確定五個(gè)分析物及一個(gè)對(duì)照的存在。表6的第1層的編碼方案可通過(guò)允許任何顏色的強(qiáng)度增加，被擴(kuò)大到第二層(層2)。如上文描述的，為了保持對(duì)照的序列計(jì)數(shù)能力，對(duì)照顏色的強(qiáng)度可保持為1。增加任何剩余三個(gè)顏色的強(qiáng)度將產(chǎn)生代碼100y、10y0、1y00、10yy、1y0y、1yy0和1yyy，其中y>1。用于編碼新的層的y的最小值等于來(lái)自現(xiàn)有層的累積最大值加1。如下文描述的，也可以使用大于1的值，以最大化強(qiáng)度之間的差異。因此，在此上下文中，術(shù)語(yǔ)“層”通常用于描述充分利用通過(guò)特定數(shù)目的沒(méi)有簡(jiǎn)并性的第一值(例如，強(qiáng)度)和第二值(例如，顏色)，提供編碼能力的代碼組。例如，表6的第1層充分利用通過(guò)沒(méi)有簡(jiǎn)并性的四個(gè)顏色與每個(gè)顏色最多1個(gè)強(qiáng)度提供的編碼能力。如表6所示，第1層，這將導(dǎo)致包括對(duì)照的六個(gè)編碼的分析物。引入第二層，如上所述，y的最小值可被增加至等于根據(jù)現(xiàn)有層的累積最大結(jié)果加1(或多于一)。在表6提供的實(shí)例中，藍(lán)色(對(duì)照)顏色的強(qiáng)度被保持為1，以保持這種顏色的序列計(jì)數(shù)能力。因此，第2層包括五個(gè)非簡(jiǎn)并的編碼的可能性，其通過(guò)將綠色、黃色和紅色通道中的強(qiáng)度增加至等于根據(jù)第1層的這些通道的每個(gè)通道中的累積最大結(jié)果加一獲得。然后可以枚舉層2的這些代碼的所有可能性，且導(dǎo)致簡(jiǎn)并性的代碼可被消除，或第2層可以通過(guò)設(shè)計(jì)，使用用于消除來(lái)自第1層的對(duì)應(yīng)的代碼的信息，制成非簡(jiǎn)并的。然后可通過(guò)添加根據(jù)類(lèi)似的方法構(gòu)建的第三層、或更多的層實(shí)現(xiàn)更大的編碼容量。編碼方案可具有無(wú)限數(shù)目的層，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100或更多層。更具體地，參照表6，第2層中的分析物h由1004編碼。對(duì)照顏色的值保持為1。紅色顏色的值等于根據(jù)先前層的累積最大結(jié)果(3)加1，或4。同樣地，分析物i和j由1030和1400分別編碼。這些代碼的組合用于編碼其余四個(gè)分析物(k-n)，如在第1層對(duì)分析物d-g完成的。這樣完成了第2層。在第2層，潛在的分析物k(1034)和m(1430)的內(nèi)容導(dǎo)致簡(jiǎn)并性。因此，這些分析物已從編碼方案消除，以消除簡(jiǎn)并性。繼續(xù)參照表6，第三層(層3)使用上文描述的相同的原理構(gòu)建。分析物o用1-0-0-16編碼。對(duì)照顏色的值仍然保持為1。紅色顏色的值等于根據(jù)先前層的累積最大結(jié)果(15)加1、或16。同樣地，分析物p和q分別由1-0-9-0和1-16-0-0編碼。這些代碼的組合用于編碼其余四個(gè)分析物(r-u)，如在第1層對(duì)分析物d-g及在第2層對(duì)分析物k-n完成的。在第3層，潛在的分析物r(1-0-9-16)和t(1-16-9-0)的內(nèi)容導(dǎo)致簡(jiǎn)并性。因此，這些分析物已從編碼方案消除，以消除簡(jiǎn)并性。表6中顯示的三層的編碼方案顯示了使用四個(gè)顏色的15個(gè)分析物和一個(gè)對(duì)照的編碼。通過(guò)增加更多的強(qiáng)度以產(chǎn)生額外的層和/或增加更多的顏色以在層內(nèi)產(chǎn)生額外的編碼能力，此編碼方案可無(wú)限地?cái)U(kuò)大。如在本公開(kāi)中描述的，減少或消除簡(jiǎn)并性的方法可以在添加每個(gè)強(qiáng)度和/或顏色時(shí)使用，以減少或消除簡(jiǎn)并的結(jié)果。更普遍地，表6中描繪的編碼方案是表3-5中描繪的編碼方案的非簡(jiǎn)并的、無(wú)限擴(kuò)大。在第一層的累積測(cè)量的最大強(qiáng)度是6。在第二層的累積測(cè)量的最大強(qiáng)度是15。在第三層的累積測(cè)量的最大強(qiáng)度是63，且以此類(lèi)推。給出最大累積強(qiáng)度值(f)，本編碼方案中可用的層(t)的最大數(shù)目為t＝log4(f+1)。表6中描繪的編碼方案提供了每層五個(gè)(p個(gè))非簡(jiǎn)并的代碼。因此，代碼的最大數(shù)目m＝5*log4(f+1)，或m＝p*t，其中，p為每層的非簡(jiǎn)并的代碼的數(shù)目，且t是層數(shù)。例如，給出f＝63，對(duì)每層5個(gè)非簡(jiǎn)并的化碼，代碼(即，分析物)的最大數(shù)目為15。此式不包括代碼1000，其在表6中保留為陽(yáng)性對(duì)照。為了在分析物的總數(shù)中包括對(duì)照，任何人可簡(jiǎn)單地增加一，提供公式m＝(p*t)+1。本公開(kāi)中提供的方法可用于無(wú)限擴(kuò)大此編碼方案。例如，通過(guò)利用不同的強(qiáng)度(即，第一值)和顏色(即，第二值)的組合，任何人可以通過(guò)改變每層的非簡(jiǎn)并的代碼數(shù)目(p)和層的數(shù)目(t)，編碼任何數(shù)目(m)的分析物。例如，每層的非簡(jiǎn)并的代碼的數(shù)目是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100或更多。類(lèi)似地，層的數(shù)目可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100或更多。表6.使用四個(gè)顏色和多個(gè)強(qiáng)度編碼15種分析物和1個(gè)對(duì)照。圖1的右手側(cè)顯示了上文描述的方法的一個(gè)示例性的實(shí)例。更具體地，圖1的右手側(cè)顯示了編碼方法，其中9個(gè)或多于9個(gè)分析物(序列1-序列9，等)中的每種個(gè)由至少兩個(gè)顏色，且在每個(gè)顏色的強(qiáng)度變化進(jìn)行編碼。顏色表示連接到還包括猝滅劑的寡核苷酸探針的熒光團(tuán)。系統(tǒng)可設(shè)計(jì)成使得每個(gè)探針以單一熒光團(tuán)標(biāo)記，或每個(gè)探針以一個(gè)以上的熒光團(tuán)標(biāo)記。例如，對(duì)于分析物h的代碼，在表6中是1004。在紅色通道中4的強(qiáng)度可通過(guò)使用包括4個(gè)紅色熒光團(tuán)的h特異性探針，或者通過(guò)使用每個(gè)包括單一的紅色熒光團(tuán)的4個(gè)h特異性探針實(shí)現(xiàn)。當(dāng)然，產(chǎn)生在紅色通道中4的結(jié)果的探針和熒光團(tuán)的任意組合也同樣合適，如每個(gè)含有2個(gè)紅色熒光團(tuán)的2個(gè)探針，及含有1個(gè)紅色熒光團(tuán)的1個(gè)探針和含有3個(gè)紅色熒光團(tuán)的1個(gè)探針，或僅僅是含有一個(gè)紅色熒光團(tuán)的一個(gè)探針，但以4x數(shù)量在反應(yīng)混合物中存在。圖1的右手側(cè)描繪的編碼方案可以如表7中所示。圖1的右手側(cè)所示的分析結(jié)果是4112，或藍(lán)色通道中強(qiáng)度為4、綠色通道中為1、黃色通道中為1、且紅色通道中為2。使用如本文所述構(gòu)建的解碼矩陣，此結(jié)果被解碼為指示序序列1、序列3、序列4和序列5存在。表7.圖1的右手側(cè)說(shuō)明的編碼方案。e.每個(gè)分析物使用一個(gè)顏色和一個(gè)強(qiáng)度，但在分析物中使用不同強(qiáng)度的編碼方法在本文提供的一些方法中，每個(gè)分析物是由單一的顏色和強(qiáng)度的組合編碼的。例如，在四色系統(tǒng)中，最前面的四個(gè)分析物可通過(guò)1000、2000、4000和8000編碼。其后的四個(gè)分析物可通過(guò)0100、0200、0400和0800編碼。分析物9-12和13-16將類(lèi)似地分配，如表8所示。像表6中描述的編碼方法，該編碼方案通過(guò)構(gòu)建在理論上是無(wú)限的、非簡(jiǎn)并的，且僅由測(cè)量信號(hào)使用的儀器的帶寬限制。然而，此編碼方案比表6中描述的編碼方法能夠在每單位帶寬上定量更多的分析物。其原因在于，以最大的效率使用信號(hào)的可用的多路性，因?yàn)榫幋a中利用了每個(gè)強(qiáng)度等級(jí)(即色譜中沒(méi)有空缺；參見(jiàn)下文色譜的描述)。表8顯示了該方法的一個(gè)實(shí)施方案，說(shuō)明了基于四個(gè)顏色和強(qiáng)度1、2、4和8的四層編碼。編碼方案是非簡(jiǎn)并的，且如果所有16個(gè)分析物存在，結(jié)果是15-15-15-15。在帶寬利用率方面，這種編碼方法比上面給出的編碼方法更有效。然而，這種方法不具有第一個(gè)方案的校對(duì)能力，這是因?yàn)榈谝粋€(gè)方案中所有解碼為合理的輸出結(jié)果的結(jié)果都存在色譜中的空缺。表8.每個(gè)分析物使用一個(gè)顏色和一個(gè)強(qiáng)度，但在分析物中使用不同強(qiáng)度的編碼方法的實(shí)例。上文所示的，及表8中示例的方法，可通過(guò)引入額外的顏色和/或強(qiáng)度擴(kuò)大。例如，可以使用5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、或更多個(gè)顏色。也可以使用額外的強(qiáng)度等級(jí)，例如16、32、64、128、256、512、1024、2048、4096、8192、16384、32768、65536、等等。該方法是可歸納的且可用于編碼無(wú)限數(shù)目的分析物。每個(gè)分析物由單一顏色中的代碼表示，其中，在該單一顏色中的代碼的值等于所有先前值的總和加1。例如，如果在特定的顏色中的第一代碼包含1，其后的代碼是2、4、8、16、32、64、128等等。其它級(jí)數(shù)(progression)是可能的，但依據(jù)帶寬的使用不會(huì)被認(rèn)為有效的。然而，本領(lǐng)域的一個(gè)普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，當(dāng)任何人希望最大化值之間的間隔時(shí)，可能希望較不有效的帶寬使用。類(lèi)似地，值1可從編碼方案排除，例如，以最大化第一編碼值和儀器的噪聲之間的強(qiáng)度中的差異。例如，在一些情況下，編碼方案可以以值2開(kāi)始，其將為分析物代碼提供為2、4、8、16、32、64、128、等等的級(jí)數(shù)，而累積結(jié)果的級(jí)數(shù)將是2、4、6、8、10、12、14、16、等等。這種方法在可能的累積結(jié)果中產(chǎn)生均勻的空缺(gap)，相比1、2、4、8、16、32、等等的分析物代碼級(jí)數(shù)，允許對(duì)噪聲更高的耐受，且其對(duì)應(yīng)于1、2、3、4、5、6、7、8、等等的累積結(jié)果級(jí)數(shù)。在這個(gè)實(shí)例中，測(cè)量中增加的魯棒性以多路性的固定帶寬中可用的代碼的數(shù)目減少為代價(jià)。例如，如果僅有63個(gè)多路性狀態(tài)能夠被可靠地測(cè)量，那么從1開(kāi)始的編碼方案每個(gè)顏色提供7個(gè)代碼，而從2開(kāi)始的編碼方案每個(gè)顏色提供6個(gè)代碼。如果4個(gè)顏色可用，前者將提供28個(gè)代碼，而后者將提供24個(gè)代碼。總之，開(kāi)始信號(hào)強(qiáng)度和級(jí)數(shù)(即，強(qiáng)度值之間的差異)兩者均可以被衡量，以最大化對(duì)儀器的噪聲的分辨能力，并最大化強(qiáng)度值之間的差異，由此增強(qiáng)區(qū)分不同實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間的能力。如表8說(shuō)明的編碼方案通過(guò)設(shè)計(jì)為非簡(jiǎn)并的。雖然表8中說(shuō)明的編碼方案使用強(qiáng)度和顏色兩者編碼16個(gè)分析物的每個(gè)分析物，還可以通過(guò)簡(jiǎn)單地利用強(qiáng)度編碼每個(gè)分析物。例如，給出表8中提供的16個(gè)分析物(a-p)，單一顏色的編碼方案編碼全部16個(gè)分析物，可分別地分配值1、2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024、2048、4096、8192和16384至分析物a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、n、o和p。這種編碼方案通過(guò)設(shè)計(jì)為非簡(jiǎn)并的，且累積強(qiáng)度結(jié)果可以被明確地解碼以指示分析物a-p的存在或不存在。這種編碼方案能夠檢測(cè)m種分析物的存在或不存在，其中m＝log2(f+1)，且f是信號(hào)(例如，信號(hào)強(qiáng)度)的最大累積值。通過(guò)向這個(gè)信號(hào)添加第二分量(如顏色，如表8中描繪的)，這個(gè)編碼方案的容量可以增大到m＝c*log2(f+1)，其中c是在所述編碼方案中使用的顏色數(shù)目。如貫穿此說(shuō)明書(shū)中描述的，任何合適的值可以用于c或f。例如，c可以是至少約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、或更多。f+1可以是至少約2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024、2048、4096、8192、16384、32768、65536、131072、262144、524288、1048576、等等。如在本公開(kāi)中其他地方描述的，f的最初開(kāi)始值和在其級(jí)數(shù)中的步長(zhǎng)(step)也可以改變。iii.分析物分析物可以是使用本發(fā)明的方法和組合物分析的任何合適的分析物，其中分析物能夠與試劑相互作用，以便產(chǎn)生可被測(cè)量的具有至少兩個(gè)分量的信號(hào)。分析物可以是天然存在的或合成的。分析物可以存在于使用本領(lǐng)域中已知的任何方法獲得的樣品中。在一些情況下，樣品可以在其用于分析物的分析前被處理。本公開(kāi)中提出的方法和組合物可在溶液相測(cè)定中使用，而不需要顆粒(如珠)或固體支持體。在一些情況下，分析物可以是多核苷酸，例如dna、rna、肽核酸、及其任何雜合體(hybrid)，其中多核苷酸包含脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的任意組合。多核苷酸可以是單鏈或雙鏈的，或同時(shí)含有雙鏈或單鏈序列部分。多核苷酸可包含核苷酸或堿基的任意組合，包括，例如，尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶、異鳥(niǎo)嘌呤及其任意核苷酸衍生物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“核苷酸”可包括核苷酸和核苷，以及核苷和核苷酸類(lèi)似物，及修飾(modified)的核苷酸，包括合成的種類(lèi)和天然存在的種類(lèi)兩者。多核苷酸可以是針對(duì)其可產(chǎn)生如本文描述的一種或更多種試劑(或探針)的任何合適的多核苷酸，包括但不限于cdna、線(xiàn)粒體dna(mtdna)、信使rna(mrna)、核糖體rna(rrna)、轉(zhuǎn)移rna(trna)、核rna(nrna)、小干擾rna(sirna)、小核rna(snrna)、小核仁rna(snorna)、小卡哈爾體特異性rna(smallcajalbody-specificrna，scarna)、微小rna(mirna)、雙鏈(dsrna)、核酶、核糖開(kāi)關(guān)(riboswitch)或病毒rna。多核苷酸可被包含在任何合適的載體中，例如質(zhì)粒、粘粒、片段、染色體、或基因組。基因組dna可從天然存在的或遺傳修飾的生物體，或從人工地或合成地產(chǎn)生的基因組獲得。包括基因組dna單獨(dú)分析物可從任何來(lái)源，且使用本領(lǐng)域中已知的任何方法獲得。例如，基因組dna可以利用或不利用擴(kuò)增被分離。擴(kuò)增可包括pcr擴(kuò)增、多重置換擴(kuò)增(mda)、滾環(huán)擴(kuò)增和其它擴(kuò)增方法?；蚪Mdna也可以通過(guò)克隆或重組的方法獲得，例如那些涉及質(zhì)粒和人工染色體的方法或其它的常規(guī)方法(參見(jiàn)sambrook和russell，molecularcloning:alaboratorymanual.，出處同上)。多核苷酸可使用本領(lǐng)域已知的其它方法分離，例如如在genomeanalysis:alaboratorymanualseries(卷i-iv)或molecularcloning:alaboratorymanual中公開(kāi)的。如果分離的多核苷酸是mrna，其可以使用常規(guī)技術(shù)被逆轉(zhuǎn)錄(reversetranscribe)為cdna，如sambrook和russell,molecularcloning:alaboratorymanual，出處同上，中描述的。分析物可以是蛋白質(zhì)、多肽、脂質(zhì)、碳水化合物、糖、小分子、或可以以本文提供的方法和組合物檢測(cè)的任何其它合適的分子。分析物可以是酶或其它蛋白質(zhì)。分析物可以是藥物或代謝物(例如，抗癌藥物、化學(xué)治療藥物、抗病毒藥物、抗生素藥物、或生物制劑(biologic))。分析物可以是任何分子，如輔因子、受體、受體配體、激素、細(xì)胞因子、血液因子、抗原、類(lèi)固醇、或抗體。分析物可以是來(lái)自任何病原體的任何分子，病原體例如病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)、真菌、或朊病毒(例如，prpsc)。病毒的實(shí)例包括來(lái)自以下科的那些，腺病毒科、黃病毒科、嗜肝病毒科、皰疹病毒科、正粘病毒科、乳多空病毒科、副粘病毒科、小核糖核酸病毒科、多瘤病毒科、逆轉(zhuǎn)錄病毒科、彈狀病毒科、及披膜病毒科。病毒的具體實(shí)例包括腺病毒、星狀病毒、博卡病毒、bk病毒、柯薩奇病毒、巨細(xì)胞病毒、登革熱病毒、埃博拉病毒、腸病毒、eb病毒、貓白血病病毒、肝炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、單純性皰疹病毒(hsv)、hsv1型、hsv2型、人免疫缺陷病毒(hiv)、hiv1型、hiv2型、人類(lèi)乳頭瘤病毒(hpv)、hpv1型、hpv2型、hpv3型、hpv4型、hpv6型、hpv10型、hpv11型、hpv16型、hpv18型、hpv26型、hpv27型、hpv28型、hpv29型、hpv30型、hpv31型、hpv33型、hpv34型、hpv35型、hpv39型、hpv40型、hpv41型、hpv42型、hpv43型、hpv44型、hpv45型、hpv49型、hpv51型、hpv52型、hpv54型、hpv55型、hpv56型、hpv57型、hpv58型、hpv59型、hpv68型、hpv69型、流感病毒、jc病毒、馬爾堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、諾沃克病毒、細(xì)小病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、鼻病毒、輪狀病毒、風(fēng)疹病毒、天花病毒、牛痘病毒、西尼羅河病毒和黃熱病病毒。細(xì)菌的實(shí)例包括來(lái)自以下屬的那些，博德特氏菌屬(bordetella)、疏螺旋體屬(borrelia)、布魯氏菌屬(brucella)、彎曲桿菌屬(campylobacter)、衣原體屬(chlamydia)、梭菌屬(clostridium)、棒狀桿菌屬(corynebacterium)、腸球菌屬(enterococcus)、埃希氏菌屬(escherichia)、弗朗西斯氏菌屬(francisella)、嗜血桿菌屬(haemophilus)、螺桿菌屬(helicobacter)、軍團(tuán)菌屬(legionella)、鉤端螺旋體屬(leptospira)、李斯特菌屬(listeria)、分枝桿菌屬(mycobacterium)、支原體屬(mycoplasma)、奈瑟菌屬(neisseria)、假單胞菌屬(pseudomonas)、立克次氏體屬(rickettsia)、沙門(mén)氏菌屬(salmonella)、志賀氏菌屬(shigella)、葡萄球菌屬(staphylococcus)、鏈球菌屬(streptococcus)、密螺旋體屬(treponema)、弧菌屬(vibrio)和耶爾森氏菌屬(yersinia)。細(xì)菌的具體實(shí)例包括副百日咳博德特氏菌(bordetellaparapertussis)、百日咳博得特氏菌(bordetellapertussis)、伯氏疏螺旋體(borreliaburgdorferi)、流產(chǎn)布魯氏菌(brucellaabortus)、犬布魯氏菌(brucellacanis)、羊布魯氏菌(brucellamelitensis)、豬布魯氏菌(brucellasuis)、空腸彎曲桿菌(campylobacterjejuni)、肺炎衣原體(chlamydiapneumoniae)、鸚鵡熱衣原體(chlamydiapsittaci)、沙眼衣原體(chlamydiatrachomatix)、肉毒梭菌(clostridiumbotulinum)、艱難梭菌(clostridiumdifficile)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(clostridiumperfringens)、破傷風(fēng)梭菌(clostridiumtetani)、白喉棒狀桿菌(corynebacteriumdiphtheriae)、糞腸球菌(enterococcusfaecalis)、屎腸球菌(enterococcusfaecium)、大腸桿菌(escherichiacoli)、土拉弗朗西斯菌(francisellatularensis)、流感嗜血桿菌(haemophilusinfluenzae)、幽門(mén)螺旋桿菌(helicobacterpylori)、嗜肺軍團(tuán)菌(legionellapneumophila)、問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體(leptospirainterrogans)、單增李斯特菌(listeriamonocytogenes)、麻風(fēng)分枝桿菌(mycobacteriumleprae)、結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis)、潰瘍分枝桿菌(mycobacteriumulcerans)、肺炎支原體(mycoplasmapneumoniae)、淋球奈瑟菌(neisseriagonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟菌(neisseriameningitidis)、銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)、立克次氏體(rickettsiarickettsii)、豬霍亂沙門(mén)氏菌(salmonellacholeraesuis)、都柏林沙門(mén)氏菌(salmonelladublin)、腸炎沙門(mén)氏菌(salmonellaenteritidis)、傷寒沙門(mén)氏菌(salmonellatyphi)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌(salmonellatyphimurium)、宋內(nèi)氏志賀菌(shigellasonnei)、金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis)、腐生葡萄球菌(staphylococcussaprophyticus)、無(wú)乳鏈球菌(streptococcusagalactiae)、肺炎鏈球菌(streptococcuspneumoniae)、化膿性鏈球菌(streptococcuspyogenes)、蒼白密螺旋體(treponemapallidum)、霍亂弧菌(vibriocholerae)、鼠疫耶爾森氏菌(yersiniapestis)和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(yersiniaenterocolitica)。寄生蟲(chóng)的實(shí)例包括來(lái)自以下屬的那些，棘阿米巴屬(acanthamoeba)、巴貝蟲(chóng)屬(babesia)、巴拉姆西屬(balamuthia)、腸袋屬蟲(chóng)(balantidium)、芽囊原蟲(chóng)屬(blastocystis)、隱孢子蟲(chóng)屬(cryptosporidium)、雙核阿米巴屬(dientamoeba)、內(nèi)阿米巴屬(entamoeba)、賈第蟲(chóng)屬(giardia)、等孢球蟲(chóng)屬(isospora)、利什曼原蟲(chóng)屬(leishmania)、耐格里蟲(chóng)屬(naegleria)、虱屬(pediculus)、瘧原蟲(chóng)屬(plasmodium,)、鼻孢子蟲(chóng)屬(rhinosporidium,)、肉孢子蟲(chóng)屬(sarcocystis)、血吸蟲(chóng)屬(schistosoma)、弓形蟲(chóng)屬(toxoplasma)、滴蟲(chóng)屬(trichomonas)和錐蟲(chóng)屬(trypanosoma)。寄生蟲(chóng)的具體實(shí)例包括分歧巴貝蟲(chóng)(babesiadivergens)、雙芽巴貝蟲(chóng)(babesiabigemina)、馬巴貝蟲(chóng)(babesiaequi)、田鼠巴貝蟲(chóng)(babesiamicroti)、鄧肯巴貝蟲(chóng)(babesiaduncani)、狒狒巴拉姆西阿米巴(balamuthiamandrillaris)、結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)(balantidiumcoli)、脆弱雙核阿米巴(dientamoebafragilis)、痢疾阿米巴(entamoebahistolytica)、賈第鞭毛蟲(chóng)(giardialamblia)、貝利等孢球蟲(chóng)(isosporabelli)、福氏耐格里阿米巴(naegleriafowleri)、人虱(pediculushumanus)、惡性瘧原蟲(chóng)(plasmodiumfalciparum)、諾氏瘧原蟲(chóng)(plasmodiumknowlesi)、三日瘧原蟲(chóng)(plasmodiummalariae)、卵形瘧原蟲(chóng)(plasmodiumovale)、間日瘧原蟲(chóng)(plasmodiumvivax)、鼻孢子蟲(chóng)(rhinosporidiumseeberi)、牛人肉孢子蟲(chóng)(sarcocystisbovihominis)、豬人肉孢子蟲(chóng)(sarcocystissuihominis)、曼氏血吸蟲(chóng)(schistosomamansoni)、弓形蟲(chóng)(toxoplasmagondii)、陰道毛滴蟲(chóng)(trichomonasvaginalis)、布氏錐蟲(chóng)(trypanosomabrucei)、和克氏錐蟲(chóng)(trypanosomacruzi)。真菌的實(shí)例包括來(lái)自以下屬的那些，鱗質(zhì)霉屬(apophysomyces)、曲霉屬(aspergillus)、芽生菌屬(blastomyces)、念珠菌屬(candida)、枝孢霉屬(cladosporium)、球孢子菌屬(coccidioides)、隱球菌屬(cryptococcus)、突臍孢屬(exserohilum)、鐮刀菌屬(fusarium)、組織胞漿菌屬(histoplasma)、畢赤酵母屬(pichia)、肺囊蟲(chóng)屬(pneumocystis)、酵母屬(saccharomyces)、孢子絲菌屬(sporothrix)、葡萄穗霉屬(stachybotrys)和毛癬菌屬(trichophyton)。真菌的具體實(shí)例包括煙曲霉(aspergillusfumigatus)、黃曲霉(aspergillusflavus)、棒曲霉(aspergillusclavatus)、皮炎芽生菌(blastomycesdermatitidis)、白色念珠菌(candidaalbicans)、粗球孢子菌(coccidioidesimmitis)、新型隱球菌(cryptococcusneoformans)、尖角突臍孢(exserohilumrostratum)、輪狀鐮刀菌(fusariumverticillioides)、莢膜組織胞漿菌(histoplasmacapsulatum)、杰氏肺囊蟲(chóng)(pneumocystisjirovecii)、申克孢子絲菌(sporothrixschenckii)、黑葡萄穗霉(stachybotryschartarum)和須癬毛癬菌(trichophytonmentagrophytes)。在一些情況下，本公開(kāi)中所提供的方法可以用于檢測(cè)在上文、或者在說(shuō)明書(shū)的其它地方描述的分析物中的任何一個(gè)。在一些情況下，本公開(kāi)中提供的方法可以用于檢測(cè)在上文、或在說(shuō)明書(shū)的其它地方描述的分析物的組合(panel)。例如，組合可包括選自由任意2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100或更多個(gè)在上文或在說(shuō)明書(shū)中的其它地方描述的分析物所組成的組的分析物。分析物可從任何合適的位置獲得，包括從生物體、完整細(xì)胞、細(xì)胞制劑和來(lái)自任何生物體、組織、細(xì)胞、或環(huán)境的無(wú)細(xì)胞組合物。分析物可從環(huán)境樣品、活檢、抽吸物、福爾馬林固定的包埋組織、空氣、農(nóng)業(yè)樣品、土壤樣品、石油樣品、水樣、或灰塵樣品中獲得。在一些情況下，分析物可以從體液獲得，其可能包括血液、尿液、糞便、血清、淋巴液、唾液、粘膜分泌物、汗液、中樞神經(jīng)系統(tǒng)流體、陰道液、或精液。分析物也可以由制造的產(chǎn)品獲得，如化妝品、食品、個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品、等等。分析物可以是實(shí)驗(yàn)操作的產(chǎn)物，包括重組克隆、多核苷酸擴(kuò)增、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)擴(kuò)增、純化方法(如基因組dna或rna的純化)和合成反應(yīng)。在每個(gè)多路測(cè)定中，可以檢測(cè)多于一種類(lèi)型的分析物。例如，多核苷酸、蛋白質(zhì)、多肽、脂質(zhì)、碳水化合物、糖、小分子、或任何其它合適的分子可以同時(shí)在相同的多路測(cè)定中以合適的試劑檢測(cè)?？稍谙嗤臅r(shí)間檢測(cè)分析物的任意組合。分析物的檢測(cè)可對(duì)任何合適的應(yīng)用有用，應(yīng)用包括科研、臨床、診斷、預(yù)后、法醫(yī)和監(jiān)測(cè)應(yīng)用。典型應(yīng)用包括遺傳性疾病的檢測(cè)、遺傳指紋的鑒定、感染性疾病的診斷、基因的克隆、親子測(cè)試、刑事鑒定、系統(tǒng)發(fā)育、生物反恐、環(huán)境監(jiān)測(cè)、及dna計(jì)算。例如，分析物可以指示疾病或狀況。分析物可以用來(lái)做出治療決定，或以評(píng)估疾病的狀態(tài)。分析物的存在可以指示具有特定病原體感染或任何其它疾病如癌癥、自身免疫性疾病、心肺病、肝病、消化道疾病、等等。因此本文提供的方法可以用于做出診斷并基于該診斷做出臨床決定。例如，指示從受試者采集的樣品中細(xì)菌多核苷酸的存在的結(jié)果可能導(dǎo)致以抗生素治療受試者。在一些情況下，本發(fā)明的方法和組合物可用于檢測(cè)至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、或1000個(gè)分析物。在一些情況下，本發(fā)明的方法和組合物可用于檢測(cè)7-50、8-40、9-30、10-20、10-15、8-12、或7-12個(gè)分析物。在一些情況下，本公開(kāi)提供在單一樣品體積中能夠明確地檢測(cè)處于存在或不存在的任意組合的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、或1000個(gè)分析物中的每個(gè)分析物的存在或不存在的測(cè)定而無(wú)需固定化、分離、質(zhì)譜法、或解鏈曲線(xiàn)分析。在一些情況下，本公開(kāi)提供在單一樣品體積中能夠明確地檢測(cè)處于存在或不存在的任意組合的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、或1000個(gè)分析物中的每個(gè)分析物的存在或不存在的測(cè)定而無(wú)需固定化、分離、質(zhì)譜法、或解鏈曲線(xiàn)分析。在一些情況下，本公開(kāi)提供在單一樣品體積中能夠明確地檢測(cè)處于存在或不存在的任意組合的少于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、或1000個(gè)分析物的存在或不存在的測(cè)定而無(wú)需固定化、分離、質(zhì)譜法、或解鏈曲線(xiàn)分析。iv.信號(hào)本公開(kāi)中提出的方法可以任何可定量的信號(hào)進(jìn)行使用。在一些情況下，本公開(kāi)提供了使用信號(hào)的單一分量(例如，強(qiáng)度)，以非簡(jiǎn)并性編碼無(wú)限數(shù)目的目標(biāo)的編碼方案和方法。例如，如在上文和在實(shí)施例3中描述的，編碼方案可依賴(lài)于信號(hào)強(qiáng)度的多路性不考慮顏色。雖然熒光探針已被用于說(shuō)明此原理，但是如在本公開(kāi)中其他地方描述的，所述編碼方案同樣適合任何其它方法，所述其它方法提供了可定量的信號(hào)，包括電化學(xué)信號(hào)和化學(xué)發(fā)光信號(hào)。本公開(kāi)提出的方法還可以利用在至少二個(gè)維度中的信號(hào)測(cè)量結(jié)果，也被稱(chēng)為信號(hào)的至少兩個(gè)分量的測(cè)量結(jié)果。例如，相比于上文段落中描述的、依賴(lài)于信號(hào)強(qiáng)度以區(qū)分分析物的編碼方案，利用信號(hào)的至少兩個(gè)分量(例如，顏色和強(qiáng)度)允許每個(gè)信號(hào)強(qiáng)度帶寬的單位產(chǎn)生更多不同的代碼。當(dāng)利用信號(hào)的至少兩個(gè)分量時(shí)，可獲得單一樣品體積的至少兩個(gè)分量的累積測(cè)量結(jié)果。例如，在表5描述的編碼方案中，每個(gè)分析物的存在導(dǎo)致在4個(gè)顏色(信號(hào)的第二分量)的每個(gè)顏色上的特定的強(qiáng)度(信號(hào)的一個(gè)分量)。這些構(gòu)成信號(hào)的組合導(dǎo)致了可以通過(guò)測(cè)量在每個(gè)波長(zhǎng)或波長(zhǎng)范圍內(nèi)的強(qiáng)度來(lái)測(cè)量累積信號(hào)。然后可使用相應(yīng)的編碼方案或解碼矩陣，將累積測(cè)量結(jié)果轉(zhuǎn)換為確定分析物存在或不存在。在一些情況下，可定量的信號(hào)包括具有頻率(波長(zhǎng))和振幅(強(qiáng)度)兩者的波形。信號(hào)可以是電磁信號(hào)。電磁信號(hào)可以是聲音、無(wú)線(xiàn)電信號(hào)、微波信號(hào)、紅外信號(hào)、可見(jiàn)光信號(hào)、紫外光信號(hào)、x射線(xiàn)信號(hào)、或γ射線(xiàn)信號(hào)。在一些情況下，電磁信號(hào)可以是熒光信號(hào)，例如可以依據(jù)波長(zhǎng)和強(qiáng)度表征的熒光發(fā)射光譜。在本公開(kāi)的某些部分，信號(hào)依據(jù)熒光信號(hào)被描述和示例。這不意味著是限制性的，且本領(lǐng)域的一個(gè)普通技術(shù)人員將容易地認(rèn)識(shí)到適用于熒光信號(hào)的測(cè)量的原理也適用于其它信號(hào)。例如，類(lèi)似熒光信號(hào)，上文描述的任何電磁信號(hào)都可以依據(jù)波長(zhǎng)和強(qiáng)度表征。熒光信號(hào)的波長(zhǎng)也可以依據(jù)顏色描述。顏色可以通過(guò)基于在特定波長(zhǎng)或波長(zhǎng)范圍測(cè)量強(qiáng)度確定，例如，通過(guò)確定在不同波長(zhǎng)熒光的強(qiáng)度分布，和/或通過(guò)利用帶通濾波器以確定特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的熒光強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行確定。這樣的帶通濾波器通常用于各種實(shí)驗(yàn)室儀器，包括定量pcr器。強(qiáng)度可以以光電檢測(cè)器測(cè)量。許多波長(zhǎng)可被稱(chēng)為“信道”。在一些情況下，本公開(kāi)中提供的方法可以用于任何信號(hào)，其中累積信號(hào)以相同的顏色、頻率、吸收帶、等等的構(gòu)成信號(hào)衡量。然而，累積信號(hào)不需要是數(shù)字信號(hào)或隨構(gòu)成信號(hào)的數(shù)目和強(qiáng)度線(xiàn)性調(diào)節(jié)(scale)。例如，如果測(cè)量的物理原理是吸收，那么由于beer-lambert定律的指數(shù)性質(zhì)，累積衰減是構(gòu)成衰減的乘積而構(gòu)成濃度是加性的。然后累積衰減的對(duì)數(shù)將隨在每個(gè)吸收帶(如果使用熒光檢測(cè)，相當(dāng)于顏色)上的構(gòu)成濃度線(xiàn)性調(diào)節(jié)。因此，本發(fā)明的方法是可以應(yīng)用的。本發(fā)明的方法也可用于化學(xué)發(fā)光信號(hào)和電化學(xué)信號(hào)。信號(hào)的數(shù)目，及測(cè)量的維數(shù)或分量的數(shù)目，也可以擴(kuò)大到超出本發(fā)明的示例性的實(shí)施方案中所示的數(shù)目，導(dǎo)致多路能力的擴(kuò)大。本公開(kāi)中提供的示例性實(shí)施方案利用了利用具有測(cè)量的一個(gè)或兩個(gè)分量：波長(zhǎng)和/或強(qiáng)度的熒光信號(hào)所構(gòu)造的編碼方案。可被編碼的分析物的數(shù)目可以通過(guò)增加波長(zhǎng)和/或強(qiáng)度的數(shù)目而增加?？杀痪幋a的分析物的數(shù)量，也可以通過(guò)增加信號(hào)的數(shù)目而增加，例如通過(guò)組合熒光信號(hào)與電化學(xué)信號(hào)或fret信號(hào)(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)而增加。在一些情況下，信號(hào)的兩個(gè)以上的分量可被測(cè)量。例如，信號(hào)的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、18、20個(gè)或更多個(gè)分量可被測(cè)量。信號(hào)的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、18、或20個(gè)分量可被測(cè)量。信號(hào)的至少2個(gè)，但少于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、18、或20個(gè)分量可被測(cè)量。在一些情況下，信號(hào)的2-3、2-4、2-5、2-6、3-5、3-6、3-8、或5-10個(gè)分量可被測(cè)量。這些額外的分量可包括動(dòng)力分量，例如信號(hào)衰減的速率和光漂白速率。如果采用熒光信號(hào)，可被編碼的分析物的數(shù)目，可以進(jìn)一步通過(guò)利用額外的熒光團(tuán)擴(kuò)大。例如，可以使用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多個(gè)熒光團(tuán)。在一些情況下，可以使用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50個(gè)熒光團(tuán)。在一些情況下，可以使用少于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50個(gè)熒光團(tuán)。在一些情況下，可以使用4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、10-15、或10-20的熒光團(tuán)。通常，可被編碼的分析物的數(shù)目，可以進(jìn)一步通過(guò)利用來(lái)自信號(hào)的第一分量的值或值的范圍的額外的第一值(例如，強(qiáng)度)擴(kuò)大。例如，可以使用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多個(gè)來(lái)自信號(hào)的第一分量的值或值的范圍的第一值。在一些情況下，可以使用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多個(gè)來(lái)自信號(hào)的第一分量的值或值的范圍的第一值。在一些情況下，可以使用少于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50個(gè)來(lái)自信號(hào)的第一分量的值或值的范圍的第一值。在一些情況下，可以使用4-20、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、10-15、或10-20的來(lái)自信號(hào)的第一分量的值或值的范圍的第一值。在實(shí)例中，其中強(qiáng)度是被定量的信號(hào)的分量，例如當(dāng)利用熒光信號(hào)時(shí)，分析物的存在可以使用多個(gè)強(qiáng)度或強(qiáng)度范圍編碼。例如，編碼方案可以利用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多個(gè)強(qiáng)度或強(qiáng)度范圍。編碼方案可以利用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多個(gè)強(qiáng)度或強(qiáng)度范圍。編碼方案可以利用少于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50個(gè)強(qiáng)度或強(qiáng)度范圍。在一些情況下，編碼方案可利用2-20、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、4-5、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、5-6、5-7、5-8、5-9或5-10個(gè)強(qiáng)度或強(qiáng)度范圍。可被編碼的分析物的數(shù)目，可以進(jìn)一步通過(guò)利用來(lái)自信號(hào)的第二分量的值或值的范圍的額外的第二值(例如，波長(zhǎng))擴(kuò)大。例如，可以使用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多個(gè)來(lái)自信號(hào)的第二分量的值或值的范圍的第二值。在一些情況下，可以使用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多個(gè)來(lái)自信號(hào)的第二分量的值或值的范圍的第二值。在一些情況下，可以使用少于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多個(gè)來(lái)自信號(hào)的第二分量的值或值的范圍的第二值。在一些情況下，可以使用4-20、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、10-15、或10-20個(gè)來(lái)自信號(hào)的第二分量的值或值的范圍的第二值。在其中波長(zhǎng)是被定量的信號(hào)的分量的實(shí)例中，例如當(dāng)利用熒光信號(hào)時(shí)，分析物的存在可以使用多種波長(zhǎng)或波長(zhǎng)范圍編碼。例如，可以使用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多個(gè)波長(zhǎng)或波長(zhǎng)范圍。在一些情況下，可以使用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多個(gè)波長(zhǎng)或波長(zhǎng)范圍。在一些情況下，可以使用少于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50個(gè)波長(zhǎng)或波長(zhǎng)范圍。在一些情況下，可以使用4-20、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、10-15、或10-20的波長(zhǎng)或波長(zhǎng)范圍。在一些情況下，當(dāng)簡(jiǎn)并性被消除，本發(fā)明的方法能夠檢測(cè)在單一體積中的至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多個(gè)分析物的存在或不存在，當(dāng)用于在體積中產(chǎn)生信號(hào)的每個(gè)試劑僅產(chǎn)生一個(gè)第二值(例如，每個(gè)試劑，僅發(fā)射一個(gè)波長(zhǎng)的光)時(shí)。在其它情況下，當(dāng)簡(jiǎn)并性被消除，本發(fā)明的方法能夠檢測(cè)在單一體積中的至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多個(gè)分析物的存在或不存在，總共在該體積中使用了四個(gè)第二值(例如，共四個(gè)波長(zhǎng)或波長(zhǎng)的范圍，其可能通過(guò)使用四個(gè)光譜可分辨的熒光團(tuán)實(shí)施)。如在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中描述的，本文提供的測(cè)定利用對(duì)樣品的累積測(cè)量結(jié)果。累積測(cè)量結(jié)果可以是，例如，強(qiáng)度值的單一測(cè)量結(jié)果，或在一個(gè)或更多個(gè)波長(zhǎng)或波長(zhǎng)的范圍的強(qiáng)度值的測(cè)量結(jié)果?？梢垣@得多個(gè)累積測(cè)量結(jié)果。例如，強(qiáng)度可以在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多個(gè)波長(zhǎng)或波長(zhǎng)范圍測(cè)量。強(qiáng)度可以在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多個(gè)波長(zhǎng)或波長(zhǎng)范圍測(cè)量。強(qiáng)度可以在少于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50個(gè)波長(zhǎng)或波長(zhǎng)范圍測(cè)量。更普遍地，可獲得關(guān)于信號(hào)的任何可定量的分量，以及關(guān)于在信號(hào)的另一個(gè)可定量的分量的信號(hào)的任何可定量的分量的累積測(cè)量結(jié)果。例如，信號(hào)的至少一個(gè)第一分量可以在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多個(gè)信號(hào)的第二分量測(cè)量。信號(hào)的至少一個(gè)第一分量可以在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多個(gè)信號(hào)的第二分量測(cè)量。信號(hào)的至少一個(gè)第一分量可以在少于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50個(gè)信號(hào)的第二分量測(cè)量。如本公開(kāi)明顯顯示的，待檢測(cè)的每個(gè)分析物可被編碼為利用任意數(shù)目的信號(hào)的合適的分量，或任意數(shù)目的信號(hào)的代碼。例如，待檢測(cè)的每個(gè)分析物可以被編碼在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多個(gè)信號(hào)的分量或信號(hào)中。在一些情況下，待檢測(cè)的每個(gè)分析物可以被編碼在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多個(gè)信號(hào)的分量或信號(hào)中。在一些情況下，待檢測(cè)的每個(gè)分析物可以被編碼在少于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50個(gè)信號(hào)的分量或信號(hào)中。在一些情況下，可以使用1-4、4-20、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、10-15、或10-20的信號(hào)的分量或信號(hào)編碼每個(gè)分析物。在編碼方案中每個(gè)分析物可以由相同數(shù)目的信號(hào)的分量，或信號(hào)，或不同數(shù)目的信號(hào)的分量，或信號(hào)編碼。a.探針、引物、熒光團(tuán)、和猝滅劑本公開(kāi)中提供的一些方法利用在分析物存在時(shí)產(chǎn)生信號(hào)的試劑。任何合適的試劑可用于本發(fā)明。通常，試劑將具有分析物特異性成分，及在分析物存在時(shí)產(chǎn)生信號(hào)的分量。在一些情況下，這些試劑被稱(chēng)為探針。探針可以是雜交探針。雜交探針可以是連接到熒光團(tuán)和猝滅劑(例如，taqman探針)的寡核苷酸探針。本發(fā)明的方法可使用一種或更多種試劑或探針以檢測(cè)每個(gè)分析物的存在或不存在。例如，可以使用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多個(gè)探針以檢測(cè)每個(gè)分析物的存在或不存在。在一些情況下，可以使用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50個(gè)探針，以檢測(cè)每個(gè)分析物的存在或不存在。在一些情況下，可以使用少于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50個(gè)探針以檢測(cè)每個(gè)分析物的存在或不存在。在一些情況下,用于檢測(cè)每個(gè)分析物的存在或不存在的探針的數(shù)目是1-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、1-3、或1-4。在一些情況下，樣品與4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多個(gè)探針接觸，以檢測(cè)所有分析物的存在或不存在。在一些情況下，樣品與至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多個(gè)探針接觸，以檢測(cè)所有分析物的存在或不存在。在一些情況下，樣品與少于4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50個(gè)探針接觸，以檢測(cè)所有分析物的存在或不存在。在一些情況下,樣品所接觸的用以檢測(cè)所有分析物的存在或不存在的探針的數(shù)目是4-50、4-40、4-30、4-20、5-15、5-10、或3-10。如上文描述的，連接到熒光團(tuán)和猝滅劑的寡核苷酸探針可用于檢測(cè)多核苷酸擴(kuò)增測(cè)定中分析物的存在。只要猝滅劑和熒光團(tuán)接近，猝滅劑就猝滅由光源激發(fā)熒光團(tuán)所發(fā)射的熒光。寡核苷酸探針的序列被設(shè)計(jì)為互補(bǔ)于分析物中存在的多核苷酸序列，并因此，能夠與分析物中存在的多核苷酸序列雜交。在包括引物的核酸擴(kuò)增反應(yīng)(例如，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))中可執(zhí)行寡核苷酸探針的雜交。通過(guò)dna聚合酶延伸引物后，聚合酶的5'至3'外切酶活性降解探針，釋放熒光團(tuán)和猝滅劑至介質(zhì)中。熒光團(tuán)和猝滅劑之間的接近被破壞，且來(lái)自熒光團(tuán)的信號(hào)不再猝滅。因此，檢測(cè)到的熒光的量是分析物存在的量的函數(shù)。如果沒(méi)有分析物存在，探針將不與分析物雜交，且熒光團(tuán)和猝滅劑將保持極為接近。很少信號(hào)或沒(méi)有信號(hào)會(huì)產(chǎn)生。寡核苷酸探針的每個(gè)探針可具有一個(gè)或多個(gè)熒光團(tuán)和猝滅劑。例如，在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸探針可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多個(gè)熒光團(tuán)。寡核苷酸探針可包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50個(gè)熒光團(tuán)。寡核苷酸探針可包括少于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50個(gè)熒光團(tuán)。寡核苷酸探針可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多個(gè)猝滅劑。寡核苷酸探針可包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50個(gè)猝滅劑。寡核苷酸探針可包括少于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50個(gè)猝滅劑。探針和猝滅劑至探針的連接可以在相同的反應(yīng)，或在系列的反應(yīng)中執(zhí)行?？梢詧?zhí)行一系列的反應(yīng)以使用至少一種熒光團(tuán)標(biāo)記探針，且反應(yīng)產(chǎn)物可被混合以產(chǎn)生具有不同熒光團(tuán)的探針的混合物。如果寡核苷酸探針包括兩個(gè)或更多個(gè)熒光團(tuán)，這些熒光團(tuán)可以被布置為允許(熒光)共振能量轉(zhuǎn)移(fret)在熒光團(tuán)之間發(fā)生。簡(jiǎn)單地說(shuō)，fret是在熒光團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)移的機(jī)制。使用基于fret的探針允許一個(gè)激發(fā)源通過(guò)單一的熒光團(tuán)的激發(fā)，產(chǎn)生兩個(gè)不同的熒光發(fā)射信號(hào)。例如，本文描述的方法可使用配對(duì)的探針，其中在配對(duì)中的一個(gè)探針連接到熒光團(tuán)和猝滅劑，且第二探針連接到兩個(gè)熒光團(tuán)(足夠接近用于fret發(fā)生)和猝滅劑?？梢允褂锰峁┯糜趂ret的熒光團(tuán)和猝滅劑任意組合。這種方法使得可以與激發(fā)源使用的熒光探針的數(shù)目加倍，這是因?yàn)閱我坏募ぐl(fā)源可用于產(chǎn)生兩個(gè)信號(hào)：一個(gè)來(lái)自具有一個(gè)熒光團(tuán)的探針，且一個(gè)來(lái)自具有足夠接近用于fret發(fā)生的兩個(gè)熒光團(tuán)的探針。例如，使用表8中描述的編碼方法，通過(guò)將表8中的每個(gè)探針與對(duì)應(yīng)的fret探針配對(duì)，明確地可檢測(cè)的分析物的數(shù)目可從16增加到32。引物可以是對(duì)特定分析物特異性的，且能夠擴(kuò)增與探針互補(bǔ)的區(qū)域。在一些情況下，使用的引物的配對(duì)的數(shù)目等于探針的數(shù)目。在其它情況下，使用的探針的數(shù)目可超過(guò)使用的引物配對(duì)的數(shù)目。在又另一些情況下，使用的引物配對(duì)的數(shù)目可超過(guò)使用的探針的數(shù)目。在一些情況下，待分析的樣品可與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多個(gè)引物的配對(duì)接觸。在一些情況下，待分析的樣品可與至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多個(gè)引物的配對(duì)接觸。在一些情況下，待分析的樣品可與少于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50個(gè)引物的配對(duì)接觸。在一些情況下,引物的配對(duì)的數(shù)目是2-10、3-15、4-20、3-10、4-10、5-10、6-8、或6-10。引物可擴(kuò)增不同數(shù)目的雜交探針在其中雜交的多核苷酸的區(qū)域。例如，引物的至少一個(gè)配對(duì)可以擴(kuò)增與至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50個(gè)雜交探針互補(bǔ)的區(qū)域。在一些情況下，引物的所有所述配對(duì)可以擴(kuò)增與至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50個(gè)雜交探針互補(bǔ)的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)例中，第一探針可以以熒光團(tuán)5'-熒光素酰胺(5'-fam)和猝滅劑黑洞猝滅劑1(bhq-1)標(biāo)記。第二探針可以以極為接近(例如，連接到)青色素5.5(cy5.5)和猝滅劑黑洞猝滅劑3(bhq-3)的5'-fam標(biāo)記。根據(jù)經(jīng)由聚合酶的核酸酶活性探針的消化，從單一激發(fā)波長(zhǎng)(例如，470nm)產(chǎn)生兩個(gè)熒光信號(hào)。來(lái)自第一探針的熒光團(tuán)在大約520nm發(fā)出熒光。在第二探針上的熒光團(tuán)經(jīng)受fret。供體熒光團(tuán)fam通過(guò)激發(fā)光源(例如，470nm)激發(fā)，且轉(zhuǎn)移其能量到受體熒光團(tuán)cy5.5。受體熒光團(tuán)在約705nm發(fā)射。這些熒光團(tuán)和猝滅劑僅是示范性的。能夠經(jīng)受fret的任何熒光團(tuán)，及可以猝滅熒光的任何猝滅劑適合于本發(fā)明使用。生產(chǎn)基于fret探針的方法，在2009年出版的jothikumar等人的biotechniques,第46(7):519-524頁(yè)中進(jìn)行了描述。在一些實(shí)施例中，單一的雜交探針可用于每個(gè)分析物。為了利用多顏色編碼(例如，如表3中所示)，每個(gè)探針可以以多個(gè)熒光團(tuán)在預(yù)確定的比例標(biāo)記。比例可被確定，在相同的顏色中，使得陽(yáng)性對(duì)照信號(hào)與相同的強(qiáng)度的其它陽(yáng)性對(duì)照信號(hào)提供相同的強(qiáng)度。這種方法減少了必須被合成的探針的數(shù)目，且可能比利用多個(gè)探針的方法更便宜地配置。此外，在雜交探針的情況下，相比多個(gè)探針，一個(gè)雜交探針配合分析物的序列更容易。雖然本發(fā)明的許多方面使用基于核酸的探針被例舉，但是本領(lǐng)域的一個(gè)普通技術(shù)人員將容易地認(rèn)識(shí)到，其它形式的探針將與在本公開(kāi)中描述的本發(fā)明同樣一起工作得很好。例如，對(duì)分析物特異的結(jié)合分子可用作探針。非限制性的示例性的結(jié)合分子包括識(shí)別的分析物，并在分析物存在時(shí)產(chǎn)生信號(hào)的抗體。在利用熒光標(biāo)記的本發(fā)明的實(shí)施方案中，可以使用任何合適的熒光標(biāo)記。適用于本發(fā)明使用的示例性的熒光標(biāo)記包括羅丹明、對(duì)甲氨基酚、熒光素、硫代熒光素(thiofluorescein)、氨基熒光素、羧基熒光素、氯代熒光素、甲基熒光素、磺基熒光素、氨基對(duì)甲氨基酚(aminorhodol)、羧基對(duì)甲氨基酚(carboxyrhodol)、氯代對(duì)甲氨基酚(chlororhodol)、甲基對(duì)甲氨基酚(methylrhodol)、磺基對(duì)甲氨基酚(sulforhodol)、氨基羅丹明(aminorhodamine)、羧基羅丹明、氯代羅丹明(chlororhodamine)、甲基羅丹明(methylrhodamine)、磺基羅丹明(sulforhodamine)、及硫代羅丹明(thiorhodamine)、青色素(cyanine)、吲哚碳青色素、氧碳青色素(oxacarbocyanine)、噻碳青色素(thiacarbocyanine)、部青色素(merocyanine)、青色素2、青色素3、青色素3.5、青色素5、青色素5.5、青色素7、惡二唑衍生物(oxadiazolederivatives)、吡啶惡唑(pyridyloxazole)、硝基苯并惡二唑(nitrobenzoxadiazole)、苯并惡二唑(benzoxadiazole)、芘衍生物(pyrenederivatives)、級(jí)聯(lián)藍(lán)、惡嗪衍生物、尼羅紅、尼羅藍(lán)、甲酚紫、惡嗪170、吖啶衍生物、二氨基吖啶(proflavin)、吖啶橙、吖啶黃、金胺(arylmethine)衍生物、金胺、結(jié)晶紫、孔雀石綠、四吡咯衍生物、卟吩、酞青色素和膽紅素。示例性的猝滅劑包括黑洞猝滅劑，如bhq-0、bhq-1、bhq-2、bhq-3；atto猝滅劑，如atto540q、atto580q和atto612q；等等。可以與本發(fā)明使用的熒光團(tuán)不限于本文描述的任何熒光團(tuán)。例如，具有改進(jìn)性能的熒光團(tuán)不斷發(fā)展，且這些熒光團(tuán)可以很容易地與本公開(kāi)提供的方法使用。這種改進(jìn)的熒光團(tuán)包括量子點(diǎn)，在單一波長(zhǎng)被激發(fā)后，其可以以不同的波長(zhǎng)發(fā)射能量。使用這樣的熒光團(tuán)的優(yōu)點(diǎn)在于，僅需要一個(gè)單一的激發(fā)源，但是許多不同的信號(hào)可以被定量，例如，根據(jù)顏色和強(qiáng)度被定量。此外，具有窄的發(fā)射光譜的熒光團(tuán)將對(duì)本文描述的方法特別有用，因?yàn)檫@樣的熒光團(tuán)可被包括在其發(fā)光光譜之間很少重疊或沒(méi)有重疊的多路測(cè)定中，從而提供更多的“顏色”并顯著地提高編碼的分析物的總體數(shù)目。在一些情況下，一種或更多種試劑被凍干。任何合適的試劑可以被凍干。例如，探針、引物、酶、抗體或用于檢測(cè)的任何其它試劑可被凍干。在一些情況下，包括分析物的樣品也可被凍干。凍干可能是有用的，例如，當(dāng)在發(fā)展中地區(qū)分配試劑和/或樣品時(shí)，在這些地區(qū)獲得冷庫(kù)是昂貴的、不易利用的、或不能可靠地利用的。在一個(gè)實(shí)例中，凍干的試劑包括在本公開(kāi)中描述的或以其它方式適合于本發(fā)明使用的任何探針或分析物特異性試劑。在另一個(gè)實(shí)例中，凍干的試劑包括pcr引物。在又另一實(shí)例中，凍干的試劑包括適合用于執(zhí)行pcr反應(yīng)的試劑。v.分析技術(shù)與儀器本文提供的方法適合與各種檢測(cè)方法使用。例如，可應(yīng)用的方法使用測(cè)量熒光信號(hào)的波長(zhǎng)和強(qiáng)度的分析技術(shù)。這可以通過(guò)測(cè)量整個(gè)光譜波長(zhǎng)的信號(hào)的強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)，或通過(guò)使用限制某些波長(zhǎng)的光的帶通濾波器，從而僅允許某些波長(zhǎng)的光到達(dá)光電檢測(cè)器實(shí)現(xiàn)。許多實(shí)時(shí)pcr和定量pcr儀器包括激發(fā)光源和帶通濾波器，其能夠檢測(cè)在四種顏色(例如，藍(lán)色、綠色、黃色和紅色)上的熒光信號(hào)。因此，本發(fā)明的方法可以使用本領(lǐng)域廣泛使用的儀器容易地應(yīng)用。重要的是，本文提供的方法和組合物可用于通過(guò)獲得單一溶液的累積測(cè)量結(jié)果來(lái)檢測(cè)多種分析物。沒(méi)有分離的必要。本發(fā)明不需要使用珠或固相。當(dāng)然，本領(lǐng)域的一個(gè)普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，如果需要的話(huà)，本發(fā)明可以結(jié)合分離、珠、或固相使用。圖5顯示了可用于獲得對(duì)本發(fā)明的方法有用的累積測(cè)量結(jié)果的儀器的配置的兩個(gè)實(shí)例。參考圖5，帶有配置為檢測(cè)波長(zhǎng)和強(qiáng)度兩者的檢測(cè)器(例如，熒光計(jì))的儀器示于501。參考501，至少一個(gè)激發(fā)光源502被引導(dǎo)到含有分析物和在分析物504存在時(shí)產(chǎn)生信號(hào)的試劑的室503中。如在其他地方描述的，分析物可以是核酸，且產(chǎn)生信號(hào)的試劑可以是包括熒光團(tuán)和猝滅劑的雜交探針。如果分析物存在，則產(chǎn)生發(fā)射信號(hào)505。在501中所示的配置中，該發(fā)射信號(hào)的波長(zhǎng)和強(qiáng)度通過(guò)能夠產(chǎn)生熒光發(fā)射光譜506的檢測(cè)器在整個(gè)光譜上測(cè)量。波長(zhǎng)和強(qiáng)度也可以使用光電檢測(cè)器和帶通濾波器的組合確定。該配置在本領(lǐng)域中已知的幾種熱循環(huán)儀中使用。參考圖5，具有帶通濾波器和光點(diǎn)檢測(cè)器的儀器在507中描繪。參考507，至少一個(gè)激發(fā)光源508被引導(dǎo)到含有分析物和在分析物510存在時(shí)產(chǎn)生信號(hào)的試劑的室509中。如在其他地方描述的，分析物可以是核酸，且產(chǎn)生信號(hào)的試劑可以是包括熒光團(tuán)和猝滅劑的雜交探針。如果分析物存在，則產(chǎn)生發(fā)射信號(hào)511。在507所示的配置中，帶通濾波器512、513和514被用于限制光的通過(guò)，以在特定的波長(zhǎng)范圍內(nèi)發(fā)光。例如帶通濾波器512可以限制光的通過(guò)，以在波長(zhǎng)范圍1內(nèi)發(fā)光。帶通濾波器513可以限制光的通過(guò)，以在波長(zhǎng)范圍2內(nèi)發(fā)光。帶通濾波器514可以限制光的通過(guò)，以在波長(zhǎng)范圍3內(nèi)發(fā)光。任何數(shù)目的帶通濾波器(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、或更多)可用于本發(fā)明。此外，在507中帶通濾波器的位置不意味著是限制性的。在一些情況下，發(fā)射的光可在任何時(shí)間通過(guò)多于一個(gè)的帶通濾波器。在其它情況下，帶通濾波器可以被配置為使得所有發(fā)射的光在一個(gè)時(shí)間僅通過(guò)一個(gè)帶通濾波器。通過(guò)帶通濾波器后，過(guò)濾的光515、516和517通過(guò)光電檢測(cè)器檢測(cè)。例如，過(guò)濾的光515可能是在波長(zhǎng)范圍1內(nèi)的光，過(guò)濾的光516可能是在波長(zhǎng)范圍2內(nèi)的光，且過(guò)濾的光517可能是在波長(zhǎng)范圍3內(nèi)的光。然后每個(gè)過(guò)濾的光515、516、及517的強(qiáng)度可以通過(guò)光電檢測(cè)器518定量。本公開(kāi)中描述的方法可與各種擴(kuò)增方法兼容，包括定量pcr(qpcr)法、終點(diǎn)pcr法、逆轉(zhuǎn)錄酶pcr、及數(shù)字pcr法。數(shù)字pcr法(例如，微滴數(shù)字(biorad)和動(dòng)態(tài)陣列(fluidigm))產(chǎn)生高度敏感的多核苷酸拷貝數(shù)目的定量。本文提供的方法可以容易地集成到這些系統(tǒng)中，通過(guò)允許在微滴或動(dòng)態(tài)陣列中的多路顯著地?cái)U(kuò)大其工作能力。類(lèi)似地，本公開(kāi)中描述的方法可在實(shí)時(shí)pcr測(cè)定中應(yīng)用。例如，隨著pcr運(yùn)行完成，實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)可以被完全記錄。然后端點(diǎn)值可被解碼以指示分析物的存在或不存在。通過(guò)檢測(cè)該顏色的實(shí)時(shí)曲線(xiàn)的二階導(dǎo)數(shù)的最大值，可對(duì)每個(gè)顏色分析各個(gè)循環(huán)閾值(ct)的值。因?yàn)樘囟ǖ姆治鑫锉粩U(kuò)增，熒光團(tuán)以與該序列編碼的顏色多樣性相同的比例從其相應(yīng)的探針釋放。因此，如1100代碼在藍(lán)色和綠色中將具有相同的ct，而1400代碼將具有領(lǐng)先其藍(lán)色ct2個(gè)循環(huán)的綠色ct。這種額外的數(shù)據(jù)能夠測(cè)定每個(gè)分析物的標(biāo)識(shí)和起始量。本文描述的方法也可以直接在組織樣品上使用。例如，可以獲得組織樣品，且使用光刻法在組織樣品上直接建造孔(well)。組織樣品可以被事先固定以建造孔。然后可通過(guò)分配適當(dāng)?shù)脑噭┻M(jìn)入組織樣品中的孔中以分析組織樣品。本公開(kāi)中描述的編碼和解碼方法可用于蝕刻到組織中的孔中的分析物的多路檢測(cè)。每個(gè)孔可以對(duì)應(yīng)于單一細(xì)胞或若干細(xì)胞，當(dāng)對(duì)組織的不同部分執(zhí)行分析物分析時(shí)，提供優(yōu)異的空間分辨率。這個(gè)方法可以被用于檢測(cè)相同組織的不同區(qū)域的分析物。在一些情況下，儀器可被修改或構(gòu)建，例如，以提供在多波長(zhǎng)的額外的激發(fā)光源，和/或提供額外的帶通濾波器或確定完整的光譜的能力。包括額外的激發(fā)源將允許更大數(shù)量的各種熒光團(tuán)的激發(fā)。包括額外的帶通濾波器，或者修改或構(gòu)建儀器能夠確定整個(gè)光譜，允許檢測(cè)來(lái)自熒光團(tuán)的更多種發(fā)射。這些技術(shù)可用于增加可以用于本公開(kāi)中描述的方法的熒光團(tuán)的數(shù)目，且因此可以增加被同時(shí)檢測(cè)的分析物的數(shù)目。在一些情況下，本公開(kāi)中描述的方法利用終點(diǎn)pcr法。然而，在一些情況下，結(jié)果可在終點(diǎn)前獲得。例如，當(dāng)盡快需要結(jié)果時(shí)，這可能是有利的。例如，在一種執(zhí)行校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)的情況下，其中分析分析物的不同的起始濃度，以確定信號(hào)達(dá)到飽和其循環(huán)數(shù)，其為分析物的起始量的函數(shù)。使用這種數(shù)據(jù)，實(shí)時(shí)監(jiān)控pcr反應(yīng)的計(jì)算機(jī)，可被編程以根據(jù)特定系統(tǒng)的檢測(cè)極限(lod)的限制搜索達(dá)到最大的循環(huán)數(shù)的飽和。如果到最大循環(huán)數(shù)時(shí)，分析物沒(méi)有擴(kuò)增(例如，除了可能存在的陽(yáng)性對(duì)照)，那么對(duì)于該分析物的結(jié)果是陰性。如果到最大循環(huán)數(shù)時(shí)，分析物有擴(kuò)增，那么對(duì)于該分析物的結(jié)果是陽(yáng)性，且在每個(gè)顏色中的飽和強(qiáng)度可以被用于使用編碼方案解碼結(jié)果。在這兩種情況下，沒(méi)有必要運(yùn)行pcr反應(yīng)超過(guò)由lod為儀器設(shè)定的循環(huán)的數(shù)目。盡管pcr方法已被用于說(shuō)明這種定量方法，本領(lǐng)域的一個(gè)普通技術(shù)人員將容易認(rèn)識(shí)到，類(lèi)似的原理可以在任何催化體系中應(yīng)用，其中分析物的起始量限制了反應(yīng)速率，且反應(yīng)速率可以通過(guò)在一段時(shí)間內(nèi)信號(hào)強(qiáng)度的演變被測(cè)量和報(bào)告。vi.組合物和試劑盒本公開(kāi)還提供了與本文描述的方法使用的組合物和試劑盒。組合物可以包括本文描述的任何成分、反應(yīng)混合物和/或中間體，以及任意組合。例如，本公開(kāi)提供了與本文提供的方法一起使用的檢測(cè)試劑?？商峁┤魏魏线m的檢測(cè)試劑，包括如在本說(shuō)明書(shū)中其他地方描述的，以熒光團(tuán)和猝滅劑和引物標(biāo)記的雜交探針。在一些情況下，組合物包括使用四個(gè)熒光團(tuán)檢測(cè)至少七個(gè)分析物的試劑。在一些情況下，組合物包括使用四個(gè)熒光團(tuán)檢測(cè)至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50個(gè)分析物的試劑。在一些情況下，組合物包括使用五個(gè)熒光團(tuán)檢測(cè)至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50個(gè)分析物的試劑。在一些情況下，組合物包括使用六個(gè)熒光團(tuán)檢測(cè)至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50個(gè)分析物的試劑。在一些情況下，組合物包括使用七個(gè)熒光團(tuán)檢測(cè)至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50個(gè)分析物的試劑。在一些情況下，組合物包括引物。組合物可包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50個(gè)引物配對(duì)。本發(fā)明還提供了用于實(shí)施本發(fā)明的方法的試劑盒。因此，各種試劑盒在合適的包裝中提供。試劑盒可用于本文描述的任何一個(gè)或更多個(gè)用途，且，相應(yīng)地，可含有用于檢測(cè)多個(gè)分析物中的每個(gè)分析物的存在或不存在的指令。試劑盒可包括編碼方案、或解碼矩陣，以幫助用戶(hù)轉(zhuǎn)換累積測(cè)量結(jié)果為表明多個(gè)分析物中的每個(gè)分析物的存在或不存在的結(jié)果。試劑盒可以是診斷試劑盒，例如，適合用于包括本文列舉的分析物的任何分析物的檢測(cè)的診斷試劑盒。試劑盒可以包含任何本公開(kāi)中提供的組合物，包括上文列舉的那些。圖6顯示了本發(fā)明的示例性試劑盒的示意圖。參考圖6，顯示了包括盒體601的試劑盒，盒體601含有用于分析物(例如，包括熒光團(tuán)和猝滅劑的多核苷酸探針)的檢測(cè)的試劑602，及用于核酸的擴(kuò)增的引物603。試劑盒也可以包含任何其他試劑，例如適合于執(zhí)行擴(kuò)增反應(yīng)的試劑604。在601中描繪的實(shí)施方案中，用于分析物的檢測(cè)的試劑及引物各自包含在單一體積(如管或瓶)中。然而，這些試劑也可以以單獨(dú)的體積提供，如605中所示的盒體所描繪的。盒體605包含七個(gè)單獨(dú)的體積。三個(gè)體積606、607和608含有用于分析物的檢測(cè)的試劑(或這類(lèi)試劑的混合物)，且三個(gè)體積609、610和611含有引物(或引物的混合物)。試劑盒還可以含有適合于執(zhí)行擴(kuò)增反應(yīng)的試劑604。提供圖6僅用于說(shuō)明的目的。用于分析物(例如，探針)的檢測(cè)的任何數(shù)目的試劑，及任何數(shù)目的引物可以被包括在單一的管或瓶中，使其適合應(yīng)用。例如，在一些實(shí)施方案中，在單一的瓶中可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多個(gè)試劑，用于分析物的檢測(cè)。在其它情況下，在單一的瓶或管中可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多個(gè)引物，用于擴(kuò)增。在一些情況下，引物和探針可在相同的瓶或管中提供。例如，每對(duì)引物配對(duì)可以提供1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多個(gè)探針。在其它情況下，每對(duì)探針配對(duì)可以提供1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多個(gè)引物。試劑盒可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多個(gè)瓶或管。對(duì)照分析物，及其相關(guān)的檢測(cè)試劑和引物，也可以包括在試劑盒中。這些可以包括在單獨(dú)的瓶或管中，或者例如，包括在提供用于擴(kuò)增反應(yīng)的試劑的瓶或管604中。如在本說(shuō)明書(shū)中其他地方描述的，可以?xún)龈稍噭┖兄械娜魏卧噭ii.系統(tǒng)和軟件本公開(kāi)的方法還可以作為系統(tǒng)的一部分執(zhí)行。例如，可以通過(guò)包含在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)中的軟件執(zhí)行本文描述的方法的一個(gè)或更多個(gè)步驟。軟件可用于編碼分析物、檢查簡(jiǎn)并性、減少或消除簡(jiǎn)并性、和/或產(chǎn)生解碼矩陣。軟件也可以用于將儀器(例如，pcr器)上作出的累積測(cè)量結(jié)果轉(zhuǎn)換為關(guān)于分析物的存在或不存在的信息。例如，參考圖4，計(jì)算機(jī)401可以連接到輸入裝置403、顯示器402和打印機(jī)404。計(jì)算機(jī)可以執(zhí)行本公開(kāi)中描述的方法的任意一個(gè)方法的一個(gè)或更多個(gè)步驟，例如包括，編碼方法410、分析方法420和解碼方法430。計(jì)算機(jī)可減少或消除簡(jiǎn)并性，例如，作為編碼方法410的一部分。類(lèi)似地，計(jì)算機(jī)可以產(chǎn)生通過(guò)設(shè)計(jì)是非簡(jiǎn)并的編碼方案，例如使用數(shù)學(xué)迭代設(shè)計(jì)的編碼方案。計(jì)算機(jī)也可以連接到網(wǎng)絡(luò)405。網(wǎng)絡(luò)可以是局域網(wǎng)和/或因特網(wǎng)。網(wǎng)絡(luò)可以用于在不同位置的多個(gè)計(jì)算機(jī)上執(zhí)行本發(fā)明的方法。例如，一臺(tái)計(jì)算機(jī)可以執(zhí)行編碼，另一臺(tái)計(jì)算機(jī)可執(zhí)行測(cè)量，且又一臺(tái)計(jì)算機(jī)可執(zhí)行解碼。一臺(tái)計(jì)算機(jī)可執(zhí)行這些方法的任何方法或全部。網(wǎng)絡(luò)可用于在全世界傳輸使用本公開(kāi)中描述的方法所獲得的信息，例如跨越國(guó)界。在一個(gè)實(shí)例中，軟件被嵌入在執(zhí)行測(cè)量的儀器中，例如熱循環(huán)儀。在另一個(gè)實(shí)例中，軟件被安裝在連接到執(zhí)行測(cè)量的儀器的計(jì)算機(jī)上，例如連接到熱循環(huán)儀的計(jì)算機(jī)。在另一個(gè)實(shí)例中，軟件是“云”，即在另一臺(tái)計(jì)算機(jī)可通過(guò)網(wǎng)絡(luò)與其通信的計(jì)算機(jī)上。上文描述的每個(gè)元件可被連接到控制器，所述控制器與每個(gè)元件通信，并協(xié)調(diào)它們的操作。例如，控制器可啟動(dòng)將一系列的分析物編碼為顏色和強(qiáng)度的值。如本公開(kāi)全文所描述的，控制器可以執(zhí)行軟件，以通過(guò)從編碼矩陣中除去一個(gè)或更多個(gè)潛在的分析物代碼來(lái)減少或消除簡(jiǎn)并性。然后，控制器可以自動(dòng)地從探針的制造商訂購(gòu)對(duì)應(yīng)該代碼的探針?？商娲?，控制器可以操作可以合成相應(yīng)的探針的寡核苷酸合成儀。分析了在儀器上的樣品(其也可以是自動(dòng)的)之后，控制器可以使用解碼矩陣處理分析的結(jié)果。然后，控制器可將這些結(jié)果提供給用戶(hù)。viii.服務(wù)本文提供的方法也可以作為服務(wù)執(zhí)行。例如，服務(wù)提供者可以獲得客戶(hù)希望分析的多個(gè)分析物的標(biāo)識(shí)。然后服務(wù)提供者可以通過(guò)本文所述的任何方法編碼每個(gè)待檢測(cè)的分析物，并向客戶(hù)提供適當(dāng)?shù)脑噭┯糜跍y(cè)定?？蛻?hù)也可以執(zhí)行測(cè)定，并向服務(wù)提供者提供結(jié)果以解碼。然后服務(wù)提供者可以向客戶(hù)提供解碼的結(jié)果?？蛻?hù)還可以通過(guò)與安裝在本地(在客戶(hù)所在地)或遠(yuǎn)程(例如，在通過(guò)網(wǎng)絡(luò)可達(dá)的一臺(tái)服務(wù)器上)的軟件交互，；來(lái)編碼分析物、產(chǎn)生探針、和/或解碼結(jié)果。示例性的客戶(hù)包括臨床實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)生、食品和消費(fèi)品制造商、工業(yè)制造商(例如，石油公司)等等?？蛻?hù)或團(tuán)體可以是有需要或希望使用本發(fā)明的方法、系統(tǒng)、組合物和試劑盒的任何合適的客戶(hù)或團(tuán)體。實(shí)施例實(shí)施例1：一般材料和方法1.一般試劑te緩沖液，ph7(lifetechnologies,carlsbad,ca)；無(wú)rna酶超純水(lifetechnologies,carlsbad,ca)；taq5x預(yù)混液(fisherscientificcompany,tustin,ca)。2.dna序列、引物和探針選擇了來(lái)自臨床相關(guān)的生物體的五種核酸用于示例性的研究：(1)人類(lèi)免疫缺陷病毒1(hiv-1)；(2)惡性瘧原蟲(chóng)(瘧疾)；(3)單純性皰疹病毒2(hsv-2)；(4)結(jié)核分枝桿菌(tb)；和(5)登革熱病毒3型(登革熱)。來(lái)自hiv-1的基因組的診斷相關(guān)的兩個(gè)區(qū)域，p17和聚蛋白酶，分別選自losalamos國(guó)家實(shí)驗(yàn)室的hiv-1參考序列。來(lái)自惡性瘧原蟲(chóng)chr7基因的診斷序列從ucsc惡性瘧原蟲(chóng)基因組瀏覽器獲得。單純性皰疹病毒2序列從歐洲分子生物學(xué)庫(kù)(europeanmolecularbiologylibrary)中獲得的序列合成。相似地，結(jié)核分歧桿菌中的rpob基因的診斷序列合成自從歐洲分子生物學(xué)庫(kù)獲得的序列。登革熱病毒3型的pcr診斷序列獲得自美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院(nationalinstituteofhealth)的健康基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)。由integrateddnatechnologies(idt)合成寡核苷酸。使用來(lái)自idt的oligo分析儀選擇用于每個(gè)分析物的探針和引物配對(duì)。對(duì)所有分析物合成包含在5'端的熒光團(tuán)和在3'端的猝滅劑的感測(cè)探針。凍干所有的寡核苷酸，并在使用前在te緩沖液中重建。表9-14顯示了六個(gè)分析物的每個(gè)分析物的序列信息、目標(biāo)序列、引物、和探針。表9.hiv-1聚蛋白酶的序列信息。表10.hivp17的序列信息。表11.瘧原蟲(chóng)chr7的序列信息。表12.單純性皰疹病毒2的序列信息。表13.結(jié)核分枝桿菌rpob的序列信息。表14.登革熱病毒3型的序列信息。3.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所有的pcr反應(yīng)在roche480lightcycler儀器上執(zhí)行。以在95℃，60秒的熱啟動(dòng)，執(zhí)行45個(gè)循環(huán)。變性、退火(annealing)和延伸的循環(huán)條件為分別在95℃、65℃和70℃分別為45秒、50秒和60秒。每個(gè)實(shí)驗(yàn)以15μl的反應(yīng)體積一式五份運(yùn)行。每個(gè)退火步驟后，在以下通道中獲得熒光測(cè)量結(jié)果：483nm至533nm(fam)、523nm至568nm(cy3)、558nm至610nm(rox)、及615nm至670nm(cy5)。在熱啟動(dòng)和45個(gè)熱循環(huán)結(jié)束后也可以獲得熒光測(cè)量結(jié)果。這兩個(gè)測(cè)量結(jié)果之間的熒光強(qiáng)度的變化(熱啟動(dòng)后，及在45個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí))確定終點(diǎn)熒光信號(hào)。實(shí)施例2：基于每個(gè)分析物使用多于一個(gè)顏色的編碼方法同時(shí)檢測(cè)來(lái)自病原體的多核苷酸標(biāo)記本實(shí)施例描述了選自hiv(2個(gè)多核苷酸)、hsv-2、分枝桿菌、瘧原蟲(chóng)、和登革病毒的最多四種多核苷酸的同時(shí)檢測(cè)。使用表15中描述的試劑，裝配(assemble)了14個(gè)pcr反應(yīng)。表15.14個(gè)pcr反應(yīng)的試劑。參照表15，在其它分析物不存在時(shí)，反應(yīng)1、3、5、7和9(分別包含hiv聚蛋白酶、瘧原蟲(chóng)、hsv、分枝桿菌和登革熱的分析物)是為每個(gè)多核苷酸分析物單獨(dú)提供基線(xiàn)熒光強(qiáng)度的陽(yáng)性對(duì)照。如下文更充分地描述的，在每個(gè)顏色中熒光強(qiáng)度的變化被用于提供色譜(圖3)中每個(gè)顏色的預(yù)期累積的強(qiáng)度水平。反應(yīng)2、4、6、8和10是陰性對(duì)照，分別用于確定非特異性擴(kuò)增的程度。在這些反應(yīng)中，提供的引物對(duì)提供的分析物特不是異性的。實(shí)驗(yàn)11、12、13和14是多路檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。如表16中表示的執(zhí)行編碼。在每個(gè)顏色中，對(duì)每個(gè)測(cè)定測(cè)量的熒光強(qiáng)度被描繪為圖3的色譜中的黑色圓圈。表16.病原體檢測(cè)的編碼方案。famcy3roxcy5hiv聚蛋白酶1000hivp171100瘧原蟲(chóng)1010hsv1001分歧桿菌1101登革熱病毒1111為了構(gòu)建色譜，在每個(gè)顏色中，陽(yáng)性對(duì)照的信號(hào)(反應(yīng)1、3、5、7和9)被用于裝配存在的序列的每個(gè)可能的組合。累積信號(hào)被繪制在稱(chēng)為“色譜”(圖3)的圖中。對(duì)應(yīng)于相同顏色中相同秩的所有可能組合的累積信號(hào)被組織到其自己的“帶”內(nèi)。對(duì)所有四個(gè)顏色這樣做產(chǎn)生水平(level)和帶結(jié)構(gòu)，針對(duì)其可以評(píng)估每個(gè)組合的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(反應(yīng)11、12、13和14)。圖3顯示了色譜的三個(gè)重復(fù)，所述色譜使用陽(yáng)性對(duì)照樣品構(gòu)建，并以實(shí)驗(yàn)結(jié)果4112、3121和3102疊加在色譜上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果由黑點(diǎn)指示。在反應(yīng)11-14中每個(gè)顏色的強(qiáng)度值以任意熒光單位(afu)測(cè)量，繪制在色譜中，且然后基于兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)分配至帶。首先，如果實(shí)驗(yàn)結(jié)果在帶內(nèi)，那么結(jié)果被分配到多路性的帶(例如，在圖3的最左邊的色譜中為1的cy3值)。第二，如果實(shí)驗(yàn)結(jié)果在兩個(gè)帶之間，則使用兩步分析。如果實(shí)驗(yàn)結(jié)果在兩個(gè)合理的結(jié)果之間，那么實(shí)驗(yàn)結(jié)果被分配到最接近的帶(例如，在圖3的最右邊的色譜中cy5的值2)。如果實(shí)驗(yàn)結(jié)果在合理的結(jié)果和不合理的結(jié)果之間，結(jié)果被分配至帶的合理的結(jié)果(例如，圖3的中間的色譜中fam的值3)。圖8示意性地顯示了4112的合理的結(jié)果(上圖)，其指示了hiv聚蛋白酶、瘧原蟲(chóng)、單純性皰疹、及分枝桿菌的存在；以及4110的不合理的結(jié)果(下圖)，其不能被解碼并指示了測(cè)定中的故障。使用這些標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)12的輸出被指定為4112，這是正確的答案。實(shí)驗(yàn)14的輸出可以被指定為2121或3121，但2121是不合理的，因此其結(jié)果必然是3121，這是正確的答案。實(shí)驗(yàn)13的輸出可以被指定為3102或3101，這兩者都是合理的，但在cy5通道中相比1，結(jié)果明確地更接近2，所以正確答案3102，被指定為的結(jié)果。這些結(jié)果提供了本文提供的方法的實(shí)驗(yàn)性驗(yàn)證。研究結(jié)果表明組合信號(hào)比可以預(yù)期的來(lái)自陽(yáng)性對(duì)照信號(hào)的簡(jiǎn)單總和略低的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)樾盘?hào)的組合不是完美的線(xiàn)性。這可能是目前不能解釋的色譜構(gòu)建的額外效應(yīng)的結(jié)果。這些效應(yīng)可能與猝滅劑的絕對(duì)濃度相關(guān)。猝滅劑的絕對(duì)濃度越高，其猝滅的反應(yīng)體積的百分比越大，使得釋放的相同的百分比的熒光團(tuán)對(duì)累積信號(hào)的貢獻(xiàn)沒(méi)有預(yù)期的那么多。這個(gè)問(wèn)題一個(gè)解決方法是使用低濃度的探針，使得信號(hào)中的百分損失是可以忽略的，而不管有多少猝滅劑被釋放。圖3顯示了包含多個(gè)組合的每個(gè)秩具有相對(duì)寬的帶。帶的寬度最終是陽(yáng)性對(duì)照樣品的最高和最低累積信號(hào)之間的差異。如果在特定顏色中所有陽(yáng)性對(duì)照產(chǎn)生完全相同的熒光信號(hào)，則每個(gè)帶的寬度將是零。因?yàn)榇娴哪切┬盘?hào)有所不同，得到的帶是相對(duì)寬的。然而，有一種簡(jiǎn)單的手段以收緊帶。如在上述實(shí)驗(yàn)完成的，與加載相同濃度的所有探針不同，作為代替，每個(gè)探針的濃度可被調(diào)整，使得每個(gè)得到的陽(yáng)性對(duì)照信號(hào)與相同的顏色中的其它的是相同的。這種方法會(huì)顯著收緊帶，使其更容易確定含有分析物的樣品的信號(hào)的多路性。實(shí)施例3：基于每個(gè)分析物使用一個(gè)顏色和不同強(qiáng)度的編碼方法同時(shí)檢測(cè)來(lái)自病原體的多核苷酸標(biāo)記本實(shí)施例描述了選自登革病毒、hivp17和hiv聚蛋白酶的最多三種多核苷酸的同時(shí)檢測(cè)。編碼方案如表11中描繪的。如表11所示，每個(gè)分析物被編碼為單一顏色中熒光強(qiáng)度的單一值。在這種情況下，如本公開(kāi)其他地方描述的，編碼方案通過(guò)設(shè)計(jì)是非簡(jiǎn)并的。這通過(guò)向每個(gè)分析物分配強(qiáng)度值實(shí)現(xiàn)，所分配的強(qiáng)度值等于之前的分析物的累積強(qiáng)度值加一。當(dāng)然，如在本說(shuō)明書(shū)中其他地方描述的，初始分配值可以大于1，例如，以更好地區(qū)別噪聲。類(lèi)似地，分配給每個(gè)分析物的值可以大于之前的分析物的累積強(qiáng)度值加一，例如，為了增加強(qiáng)度之間的間隔，并使得強(qiáng)度分配更簡(jiǎn)單。表17.檢測(cè)登革熱病毒、hiv聚蛋白酶和hivp17的編碼方案。fam登革熱病毒1hivp172hiv聚蛋白酶4實(shí)施例2中使用的相同的試劑(例如，模板、引物和探針)用于此處。測(cè)量了由陽(yáng)性對(duì)照終點(diǎn)pcr反應(yīng)中的各個(gè)探針產(chǎn)生的熒光信號(hào)，并將其用于計(jì)算將產(chǎn)生1x、2x、和4x的信號(hào)強(qiáng)度的探針的濃度。然后設(shè)置實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)分析物出現(xiàn)的七個(gè)非空的組合。表18-24提供了這些混合物的每個(gè)的分析物pcr反應(yīng)成分。表18.二進(jìn)制fam實(shí)驗(yàn)1混合液(cocktail)：hiv聚蛋白酶、hivp17、及登革熱病毒。表19.二進(jìn)制fam實(shí)驗(yàn)2混合液：登革熱病毒和hivp17。表20.二進(jìn)制fam實(shí)驗(yàn)3混合液：登革熱病毒和hiv聚蛋白酶。表21.二進(jìn)制fam實(shí)驗(yàn)4混合液：hiv聚蛋白酶和hivp17。表22.二進(jìn)制fam實(shí)驗(yàn)5混合液：登革熱病毒。表23.二進(jìn)制fam實(shí)驗(yàn)6混合液：hivp17。表24.二進(jìn)制fam實(shí)驗(yàn)7混合液：hiv聚蛋白酶。每個(gè)實(shí)驗(yàn)的總熒光信號(hào)在如上文描述構(gòu)建的色譜上繪制(圖7)。圍繞每個(gè)陽(yáng)性對(duì)照測(cè)量結(jié)果的帶的寬度是1x測(cè)量結(jié)果傳播的不確定性。該不確定性等于飽和的最后五個(gè)pcr循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)差。圖7顯示了該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。最右邊的三個(gè)結(jié)果顯示了單獨(dú)的登革病毒(den)、單獨(dú)的hivp17(p17)和hiv聚蛋白酶(tpp)的測(cè)量強(qiáng)度。對(duì)這些分析物的每個(gè)分配的強(qiáng)度如表11所示，且圖7確認(rèn)了三個(gè)分析物單獨(dú)存在時(shí)，產(chǎn)生了預(yù)期的強(qiáng)度結(jié)果(見(jiàn)den、p17和tpp)。在測(cè)定結(jié)束時(shí)，基本上所有的探針已被水解，釋放了發(fā)射信號(hào)的基本上所有的熒光團(tuán)。固定數(shù)量的熒光團(tuán)產(chǎn)生固定的且可預(yù)測(cè)的信號(hào)量。因此，由通過(guò)加入到反應(yīng)體積的探針的數(shù)量確定的，存在的目標(biāo)通常應(yīng)產(chǎn)生固定量的信號(hào)。如預(yù)期的，分析物的組合的強(qiáng)度值等于分配的強(qiáng)度之和。因?yàn)檫@種編碼方案被設(shè)計(jì)成非簡(jiǎn)并的，每個(gè)結(jié)果可以明確地解碼成特定分析物的存在或不存在。例如，從圖7的左側(cè)開(kāi)始，7的結(jié)果表明所有三個(gè)分析物存在。3的結(jié)果表明登革熱病毒和hivp17分析物存在，而hiv聚蛋白酶不存在。5的結(jié)果表明登革熱病毒和hiv聚蛋白酶存在，而hivp17不存在。最后，6的結(jié)果表明hivp17和hiv聚蛋白酶存在，而登革熱病毒不存在。如在本公開(kāi)中其他地方描述的，這種編碼方案可被擴(kuò)大以編碼額外的分析物。序列表<110>加州理工學(xué)院<120>多路生化測(cè)定中信號(hào)的編碼和解碼<130>38075-716.601<140>pct/us2013/024509<141>2013-02-01<150>61/703,093<151>2012-09-19<150>61/594,480<151>2012-02-03<160>32<170>patentinversion3.5<210>1<211>198<212>dna<213>人類(lèi)免疫缺陷病毒1<400>1ggaagctctattagatacaggagcagatgatacagtattagaagaaatgagtttgccagg60aagatggaaaccaaaaatgatagggggaattggaggttttatcaaagtaagacagtatga120tcagatactcatagaaatctgtggacataaagctataggtacagtattagtaggacctac180acctgtcaacataattgg198<210>2<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成引物<400>2ggaagctctattagatacaggagcag26<210>3<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成引物<400>3ccaattatgttgacaggtgtaggtcc26<210>4<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成探針<220><223>5'6-fam<220><223>3'bhq_1<400>4tgagtttgccaggaagatggaaacca26<210>5<211>199<212>dna<213>人類(lèi)免疫缺陷病毒1<400>5cagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagta60gcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagac120aagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaaaaaagcacagcaagcagcagctgacaca180ggacacagcaatcaggtca199<210>6<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成引物<400>6cagctacaaccatcccttcagaca24<210>7<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成引物<400>7tgacctgattgctgtgtcctgtgt24<210>8<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成探針<220><223>5'6-fam<220><223>3'bhq_1<400>8agcaaccctctattgtgtgcatcaaagg28<210>9<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成探針<220><223>5'cy3<220><223>3'bhq_2<400>9aaagcacagcaagcagcagctga23<210>10<211>199<212>dna<213>惡性瘧原蟲(chóng)（plasmodiumfalciparum）<400>10gcctaacatggctatgacgggtaacggggaattagagttcgattccggagagggagcctg60agaaatagctaccacatctaaggaaggcagcaggcgcgtaaattacccaattctaaagaa120gagaggtagtgacaagaaataacaatgcaaggccaatttaaaaccttcccagagtaacaa180ttggagggcaagtctggtg199<210>11<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成引物<400>11gcctaacatggctatgacgggtaa24<210>12<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成引物<400>12caccagacttgccctccaattgtt24<210>13<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成探針<220><223>5'6-fam<220><223>3'bhq_1<400>13attccggagagggagcctgagaaata26<210>14<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成探針<220><223>5'6-roxn<220><223>3'bhq_2<400>14aaggaaggcagcaggcgcgtaaatta26<210>15<211>192<212>dna<213>單純性皰疹病毒2<400>15tcagcccatcctccttcggcagtatggagggtgtcgcggcggcgagccgccgtccccaaa60gacgtgcgggtcgtacacgtacacgtaccagggcggcgggcctccgacccggtacgctct120cgtaaatgcttccctgctggtgccgatctgggaccgcgccgcggagacattcgagtacca180gatcgaactcgg192<210>16<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成引物<400>16tcagcccatcctccttcggcagtat25<210>17<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成引物<400>17ccgagttcgatctggtactcgaatgt26<210>18<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成探針<220><223>5'6-fam<220><223>3'bhq_1<400>18aaagacgtgcgggtcgtacacgtaca26<210>19<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成探針<220><223>5'cy5<220><223>3'3iabrqsp<400>19taaatgcttccctgctggtgccgat25<210>20<211>200<212>dna<213>結(jié)核分歧桿菌（mycobacteriumtuberculosis）<400>20gagtgcaaagacaaggacatgacgtacgcggccccgctgttcgtcacggccgagttcatc60aacaacaacaccggcgagatcaagagccagacggtgttcatgggtgacttcccgatgatg120accgagaagggcaccttcatcatcaacggcaccgagcgcgtcgtggtcagccagctggtc180cgctcgcccggtgtgtactt200<210>21<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成引物<400>21gagtgcaaagacaaggacatgacg24<210>22<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成引物<400>22aagtacacaccgggcgagc19<210>23<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成探針<220><223>5'6-fam<220><223>3'bhq_1<400>23cgctgttcgtcacggccgagttcat25<210>24<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成探針<220><223>5'cy3<220><223>3'bhq_2<400>24agatcaagagccagacggtgttcatg26<210>25<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成探針<220><223>5'cy5<220><223>3'iabrqsp<400>25aagggcaccttcatcatcaacggca25<210>26<211>200<212>dna<213>登革熱病毒3<400>26atgccaactgtgattgagcacttagaaagactacaaaggaaacatggaggaatgcttgtg60agaaatccactctcacgaaactccacgcacgaaatgtattggatatccaatggtacaggc120aacatcgtctcattcacaatgacacacaggagacccaccatagagaaagatgtggattta180ggagcaggaacccgacatgt200<210>27<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成引物<400>27atgccaactgtgattgagcact22<210>28<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成引物<400>28acatgtcgggttcctgctcctaaa24<210>29<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成探針<220><223>5'6-fam<220><223>3'bhq_1<400>29acaaaggaaacatggaggaatgcttgtga29<210>30<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成探針<220><223>5'cy3<220><223>3'bhq_2<400>30actctcacgaaactccacgcacgaaa26<210>31<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成探針<220><223>5'6-roxn<220><223>3'bhq_2<400>31acaatgacacacaggagacccaccat26<210>32<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成探針<220><223>5'cy5<220><223>3'iabrqsp<400>32ggatatccaatggtacaggcaacatcgt28當(dāng)前第1頁(yè)12