本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及檢測(cè)血小板長(zhǎng)鏈非編碼rnamagi2-as3和zfas1表達(dá)量的試劑在制備用于非小細(xì)胞肺癌診斷試劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率位居各種腫瘤之首，其中80％的肺癌為非小細(xì)胞肺癌(non-smallcelllungcancer，nsclc)。nsclc又主要分為肺鱗癌(ad)、肺腺癌(scc)。盡管非小細(xì)胞肺癌近幾十年來在診治和基礎(chǔ)研究方面均取得了很大的進(jìn)步，但總體而言，非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后并沒有得到顯著的改善，其5年生存率僅為5％-20％。因而，對(duì)于肺癌的治療，最重要的依舊是尋找有效的早期診斷標(biāo)志物，為對(duì)抗癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移提供理論依據(jù)。lncrna作為一種參與癌癥生物學(xué)的遺傳分子，在近年來的科學(xué)研究中嶄露頭角。lncrna的轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度大于200nt，一般不編碼蛋白或編碼蛋白能力有限，它們通常以rna的形式在多種層面上(表觀遺傳學(xué)調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等)調(diào)控靶基因的表達(dá)水平，在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生過程中扮演重要的角色。lncrnamalat-1、lncrnaccat2在肺癌中高表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞遷移，刺激體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲；lncrnameg3在nsclc癌組織中的表達(dá)比正常組織低，并與病理分期、腫瘤大小有關(guān)；此外，較低水平的meg3表達(dá)患者預(yù)后相對(duì)較差；meg3過度表達(dá)降低nsclc的細(xì)胞增殖，在體外可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在體內(nèi)阻礙腫瘤的發(fā)生；lncrnah19主要起促進(jìn)肺癌生長(zhǎng)的作用，干擾h19基因表達(dá)后可使肺癌細(xì)胞的集落形成能力和獨(dú)立貼壁能力下降。隨著越來越多的研究，lncrna對(duì)非小細(xì)胞肺癌的治療和診斷有著重要意義。用于肺癌的診斷主要依賴于傳統(tǒng)的腫瘤組織臨床病征、放射影像、生化檢測(cè)和病檢等方面,而且其中大部分方法是有創(chuàng)傷的,給患者帶來痛苦,且存在組織異質(zhì)性等局限性；為了降低獲取腫瘤組織的局限性,基于血液的液體活檢方法對(duì)組織樣本分析成為近些年的流行趨勢(shì),目前主要包括血漿游離dna、腫瘤血小板、外泌體和循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)。血小板，是外周血中第二豐富的細(xì)胞類型,來源于骨髓巨核細(xì)胞的循環(huán)無核碎片，雖然是一種無核的細(xì)胞碎片，但是血小板內(nèi)卻包含有豐富的rna，而且血小板能夠吸收腫瘤釋放的一些腫瘤標(biāo)記物。但現(xiàn)有技術(shù)中,還沒有利用血小板中的標(biāo)記物對(duì)腫瘤進(jìn)行較為準(zhǔn)確診斷的成熟技術(shù)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足,本發(fā)明提供了一種將血小板lncrnamagi2-as3和zfas1熒光定量pcr的結(jié)果聯(lián)合用于nsclc診斷的檢測(cè)方法，該方法靈敏度、特異性較高；更進(jìn)一步能夠提供一種性價(jià)比高，易于推廣應(yīng)用的非小細(xì)胞肺癌診斷試劑盒。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)上述目的技術(shù)方案如下：本發(fā)明第一方面，提供檢測(cè)血小板長(zhǎng)鏈非編碼rnamagi2-as3和zfas1表達(dá)量的試劑在制備用于非小細(xì)胞肺癌診斷試劑中的應(yīng)用，其特征在于，所述的檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼rnamagi2-as3和zfas1表達(dá)量的試劑為實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)試劑；所述的實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)試劑包括根據(jù)長(zhǎng)鏈非編碼rnamagi2-as3和zfas1的核苷酸序列設(shè)計(jì)并合成出特異性用于實(shí)時(shí)熒光定量pcr的檢測(cè)引物，特異性引物如序列表中seqidno.1-4所示；所述的血小板長(zhǎng)鏈非編碼rna的檢測(cè)方法包括樣品rna的提取、樣品cdna的制備、長(zhǎng)鏈非編碼rna的擴(kuò)增，具體步驟包括：1)血小板rna的提?。喊凑誦ioteke公司的血液總rna快速提取試劑盒說明書要求的步驟提取血小板rna；2)cdna的制備：采用takara試劑盒primescripttmrtreagentkit對(duì)提取的血小板rna反轉(zhuǎn)錄合成cdna；3)長(zhǎng)鏈非編碼rna的擴(kuò)增：使用cwbio的ultrasybrmixture試劑盒,按照其說明書所規(guī)定的操作步驟以步驟2)反轉(zhuǎn)錄的cdna為模板進(jìn)行熒光定量pcr擴(kuò)增；實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增獲得待測(cè)樣本中目的lncrna表達(dá)量相對(duì)于內(nèi)參基因gapdh變化的表達(dá)倍數(shù)2-δct，代入公式y(tǒng)＝12.330*(magi2-as3)+11.876*(zfas1)-3.675，式中(magi2-as3)、(zfas1)是magi2-as3和zfas1在血小板中的表達(dá)量2-δct，其中δct＝目的基因的ct值-內(nèi)參基因gapdh的ct值，ct值為用實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)到的各基因的ct值；當(dāng)y值小于0.370時(shí)判定為非小細(xì)胞肺癌陽性，反之為陰性。本發(fā)明第二方面，提供一種用于非小細(xì)胞肺癌診斷的實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)試劑盒，包含根據(jù)長(zhǎng)鏈非編碼rnamagi2-as3和zfas1的核苷酸序列設(shè)計(jì)的特異性用于實(shí)時(shí)熒光定量pcr的檢測(cè)引物，特異性引物如序列表中seqidno.1-4所示。利用本發(fā)明的檢測(cè)制劑可以檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼rnamagi2-as3和zfas1在血小板中的表達(dá)水平，聯(lián)合血小板magi2-as3和zfas1的定量表達(dá)結(jié)果，建立了非小細(xì)胞肺癌診斷的logistic回歸擬合數(shù)據(jù)模型，該模型對(duì)非小細(xì)胞肺癌有較高的診斷效能和敏感性，具有深遠(yuǎn)的臨床意義和推廣性。附圖說明圖1本發(fā)明的工作流程圖；圖2本發(fā)明中血小板magi2-as3、zfas1表達(dá)量ad-肺腺癌；scc-肺鱗癌；control-健康對(duì)照組；relativeexpression用2-δct表示，多組間比較用非參數(shù)檢驗(yàn)，*p<0.05，**p<0.01***p<0.001,****p<0.0001a：目的基因magi2-as3在非小細(xì)胞肺癌血小板中的表達(dá)情況b：目的基因zfas1在非小細(xì)胞肺癌血小板中的表達(dá)情況；圖3本發(fā)明中血小板目的基因magi2-as3、zfas1診斷roc曲線圖其中，sensitivity-敏感性，specificity-特異性a：血小板中magi2-as3在肺腺癌、肺鱗癌的roc曲線b：血小板中zfas1在肺腺癌、肺鱗癌的roc曲線c：血小板中magi2-as3和zfas1在肺腺癌、肺鱗癌聯(lián)合診斷的roc曲線；圖4本發(fā)明中血小板目的基因與臨床病理參數(shù)的關(guān)系分析圖a：nsclc血小板zfas1與tnm(腫瘤分期)關(guān)系分析圖b：nsclc血小板magi2-as3與tnm(腫瘤分期)關(guān)系分析圖c：nsclc血小板magi2-as3與n(區(qū)域淋巴結(jié)受累情況)關(guān)系分析圖d：nsclc血小板magi2-as3與m(遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況)關(guān)系分析圖；具體實(shí)施方式通過以下詳細(xì)說明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。所提供的實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容?！緦?shí)施例1】采用101例nsclc(68例腺癌+33例鱗癌)腫瘤患者及60例健康對(duì)照組的血小板，對(duì)magi2-as3、zfas1進(jìn)行檢測(cè)及模型建立，其工作流程見圖1所示，具體檢測(cè)方法,包括以下步驟：1.血小板的采集與保存采集受試者靜脈血于4ml抗凝管中，室溫環(huán)境下在12h內(nèi)離心分離血小板。首先于室溫120g離心20min,分兩層，吸取上層富含血小板血漿轉(zhuǎn)移至新的ep管(注意吸取的時(shí)候留部分血漿，不吸全)，360g離心20min，沉淀即為血小板，用pbs洗滌兩次,加300μldepc水后提取rna。2.血小板rna提取(血液總rna快速提取試劑盒，bioteke)1)血小板懸液中加入900μl裂解液rls，吹打裂解；2)4℃條件下，12000rpm離心10min，取上清入新的無酶ep管；3)加入180μl氯仿，蓋緊ep管蓋，振蕩15s在室溫下孵育10min；4)4℃條件下，12000rpm離心10min,取550μl上層水相；5)加入等體積70％乙醇，顛倒混勻，轉(zhuǎn)入吸附柱ra中；6)1000rpm離心3min后棄廢液；7)加入500μl去蛋白液re，12000rpm離心3min，棄廢液；8)加入700μl去漂洗液re，12000rpm離心3min，棄廢液；9)加入500μl去漂洗液re二次漂洗，12000rpm離心3min，棄廢液；10)12000rpm離心4min，甩掉剩余殘液；11)吸附柱ra放入新的無酶ep管，加入已56℃水浴的rnasefreewater30μl，12000rpm離心3min收集血小板rna；12)rna濃度和純度測(cè)定后-80℃保存。3.cdna合成(primescripttmrtreagentkit，takara)1)去除基因組dna：混勻，離心后置于pcr儀42℃2min,4℃保存。2)反轉(zhuǎn)錄：混勻，離心后置于pcr儀37℃15min，85℃5s，4℃保存。4.lncrna的篩選：利用三個(gè)geo數(shù)據(jù)庫gse19188、gse30219、gse27262篩選出在肺腺癌、肺鱗癌中與正常組織有明顯表達(dá)差異的長(zhǎng)鏈非編碼rnamagi2-as3、zfas1。5.實(shí)時(shí)熒光定量pcr：使用cwbio的ultrasybrmixture，按照試劑盒說明所規(guī)定的操作步驟：20μl體系含10μlsybrmix、1.6μlprimer、2μlcdna、6.4μlddh2o,反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min，(95℃30sec、63.3℃30sec、72℃30sec)42個(gè)循環(huán)，根據(jù)2-δct的方法計(jì)算血小板中兩條目的基因的表達(dá)量。下表1為所使用的引物。表1引物序列基因名稱基因序列上游引物下游引物magi2-as3nr_038343gagcagaaatagcgggaccttctcttggatgcaaacggcazfas1nr_003604acgtgcagacatctacaaccttacttccaacacccgcatgapdhnm_002046ggtctcctctgacttcaacagtgagggtctctctcttcct6.結(jié)果分析1)magi2-as3、zfas1表達(dá)量：采用2-δct對(duì)兩目的基因定量數(shù)據(jù)分析，δct＝目的基因的ct值-內(nèi)參基因的ct，目的基因ct值為用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)檢測(cè)到的目的基因magi2-as3、zfas1的ct值，結(jié)果如附圖2所示，magi2-as3、zfas1在肺腺癌、肺鱗癌患者血小板的表達(dá)水平低于健康對(duì)照組，且差異有顯著性。2)roc診斷效能分析：roc分析血小板中目的基因magi2-as3、zfas1分別在非小細(xì)胞肺癌的診斷價(jià)值；結(jié)果如附圖3和表2所示，血小板中magi2-as3比zfas1診斷效能好，但當(dāng)兩種lncrna聯(lián)合診斷時(shí)，診斷效能明顯高于單獨(dú)的lncrna的診斷效能，敏感性和特異性都達(dá)到80％以上，表明聯(lián)合血小板的magi2-as3和zfas1的表達(dá)量能較好的診斷nsclc。表2各種診斷的靈敏度、特異性3)lncrna與臨床病理參數(shù)關(guān)系分析：用非參數(shù)檢驗(yàn)分析magi2-as3、zfas1與病理類型、性別、年齡、tnm分期、t(腫瘤原發(fā)灶的情況)、n(區(qū)域淋巴結(jié)受累情況)、m(遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況)的關(guān)系，圖4展示了有表達(dá)差異的分析結(jié)果,用2-δct表示relativeexpression，tnm表示非小細(xì)胞肺癌分期，n表示區(qū)域淋巴結(jié)受累情況,m表示遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況；結(jié)果表明zfas1僅與非小細(xì)胞肺癌的tnm分期呈負(fù)相關(guān)，分期越大，zfas1表達(dá)越低；而magi2-as3除跟非小細(xì)胞肺癌的分期呈負(fù)相關(guān)，還與n、m呈負(fù)相關(guān)，即淋巴結(jié)受累情況越嚴(yán)重、發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，magi2-as3表達(dá)越低。7.logistic回歸擬合數(shù)據(jù)模型建立：y＝12.330*(magi2-as3)+11.876*(zfas1)-3.675；其中(magi2-as3)、(zfas1)是magi2-as3和zfas1在血小板中的表達(dá)量2-δct，當(dāng)y值小于0.370時(shí)判定為陽性(nsclc患者)，反之為陰性(非nsclc患者)。序列表<110>武漢大學(xué)<120>用于非小細(xì)胞肺癌診斷的血小板lncrna的定量檢測(cè)方法<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人類(homosapiens)<400>1gagcagaaatagcgggacct20<210>2<211>20<212>dna<213>人類(homosapiens)<400>2tctcttggatgcaaacggca20<210>3<211>21<212>dna<213>人類(homosapiens)<400>3acgtgcagacatctacaacct21<210>4<211>18<212>dna<213>人類(homosapiens)<400>4tacttccaacacccgcat18<210>5<211>20<212>dna<213>人類(homosapiens)<400>5ggtctcctctgacttcaaca20<210>6<211>20<212>dna<213>人類(homosapiens)<400>6gtgagggtctctctcttcct20當(dāng)前第1頁12