本發(fā)明屬于食品加工技術(shù)和蛋白利用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用超聲預(yù)處理性成膠原凝膠結(jié)合仿生動態(tài)鼠胃消化系統(tǒng)和模擬腸消化制備抗氧化多肽液。

背景技術(shù)：

膠原凝膠是膠原蛋白分子，在沒有外力的作用下，通過非共價鍵的作用力在體外自發(fā)組織、聚集形成有序排列、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的超分子結(jié)構(gòu)或者分子聚集體。膠原蛋白從分子結(jié)構(gòu)，聚集逐漸形成纖維絲，再聚合形成膠原纖維和膠原纖維束，這一過程分三個階段完成：成核階段，成長階段和平衡階段。近年來，超聲波在生物、化學(xué)等領(lǐng)域的研究很熱門，超聲波以其機(jī)械作用、空化作用等效應(yīng)在各個領(lǐng)域都有很好的應(yīng)用。超聲波預(yù)處理會對膠原凝膠的自組裝有明顯的促進(jìn)作用，形成的膠原凝膠質(zhì)構(gòu)軟，更有利于酶解。目前，膠原凝膠廣泛應(yīng)用于食品中的腸衣、醫(yī)藥學(xué)中的敷料、膠囊外皮等，因此研究制備膠原凝膠的抗氧化多肽液具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

多肽是α-氨基酸以肽鍵連接在一起而形成的化合物，是蛋白質(zhì)水解的中間產(chǎn)物?？寡趸嚯闹饕ㄌ烊恍纬傻目寡趸嚯模绻入赘孰牡?；蛋白降解產(chǎn)生的抗氧化多肽，如酶解大豆蛋白的酶解產(chǎn)物；人工合成的抗氧化多肽等。其中酶解形成的抗氧化多肽符合人體的營養(yǎng)需求，易于工業(yè)化生產(chǎn)，且操作簡單，高效。目前酶解蛋白產(chǎn)生多肽多采用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶等單一酶解方法。例如：中國專利cn106520877a中，利用新鮮豬腦為原料，利用堿性蛋白酶解提取豬腦蛋白抗氧化肽。此專利單一酶解方法易導(dǎo)致酶解不完全，形成的多肽分子量分布較復(fù)雜，因此帶來分離純化繁瑣，成本較高等問題。

胃腸是人體消化食物的主要場所，胃通過蠕動把食物和胃分泌液混勻，使食物顆粒研磨變小，并且在胃中發(fā)生部分生物化學(xué)反應(yīng)，之后進(jìn)入腸在腸消化液的作用下大部分都消化掉從而使食物更有利于人體消化吸收。因此本發(fā)明先采用超聲預(yù)處理技術(shù)，使膠原蛋白溶液形成膠原凝膠，再通過仿生動態(tài)鼠胃消化系統(tǒng)來進(jìn)行模擬胃消化，之后加入模擬腸消化來制備膠原凝膠抗氧化多肽液。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明以超聲預(yù)處理(膠原蛋白溶液)形成的膠原凝膠為原料，利用仿生動態(tài)鼠胃消化系統(tǒng)來進(jìn)行模擬胃消化，之后加入模擬腸消化來制備抗氧化多肽液。

超聲處理形成膠原凝膠的仿生動態(tài)鼠胃消化和模擬腸消化制備抗氧化肽的方法，按照以下步驟進(jìn)行：

(1)將膠原蛋白溶解于分散劑中得到一定濃度的溶液，透析48h，以除去溶液中鹽離子小分子雜質(zhì)等。透析結(jié)束后，溶液在20000×g的離心機(jī)中離心15min，取上清液。恒溫條件下，采用超聲波技術(shù)，對膠原蛋白溶液進(jìn)行預(yù)處理，之后將形成的膠原分子單體在水浴的條件下自組裝形成膠原凝膠。

(2)構(gòu)建仿生動態(tài)鼠胃消化系統(tǒng)：模擬胃液配制，稱取10.42g胃蛋白酶，0.02g碳酸氫鈉，0.44g氯化鈉，0.08g胃粘膜素(mucin)，攪拌溶解在蒸餾水中，50ml容量瓶定容，用1mhcl調(diào)整ph為1.63±0.01。實(shí)驗(yàn)中，注射泵選擇工作模式為灌注，灌注量為3.4ml，流量0.85ml/h，灌注時間為4h。消化系統(tǒng)裝置37℃預(yù)熱10min后，裝樣前鼠胃模型里面先加入0.6ml模擬胃液來模擬鼠胃胃液殘留，然后加入2ml樣品進(jìn)行模擬胃消化。

(3)模擬腸消化系統(tǒng)：模擬腸消化液(模擬腸消化液的配制：稱取0.68g磷酸二氫鉀，用1m氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph為6.8，用蒸餾水定容到100ml，加入1g胰蛋白酶。)使用前37℃加熱10min。胃消化階段結(jié)束后加入4ml模擬腸消化液，在水浴37℃下持續(xù)攪拌消化6h。

(4)上述消化液在100℃滅酶10min，5000×g離心10min除去大分子蛋白，所得上清液即為抗氧化肽液。

其中步驟(1)中溶解膠原蛋白所用的溶液為0.5m醋酸，配制成3mg/ml的膠原蛋白溶液。

其中步驟(1)中透析在4℃冰箱中進(jìn)行，透析液為磷酸鹽緩沖液(200mm，ph7.4)，反復(fù)換透析液，直至測定透析后透析液ph保持7.4不變，并且透析液和0.01magno3(1:1)反應(yīng)無白色絮狀沉淀，反應(yīng)液保持澄清透明即透析結(jié)束。

其中步驟(1)中超聲預(yù)處理?xiàng)l件為，用單頻超聲設(shè)備對前處理后的膠原溶液進(jìn)行超聲預(yù)處理，水浴30℃，超聲頻率60khz，功率90w，作用5min，之后相同水浴條件下進(jìn)行膠原蛋白自組裝，最得到膠原凝膠，最后再進(jìn)行真空冷凍干燥，得到膠原凝膠海綿體。

其中步驟(1)中膠原蛋白溶液的前處理在4℃條件下完成，以防止膠原蛋白變性，膠原凝膠的形成過程都在30℃下完成。

其中步驟(2)中樣品液的制備為：將0.04g膠原凝膠固體溶解在2ml蒸餾水中。

其中步驟(4)中采用高溫滅酶，再通過離心方法除去大分子蛋白和不溶解的雜質(zhì)，得到抗氧化多肽液。

本發(fā)明的優(yōu)勢在于：

1)本發(fā)明采用超聲預(yù)處理制備膠原凝膠，可以加速膠原蛋白的自組裝進(jìn)程，使形成的膠原凝膠更利于酶解消化。

2)本發(fā)明采用仿生動態(tài)鼠胃消化系統(tǒng)裝置來進(jìn)行模擬胃消化，過程中模擬鼠胃的蠕動，每分鐘三個壓縮循環(huán)，并且固定胃的壓縮振幅，使消化更加徹底。

3)本發(fā)明采用仿生動態(tài)鼠胃消化系統(tǒng)裝置來進(jìn)行模擬胃消化，過程中在注射泵的作用下模擬分泌腺以一定分泌速度加入模擬胃液，胃消化結(jié)束后引入腸消化過程，兩步酶解法，使得酶解液中的蛋白更少。

4)本發(fā)明模擬動物的消化系統(tǒng)，過程為動態(tài)模型消化，在食品安全方面，比其他的抗氧化多肽的生產(chǎn)，如發(fā)酵法和人工合成法所得到的產(chǎn)品更加安全合理。

附圖說明

圖1是抗氧化肽液的制備流程圖。

圖2是標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白和多肽對照品色譜圖(a)；仿生動態(tài)鼠胃消化系統(tǒng)消化后酶解液的相對分子質(zhì)量分布圖(b)。

圖3是仿生動態(tài)鼠胃模擬消化系統(tǒng)實(shí)物安裝圖，其中(1)馬達(dá)；(2)頻率控制；(3)軸；(4)角板；(5)彈簧；(6)壓板；(7)體外仿生鼠胃；(8)支撐板。

圖4是模擬鼠胃示意圖。

具體實(shí)施方式

仿生動態(tài)鼠胃消化系統(tǒng)裝置由實(shí)驗(yàn)室購買所得(圖3)，結(jié)構(gòu)為由一個軟硅膠制成的鼠胃模型、保溫盒、體外電動壓縮裝置和模擬胃液分泌裝置四部分組成。模擬鼠胃(圖4)的制作是在小鼠體內(nèi)取出胃，將其內(nèi)部翻到外面，然后用特定的石蠟澆筑模型，修復(fù)后切開并流出分泌胃液和排空食物的管口，之后用硅膠制作鼠胃模型。模擬鼠胃的尺寸為40×30×21mm，內(nèi)部的最大儲水體積為9ml，較薄的前胃厚度為0.65±0.11mm，腺胃厚度為1.22±0.15mm。十二指腸和食道于胃的連接處的咽和幽門裝上單向閥，咽的單向閥使氣體可以進(jìn)入以確保消化過程胃中的氣壓是恒定的，幽門處的單向閥只能排空消化物，阻止其回流入胃中。

體外電動壓縮裝置由馬達(dá)調(diào)節(jié)為接近真實(shí)鼠胃蠕動收縮頻率即每分鐘3個循環(huán)。通過調(diào)節(jié)角板的角度(彈簧的支點(diǎn)位置)和壓縮板的螺絲位置，可以改變壓縮板的初始位置和垂直移動高度即振幅，為保證固體顆粒有效破碎，振幅應(yīng)設(shè)在4mm。

本發(fā)明對前處理好的膠原蛋白溶液進(jìn)行超聲預(yù)處理，水浴條件下自組裝形成膠原凝膠。利用體外模擬胃腸消化制備抗氧化多肽液，以過程中游離氨基的含量變化來監(jiān)測抗氧化肽的形成進(jìn)程，利用高效液相色譜法測定仿生動態(tài)鼠胃結(jié)束后消化液的相對分子量分布。實(shí)施流程圖如圖1所示。

(1)可溶性氨基含量測定

消化過程中每0.5h取適量的消化液，100℃水浴10min進(jìn)行滅酶處理，5000×g離心10min除去大分子蛋白。取125μl消化液離心上清液與磷酸緩沖液(ph8.2)和2,4,6-三硝基苯磺酸溶液震蕩混合均勻，50℃水浴避光反應(yīng)30min，用亞硫酸鈉溶液終止反應(yīng)，室溫下放置15min后，可見光分光光度計法在420nm波長下測定吸光值，相同試驗(yàn)方法用l-亮氨酸測定自由氨基含量，以此繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(y＝14.429x+0.0062，相關(guān)系數(shù)r²＝0.9925)，空白組用蒸餾水代替酶解液測定。

(2)多肽分子量分布

安捷倫1260色譜儀，色譜柱：tskgel-g2000swxl(300mm×7.8mm，tosoh)；流動相：超純水配制0.1mol/lna2so4+0.1mol/l磷酸緩沖液(ph6.7)混合均勻，超聲脫氣；試驗(yàn)柱溫30℃；紫外檢測器波長：220nm；檢測流速：0.5ml/min；樣品用流動相稀釋合適倍數(shù)0.22μl水膜過濾才能上樣，進(jìn)樣量為10μl。

實(shí)例1：

稱取0.04g酶溶性膠原蛋白(膠原蛋白由實(shí)驗(yàn)室制備所得，雞爪皮在4℃條件下，利用20％(w/v)nacl(0.05mol/ltris-hcl,ph7.5)的溶液除去雜蛋白、脂肪以及色素等雜質(zhì)。預(yù)處理后的雞爪皮用含0.1％(w/v)胃蛋白酶(2500u/mg)的預(yù)冷的0.5m乙酸提取，離心，上清液鹽析所得沉淀真空冷凍干燥即為酶溶性膠原蛋白。)，用0.5m醋酸，配制成0.02g/ml的膠原蛋白溶液，4℃冰箱磷酸鹽緩沖液(200mm，ph7.4)透析。透析結(jié)束后，溶液離心20000×g離心15min，取上清液。30℃水浴，用單頻超聲設(shè)備270w/60khz超聲5min，30℃水浴加熱55min，形成膠原分子單體自組裝形成膠原凝膠。真空冷凍干燥得到膠原凝膠海綿體，以待下一步使用。

試驗(yàn)中用蒸餾水配制2ml0.04g/ml的膠原凝膠溶液進(jìn)行體外模擬胃腸消化。仿生動態(tài)鼠胃消化系統(tǒng)設(shè)置體外電動壓縮裝置由馬達(dá)調(diào)節(jié)為接近真實(shí)鼠胃蠕動收縮頻率即每分鐘3個循環(huán),振幅設(shè)在3mm，在37℃下，注射泵選擇工作模式為灌注，灌注量為3.4ml，流量0.85ml/h，灌注時間為4h。消化系統(tǒng)裝置37℃預(yù)熱10min后，裝樣前鼠胃模型里面先加入0.6ml模擬胃液來模擬鼠胃胃液殘留，然后加入2ml樣品進(jìn)行模擬胃消化4h。取出混合物，不用滅酶，加入37℃預(yù)熱10min的模擬腸消化液，在37℃恒溫水浴鍋中，攪拌，消化6h，定時定量取樣檢測消化過程。消化結(jié)束后可得到超聲預(yù)處理的膠原凝膠的模擬胃腸消化抗氧化肽液。測定消化過程的游離氨基含量，測定得模擬胃消化結(jié)束游離氨基含量為0.078mmol/l，腸消化結(jié)束后含量為0.0143mmol/l。相對分子質(zhì)量在200-5000da的占84.56％。

實(shí)例2：

稱取0.04g酶溶性膠原蛋白(實(shí)驗(yàn)室自制，同實(shí)施例1)，用0.5m醋酸，配制成0.02g/ml的膠原蛋白溶液，4℃冰箱磷酸鹽緩沖液(200mm，ph7.4)透析。透析結(jié)束后，溶液離心20000×g離心15min，取上清液。30℃水浴，用單頻超聲設(shè)備270w/60khz超聲5min，30℃水浴加熱55min，形成膠原分子單體自組裝形成膠原凝膠。真空冷凍干燥得到膠原凝膠海綿體，以待下一步使用。

試驗(yàn)中用蒸餾水配制2ml0.02g/ml的膠原凝膠溶液進(jìn)行體外模擬胃腸消化。仿生動態(tài)鼠胃消化系統(tǒng)設(shè)置體外電動壓縮裝置由馬達(dá)調(diào)節(jié)為接近真實(shí)鼠胃蠕動收縮頻率即每分鐘3個循環(huán),振幅設(shè)在4mm，在37℃下，注射泵選擇工作模式為灌注，灌注量為3.4ml，流量0.85ml/h，灌注時間為4h。消化系統(tǒng)裝置37℃預(yù)熱10min后，裝樣前鼠胃模型里面先加入0.6ml模擬胃液來模擬鼠胃胃液殘留，然后加入2ml樣品進(jìn)行模擬胃消化4h。取出混合物，不用滅酶，加入37℃預(yù)熱10min的模擬腸消化液，在37℃恒溫水浴鍋中，攪拌，消化6h，定時定量取樣檢測消化過程。消化結(jié)束后可得到超聲預(yù)處理的膠原凝膠的模擬胃腸消化抗氧化肽液。測定消化過程的游離氨基含量，測定得模擬胃消化結(jié)束游離氨基含量為0.0069mmol/l，腸消化結(jié)束后含量為0.0093mmol/l。分子量分布如圖2，相對分子質(zhì)量在200-5000da的占87.48％。