本發(fā)明涉及生命科學(xué)領(lǐng)域的腺病毒載體及其應(yīng)用，具體涉及一種病毒復(fù)制受tetr-krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型tet-on系統(tǒng)調(diào)控的條件復(fù)制腺病毒載體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：腫瘤是威脅人類(lèi)健康的最主要疾病。盡管傳統(tǒng)治療手段應(yīng)用廣泛，但因?yàn)槿狈δ[瘤特異性，常會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成較大的毒副作用。條件復(fù)制型腺病毒(crad)，是在腺病毒的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的一類(lèi)用于腫瘤基因治療的新型病毒，該病毒可在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性擴(kuò)增，但在正常細(xì)胞中不復(fù)制，或者復(fù)制很弱，所以也稱(chēng)為溶瘤腺病毒(oncolyticadenovirus)。目前crad主要分三類(lèi)：(1)ad5e1b區(qū)55kd缺失的ad5e1bδ55kd(如onyx-015)，它可以在p53功能異常的腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，而在正常細(xì)胞內(nèi)不能復(fù)制。(2)ad5e1acr2區(qū)的24bp(919-943)堿基序列缺失的ad5d24，其可在rb功能異常的腫瘤細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制。(3)利用腫瘤特異性啟動(dòng)子表達(dá)復(fù)制相關(guān)基因，使病毒在特定腫瘤特異性啟動(dòng)子活性較高的腫瘤細(xì)胞中特異性擴(kuò)增。條件復(fù)制型腺病毒在腫瘤治療中應(yīng)用廣泛，但依然存在一些缺點(diǎn)如：免疫原性高，肝臟毒性大，腫瘤治療時(shí)以腫瘤內(nèi)局部注射給藥為主，投遞方式受限制，感染范圍有限，復(fù)制特異性不嚴(yán)謹(jǐn)，病毒安全性有不足等。已有研究表明，使用人間充質(zhì)干細(xì)胞(humanmesenchymalstemcell，簡(jiǎn)稱(chēng)hmsc)來(lái)裝載和投送條件復(fù)制型腺病毒載體，進(jìn)行體內(nèi)的基因治療，可以克服上述的條件復(fù)制型腺病毒載體在應(yīng)用中的缺陷。hmsc作為運(yùn)載細(xì)胞而裝載病毒時(shí)，病毒可以在hmsc中進(jìn)行復(fù)制和擴(kuò)增，最后病毒復(fù)制裂解hmsc，釋放病毒到腫瘤組織，實(shí)現(xiàn)病毒投送。但病毒在hmsc中的復(fù)制會(huì)導(dǎo)致hmsc的活力受到影響，減弱其遷移與歸巢的活力，進(jìn)而影響其投送病毒的能力。因此，條件復(fù)制型腺病毒在hmsc細(xì)胞中的裝載量會(huì)受到限制，需要在病毒裝載量和細(xì)胞歸巢活力之間取得平衡。當(dāng)病毒裝載量過(guò)多時(shí)，hmsc可能因?yàn)椴《镜膹?fù)制而失去活力甚至被裂解，導(dǎo)致無(wú)法有效投送病毒到達(dá)腫瘤組織中。因此，嚴(yán)格控制病毒的復(fù)制，除了有利于病毒治療的安全性外，也能提高h(yuǎn)msc投送腺病毒的效果。使用調(diào)控系統(tǒng)控制病毒復(fù)制，在hmsc未到達(dá)腫瘤細(xì)胞之前，細(xì)胞內(nèi)裝載的病毒不復(fù)制，當(dāng)hmsc遷移到腫瘤組織后，再開(kāi)啟病毒復(fù)制，如此可在獲得最大的病毒裝載量的同時(shí)，避免病毒復(fù)制對(duì)hmsc活力的影響。并且，這種方式可以精確控制病毒的釋放，使hmsc到達(dá)腫瘤組織后釋放病毒，避免病毒對(duì)正常組織和細(xì)胞的影響。申請(qǐng)人研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)控制病毒e1a基因表達(dá)可以調(diào)控病毒復(fù)制。申請(qǐng)人曾經(jīng)報(bào)道了一種基于腺病毒的rtta介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活型tet-on系統(tǒng)，該系統(tǒng)為低本底嚴(yán)密型tet-on系統(tǒng)，帶有該系統(tǒng)的載體名為pad5-krab-bi-tet-on(chenh,wangd，xiar，maoq，xiah.anoveladenoviralvectorcarryinganall-in-onetet-onsystemwithanautoregulatoryloopfortight,inducibletransgeneexpression.bmcbiotechnol，2015，(1)：1-8)。在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)rtta介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活型tet-on系統(tǒng)無(wú)法有效調(diào)控腺病毒的復(fù)制，所以使用tetr-krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型的調(diào)控系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)基因e1a的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，達(dá)到控制病毒復(fù)制的目的。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種病毒復(fù)制受tetr-krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型tet-on系統(tǒng)調(diào)控的條件復(fù)制腺病毒載體。本發(fā)明的另外一個(gè)目的在于，為病毒復(fù)制受tetr-krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型tet-on系統(tǒng)調(diào)控的條件復(fù)制腺病毒載體用于在腫瘤治療研究中的新用途。為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)解決方案：一種病毒復(fù)制受tetr-krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型tet-on系統(tǒng)調(diào)控的條件復(fù)制型腺病毒載體，其特征在于：腺病毒e1區(qū)包含元件及連接順序?yàn)?’-cmv啟動(dòng)子、tetr-krab基因、含四環(huán)素反應(yīng)元件的啟動(dòng)子tre3g-e1bpro、ecorⅰ酶切位點(diǎn)、缺失e1bδ55kd蛋白的腺病毒e1a-e1b19kd基因序列、酶切位點(diǎn)speⅰ、mrna轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)sv40polya-3’；cmv啟動(dòng)子表達(dá)轉(zhuǎn)錄抑制因子tetr-krab；兩個(gè)酶切位點(diǎn)ecorⅰ和speⅰ中插入的基因序列為腺病毒e1a翻譯起始位點(diǎn)至腺病毒e1b19kd蛋白終止密碼子基因片段，包含四環(huán)素反應(yīng)元件的啟動(dòng)子tre3g-e1bpro表達(dá)腺病毒e1a基因，腺病毒e1b19kd基因則由其自身的啟動(dòng)子表達(dá)，經(jīng)過(guò)包裝獲得的腺病毒命名為ad5-cmv-tetr-krab-tre3g-e1bpro-δ55kd。根據(jù)本發(fā)明，所述的含四環(huán)素反應(yīng)元件的啟動(dòng)子tre3g-e1bpro的序列為：ctcgagttactccctatcagtgatagagaacgtatgaagagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgcagactttactccctatcagtgatagagaacgtataaggagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgaccagtttactccctatcagtgatagagaacgtatctacagtttactccctatcagtgatagagaacgtatatccagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgtcgaggtaggcatcgatgctagcggggggctataaaagggggtgggggcgttcgtcctcactctagatctctcgatcgagaagcttgaattc。上述腺病毒e1a翻譯起始位點(diǎn)至e1b19kd蛋白終止密碼子基因片段序列為：atgagacatattatctgccacggaggtgttattaccgaagaaatggccgccagtcttttggaccagctgatcgaagaggtactggctgataatcttccacctcctagccattttgaaccacctacccttcacgaactgtatgatttagacgtgacggcccccgaagatcccaacgaggaggcggtttcgcagatttttcccgactctgtaatgttggcggtgcaggaagggattgacttactcacttttccgccggcgcccggttctccggagccgcctcacctttcccggcagcccgagcagccggagcagagagccttgggtccggtttctatgccaaaccttgtaccggaggtgatcgatcttacctgccacgaggctggctttccacccagtgacgacgaggatgaagagggtgaggagtttgtgttagattatgtggagcaccccgggcacggttgcaggtcttgtcattatcaccggaggaatacgggggacccagatattatgtgttcgctttgctatatgaggacctgtggcatgtttgtctacagtaagtgaaaattatgggcagtgggtgatagagtggtgggtttggtgtggtaattttttttttaatttttacagttttgtggtttaaagaattttgtattgtgatttttttaaaaggtcctgtgtctgaacctgagcctgagcccgagccagaaccggagcctgcaagacctacccgccgtcctaaaatggcgcctgctatcctgagacgcccgacatcacctgtgtctagagaatgcaatagtagtacggatagctgtgactccggtccttctaacacacctcctgagatacacccggtggtcccgctgtgccccattaaaccagttgccgtgagagttggtgggcgtcgccaggctgtggaatgtatcgaggacttgcttaacgagcctgggcaacctttggacttgagctgtaaacgccccaggccataaggtgtaaacctgtgattgcgtgtgtggttaacgcctttgtttgctgaatgagttgatgtaagtttaataaagggtgagataatgtttaacttgcatggcgtgttaaatggggcggggcttaaagggtatataatgcgccgtgggctaatcttggttacatctgacctcatggaggcttgggagtgtttggaagatttttctgctgtgcgtaacttgctggaacagagctctaacagtacctcttggttttggaggtttctgtggggctcatcccaggcaaagttagtctgcagaattaaggaggattacaagtgggaatttgaagagcttttgaaatcctgtggtgagctgtttgattctttgaatctgggtcaccaggcgcttttccaagagaaggtcatcaagactttggatttttccacaccggggcgcgctgcggctgctgttgcttttttgagttttataaaggataaatggagcgaagaaacccatctgagcggggggtacctgctggattttctggccatgcatctgtggagagcggttgtgagacacaagaatcgcctgctactgttgtcttccgtccgcccggcgataataccgacggaggagcagcagcagcagcaggaggaagccaggcggcggcggcaggagcagagcccatggaacccgagagccggcctggaccctcgggaatga。根據(jù)發(fā)明人的研究表明，使用本發(fā)明構(gòu)建的腺病毒載體(ad5-cmv-tetr-krab-tre3g-e1bpro-δ55kd)感染hela，u87mg，mda-mb-231及hmsc細(xì)胞后，使用real-timepcr檢測(cè)病毒基因組的復(fù)制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該病毒可以在多種腫瘤細(xì)胞及hmsc中復(fù)制，并且病毒的復(fù)制受到dox藥物的有效調(diào)控；使用腺病毒載體(ad5-cmv-tetr-krab-tre3g-e1bpro-δ55kd)感染mda-mb-231細(xì)胞，檢測(cè)病毒對(duì)mda-mb-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在體外試驗(yàn)中，該病毒能有效抑制mda-mb-231細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且抑制效果受到dox藥物調(diào)控；使用腺病毒ad5-cmv-tetr-krab-tre3g-e1bpro-δ55kd感染hmsc細(xì)胞，檢測(cè)病毒對(duì)hmsc的遷移活性影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，控制該病毒在hmsc中的復(fù)制能有效保護(hù)hmsc的遷移活力，將hmsc對(duì)病毒的裝載量提升一個(gè)數(shù)量級(jí)。本發(fā)明所構(gòu)建的病毒復(fù)制受tetr-krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型tet-on系統(tǒng)調(diào)控的條件復(fù)制腺病毒載體(ad5-cmv-tetr-krab-tre3g-e1bpro-δ55kd)在腫瘤細(xì)胞和hmsc細(xì)胞中的復(fù)制均受到dox藥物調(diào)控；該腺病毒能有效提高h(yuǎn)msc的病毒裝載量。附圖說(shuō)明圖1是腺病毒e1區(qū)穿梭載體pad5-e1-cmv-tetr-krab-tre3g-e1bpro-δ55kd的結(jié)構(gòu)圖。圖2是腺病毒ad5-cmv-tetr-krab-tre3g-e1bpro-δ55kd的結(jié)構(gòu)圖。圖3是腺病毒ad5-cmv-tetr-krab-tre3g-e1bpro-δ55kd感染hela細(xì)胞后病毒基因組復(fù)制情況圖。圖4是腺病毒ad5-cmv-tetr-krab-tre3g-e1bpro-δ55kd感染u87mg細(xì)胞后病毒基因組復(fù)制情況圖。圖5是腺病毒ad5-cmv-tetr-krab-tre3g-e1bpro-δ55kd感染mda-mb-231細(xì)胞后病毒基因組復(fù)制情況圖。圖6是腺病毒ad5-cmv-tetr-krab-tre3g-e1bpro-δ55kd感染hmsc細(xì)胞后病毒基因組復(fù)制情況圖。圖7是腺病毒ad5-cmv-tetr-krab-tre3g-e1bpro-δ55kd感染mda-mb-231細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞增殖抑制效果圖。圖8是腺病毒ad5-cmv-tetr-krab-tre3g-e1bpro-δ55kd感染hmsc細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞遷移活力影響圖。下面結(jié)合附圖和實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。具體實(shí)施方式申請(qǐng)人在研究中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，rtta激活類(lèi)型的tet-on系統(tǒng)調(diào)控e1a基因表達(dá)時(shí)，在系統(tǒng)中rtta2s-m2不發(fā)揮主要作用的情況下，即不加入誘導(dǎo)藥物強(qiáng)力霉素(doxcyclin，dox)時(shí)，由tet-on調(diào)控表達(dá)的的e1a的本底滲漏就可激活該系統(tǒng)，達(dá)到足夠的e1a表達(dá)量，引起病毒復(fù)制，導(dǎo)致病毒復(fù)制調(diào)控失敗。所以申請(qǐng)人設(shè)計(jì)了一個(gè)不帶轉(zhuǎn)錄激活因子的調(diào)控系統(tǒng)。通過(guò)對(duì)載體pad5-krab-bi-tet-on進(jìn)行改造，設(shè)計(jì)了病毒復(fù)制受tetr-krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型tet-on系統(tǒng)調(diào)控的條件復(fù)制型腺病毒載體。本發(fā)明構(gòu)建的病毒復(fù)制受tetr-krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型tet-on系統(tǒng)調(diào)控的條件復(fù)制型腺病毒載體與以往的不同。通常情況下，在tre下游使用強(qiáng)啟動(dòng)子的啟動(dòng)基因表達(dá)，而使用本底表達(dá)非常低的啟動(dòng)子tre3g-e1b-pro啟動(dòng)e1a。利用tetr-krab抑制該啟動(dòng)子的活性，降低非誘導(dǎo)狀態(tài)下的e1a基因表達(dá)，并通過(guò)抑制e1a的激活轉(zhuǎn)錄作用，阻斷e1a基因自我激活的正反饋回路，關(guān)閉病毒基因組的復(fù)制；而當(dāng)加入dox后，tetr-krab的轉(zhuǎn)錄抑制解除，會(huì)恢復(fù)到與激活型調(diào)控系統(tǒng)調(diào)控病毒基因組復(fù)制時(shí)的失控狀態(tài)一樣，利用病毒e1a的自我激活，正反饋調(diào)控，導(dǎo)致病毒復(fù)制開(kāi)啟。以下是發(fā)明人給出的具體實(shí)施例，需要說(shuō)明的是，以下的實(shí)施例是較佳的例子，本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例實(shí)施例1：本實(shí)施例構(gòu)建的病毒復(fù)制受tetr-krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型tet-on系統(tǒng)調(diào)控的條件復(fù)制型腺病毒載體如下：腺病毒e1區(qū)包含元件及連接順序?yàn)?’-cmv啟動(dòng)子、tetr-krab基因、含四環(huán)素反應(yīng)元件的啟動(dòng)子tre3g-e1bpro、ecorⅰ酶切位點(diǎn)、缺失e1bδ55kd蛋白的腺病毒e1a-e1b19kd基因序列、酶切位點(diǎn)speⅰ、mrna轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)sv40polya-3’；cmv啟動(dòng)子表達(dá)轉(zhuǎn)錄抑制因子tetr-krab；兩個(gè)酶切位點(diǎn)ecorⅰ和speⅰ中插入的基因序列為腺病毒e1a翻譯起始位點(diǎn)至腺病毒e1b19kd蛋白終止密碼子基因片段，包含四環(huán)素反應(yīng)元件的啟動(dòng)子tre3g-e1bpro表達(dá)腺病毒e1a基因，腺病毒e1b19kd基因則由其自身的啟動(dòng)子表達(dá)，經(jīng)過(guò)包裝獲得的腺病毒命名為ad5-cmv-tetr-krab-tre3g-e1bpro-δ55kd。含四環(huán)素反應(yīng)元件的啟動(dòng)子tre3g-e1bpro的序列為：ctcgagttactccctatcagtgatagagaacgtatgaagagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgcagactttactccctatcagtgatagagaacgtataaggagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgaccagtttactccctatcagtgatagagaacgtatctacagtttactccctatcagtgatagagaacgtatatccagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgtcgaggtaggcatcgatgctagcggggggctataaaagggggtgggggcgttcgtcctcactctagatctctcgatcgagaagcttgaattc。上述腺病毒e1a翻譯起始位點(diǎn)至e1b19kd蛋白終止密碼子基因片段序列為：atgagacatattatctgccacggaggtgttattaccgaagaaatggccgccagtcttttggaccagctgatcgaagaggtactggctgataatcttccacctcctagccattttgaaccacctacccttcacgaactgtatgatttagacgtgacggcccccgaagatcccaacgaggaggcggtttcgcagatttttcccgactctgtaatgttggcggtgcaggaagggattgacttactcacttttccgccggcgcccggttctccggagccgcctcacctttcccggcagcccgagcagccggagcagagagccttgggtccggtttctatgccaaaccttgtaccggaggtgatcgatcttacctgccacgaggctggctttccacccagtgacgacgaggatgaagagggtgaggagtttgtgttagattatgtggagcaccccgggcacggttgcaggtcttgtcattatcaccggaggaatacgggggacccagatattatgtgttcgctttgctatatgaggacctgtggcatgtttgtctacagtaagtgaaaattatgggcagtgggtgatagagtggtgggtttggtgtggtaattttttttttaatttttacagttttgtggtttaaagaattttgtattgtgatttttttaaaaggtcctgtgtctgaacctgagcctgagcccgagccagaaccggagcctgcaagacctacccgccgtcctaaaatggcgcctgctatcctgagacgcccgacatcacctgtgtctagagaatgcaatagtagtacggatagctgtgactccggtccttctaacacacctcctgagatacacccggtggtcccgctgtgccccattaaaccagttgccgtgagagttggtgggcgtcgccaggctgtggaatgtatcgaggacttgcttaacgagcctgggcaacctttggacttgagctgtaaacgccccaggccataaggtgtaaacctgtgattgcgtgtgtggttaacgcctttgtttgctgaatgagttgatgtaagtttaataaagggtgagataatgtttaacttgcatggcgtgttaaatggggcggggcttaaagggtatataatgcgccgtgggctaatcttggttacatctgacctcatggaggcttgggagtgtttggaagatttttctgctgtgcgtaacttgctggaacagagctctaacagtacctcttggttttggaggtttctgtggggctcatcccaggcaaagttagtctgcagaattaaggaggattacaagtgggaatttgaagagcttttgaaatcctgtggtgagctgtttgattctttgaatctgggtcaccaggcgcttttccaagagaaggtcatcaagactttggatttttccacaccggggcgcgctgcggctgctgttgcttttttgagttttataaaggataaatggagcgaagaaacccatctgagcggggggtacctgctggattttctggccatgcatctgtggagagcggttgtgagacacaagaatcgcctgctactgttgtcttccgtccgcccggcgataataccgacggaggagcagcagcagcagcaggaggaagccaggcggcggcggcaggagcagagcccatggaacccgagagccggcctggaccctcgggaatga。上述的病毒復(fù)制受tetr-krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型tet-on系統(tǒng)調(diào)控的腺病毒載體構(gòu)建方法步驟如下：1、構(gòu)建帶有tetr-krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型tet-on系統(tǒng)調(diào)控的腺病毒e1區(qū)穿梭載體使用tre3g(clontech)替換pad5-krab-bi-tet-on中的四環(huán)素反應(yīng)元件tre，同時(shí)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道(wangx，chenx，yangy.spatiotemporalcontrolofgeneexpressionbyalight-switchabletransgenesystem[j].natmethods，2012，9(3)：266-269.)，引入了本底表達(dá)很低的e1b核心啟動(dòng)子e1b-pro替換pad5-krab-bi-tet-on中的tight-pmincmv。合成5’段帶有xhoⅰ，3’端帶有ecorⅰ的tre3g-e1bpro的基因片段。載體pad5-krab-bi-tet-on與片段tre3g-e1bpro均經(jīng)過(guò)xhoi與ecorⅰ雙酶切后，使用1％的瓊脂糖凝膠電泳后回；使用t4連接酶將片段tre3g-e1bpro與載體pad5-krab-bi-tet-on連接，連接條件為：pad5-krab-bi-tet-on載體0.5μl，tre3g-e1bpro啟動(dòng)子片段4μl，2×t4dna快速連接酶緩沖液5μl，t4dna快速連接酶0.5μl，25℃反應(yīng)1個(gè)小時(shí)后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞dh5α，并涂布于含有100μg/ml的氨芐青霉素的lb平板中。挑取菌落接種到含有100μg/ml的氨芐青霉素的lb培養(yǎng)液中，14～16小時(shí)后，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒dna，通過(guò)酶切及測(cè)序鑒定獲得陽(yáng)性克隆，稱(chēng)為pad5-krab-bi-tre3g-e1bpro-tet-on。將pad5-krab-bi-tre3g-e1bpro-tet-on用xhoi與notⅰ雙酶切后，使用t4dna聚合酶將粘性末端補(bǔ)平，反應(yīng)體系為：20μl的酶切產(chǎn)物，3μl的緩沖液，1μl的10mmdntp，1μl的t4dna聚合酶，25μl的三蒸水，37℃反應(yīng)1小時(shí)。補(bǔ)平末端的產(chǎn)物，進(jìn)行平末端連接，連接條件為：1μl的補(bǔ)平末端產(chǎn)物，5μl的2×t4連接酶緩沖液，0.5μl的t4連接酶，3.5μl的三蒸水，25℃連接1小時(shí)，使得位于原pad5-krab-bi-tre3g-e1bpro-tet-on上x(chóng)hoi與noti之間的pmincmv-rtta2s-m2-sv40polya元件去除，將所獲得陽(yáng)性克隆，命名為pad5-e1-cmv-tetr-krab-tre3g-e1bpro載體。2、pcr擴(kuò)增缺失e1bδ55kd蛋白的腺病毒e1a-e1b19kd的基因序列根據(jù)野生型腺病毒基因組e1a翻譯起始位點(diǎn)至e1b19kd蛋白終止密碼子結(jié)束的基因序列為模板，設(shè)計(jì)引物，引物由蘇州金唯智公司合成，序列如下(下劃線(xiàn)表示粘性末端序列)：正向引物p1：cgaattcatgagacatattatctgc反向引物p2：cactagttcattcccgagggtccag兩條引物用超純水稀釋成濃度為20μm的溶液，以野生型人5型腺病毒基因組為模板，pcr擴(kuò)增目標(biāo)片段。反應(yīng)體系：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的條件是：94℃，30秒，98℃，10秒，55℃，30秒，72℃，100秒，30個(gè)循環(huán)。pcr產(chǎn)物使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的瓊脂糖凝膠電泳后回，使用t4連接酶將片段與pgem-teasy載體相連接，連接條件為：pgem-teasy載體：0.5μl，e1a-e1b19kd的基因序列片段：4μl，2×t4dna快速連接酶緩沖液：5μl，t4dna快速連接酶：0.5μl；25℃反應(yīng)1個(gè)小時(shí)后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞dh5α，并涂布于含有100μg/ml的氨芐青霉素的lb平板中。挑取菌落接種到含有100μg/ml的氨芐青霉素的lb培養(yǎng)液中，14～16小時(shí)后，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒dna，通過(guò)酶切及測(cè)序鑒定獲得陽(yáng)性克隆。經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定正確的質(zhì)粒命名為pgem-teasy-e1bδ55kd(圖2)。3、構(gòu)建病毒復(fù)制受tetr-krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型tet-on系統(tǒng)調(diào)控的腺病毒e1區(qū)穿梭載體將質(zhì)粒pgem-teasy-e1b-δ55kd經(jīng)過(guò)ecorⅰ和speⅰ雙酶切后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的瓊脂糖電泳回收片段，與經(jīng)過(guò)同樣酶切的載體pad5-e1-cmv-tetr-krab-tre3g-e1bpro載體進(jìn)行連接，經(jīng)過(guò)連接轉(zhuǎn)化后獲得的陽(yáng)性克隆命名為pad5-e1-cmv-tetr-krab-tre3g-e1bpro-δ55kd。該載體中，腺病毒e1a基因的表達(dá)由含四環(huán)素反應(yīng)元件的啟動(dòng)子tre3g-e1bpro控制。該載體結(jié)構(gòu)圖如圖1所示。4、構(gòu)建病毒復(fù)制受tetr-krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型tet-on系統(tǒng)調(diào)控的腺病毒載體采用磷酸鈣法將pacⅰ線(xiàn)性化的病毒復(fù)制受tetr-krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型tet-on調(diào)控的腺病毒e1區(qū)穿梭載體pad5-e1-cmv-tetr-krab-tre3g-e1bpro-δ55kd與經(jīng)pacⅰ線(xiàn)性化的腺病毒骨架padeasy-1(購(gòu)自addgene公司)按摩爾比3:1共轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞系。經(jīng)過(guò)7～10天后，可見(jiàn)明顯的細(xì)胞病變(cytopathiceffect，cpe)，然后經(jīng)過(guò)離心收獲病毒原液，經(jīng)過(guò)2～3輪的病毒擴(kuò)增后，進(jìn)一步將所獲得的病毒原液感染10個(gè)150mm的細(xì)胞培養(yǎng)平皿，從而擴(kuò)增獲得足夠量的病毒原液用于后續(xù)的進(jìn)一步純化。感染病毒的細(xì)胞經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融3次(37℃水浴鍋和酒精干冰中返去切換)后經(jīng)3500rpm離心15分鐘，通過(guò)兩次氯化銫密度梯度超速離心，獲得純化的病毒復(fù)制受tetr-krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型tet-on系統(tǒng)調(diào)控的腺病毒載體，命名為ad5-cmv-tetr-krab-tre3g-e1bpro-δ55kd。用微量分光光度計(jì)(nanodrop)，測(cè)樣品260nm吸光值，再根據(jù)公式：病毒滴度(vp/ml)＝a260nm×1.1×1012。24孔板培養(yǎng)hek293細(xì)胞至每孔細(xì)胞數(shù)約2×104個(gè)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％dmem培養(yǎng)基將病毒液稀釋成7個(gè)濃度(10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9)，每個(gè)濃度重復(fù)3個(gè)，每孔加入病毒稀釋液400μl。另留不加病毒液的孔作為陰性對(duì)照。37℃下，培養(yǎng)箱培養(yǎng)5-7天，每天觀察細(xì)胞，記數(shù)每孔出現(xiàn)cpe的個(gè)數(shù)。在病毒液稀釋梯度為1×10-9條件下，計(jì)算病毒活力(iu/ml)＝cpe個(gè)數(shù)×2.5×109。計(jì)算病毒的滴度/活力。構(gòu)建并包裝獲得的腺病毒載體的滴度和活力測(cè)定如下：實(shí)施例2：病毒復(fù)制受tetr-krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型tet-on系統(tǒng)調(diào)控的條件復(fù)制型腺病毒載體感染人宮頸癌hela細(xì)胞后的復(fù)制調(diào)控本實(shí)施例構(gòu)建的病毒復(fù)制受tetr-krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型tet-on系統(tǒng)調(diào)控的條件復(fù)制型腺病毒載體與實(shí)施例1中的相同。其方法步驟如下：該實(shí)施例方法步驟1-4與實(shí)施例1完全相同。5、病毒復(fù)制受tetr-krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型tet-on系統(tǒng)調(diào)控的條件復(fù)制型腺病毒載體感染hela細(xì)胞hela細(xì)胞，經(jīng)過(guò)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％胰酶消化后，按5×104/孔平鋪于24孔板，并加入600μl含10％ncs的dmem培養(yǎng)過(guò)夜。隔日進(jìn)行感染，病毒ad5-cmv-tetr-krab-tre3g-e1bpro-δ55kd以感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection，moi)為1的條件感染細(xì)胞，根據(jù)病毒的活力單位進(jìn)行計(jì)算，將病毒原液按比例稀釋到濃度為5×104iu/ml，之后將細(xì)胞的培養(yǎng)基更換為含有病毒的培養(yǎng)基，體積為1ml。4小時(shí)后，再次更換為正常培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分為兩組，一組加入終濃度為2μg/ml的dox，另一組則不加入dox，每組分別設(shè)3個(gè)重復(fù)。6、細(xì)胞基因組的提取感染后的細(xì)胞分別于感染后4小時(shí)，24小時(shí)，48小時(shí)收取細(xì)胞，并使用tianampblooddnakit，tiangenbiotech試劑盒，提取細(xì)胞基因組。具體操作如下：(1)取出細(xì)胞培養(yǎng)皿，輕輕倒去培養(yǎng)基，并用槍頭洗干凈剩余液體。使用0.01m的pbs溶液沖洗貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移至一支無(wú)菌的1.5ml的ep管中。(2)13200rpm離心1分鐘后，棄去上清，加入1ml0.01m的pbs，重懸沉淀，再次離心1分鐘。(3)重復(fù)以上步驟后，棄去上清，再加入200μl的gs溶液，重懸沉淀。(4)加入40μl濃度為10mg/ml的rnase，劇烈震蕩15秒，在室溫下靜置10分鐘。(5)先后加入20μl的蛋白酶k以及200μl的gb溶液，混勻。在56℃下放置約10分鐘，其間顛倒混勻數(shù)次，讓其充分反應(yīng)至溶液清亮為止。(6)加入200μl乙醇，混勻后將溶液轉(zhuǎn)移到吸附柱，13200rpm離心30秒。棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。(7)向吸附柱中加入500μl的緩沖液gd，13200rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液后將吸附柱放回收集管中。(8)向吸附柱中加入600μl的漂洗液pw，13200rpm離心30秒，倒掉收集管中廢液，將吸附柱放入收集管中。重復(fù)該操作步驟一次。(9)將吸附柱放回收集管中，13200rpm離心2分鐘，棄廢液。將吸附柱置于室溫放置5分鐘，直至晾干吸附柱中的殘余漂洗液。(10)將吸附柱轉(zhuǎn)入1.5ml的ep管中，向吸附膜加入100μl去離子水，室溫放置2～5分鐘，13200rpm離心2分鐘，將離心后溶液收集到ep管中。7、real-timepcr測(cè)定病毒基因組復(fù)制倍數(shù)以感染病毒后的+dox組和-dox組細(xì)胞提取的基因組dna作為模板，對(duì)病毒基因組e4的擴(kuò)增倍數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，使用hgapdh作為內(nèi)參基因。以病毒感染4小時(shí)收取的細(xì)胞作為起始時(shí)間點(diǎn)，以此時(shí)間點(diǎn)為每組的對(duì)照，測(cè)定病毒感染后不同時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞內(nèi)病毒基因組的復(fù)制倍數(shù)。所用的引物如下：e4引物p3：catgcgccgctgccctgatap4：ttcccgctcctcccgtgtgthgapdh引物p5：gcaccgtcaaggctgagaacp6：tggtgaagacgccagtggareal-timepcr反應(yīng)體系：e4反應(yīng)體系dw8.7μlp3(20μm)0.4μlp4(20μm)0.4μldna模板0.5μl2×sybrpremixextaqii10μl總體積20μlhgapdh反應(yīng)體系dw8.7μlp5(20μm)0.4μlp6(20μm)0.4μldna模板0.5μl2×sybrpremixextaqii10μl總體積20μlreal-timepcr反應(yīng)程序：病毒基因組復(fù)制的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3，結(jié)果顯示，本實(shí)施例中的病毒復(fù)制受tetr-krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型tet-on系統(tǒng)調(diào)控的條件復(fù)制型腺病毒ad5-cmv-tetr-krab-tre3g-e1bpro-δ55kd在感染hela細(xì)胞后，其復(fù)制受到dox的調(diào)控。加入dox組別中，病毒復(fù)制明顯，而不加入dox的組別中，病毒基因組復(fù)制微弱。說(shuō)明該腺病毒的復(fù)制能有效被dox藥物控制。實(shí)施例3：病毒復(fù)制受tetr-krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型tet-on系統(tǒng)調(diào)控的條件復(fù)制型腺病毒載體感染人惡性腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞u87mg后的復(fù)制調(diào)控本實(shí)施例構(gòu)建的病毒復(fù)制受tetr-krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型tet-on系統(tǒng)調(diào)控的條件復(fù)制型腺病毒載體與實(shí)施例1中的相同。其方法步驟如下：該實(shí)施例方法步驟1-4與實(shí)施例1完全相同。其方法步驟5-7中的使用的細(xì)胞由實(shí)施例2中的hela細(xì)胞替換為u87mg細(xì)胞，其余方法與實(shí)施例2相同。病毒基因組復(fù)制的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4，結(jié)果顯示，本實(shí)施例中的病毒復(fù)制受tetr-krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型tet-on系統(tǒng)調(diào)控的條件復(fù)制型腺病毒ad5-cmv-tetr-krab-tre3g-e1bpro-δ55kd在感染u87mg細(xì)胞后，其復(fù)制受到dox的調(diào)控。加入dox組別中，病毒復(fù)制明顯，而不加入dox的組別中，病毒基因組復(fù)制微弱。說(shuō)明該腺病毒的復(fù)制能有效被dox藥物控制。實(shí)施例4：病毒復(fù)制受tetr-krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型tet-on系統(tǒng)調(diào)控的條件復(fù)制型腺病毒載體感染人乳腺癌細(xì)胞mda-mb-231后的復(fù)制調(diào)控本實(shí)施例構(gòu)建的病毒復(fù)制受tetr-krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型tet-on系統(tǒng)調(diào)控的條件復(fù)制型腺病毒載體與實(shí)施例1中的相同。其方法步驟如下：該實(shí)施例方法步驟1-4與實(shí)施例1完全相同。其方法步驟5-7中的使用的細(xì)胞由實(shí)施例2中的hela細(xì)胞替換為mda-mb-231細(xì)胞，其余方法與實(shí)施例2相同。病毒基因組復(fù)制的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5，結(jié)果顯示，本實(shí)施例中的病毒復(fù)制受tetr-krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型tet-on調(diào)控的條件復(fù)制型腺病毒ad5-cmv-tetr-krab-tre3g-e1bpro-δ55kd在感染mda-mb-231細(xì)胞后，其復(fù)制受到dox的調(diào)控。加入dox組別中，病毒復(fù)制明顯，而不加入dox的組別中，病毒基因組復(fù)制微弱。說(shuō)明該腺病毒的復(fù)制能有效被dox藥物控制。實(shí)施例5：病毒復(fù)制受tetr-krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型tet-on系統(tǒng)調(diào)控的條件復(fù)制型腺病毒載體感染hmsc細(xì)胞后的復(fù)制調(diào)控本實(shí)施例構(gòu)建的病毒復(fù)制受tetr-krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型tet-on調(diào)控的條件復(fù)制型腺病毒載體與實(shí)施例1中的相同。其方法步驟如下：該實(shí)施例方法步驟1-4與實(shí)施例1完全相同。步驟5：病毒復(fù)制受tetr-krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型tet-on系統(tǒng)調(diào)控的條件復(fù)制型腺病毒載體感染hmsc細(xì)胞hmsc細(xì)胞，經(jīng)過(guò)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05％的胰酶消化后，按1×104/孔平鋪于24孔板，并加入600μl含10％ncs的oricelltm成人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜。隔日進(jìn)行感染，病毒ad5-cmv-tetr-krab-tre3g-e1bpro-δ55kd在1moi和10moi兩種條件下感染細(xì)胞，根據(jù)病毒的活力單位進(jìn)行計(jì)算，將病毒原液分別稀釋到濃度為1×104iu/ml和1×105iu/ml，之后將細(xì)胞的培養(yǎng)基分別更換為含有不同濃度病毒的oricelltm成人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基，體積為1ml。4小時(shí)后，再次更換為正常oricelltm成人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基。1moi條件下，實(shí)驗(yàn)分為兩組，一組加入終濃度為2μg/ml的dox，另一組則不加入dox，每組分別設(shè)3個(gè)重復(fù)。10moi條件下，實(shí)驗(yàn)也分為兩組，一組加入終濃度為2μg/ml的dox，另一組則不加入dox，每組分別設(shè)3個(gè)重復(fù)。該實(shí)施例方法步驟6-7中的使用的細(xì)胞由實(shí)施例2中的hela細(xì)胞替換為hmsc細(xì)胞，其余方法與實(shí)施例2相同。病毒基因組復(fù)制的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6，結(jié)果顯示，本實(shí)施例中的病毒復(fù)制受tetr-krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型tet-on系統(tǒng)調(diào)控的條件復(fù)制型腺病毒ad5-cmv-tetr-krab-tre3g-e1bpro-δ55kd在1moi和10moi兩種條件下感染hmsc細(xì)胞后，其復(fù)制均受到dox的調(diào)控。加入dox組別中，病毒復(fù)制明顯，而不加入dox的組別中，病毒基因組復(fù)制微弱。說(shuō)明該腺病毒的復(fù)制能有效被dox藥物控制。實(shí)施例6：病毒復(fù)制受tetr-krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型tet-on系統(tǒng)調(diào)控的條件復(fù)制型腺病毒對(duì)人乳腺癌細(xì)胞mda-mb-231的增殖抑制作用檢測(cè)本實(shí)施例構(gòu)建的病毒復(fù)制受tetr-krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型tet-on系統(tǒng)調(diào)控的條件復(fù)制型腺病毒載體與實(shí)施例1中的相同。其方法步驟如下：該實(shí)施例方法步驟1-4與實(shí)施例1完全相同。步驟5：mtt法檢測(cè)腺病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制效果mtt法為常用的檢測(cè)細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)方法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人乳腺癌mda-mb-231細(xì)胞系，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的胰酶消化后接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為5×103，培養(yǎng)基體積為200μl。然后使用1moi、10moi、100moi三種梯度的ad5-cmv-tetr-krab-tre3g-e1bpro-δ55kd病毒感染mda-mb-231細(xì)胞，并分別進(jìn)行加入dox和不加入dox處理，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。使用e1b區(qū)55kd缺失的腺病毒ad5e1bδ55kd(onyx-015)作為陽(yáng)性對(duì)照，感染設(shè)置與病毒ad5-cmv-tetr-krab-tre3g-e1bpro-δ55kd相同。以1×pbs處理組作為陰性對(duì)照。感染48小時(shí)后檢測(cè)以上病毒對(duì)mda-mb-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。每孔加入5g/l的mtt20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。然后移除培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜(dmso)150μl，于培養(yǎng)箱中37℃作用10分鐘。用移液器輕輕將每孔液體吹打均勻，酶標(biāo)儀570nm和630nm處測(cè)得吸光值，使用a570nm減去a630nm的值作為每孔吸光值。取各孔光吸收值，將所得結(jié)果用spss22.0軟件的單因素方差分析功能進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較各組間差異。ad5-cmv-tetr-krab-tre3g-e1bpro-δ55kd病毒對(duì)mda-mb-231細(xì)胞的增殖抑制效果見(jiàn)圖7。結(jié)果顯示，復(fù)制受調(diào)控的病毒ad5-cmv-tetr-krab-tre3g-e1bpro-δ55kd感染細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞的增殖抑制可受藥物調(diào)控，其中100moi條件下的感染最為明顯。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析也顯示，dox存在與不存在的條件下，細(xì)胞增殖有顯著性差異。同時(shí)，復(fù)制不受調(diào)控的陽(yáng)性對(duì)照病毒ad5e1bδ55kd(onyx-015)感染細(xì)胞后也產(chǎn)生明顯的增殖抑制效果，但其增殖抑制效果受藥物調(diào)控不顯著。此結(jié)果也與實(shí)施例4中，病毒在mda-mb-231細(xì)胞中的復(fù)制結(jié)果相互驗(yàn)證，即調(diào)控病毒復(fù)制也同步調(diào)控了病毒對(duì)mda-mb-231細(xì)胞的增殖抑制。實(shí)施例7：病毒復(fù)制受tetr-krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型tet-on系統(tǒng)調(diào)控的條件復(fù)制型腺病毒感染hmsc后對(duì)細(xì)胞遷移活力的影響檢測(cè)本實(shí)施例構(gòu)建的病毒復(fù)制受tetr-krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型tet-on系統(tǒng)調(diào)控的條件復(fù)制型腺病毒載體與實(shí)施例1中的相同。其方法步驟如下：該實(shí)施例方法步驟1-4與實(shí)施例1完全相同。步驟5：transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)感染病毒的hmsc的遷移活力具體方法如下：(1)下層細(xì)胞準(zhǔn)備mda-mb-231細(xì)胞，經(jīng)過(guò)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的胰酶消化后，按5×104/孔平鋪于24孔板，并加入600μl含10％ncs的dmem，培養(yǎng)過(guò)夜。(2)上層細(xì)胞準(zhǔn)備hmsc細(xì)胞經(jīng)過(guò)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05％的胰酶消化后按1×104/孔平鋪于24孔板，并加入600μl含10％ncs的oricelltm成人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)夜。第二天，在每個(gè)孔中加入不同量的病毒ad5-cmv-tetr-krab-tre3g-e1bpro-δ55kd，使該病毒感染hmsc的moi分別為10、20、40、60、80、100。4小時(shí)后，更換為600μl含10％ncs的oricelltm成人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基。(3)traswell實(shí)驗(yàn)感染病毒，并更換過(guò)培養(yǎng)基的hmsc細(xì)胞經(jīng)過(guò)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05％的胰酶消化后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，配置成1×105cell/ml的細(xì)胞懸液，按每個(gè)上層小室內(nèi)滴加200μl的細(xì)胞懸液，使每個(gè)上層小室的hmsc細(xì)胞數(shù)量為1×104。根據(jù)實(shí)驗(yàn)組別的設(shè)置，在需要加入dox組的上下層培養(yǎng)基中均加入終濃度為2μg/ml的dox。(4)trasnwell實(shí)驗(yàn)的結(jié)果檢測(cè)72小時(shí)后，將各組上層小室取出，移除培養(yǎng)基，使用棉簽清除小室膜上表面的未遷移透過(guò)膜的細(xì)胞。然后將小室放置于超凈工作臺(tái)中，室溫干燥30分鐘。待小室干燥徹底后，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的結(jié)晶紫溶液進(jìn)行染色，37℃，30分鐘。染色完畢后，使用超純水和振蕩器對(duì)染色后的小室進(jìn)行洗滌，去除所有殘余在小室膜上下表面的結(jié)晶紫染料。室溫干燥后，在彩色顯微鏡下進(jìn)行拍照。(5)transwell實(shí)驗(yàn)的遷移率計(jì)算每個(gè)視野的照片實(shí)際面積s測(cè)＝3.156mm2，而小室膜面積s總＝30mm2，所以s總/s測(cè)＝30/3.156＝9.5。不同moi組的hmsc細(xì)胞在照片下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個(gè)小室至少進(jìn)行3個(gè)視野的拍攝，每組單個(gè)視野計(jì)數(shù)獲得的細(xì)胞數(shù)的平均值乘以9.5，計(jì)算得到該遷移穿過(guò)該小室的細(xì)胞總數(shù)。用遷移穿過(guò)膜的細(xì)胞除以接種的細(xì)胞總量得出遷移率，遷移率＝遷移細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)共重復(fù)三次。將所得結(jié)果用spss22.0軟件的單因素方差分析功能進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較各組間差異。發(fā)明人將遷移細(xì)胞進(jìn)行了計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8。無(wú)dox條件下，10，20，40，60，80，100moi病毒感染細(xì)胞后，遷移率分別為86.16％，81.19％，63.99％，62.38％，63.71％和64.38％。而加入dox條件下，遷移率分別為60.8％，35.18％，19.69％，15.07％，10.86％和8.14％。dox的存在與否，對(duì)細(xì)胞遷移率有很明顯的影響，說(shuō)明該病毒在hmsc中的復(fù)制能被dox調(diào)控。通過(guò)調(diào)控系統(tǒng)關(guān)閉病毒復(fù)制，可以在保持hmsc遷移能力的情況下，耐受更高moi的病毒感染，而不影響其遷移能力。在不加dox時(shí)，100moi病毒感染后的細(xì)胞的遷移率為64.38％，這與加入dox條件下10moi病毒感染后的細(xì)胞遷移率60.8％幾乎相等。由此可以得出結(jié)論，利用tetr-krab介導(dǎo)的tet-on調(diào)控可以控制病毒的復(fù)制，在保證hmsc具有相同遷移能力的情況下，可以將hmsc的病毒裝載量提升一個(gè)數(shù)量級(jí)。核苷酸或氨基酸序列表<110>陜西師范大學(xué)<120>病毒復(fù)制受krab介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制型tet-on系統(tǒng)調(diào)控的條件復(fù)制腺病毒載體及應(yīng)用<160><210>1<211>344<212>dna<213>含四環(huán)素反應(yīng)元件的啟動(dòng)子tre3g-e1bpro的序列<220><400>1ctcgagttactccctatcagtgatagagaacgtatgaagagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgcagactttactccctatcagtgatagagaacgtataaggagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgaccagtttactccctatcagtgatagagaacgtatctacagtttactccctatcagtgatagagaacgtatatccagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgtcgaggtaggcatcgatgctagcggggggctataaaagggggtgggggcgttcgtcctcactctagatctctcgatcgagaagcttgaattc<210>2<211>1685<212>dna<213>腺病毒e1a翻譯起始位點(diǎn)至腺病毒e1b19kd蛋白終止密碼子基因片段<220><400>2atgagacatattatctgccacggaggtgttattaccgaagaaatggccgccagtcttttggaccagctgatcgaagaggtactggctgataatcttccacctcctagccattttgaaccacctacccttcacgaactgtatgatttagacgtgacggcccccgaagatcccaacgaggaggcggtttcgcagatttttcccgactctgtaatgttggcggtgcaggaagggattgacttactcacttttccgccggcgcccggttctccggagccgcctcacctttcccggcagcccgagcagccggagcagagagccttgggtccggtttctatgccaaaccttgtaccggaggtgatcgatcttacctgccacgaggctggctttccacccagtgacgacgaggatgaagagggtgaggagtttgtgttagattatgtggagcaccccgggcacggttgcaggtcttgtcattatcaccggaggaatacgggggacccagatattatgtgttcgctttgctatatgaggacctgtggcatgtttgtctacagtaagtgaaaattatgggcagtgggtgatagagtggtgggtttggtgtggtaattttttttttaatttttacagttttgtggtttaaagaattttgtattgtgatttttttaaaaggtcctgtgtctgaacctgagcctgagcccgagccagaaccggagcctgcaagacctacccgccgtcctaaaatggcgcctgctatcctgagacgcccgacatcacctgtgtctagagaatgcaatagtagtacggatagctgtgactccggtccttctaacacacctcctgagatacacccggtggtcccgctgtgccccattaaaccagttgccgtgagagttggtgggcgtcgccaggctgtggaatgtatcgaggacttgcttaacgagcctgggcaacctttggacttgagctgtaaacgccccaggccataaggtgtaaacctgtgattgcgtgtgtggttaacgcctttgtttgctgaatgagttgatgtaagtttaataaagggtgagataatgtttaacttgcatggcgtgttaaatggggcggggcttaaagggtatataatgcgccgtgggctaatcttggttacatctgacctcatggaggcttgggagtgtttggaagatttttctgctgtgcgtaacttgctggaacagagctctaacagtacctcttggttttggaggtttctgtggggctcatcccaggcaaagttagtctgcagaattaaggaggattacaagtgggaatttgaagagcttttgaaatcctgtggtgagctgtttgattctttgaatctgggtcaccaggcgcttttccaagagaaggtcatcaagactttggatttttccacaccggggcgcgctgcggctgctgttgcttttttgagttttataaaggataaatggagcgaagaaacccatctgagcggggggtacctgctggattttctggccatgcatctgtggagagcggttgtgagacacaagaatcgcctgctactgttgtcttccgtccgcccggcgataataccgacggaggagcagcagcagcagcaggaggaagccaggcggcggcggcaggagcagagcccatggaacccgagagccggcctggaccctcgggaatga<210>3<211>25<212>dna<213>正向引物p1<220><400>3cgaattcatgagacatattatctgc<210>4<211>25<212>dna<213>反向引物p2<220><400>4cactagttcattcccgagggtccag<210>5<211>20<212>dna<213>e4引物p3<220><400>5catgcgccgctgccctgata<210>6<211>20<212>dna<213>e4引物p4<220><400>6ttcccgctcctcccgtgtgt<210>7<211>20<212>dna<213>hgapdh引物p5<220><400>7gcaccgtcaaggctgagaac<210>8<211>19<212>dna<213>hgapdh引物p6<220><400>8tggtgaagacgccagtgga當(dāng)前第1頁(yè)12