本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及熱帶無爪螨重組變應原blot5-21、其制備方法及過敏小鼠模型的建立。

背景技術：

塵螨是支氣管哮喘發(fā)生的重要誘因之一，對塵螨敏感的人口比例高達10％，而在過敏性哮喘病人中，這個比例超過90％。塵螨中最主要的三種是粉塵螨(dermatophagoidesfarinae,derf)、屋塵螨(dermatophagoidespteronyssinus,derp)和熱帶無爪螨(blomiatropicalis,blot)。在熱帶和亞熱帶地區(qū)熱帶無爪螨是主要的螨種。

熱帶無爪螨，又稱熱帶無爪螨，或熱帶螨，其分泌物、排泄物、蟲卵等均能引起嚴重的過敏性哮喘、鼻炎等疾病。近年來，從熱帶無爪螨中至少分離出25種分子量大小在11～85kda的ige結合蛋白，已正式命名的有blot1、blot3、blot4、blot5、blot6、blot7、blot10、blot11、blot12、blot13、blot19和blot21等12種，其中分子量為11～14kda和16kda的成分是臨床上重要的變應原。

研究表明，blot5和blot21是熱帶無爪螨的的主要變應原。blot5由熱帶無爪螨的腸上皮細胞分泌，主要存在于其腸壁和排泄物顆粒中。blot5是熱帶無爪螨的最重要的致敏成分，在對熱帶無爪螨敏感的人群調查中發(fā)現有40～60％的人的體內發(fā)現了blot5特異性的ige。blot21主要存在于b.t螨的腸的內容物中，blot21由129個氨基酸組成，與blot5有39％的序列一致性，其二級結構是α螺旋。大多數的過敏患者(>75％)能同時對blot5和blot21過敏，研究發(fā)現這兩種抗原之間有中度的交叉反應性。

粗提螨浸液成分復雜，含有多種變應原和非變應原，處理不當可能含有內毒素，很難做到真正的標準化生產，同時其安全使用也受到了限制，而應用重組蛋白技術就可以解決這個問題。

技術實現要素：

為解決以上技術問題，本發(fā)明采取的技術方案如下：

熱帶無爪螨重組變應原blot5-21，該重組變應原通過下述方法制得：

(1)將熱帶無爪螨blot5基因序列和blot21基因序列融合在一起后進行密碼子優(yōu)化，然后進行全基因合成；

(2)將blot5-21基因序列連接至原核表達載體上，構建重組質粒；

(3)將重組質粒轉入宿主細胞中，挑取單菌落至含有卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，振搖8～24h，轉接培養(yǎng)至od600nm＝0.5～0.7，然后加入iptg誘導，收集菌體，破碎菌體，取上清，進行重組蛋白的純化，得到純化后的rblot5-21蛋白。

優(yōu)選的，所述步驟(2)中，所述的原核表達載體為pqe-80l，所述重組質粒為pqe80l-blot5-21。

優(yōu)選的，所述步驟(3)為：將重組質粒pqe80l-blot5-21轉入大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細胞中，挑取單菌落至10ml～50ml含有卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，振搖8～24h，轉接培養(yǎng)至od600nm＝0.5～0.7，然后加入iptg，收集菌體，破碎菌體，取上清，進行重組蛋白的純化，得到純化后的rblot5-21蛋白。

優(yōu)選的，所述步驟(3)中：iptg誘導的條件為：iptg濃度為0.1～1mmol/l、在37℃條件下進行誘導4～6h。

優(yōu)選的，所述步驟(3)中的純化過程為利用鎳柱進行重組蛋白的純化。

優(yōu)選的，所述步驟(3)中，純化方法為：先用10～15mmol/l咪唑緩沖液平衡鎳柱，然后將超聲破碎離心后的上清液加入鎳柱里；接著利用40～50mmol/l咪唑緩沖液漂洗鎳柱，洗脫掉結合不牢固的雜蛋白；最后利用250～300mmol/l咪唑緩沖液洗脫目的蛋白。

所述熱帶無爪螨重組變應原blot5-21在制備治療熱帶無爪螨過敏性疾病的制劑中應用。

所述熱帶無爪螨重組變應原blot5-21可用于替代熱帶無爪螨的粗提總變應原混合物。

熱帶無爪螨過敏小鼠模型，通過下述方法建立：

將純化的rblot5-21蛋白作為過敏抗原與氫氧化鋁凝膠佐劑混合，小鼠腹腔注射rblot5-21/氫氧化鋁的復合物，然后利用rblot5-21經過氣管注入小鼠的肺組織，進行過敏模型的誘導。

優(yōu)選的，所述的過敏小鼠模型，通過下述方法建立：

將1～10mgrblot5-21蛋白作為過敏抗原與50～500mg氫氧化鋁凝膠佐劑混合，室溫條件下震蕩混合2～6小時，每只小鼠腹腔注射100～200μlrblot5-21/氫氧化鋁的復合物，然后利用100～300μgrblot5-21經過氣管注入小鼠的肺組織，進行過敏模型的誘導。

與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明制備純化出具有天然免疫活性的重組熱帶無爪螨變應原blot5-21，該重組變應原有周期短、成本低等優(yōu)點，以可溶蛋白形式表達，表達量高，且通過鎳柱親和層析就可以得到純度較高的重組變應原blot5-21蛋白，實現熱帶無爪螨變應原的標準化，可作為對熱帶無爪螨過敏患者進行診斷和特異性免疫治療的候選分子。

本發(fā)明利用純化后的rblot5-21蛋白對balb/c小鼠進行過敏模型的誘導，建立小鼠過敏模型，為熱帶螨過敏的診斷與治療打下基礎，尤其為研究熱帶螨過敏的預防與治療性疫苗或者藥物提供了動物模型，同時，熱帶無爪螨與其他的塵螨之間存在一定的交叉反應性，因而本實驗也為熱帶無爪螨與其他過敏原的交叉致敏反應的研究奠定了基礎。

附圖說明

圖1：blot5基因和blot21基因融合重組質粒載體示意圖。

圖2：重組質粒非誘導菌體、誘導菌體表達產物的sds-page電泳圖。

圖中，泳道1為預染蛋白分子質量標準(fermentas,sm0441)；泳道2為pqe80l-blot5未誘導菌體表達產物；泳道3為pqe80l-blot5誘導菌體表達產物；泳道4為pqe80l-blot21未誘導菌體表達產物；泳道5為pqe80l-blot21誘導菌體表達產物；泳道6為pqe80l-blot5-21未誘導菌體表達產物；泳道7為pqe80l-blot5-21誘導菌體表達產物。

圖3：重組質粒pqe80l-blot5非誘導菌體表達產物、誘導菌體表達產物、誘導菌體上清液及產物經鎳柱純化后的sds-page電泳圖。

圖中，泳道1為預染蛋白分子質量標準(fermentas,sm0441)；泳道2為pqe80l-blot5未誘導菌體表達產物；泳道3為pqe80l-blot5誘導菌體表達產物；泳道4為pqe80l-blot5誘導菌體超聲破碎上清溶液；泳道5～9為鎳柱純化rblot5蛋白。

圖4：重組質粒pqe80l-blot21非誘導菌體表達產物、誘導菌體表達產物、誘導菌體上清液及產物經鎳柱純化后的sds-page電泳圖

圖中，泳道1為預染蛋白分子質量標準(fermentas,sm0441)；泳道2為pqe80l-blot21未誘導菌體表達產物；泳道3為pqe80l-blot21誘導菌體表達產物；泳道4為pqe80l-blot21誘導菌體超聲破碎上清溶液；泳道5～9為鎳柱純化rblot21蛋白。

圖5：重組質粒pqe80l-blot5-21非誘導菌體表達產物、誘導菌體表達產物、誘導菌體上清液及產物經鎳柱純化后的sds-page電泳圖。

圖中，泳道1為預染蛋白分子質量標準(fermentas,sm0441)；泳道2為pqe80l-blot5-21未誘導菌體表達產物；泳道3為pqe80l-blot5-21誘導菌體表達產物；泳道4為pqe80l-blot5-21誘導菌體超聲破碎上清溶液；泳道5～9為鎳柱純化rblot5-21蛋白。

圖6：westernblotting法檢測純化的rblot5和rblot5-21蛋白。

圖中：m為預染蛋白分子質量標準(neb,p7708)；1為純化rblot5-21蛋白；2為純化rblot5蛋白。

圖7：小鼠血清總ige水平的檢測結果統(tǒng)計圖。

圖8：小鼠體溫變化趨勢圖。

圖9：體溫變化曲線面積圖。

圖10：小鼠肺部組織h&e染色結果圖。

圖11：小鼠肺部組織切片細胞浸潤的嚴重程度打分統(tǒng)計圖。

具體實施方式

為了更好理解本發(fā)明技術內容，下面提供具體實施例，并結合附圖對本發(fā)明做進一步的說明。

實施例1：

熱帶無爪螨重組變應原blot5-21，該重組變應原通過下述方法制得：

(1)將熱帶螨blot5基因序列(genbank：u59102)和blot21基因序列(genbank：dq788677.1)融合在一起后進行密碼子優(yōu)化，以達到在大腸桿菌中更好的表達，在優(yōu)化后的序列兩端分別加入bamhⅰ和salⅰ限制性內切酶的酶切位點，由上海生工生物工程技術服務有限公司進行全基因合成；

(2)將blot5-21基因序列連接至原核表達載體pqe-80l上，構建pqe80l-blot5-21重組質粒(重組質粒載體示意圖見圖1)；

(3)將重組質粒pqe80l-blot5-21轉入大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細胞中，挑取單菌落至10ml含有卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振搖8h，按1:100轉接培養(yǎng)至od600nm＝0.7，然后利用iptg1mmol/l、37℃誘導4h擴大誘導的菌液量，收集菌體，超聲破碎菌體，離心取上清，利用鎳柱進行重組蛋白的純化。純化方法為：先用1倍柱體積的10mmol/l咪唑緩沖液(50mmol/lnah2po4、300mmol/lnacl、10mmol/l咪唑)平衡鎳柱，然后將超聲破碎離心后的上清液加入鎳柱里，此步優(yōu)選重復一次；接著利用3倍柱體積的50mmol/l咪唑緩沖液(50mmol/lnah2po4、300mmol/lnacl、50mmol/l咪唑)漂洗鎳柱，洗脫掉結合不牢固的雜蛋白；最后利用250mmol/l咪唑緩沖液(50mmol/lnah2po4、300mmol/lnacl、250mmol/l咪唑)洗脫目的蛋白，每2ml洗脫目的蛋白的流出液儲存在一個ep管內，當2ml洗脫液進行洗脫結束后再加入下一個2ml洗脫液。

實施例2：

熱帶無爪螨重組變應原blot5-21，該重組變應原通過下述方法制得：

(1)將熱帶螨blot5基因序列(genbank:u59102)和blot21基因序列(genbank：dq788677.1)融合在一起后進行密碼子優(yōu)化，以達到在大腸桿菌中更好的表達，在優(yōu)化后的序列兩端分別加入bamhⅰ和salⅰ限制性內切酶的酶切位點，由上海生工生物工程技術服務有限公司進行全基因合成；

(2)將blot5-21基因序列連接至原核表達載體pqe-80l上，構建pqe80l-blot5-21重組質粒(重組質粒載體示意圖見圖1)；

(3)將重組質粒pqe80l-blot5-21轉入大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細胞中，挑取單菌落至10ml含有卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，37℃、300r/min振搖24h，按1:300轉接培養(yǎng)至od600nm＝0.5，利用iptg0.1mmol/l、37℃誘導6h擴大誘導的菌液量，收集菌體，超聲破碎菌體，離心取上清，利用鎳柱進行重組蛋白的純化。純化方法為：先用1倍柱體積的15mmol/l咪唑緩沖液(50mmol/lnah2po4、300mmol/lnacl、15mmol/l咪唑)平衡鎳柱，然后將超聲破碎離心后的上清液加入鎳柱里，此步優(yōu)選重復一次；接著利用3倍柱體積的40mmol/l咪唑緩沖液(50mmol/lnah2po4、300mmol/lnacl、40mmol/l咪唑)漂洗鎳柱，洗脫掉結合不牢固的雜蛋白；最后利用300mmol/l咪唑緩沖液(50mmol/lnah2po4、300mmol/lnacl、300mmol/l咪唑)洗脫目的蛋白，每2ml洗脫目的蛋白的流出液儲存在一個ep管內，當2ml洗脫液進行洗脫結束后再加入下一個2ml洗脫液。

實施例3：

熱帶無爪螨過敏小鼠模型，通過下述方法建立：

將1mgrblot5-21蛋白作為過敏抗原與50mg氫氧化鋁凝膠佐劑混合，室溫條件下震蕩混合2小時，小鼠腹腔注射100μlrblot5-21/氫氧化鋁的復合物，然后利用100μgrblot5-21經過氣管注入小鼠的肺組織，進行過敏模型的誘導。

實施例4：

熱帶無爪螨過敏小鼠模型，通過下述方法建立：

將10mgrblot5-21蛋白作為過敏抗原與500mg氫氧化鋁凝膠佐劑混合，室溫條件下震蕩混合6小時，每只小鼠腹腔注射200μlrblot5-21/氫氧化鋁的復合物，然后利用300μgrblot5-21經過氣管注入小鼠的肺組織，進行過敏模型的誘導。

實驗例1：重組蛋白的原核表達和可溶性表達分析

1)根據實施例1中步驟(2)的方法，分別構建pqe80l-blot5、pqe80l-blot21和pqe80l-blot5-21重組質粒；

2)上述重組質粒構建成功并測序正確后，分別轉入大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細胞中，挑取單菌落至10ml含有卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振搖12h，按1:100轉接培養(yǎng)至od600nm＝0.7。取出部分菌液作為非誘導對照，然后加入iptg至終濃度為1mmol/l，37℃誘導6h收樣，進行sds-page電泳檢測(實驗結果見圖2)。

結果顯示：與非誘導對照相比，經iptg誘導后，重組blot5、重組blot21和重組blot5-21蛋白均呈較好表達。

實驗例2：重組蛋白的可溶性表達分析和純化

取實驗例1中的誘導菌液，收集菌體，超聲破碎菌體，離心取上清進行sds-page電泳檢測(結果見圖3至圖5)，利用鎳柱進行重組蛋白的純化。純化方法為：先用1倍柱體積的10mmol/l咪唑緩沖液(50mmol/lnah2po4、300mmol/lnacl、10mmol/l咪唑)平衡鎳柱，然后將超聲破碎離心后的上清液加入鎳柱里，此步優(yōu)選重復一次；接著利用3倍柱體積的50mmol/l咪唑緩沖液(50mmol/lnah2po4、300mmol/lnacl、50mmol/l咪唑)漂洗鎳柱，洗脫掉結合不牢固的雜蛋白；最后利用250mmol/l咪唑緩沖液(50mmol/lnah2po4、300mmol/lnacl、250mmol/l咪唑)洗脫目的蛋白，每2ml洗脫目的蛋白的流出液儲存在一個ep管內，當2ml洗脫液進行洗脫結束后再加入下一個2ml洗脫液，根據洗脫目的蛋白的順序，依次標記為e1～e5，將e1～e5進行電泳檢測(結果如圖3至圖5的泳道5～9)

結果顯示，rblot5-21蛋白幾乎全部在上清中存在(圖5的泳道4)，表明了rblot5-21蛋白在大腸桿菌內呈現很好的可溶性表達。上清液經過鎳柱親和層析純化后，在不同的洗脫管內，均有較純的rblot5-21蛋白(如圖5泳道5～9所示)。同樣rblot5和rblot21蛋白均有相同結果(如圖3、圖4所示)。

實驗例3：westernblotting法檢測純化rblot5-21蛋白

利用商品化biotin4d9antiblot5抗體(ma-4d9，indoorbiotechnologies)對純化后的rblot5-21蛋白和rblot5進行westernblotting檢測，方法如下：

將純化的rblot5-21蛋白和rblot5分別進行sds-page電泳，半干法轉膜，電壓25v，轉膜時間為30min；5％的脫脂奶37℃封閉2h，一抗(稀釋度：1:5000)室溫孵育1h，然后tbst漂洗5次，每次5min；二抗(稀釋度：1:5000，羊抗鼠igg-alexafluor488)室溫孵育1h，然后tbst漂洗5次，每次5min；typhoonfla9500熒光掃描成像系統(tǒng)進行檢測，激發(fā)光波長為488nm(實驗結果見圖6)。

結果顯示：在25kda和30kda之間，有明顯的陽性條帶，表明本發(fā)明純化的重組蛋白大小與rblot5-21一致。

實驗例4：重組blot5-21蛋白誘導小鼠過敏模型及檢測

將balb/c小鼠隨機分成4組：pbs組，rblot5組，rblot21組，rblot5-21組；每組6只小鼠。利用純化rblot5、rblot21、rblot5-21蛋白進行誘導小鼠過敏模型，pbs組則用等體積的pbs溶液代替，具體實驗方法如下：

1)將1mgrblot5-21蛋白(溶于pbs，濃度為1mg/ml)作為過敏抗原與50mg氫氧化鋁凝膠佐劑混合，室溫條件下震蕩混合2小時。第0、7天時，每只小鼠腹腔注射100μlrblot5-21/氫氧化鋁的復合物，第14、16、18和20天，利用100μgrblot5-21(溶于pbs，濃度為1mg/ml)經過氣管注入小鼠的肺組織，進行過敏模型的誘導。于第21天，眼眶靜脈采血；

2)elisa法檢測小鼠血清總ige水平：設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μl；待測樣本孔先加待測樣本10μl，再加樣本稀釋液40μl；隨后標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(hrp)標記的檢測抗體100μl，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次(也可用洗板機洗板)。每孔加入底物a、b各50μl，37℃避光孵育15min。每孔加入終止液50μl，15min內，在450nm波長處測定各孔的od值，根據od值計算小鼠血清總ige濃度(實驗結果見圖7)；

3)小鼠應激性過敏反應的檢測：小鼠尾靜脈注射rblot5-21變應原50μg,pbs組注射等體積的pbs溶液。每隔五分鐘記錄小鼠體溫。體溫變化曲線所圍成面積的統(tǒng)計分析采用one-wayanova，bonferroni’smultiplecomparisonposttests(*,p<0.05；**,p<0.005；***,p<0.0005)(實驗結果見圖8、圖9)；

4)小鼠肺部組織切片h&e染色：小鼠被麻醉處死，取小鼠的肺組織進行固定、包埋和切片，進行h&e(hematoxylinforevaluation)染色。肺部組織切片h&e染色的炎癥打分標準：以0-3分標準來評價支氣管周圍炎癥的程度。0分是指沒有炎癥細胞的侵潤；1分是指支氣管周圍偶爾出現炎癥細胞；2分則說明大多數支氣管包圍著1-5層炎癥細胞薄層；3分則代表了大多數支氣管周圍環(huán)繞著一厚層(超過5層細胞厚度)的炎癥細胞(實驗結果見圖10、圖11)。

實驗結果表明：

a.與pbs組相比，rblot5-21誘導組小鼠血清ige水平顯著上升(p<0.005)，rblot5-21誘導后的小鼠呈現出明顯的過敏癥狀；

b.與pbs組相比，rblot5-21誘導組小鼠的體溫下降明顯，約20min左右，體溫下降達到最低，約下降3℃左右，隨后小鼠體溫又緩慢恢復，約90min左右，體溫恢復到低正常體溫1℃左右。對小鼠體溫變化曲線與y軸0.0處的虛線所圍成的面積進行統(tǒng)計，結果如圖9所示，與pbs組相比，rblot5-21誘導組顯著上升(p<0.0005)；

c.與pbs組相比，rblot5-21誘導組小鼠的肺部細胞侵潤顯著增多，呈顯著差異。

由上述結果可以看出，rblot5-21誘導后的小鼠血清ige上升，肺部組織細胞侵潤增加，小鼠的應激性過敏反應更加強烈和敏感，體溫下降明顯等，這表明了原核表達純化的rblot5-21具有很強的變應原性，能夠誘導小鼠呈現出過敏癥狀。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。