本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及病毒介導(dǎo)的基因沉默的vigs載體，特別涉及fomv介導(dǎo)的基因沉默的vigs載體。

背景技術(shù)：

病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus-inducedgenesilencing,vigs)是利用植物對rna病毒防御機(jī)制發(fā)展的技術(shù)。重組的植物病毒攜帶被侵染植物的基因序列并侵染植物，病毒侵染將誘發(fā)植物內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing，ptgs)，使植物內(nèi)源基因的rna被特異降解，從而誘導(dǎo)植物內(nèi)源基因沉默，引起表型變化，進(jìn)而根據(jù)表型變異研究目標(biāo)基因的功能。vigs技術(shù)不需要植物的遺傳轉(zhuǎn)化或獲取突變體，能簡單、快速、瞬時(shí)、高效、特異地下調(diào)特定基因的表達(dá)，vigs已成為植物基因功能研究領(lǐng)域的強(qiáng)大技術(shù)工具。vigs技術(shù)是既是反向遺傳學(xué)方法又是正向遺傳學(xué)方法對相關(guān)功能基因進(jìn)行研究。隨著vigs技術(shù)發(fā)展的不斷成熟和研究的不斷深入，該技術(shù)已經(jīng)廣泛的應(yīng)用在植物抗性、生長發(fā)育以及代謝調(diào)控等相關(guān)功能基因的研究鑒定，在植物性狀改良和植物保護(hù)等方面具有良好的發(fā)展及應(yīng)用前景。

vigs在基因功能研究方面具有突出的優(yōu)勢，眾多vigs載體的成功構(gòu)建及應(yīng)用極大地增加了用于vigs進(jìn)行基因功能分析的植物種類；但每個(gè)vigs載體病毒都有自身的寄主范圍，對于不同寄主的植物往往需要不同的病毒載體。盡管現(xiàn)在應(yīng)用vigs技術(shù)在雙子葉植物功能基因的研究方面發(fā)揮了重要的作用，然而針對單子葉植物尤其是重要的經(jīng)濟(jì)作物構(gòu)建適合的vigs系統(tǒng)則具有更實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。

目前單子葉植物功能基因組研究主要依賴于基因的自然突變、t-dna插入突變系及轉(zhuǎn)基因介導(dǎo)的rna沉默。雖然這些方法在研究中已取得了許多重要的結(jié)果，然而這些方法非常耗時(shí)；另外t-dna插入基因的數(shù)目有限，有興趣的基因常沒有插入突變體。采用vigs技術(shù)比傳統(tǒng)的方法節(jié)省時(shí)間。目前構(gòu)建的vigs載體有5個(gè)載體用于單子葉植物的研究：1)大麥條紋花葉病毒(barleystripemosaicvirus，bsmv)(holzbergs,brosiop,grossc,poguegp.barleystripemosaicvirus-inducedgenesilencinginamonocotplant[j].plantjournal,2002,30(3):315-327.)；2)雀麥花葉病毒(bromemosaicvirus,bmv)(dingxs,schneiderwl,chaluvadisr,mianma，nelsonrs.characterizationofabromemosaicvirusstrainanditsuseasavectorforgenesilencinginmonocotyledonoushosts[j].molplantmicrobeinteract,2006,19(11):1229-1239.)介導(dǎo)的rna病毒vigs載體系統(tǒng)；3)竹花葉病毒和它的衛(wèi)星rna(bamboomosaicvirusanditssatelliterna)(lioumr,huangyw,hucc,linns,hsuyh.adualgene-silencingvectorsystemformonocotanddicotplants.plantbiotechnol[j].2014,12:330-343)介導(dǎo)的vigs系統(tǒng)在煙草和短柄草上的應(yīng)用；4)水稻東格魯桿狀病毒(ricetungrobacilliformvirus,rtbv)dna病毒vigs載體系統(tǒng)，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，實(shí)現(xiàn)了對水稻內(nèi)源基因的高效沉默(purkayasthaa，mathurs，vermav，sharmas，dasguptai.virus-inducedgenesilencinginriceusingavectorderivedfromadnavirus[j].planta,2010,232(6):1531–1540.)；5)最近報(bào)道，黃瓜花葉病毒(cucumbermosaicvirus，cmv)介導(dǎo)的vigs在玉米上得到了應(yīng)用(wangr,yangx,wangn,liux,nelsonrs,liw,fanz,zhout.anefficientvirus-inducedgenesilencingvectorformaizefunctionalgenomicsresearch[j].plantjournal,2016，86:102-115)。bmsv在單子葉植物大麥和小麥上建立了沉默系統(tǒng)；bmv在水稻和玉米、水稻上建立了應(yīng)用。然而，這些vigs系統(tǒng)仍有一些缺陷：基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜，對溫度要求相對敏感，不能對特定寄主的所有品種產(chǎn)生侵染或發(fā)生沉默表型等，使得現(xiàn)有的用于單子葉植物的vigs載體還不能對單子葉植物進(jìn)行大規(guī)模的基因功能分析。為了更好地進(jìn)行單子葉植物植物功能基因組的研究，目前迫切需要構(gòu)建新的具有廣泛寄主的單子葉植物的vigs載體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種病毒誘導(dǎo)的基因沉默載體。

本發(fā)明提供的病毒誘導(dǎo)的基因沉默載體是狗尾草花葉病毒(foxtailmosaicvirus,fomv)介導(dǎo)外源片段沉默植物目的基因的載體。

上述fomv是馬鈴薯x病毒屬，寄主范圍廣泛，包括56種禾本科和至少35種雙子葉植物。fomv為正向單鏈(ss)rna病毒，其基因組由5’帽子結(jié)構(gòu)、3’poly-a尾巴結(jié)構(gòu)和5個(gè)主要開放閱讀框(orfs)組成。五個(gè)主要orf分別編碼一個(gè)功能蛋白。orf1是編碼復(fù)制酶相關(guān)蛋白，其功能與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及戴帽活性有關(guān)；orf2、orf3和orf4亞基因組分別編碼tgb1、tgb2和tgb3組成三基因盒，這個(gè)三基因盒是病毒在細(xì)胞之間移動(dòng)所必須的；orf5亞基因組編碼外殼蛋白，其功能則和病毒基因體的包被及病毒在宿主內(nèi)的移動(dòng)有關(guān)。

本發(fā)明基于fomv設(shè)計(jì)了可以在植物中有效使用的新的vigs載體，可應(yīng)用于植物基因的功能研究，尤其是在單子葉植物的研究中，如大麥、小麥、谷子和玉米等。

本發(fā)明提供的病毒誘導(dǎo)的基因沉默載體包括可轉(zhuǎn)移的核苷酸序列和允許所述可轉(zhuǎn)移的核苷酸序列轉(zhuǎn)入植物基因組中的邊界序列；

所述可轉(zhuǎn)移的核苷酸序列包括啟動(dòng)子、重組fomv的cdna序列和終止子序列；

所述允許可轉(zhuǎn)移的核苷酸序列轉(zhuǎn)入植物基因組中的邊界序列是植物中常用的表達(dá)載體的骨架序列；

所述重組fomv的cdna序列包含至少兩個(gè)fomv亞基因組啟動(dòng)子，分別將其命名為第一個(gè)亞基因組啟動(dòng)子和第二個(gè)亞基因組啟動(dòng)子；所述第一個(gè)亞基因組啟動(dòng)子用于啟動(dòng)外源核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄；所述第二個(gè)亞基因組啟動(dòng)子用于啟動(dòng)fomv自身基因的轉(zhuǎn)錄。所述重組fomv的cdna序列中可連接靶基因序列，優(yōu)選為反向重復(fù)序列。

通常，所述第一個(gè)亞基因組啟動(dòng)子和所述第二個(gè)亞基因組啟動(dòng)子都源自相同的fomvorf，例如它們可以是外殼蛋白(cp)亞基因組啟動(dòng)子或三基因盒蛋白(tgb)亞基因組啟動(dòng)子。

在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，所述重組fomv的cdna序列包含至少兩個(gè)fomv外殼蛋白cp亞基因組啟動(dòng)子，分別將其命名為第一個(gè)cp亞基因組啟動(dòng)子和第二個(gè)cp亞基因組啟動(dòng)子；所述第一個(gè)cp亞基因組啟動(dòng)子用于啟動(dòng)外源核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄；所述第二個(gè)cp亞基因組啟動(dòng)子用于啟動(dòng)fomv外殼蛋白cp基因編碼序列的轉(zhuǎn)錄。

優(yōu)選地，所述載體包括在植物中復(fù)制和運(yùn)動(dòng)所需的全部序列，例如，一個(gè)有侵染性的cdna克隆，其中，cdna編碼整個(gè)fomv基因組(參見例如圖1a，序列1)，而且還包括外源核苷酸序列和啟動(dòng)該序列轉(zhuǎn)錄的第一個(gè)cp亞基因組啟動(dòng)子，優(yōu)選地，外源核苷酸序列為期望沉默的靶基因的反向重復(fù)序列，該序列轉(zhuǎn)錄后可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，外源核苷酸序列來自靶基因序列，長度為40至70個(gè)核苷酸，更優(yōu)選為50至65個(gè)核苷酸，具體為55或60。

所述可轉(zhuǎn)移的核苷酸序列位于所述邊界序列之間，并且能夠在合適的條件下轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞中。通常通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法整合到受體植物的基因組中。

所述外源核苷酸序列并非fomv自身的序列，它在fomv病毒基因組中不是天然存在的。

上述載體中，所述載體含有fomvrna依賴的rna聚合酶的基因編碼序列、fomv三基因盒的基因編碼序列和fomv外殼蛋白cp的基因編碼序列。在本發(fā)明的實(shí)施例中，使用的是fomv-p9的cdna克隆(robertson等人，2000)。該cdna序列如序列1所示。在cdna序列內(nèi)，優(yōu)選保留所有天然的fomvorf，即rna聚合酶、三基因盒和外殼蛋白。然而，一個(gè)或多個(gè)序列可以被刪除，條件是刪除后的cdna在植物體內(nèi)仍具有系統(tǒng)侵染性。

上述載體中，所述第一個(gè)cp亞基因組啟動(dòng)子位于所述fomv三基因盒的基因編碼序列的3’端；所述第二個(gè)cp亞基因組啟動(dòng)子位于所述fomv外殼蛋白cp的基因編碼序列的5’端；所述第一個(gè)cp亞基因組啟動(dòng)子包含fomvcp亞基因組啟動(dòng)子的全部或部分序列；所述第一個(gè)cp亞基因組啟動(dòng)子和所述第二個(gè)cp亞基因組啟動(dòng)子包含相同的序列。例如，兩個(gè)cp亞基因組啟動(dòng)子都包含天然的fomv外殼蛋白cp亞基因組啟動(dòng)子，在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述第一個(gè)cp亞基因組啟動(dòng)子和所述第二個(gè)cp亞基因組啟動(dòng)子的核苷酸序列均為序列1第5202至5371所示的大小為170bp的序列，但此處也可以使用比序列1第5202至5371所示的大小為170bp的序列稍長或更短的序列。

上述載體中，所述外源核苷酸序列位于所述第一個(gè)cp亞基因組啟動(dòng)子的3’端，所述第二個(gè)cp亞基因組啟動(dòng)子的5’端，其由所述第一個(gè)cp亞基因組啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄。

上述載體中，所述啟動(dòng)子包括可在植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子，可以是幾乎在所有植物組織中高水平表達(dá)的花椰菜花葉病毒35s(camv35s)啟動(dòng)子，也可以是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如gst啟動(dòng)子或dex啟動(dòng)子。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述啟動(dòng)子為花椰菜花葉病毒(camv)35s啟動(dòng)子或含有雙增強(qiáng)子的camv35s啟動(dòng)子。

上述載體中，所述終止子可以為nos終止子。

上述載體中，所述載體還包括poly-a序列，其位于nos終止子的5’端。

上述載體中，所述邊界序列來源于根癌農(nóng)桿菌agrobacteriumtumefaciens。

上述載體中，所述外源核苷酸序列通過多克隆位點(diǎn)插入所述第一個(gè)cp亞基因組啟動(dòng)子和所述第二個(gè)cp亞基因組啟動(dòng)子之間。所述多克隆位點(diǎn)位于所述第一個(gè)cp亞基因組啟動(dòng)子和所述第二個(gè)cp亞基因組啟動(dòng)子之間，以便插入外源核苷酸序列；在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述多克隆位點(diǎn)具體為hpai、mlui、xhoi和asci。

上述載體中，所述外源核苷酸序列是對應(yīng)于植物靶基因或靶基因家族的保守序列的一段序列；所述外源核苷酸序列是與靶基因反向互補(bǔ)的序列，所述外源核苷酸序列的大小為100-300bp；所述外源核苷酸序列是靶基因的反向重復(fù)序列，所述反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄后形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)；所述反向重復(fù)序列由靶基因的正向序列和靶基因的反向互補(bǔ)序列組成；所述靶基因的正向序列和所述靶基因的反向互補(bǔ)序列的大小均為40-70bp。

上述載體中，所述靶基因可以為與植物生長、發(fā)育、植物抗病或植物非生物脅迫途徑相關(guān)的基因。

在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，所述載體為將所述可轉(zhuǎn)移的核苷酸序列插入植物t-dna載體中得到的載體，所述植物載體具體為pyl44，pyl44是一種含有雙增強(qiáng)子的camv35s啟動(dòng)子和nos終止子的以pbin19為骨架的t-dna載體。所述載體具體為fomv-sg載體，所述fomv-sg載體為將序列10所示的dna分子插入pyl44載體的stui和xbai酶切位點(diǎn)間，且保持pyl44載體的其他序列不變得到的載體。

上述載體的構(gòu)建方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

上述構(gòu)建方法包括將上述外源核苷酸序列即靶序列克隆到所述載體的多克隆位點(diǎn)中的步驟。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用vigs技術(shù)沉默植物組織中靶基因的方法。

本發(fā)明提供的vigs技術(shù)沉默植物組織中靶基因的方法包括將上述載體轉(zhuǎn)入植物組織中的步驟。具體步驟如下：將用于沉默植物靶基因的外源核苷酸序列通過上述載體導(dǎo)入植物中，得到導(dǎo)入外源片段的植物；用所述導(dǎo)入外源片段的植物的汁液侵染所述植物，實(shí)現(xiàn)植物靶基因的沉默。

本發(fā)明提供的用vigs技術(shù)沉默植物組織中靶基因的方法可以使植物組織中對應(yīng)的靶基因的mrna50％以上被沉默。所述沉默通常指下調(diào)基因表達(dá)。沉默的程度可以是完全地也可為部分地沉默，但更通常地，沉默是部分的。因此，所述沉默不應(yīng)被視為要求完全沉默。

上述方法中，所述植物組織是植株或培養(yǎng)物中的任何植物組織。優(yōu)選地，植物組織是處于2-3葉期的植物組織。

上述方法中，所述載體利用了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的t-dna轉(zhuǎn)移到植物組織中。具體是通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的t-dna轉(zhuǎn)移將載體引入植物細(xì)胞中，轉(zhuǎn)移序列可以瞬時(shí)地整合到植物(細(xì)胞)基因組中。

上述方法中，所述植物為c3植物或c4植物或單子葉植物或禾本科植物；所述植物具體為煙草、扁豆、苜蓿、大麥、小麥、谷子、水稻、柳枝稷或玉米。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種分析靶基因特性或研究靶基因功能的方法。

本發(fā)明提供的分析靶基因特性或研究靶基因功能的方法包括如下步驟：

1)用上述方法在植物、植物的一部分或在植物生長發(fā)育某一階段沉默靶基因；

2)觀察靶基因被沉默后的植物表型。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種dna片段。

本發(fā)明提供的dna片段為序列1第5202-5371位所示的dna片段或含有序列1第5202-5371位的dna片段或序列1第5202-5371位所示的dna片段的部分片段。

如下a1)-a5)中任一所述的物質(zhì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：

a1)來源于上述載體的rna轉(zhuǎn)錄物；

a2)含有來源于上述載體的rna轉(zhuǎn)錄物的病毒或病毒顆粒；

a3)含有上述載體的試劑盒；

a4)含有上述載體的宿主細(xì)胞，這些宿主細(xì)胞可以是植物細(xì)胞，也可以是微生物(特別是細(xì)菌和農(nóng)桿菌)細(xì)胞；

a5)含有或瞬時(shí)表達(dá)上述載體的植物組織。

本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供序列1第5202-5371位所示的dna片段或含有序列1第5202-5371位的dna片段或序列1第5202-5371位所示的dna片段的部分片段的新用途。

本發(fā)明提供了序列1第5202-5371位所示的dna片段或含有序列1第5202-5371位的dna片段或序列1第5202-5371位所示的dna片段的部分片段在制備vigs載體中的應(yīng)用。

上述載體或序列1第5202-5371位所示的dna片段或含有序列1第5202-5371位的dna片段或序列1第5202-5371位所示的dna片段的部分片段在沉默植物目的基因中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

上述載體或序列1第5202-5371位所示的dna片段或含有序列1第5202-5371位的dna片段或序列1第5202-5371位所示的dna片段的部分片段在分析靶基因特性或研究靶基因功能中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明構(gòu)建了由fomv介導(dǎo)的適用于單子葉植物功能基因研究的vigs載體，該載體可將大麥、小麥和谷子等單子葉植物的內(nèi)源基因高效沉默。本發(fā)明利用fomv介導(dǎo)的vigs載體，成功地沉默大麥的pds(phytoenedesaturase)基因和chlh(cloroplastosalterados1)基因、小麥和谷子的pds基因和cla1(cloroplastosalterados1)基因以及谷子的isph基因，上述基因的沉默會(huì)導(dǎo)致大麥、小麥和谷子出現(xiàn)光漂白、白化或褪綠的表型。此外，fomv介導(dǎo)的vigs載體是首個(gè)在谷子中報(bào)道并成功應(yīng)用的vigs載體(谷子是重要的c4模式植物)。本發(fā)明的fomv介導(dǎo)的vigs載體克服了重要經(jīng)濟(jì)作物遺傳轉(zhuǎn)化周期長、步驟繁瑣等困難，不僅為單子葉植物的基因功能研究提供強(qiáng)有力的工具，也為大規(guī)模地研究單子葉植物功能基因組學(xué)提供高效的技術(shù)手段，具有重要的科學(xué)意義和重大應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為fomv的基因組結(jié)構(gòu)和fomv侵染性克隆載體。圖1a為fomv基因組結(jié)構(gòu)示意圖，其中，長方塊代表開放閱讀框(orf)，152kda蛋白是rna依賴的rna聚合酶；三種蛋白26kda、11.3kda和5.8kda統(tǒng)稱為三基因盒(tgb)，其功能可能是參與細(xì)胞與細(xì)胞間的運(yùn)動(dòng)蛋白；5a蛋白是由體內(nèi)合成；24kda外殼蛋白(cp)位于3’端；圖1b為pfomv-wt載體示意圖，其中，lb為左邊界，rb為右邊界；fomv克隆位于camv35s啟動(dòng)子與nos終止子的t-dna二元載體之間，pfomv-wt載體3’末端加入70個(gè)a；圖1c為pfomv-sg載體示意圖，其中，pfomv-sg是以pfomv-wt載體為骨架載體；圖1d為pfomv-wt和pfomv-sg侵染大麥的癥狀及rt-pcr檢測的結(jié)果。

圖2為fomv-hvpds和fomv-hvchlh的pcr和酶切鑒定結(jié)果。圖2a為pcr鑒定結(jié)果；其中，m：marker；泳道1-2：fomv-hvchlh的pcr鑒定結(jié)果；引物分別為f2/f6和f3/f6；泳道3-4：fomv-hvpds的pcr鑒定結(jié)果；引物分別為f2/f5和f3/f5；圖2b為雙酶切鑒定結(jié)果；其中，m：marker；泳道5-6：fomv-hvchlh及其spei/xbal雙酶切鑒定結(jié)果；泳道7-8：fomv-hvpds及其spei/xbal雙酶切鑒定結(jié)果。

圖3為fomv介導(dǎo)的vigs載體在大麥上的應(yīng)用。圖3a為沉默hvpds的大麥植株(fomv-hvpds)、沉默hvchlh的大麥植株(fomv-hvchlh)和對照植株(pfomv-sg)在侵染21天時(shí)第三片葉子上的沉默表型，bar＝1cm；圖3b為沉默hvpds的大麥植株(fomv-hvpds)、沉默hvchlh的大麥植株(fomv-hvchlh)和對照植株(pfomv-sg)的實(shí)時(shí)定量pcr檢測結(jié)果，其中，***代表p<0.01。

圖4為fomv-sipds、fomv-sicla1和fomv-siisph的pcr和酶切鑒定結(jié)果。圖4a為pcr鑒定結(jié)果；其中，m：marker；泳道1-2：fomv-sipds的pcr鑒定結(jié)果；引物分別為f2/f10和f3/f10；泳道3-4：fomv-sicla1的pcr鑒定結(jié)果；引物分別為f2/f11和f3/f11；泳道5-6：fomv-siisph的pcr鑒定結(jié)果；引物分別為f2/f12和f3/f12。圖4b為雙酶切鑒定結(jié)果；其中，m：marker；泳道7-8：fomv-sipds質(zhì)粒及其spei/xbal雙酶切鑒定結(jié)果；泳道9-10：fomv-sicla1質(zhì)粒及其spei/xbal雙酶切鑒定結(jié)果；泳道11-12為：fomv-siisph質(zhì)粒及其spei/xbal雙酶切鑒定結(jié)果。

圖5為fomv介導(dǎo)的vigs載體在谷子上的應(yīng)用。圖5a、圖5c和圖5e分別為對照植株(pfomv-sg)、沉默sipds的谷子(fomv-sipds)、沉默sicla1的谷子和沉默siisph的谷子(fomv-siisph)在侵染第24天時(shí)谷子第七片葉子(7l)，39天時(shí)第十片葉子(10l)和55天時(shí)第十三片葉子(13l)上的沉默表型；圖5b、圖5d和圖5f分別為對照植株(pfomv-sg)、沉默sipds的谷子(fomv-sipds)、沉默sicla1的谷子和沉默siisph的谷子(fomv-siisph)在侵染24天，39天和55天時(shí)sipds、sicla1和siisphmrna的實(shí)時(shí)定量pcr檢測結(jié)果，***代表p<0.01。

圖6為fomv-tapds和fomv-tacla1的pcr和酶切鑒定結(jié)果。圖6a為pcr鑒定結(jié)果；其中，m：marker；泳道1-2：fomv-tapdspcr的鑒定結(jié)果，引物分別為f2/f10和f3/f10；泳道3-4：fomv-tacla1的pcr鑒定結(jié)果，引物分別為f2/f17和f3/f17。圖6b為雙酶切鑒定結(jié)果；其中，m：marker；泳道5-6：fomv-tapds及其spei/xbal雙酶切鑒定結(jié)果；泳道7-8：fomv-tacla1及其spei/xbal雙酶切鑒定結(jié)果。

圖7為fomv介導(dǎo)的vigs載體在小麥上的應(yīng)用。圖7a為對照植株(pfomv-sg)、沉默tapds的小麥植株(fomv-tapds)、沉默tacla1的小麥植株(fomv-tacla1)在侵染第35天時(shí)小麥第四片葉子上的沉默表型；bar＝1cm；圖7b為對照植株(pfomv-sg)、沉默tapds的小麥植株(fomv-tapds)、沉默tacla1的小麥植株(fomv-tacla1)的tapds和tacla1mrna的實(shí)時(shí)定量pcr檢測結(jié)果，**代表p<0.05，***代表p<0.01。

圖8為fomv-zmpds的pcr和酶切鑒定結(jié)果。圖8a為pcr鑒定結(jié)果；其中，m：marker；泳道1-2：fomv-zmpds的pcr鑒定結(jié)果；引物分別為f2/f21和f3/f21；圖8b為雙酶切鑒定結(jié)果；其中，m：marker；泳道3-4：fomv-zmpds質(zhì)粒及其spei/xbal雙酶切鑒定結(jié)果。

圖9為fomv介導(dǎo)的vigs載體在玉米上的應(yīng)用。圖為對照植株(pfomv-sg)和沉默zmpds的玉米(fomv-zmpds)在侵染第21天時(shí)玉米第4片葉子上的沉默表型，bar＝1cm。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的pyl44載體在文獻(xiàn)“l(fā)iuy,schiffm,marather,etal.2002.tobaccorar1,eds1andnpr1/nim1likegenesarerequiredforn-mediatedresistancetotobaccomosaicvirus.plantjournal[j],30:415-429.”中公開過，公眾可從清華大學(xué)獲得。

下述實(shí)施例中的農(nóng)桿菌gv3101和本生煙草植株均在文獻(xiàn)“xug,suin,tangy,etal.2010.one-step,zero-backgroundligation-independentcloningintron-containinghairpinrnaconstructsforrnaiinplants.newphytologist[j],187:240-250.”中公開過，公眾可從清華大學(xué)獲得。

實(shí)施例1、fomv介導(dǎo)的vigs載體的構(gòu)建

1、pfomv-wt載體的構(gòu)建

(1)以fomvcdna全長基因組(圖1a)(來源于fomv-p9的cdna克隆)為模板，采用引物f1/r1進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，即為fomvcdna全長基因組的核苷酸序列。引物序列如下：

f1：5’-gaaaactcttccgaaaccgaaactg-3’；

r1：5’-tctagattttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttataagcgatgtgtgcattcacc-3’。

(2)用限制性內(nèi)切酶xbai對步驟(1)獲得的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，回收得到大小為6237bp的dna片段；用限制性內(nèi)切酶stui和xbai對pyl44載體進(jìn)行雙酶切，回收得到大小為12786bp的骨架載體；將上述大小為6237bp的dna片段和大小為12786bp的骨架載體連接，得到大小為19023bp的pfomv-wt載體(圖1b)。并對其進(jìn)行測序驗(yàn)證。

測序結(jié)果表明：pfomv-wt載體為將序列1所示的fomv全長基因組的dna分子插入pyl44載體的stui和xbai酶切位點(diǎn)間，且保持pyl44載體的其他序列不變得到的載體。

2、建立基于pfomv-wt載體的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染性克隆

(1)將步驟1獲得的pfomv-wt載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌gv3101中；三天后挑取陽性克隆接種到lb液體培養(yǎng)基中(含50μg/mlkan，30μg/mlrif，25μg/mlgen)，28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜；次日收集菌體，得到pfomv-wt/gv3101重組菌，并用侵染懸浮液(10mmmgcl2，10mmmes和200μm乙酰丁香酮)重懸。室溫下放置4小時(shí)。

(2)選取6-8葉齡大的、生長良好的本生煙草(nicotianabenthamiana)，用pfomv-wt/gv3101重組菌對其進(jìn)行注射。將注射過的煙草置于光照/黑暗周期為16h/8h的溫室中培養(yǎng)，得到pfomv-wt侵染的本生煙草植株。

(3)10天后，取上部新生葉片提取rna，檢測pfomv-wt在本生煙草上的侵染性。

具體檢測方法如下：

a、trizol法分別提取本生煙草植株(對照植株)和pfomv-wt侵染的本生煙草植株葉片總rna；

b、分別取2μg提取的rna進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cdna；

c、以獲得的cdna為模板，采用f2和r2引物進(jìn)行rt-pcr，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，即為fomv的mrna。引物序列如下：

f2：5’-cctcacacagccatatctagctaccag-3’；

r2：5’-gactatagctgcttgaacaaaggc-3’。

rt-pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性10分鐘；循環(huán)條件為94℃30秒，55℃30秒；共35循環(huán)。

d、rt-pcr檢測結(jié)果表明，擴(kuò)增得到大小為490bp的條帶，說明fomv-wt在本生煙草上有侵染性。

(4)取注射10天后的煙草接種葉片，研磨，將含有pfomv-wt的煙草汁液，用摩擦接種法接種2葉期的大麥(hordeumvulgare)。

(5)接種12-14天后，在新生的大麥葉片上出現(xiàn)輕微的褪綠條斑癥狀。

(6)取該葉片提取rna并進(jìn)行rt-pcr檢測。結(jié)果證明pfomv-wt在大麥上有侵染性(圖1d)。具體檢測方法同上述描述。

上述試驗(yàn)結(jié)果表明：本發(fā)明成功建立了基于pfomv-wt的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染性克隆。本生煙草可作為擴(kuò)繁病毒的中間寄主。

3、pfomv-sg載體的構(gòu)建

(1)以pfomv-wt為模板，分別用引物f3/r3和f4/r4進(jìn)行pcr擴(kuò)增，分別獲得包含fomvnt4258-5371的dna片段1和包含fomvnt5202-6008的dna片段2。引物序列如下：

f3：5’-gtcttcacaggcggggagc-3’；

r3：5’-ggcgcgcctcgagacgcgttaactgtgtcctgaaatgatgaggtcac-3’。

f4：5’-gttaacgcgtctcgagggcgcgccactcgacccgttcaaccatcgtgc-3’；

r4：5’-cctgcccatagtcaggaggc-3’。

(2)用限制性內(nèi)切酶sali和asci對dna片段1進(jìn)行雙酶切，回收得到大小為880bp的dna片段；用限制性內(nèi)切酶asci和avrii對dna片段2進(jìn)行雙酶切，回收得到大小為746bp的dna片段；用限制性內(nèi)切酶sali和avrii對pfomv-wt載體進(jìn)行雙酶切，回收得到大小為17601bp的骨架載體；將上述大小為880bp和746bp的dna片段和大小為17601bp的骨架載體連接，得到pfomv-sg載體，pfomv-sg載體包含了重復(fù)170bp的fomvcp亞基因組啟動(dòng)子和多克隆位點(diǎn)(hpai、mlui、xhoi和asci)(圖1c)。

對pfomv-sg載體進(jìn)行測序驗(yàn)證。測序結(jié)果表明：pfomv-sg載體為將序列2所示的大小為1620bp的含有重復(fù)的fomvcp亞基因組啟動(dòng)子(170bp)和多克隆位點(diǎn)(hpai、mlui、xhoi和asci)的dna片段替換pfomv-wt載體的sali和avrii酶切位點(diǎn)間的dna片段，且保持pfomv-wt載體的其他序列不變得到的載體。其中，序列2的第690-859位和第882-1051位所示的核苷酸分子為fomvcp亞基因組啟動(dòng)子或其部分片段，也即為序列1第5202-5371位所示的核苷酸分子；序列2的第860-865位、第864-869位、第870-875位、第875-882位分別為hpai、mlui、xhoi和asci的酶切識(shí)別位點(diǎn)。

pfomv-sg載體也即為將序列10所示的dna分子插入pyl44載體的stui和xbai酶切位點(diǎn)間，且保持pyl44載體的其他序列不變得到的載體。

4、建立基于fomv-sg的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染性克隆

(1)將獲得的pfomv-sg載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌gv3101中；三天后挑取陽性克隆接種到lb液體培養(yǎng)基中(含50μg/mlkan、30μg/mlrif和25μg/mlgen)，28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜；次日收集菌體，得到pfomv-sg/gv3101重組菌，并用侵染懸浮液(10mmmgcl2、10mmmes和200μm乙酰丁香酮)重懸。室溫下放置4小時(shí)。

(2)選取6-8葉齡大的、生長良好的本生煙草，用pfomv-sg/gv3101重組菌對其進(jìn)行注射。將注射過的煙草置于光照/黑暗周期為16h/8h的溫室中培養(yǎng)。

(3)10天后，取上部新生葉片提取rna，檢測pfomv-sg在本生煙草上的侵染性。

具體檢測方法如下：

a、trizol法分別提取對照植株(健康植株)和pfomv-sg侵染的本生煙草植株葉片總rna；

b、分別取2μg的rna進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cdna；

c、以獲得的cdna為模板，采用f2和r2引物進(jìn)行rt-pcr，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，即為fomv的mrna。引物序列如下：

f2：5’-cctcacacagccatatctagctaccag-3’；

r2：5’-gactatagctgcttgaacaaaggc-3’。

rt-pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性10分鐘；循環(huán)條件為94℃30秒，55℃30秒；共35循環(huán)。

d、rt-pcr檢測結(jié)果表明，擴(kuò)增得到大小為682bp的條帶，說明fomv-sg在本生煙草上有侵染性。

(4)取注射10天后的煙草接種葉片，研磨，將含有pfomv-sg的煙草汁液，用摩擦接種法接種2葉期的大麥(hordeumvulgare)。

(5)接種12-14天后，在新生的大麥葉片上出現(xiàn)輕微的褪綠條斑癥狀。

(6)取該葉片提取rna并進(jìn)行rt-pcr檢測。結(jié)果證明pfomv-sg在大麥上有侵染性(圖1d)。具體檢測方法同上述描述。

上述結(jié)果表明：成功構(gòu)建了基于fomv-sg農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染性克隆。本生煙草可作為擴(kuò)繁fomv介導(dǎo)的病毒的中間寄主。pfomv-sg即為fomv介導(dǎo)的vigs載體。

實(shí)施例2、fomv介導(dǎo)的vigs載體在單子葉植物基因沉默中的應(yīng)用

一、fomv介導(dǎo)的vigs載體在大麥基因沉默中的應(yīng)用

1、fomv介導(dǎo)的vigs載體的構(gòu)建

(1)以大麥基因組cdna為模板，采用引物f5和r5進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到大小為60bp的大麥pds基因(hvpds,nt1089–1148,genbankaccession:ay062039)，將其命名為dna片段3；采用引物f6和r6進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增得到大小為55bp的大麥chlh基因(hvchlh，nt24-78，genbankaccession:u26545)，將其命名為dna片段4。引物序列如下：

f5：5’-actagtcgaagattcttaaataccatgttgtgaagacaccaaggtctgttta-3’；

r5：5’-ggcgcgccttcgggacggtcttgtaaacagaccttggtgtcttcacaacatgg-3’。

f6：5’-actagtcctgctgctcaacgtcatcgaccccaagatcggcggcgtcatg-3’；

r6：5’-ggcgcgccgtcgcccatgatcatgacgccgccgatcttggggtcgatgacg-3’。

(2)用限制性內(nèi)切酶spei分別對獲得的dna片段3和dna片段4進(jìn)行酶切，分別將回收得到的dna片段進(jìn)行自連，分別回收得到dna片段5(其核苷酸序列由dna片段3的核苷酸序列和其反向互補(bǔ)序列組成)和dna片段6(其核苷酸序列由dna片段4的核苷酸序列和其反向互補(bǔ)序列組成)。

(3)用限制性內(nèi)切酶asci分別對dna片段5和dna片段6進(jìn)行酶切，分別回收得到大小為126bp和116bp的dna片段；用限制性內(nèi)切酶asci對pfomv-sg載體進(jìn)行單酶切，回收得到大小為19215bp的骨架載體；

(4)將序列3所示的dna片段5插入大小為19215bp的骨架載體的asci酶切位點(diǎn)間，得到fomv-hvpds載體；將序列4所示的dna片段6插入大小為19215bp的骨架載體的asci酶切位點(diǎn)間，得到fomv-hvchlh載體。并分別對fomv-hvpds載體和fomv-hvchlh載體進(jìn)行pcr及酶切鑒定。具體步驟如下：

用引物f2/f5和f3/f5對fomv-hvpds載體進(jìn)行pcr驗(yàn)證，分別擴(kuò)增出大小為383bp和435bp的片段(圖2a中的泳道3和泳道4)；用spei/xbal對fomv-hvpds載體進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切得到大小為1109bp的片段(圖2b中的泳道7和泳道8)。

用引物f2/f6和f3/f6分別對fomv-hvchlh進(jìn)行pcr驗(yàn)證，分別擴(kuò)增出大小為378bp和430bp的片段(圖2a中的泳道1和泳道2)。用spei/xbal對fomv-hvpds載體進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切得到大小為1100bp的片段(圖2b中的泳道5和泳道6)。

2、通過vigs技術(shù)下調(diào)大麥的hvpds和hvchlh基因的表達(dá)

(1)分別將pfomv-sg(對照)、fomv-hvpds和fomv-hvchlh載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌gv3101中；三天后挑取陽性克隆接種到lb液體培養(yǎng)基中(含50μg/mlkan、30μg/mlrif和25μg/mlgen)，28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜；次日收集菌體，分別得到pfomv-sg/gv3101，fomv-hvpds/gv3101和fomv-hvchlh/gv3101重組菌，并用侵染懸浮液(10mmmgcl2，10mmmes和200μm乙酰丁香酮)重懸。室溫下放置4小時(shí)。

(2)選取6-8葉齡大的、生長良好的本生煙草，分別用pfomv-sg/gv3101，fomv-hvpds/gv3101和fomv-hvchlh/gv3101重組菌對其進(jìn)行注射。將注射過的煙草置于光照/黑暗周期為16h/8h的溫室中培養(yǎng)。

(3)取注射10天后的煙草接種葉片，研磨，將含有pfomv-sg，fomv-hvpds和fomv-hvchlh的煙草汁液，用摩擦接種法接種2葉期的大麥。

(4)接種21天后，分別得到對照植株(pfomv-sg)、沉默hvpds的大麥植株(fomv-hvpds)和沉默hvchlh的大麥植株(fomv-hvchlh)?？捎^察在fomv-hvpds侵染的大麥的第三片葉子上有很強(qiáng)的光漂白表型，在fomv-hvchlh侵染的大麥的第三片葉子(從基部葉片算起)上有很強(qiáng)的褪綠表型(圖3a)。

(5)分別收取上述表型葉片，通過real-timert-pcr檢測沉默hvpds的大麥植株(fomv-hvpds)體內(nèi)的pds、沉默hvchlh的大麥植株(fomv-hvchlh)體內(nèi)的chlh和對照植株(pfomv-sg)體內(nèi)pds和chlh基因的mrna水平。具體real-timert-pcr檢測方法如下：

a、trizol法分別提取對照植株(pfomv-sg)，沉默hvpds的大麥植株(fomv-hvpds)和沉默hvchlh的大麥植株(fomv-hvchlh)的葉片；

b、分別取2μg提取的rna進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cdna；

c、以獲得的cdna為模板，采用f7/r7和f8/r8引物進(jìn)行rt-pcr，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，即為目標(biāo)基因hvpds和hvchlh的mrna，同時(shí)以18srrna為內(nèi)參基因，內(nèi)參基因的引物為f9/r9。引物序列如下：

f7：5’-gctgcttggaaggatgaagatgg-3’；

r7：5’-ggcatggcaaatatcatggagtgt-3’。

f8：5’-gaggagacattgtcactaac-3’；

r8：5’-ctagccaaagacttcatagaa-3’。

f9：5’-gtgacgggtgacggagaatt-3’；

r9：5’-gacactaacgcgcccggtat-3’。

具體方法如下：儀器bio-radcfx96^tmreal-timepcrdetectionsystem；試劑powersybrgreenpcrmastermix(abi，4367218)。

反應(yīng)體系如下：

配好體系后，將樣品置于伯樂real-timepcr儀(bio-radcfx96^tmreal-timepcrdetectionsystem)上擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10min；循環(huán)條件為95℃15sec，60℃30sec，共40循環(huán)，檢測樣本的hvpds和hvchlh的mrna水平。

real-timert-pcr檢測結(jié)果如圖3b所示：與對照植株(pfomv-sg)相比，沉默hvpds的大麥植株(fomv-hvpds)體內(nèi)的pds表達(dá)量下調(diào)90％；沉默hvchlh的大麥植株(fomv-hvchlh)體內(nèi)的chlh表達(dá)量下調(diào)75％。

上述試驗(yàn)結(jié)果表明，fomv介導(dǎo)的vigs載體成功沉默了大麥的pds和chlh基因，可用于大麥基因沉默。

二、fomv介導(dǎo)的vigs載體在谷子基因沉默中的應(yīng)用

1、fomv介導(dǎo)的vigs載體在谷子上的基因沉默

(1)以谷子基因組cdna為模板，采用引物f10和r10進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增得到大小為60bp的谷子pds基因(sipds,nt558-617,genbankaccession:xm004985406)，將其命名為dna片段7；

以谷子基因組cdna為模板，采用引物f11和r11進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增得到大小為60bp的谷子cla1基因(sicla1,nt1511-1570,genbankaccession:xm004962054)，將其命名為dna片段8。

以谷子基因組cdna為模板，采用引物f12和r12進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增得到大小為60bp的谷子isph(siisph,nt364-423,genbankaccession:xm004981826)，將其命名為dna片段9。引物序列如下：

f10：5’-actagtgaacgccccagtaaaccattacaggtcgtgattgctggtgc-3’；

r10：5’-ggcgcgcctgatagaccagccagtcctgcaccagcaatcacgacctgtaa-3’。

f11：5’-actagtatccacgcggccatgggcggcggcacggggctcaactacttcc-3’；

r11：5’-ggcgcgccggttggggaagcggcggaggaagtagttgagccccgtgccgcc-3’。

f12：5’-actagtctcgagctcatgagccaggagtacaccagcgatgtgatcaag-3’；

r12：5’-ggcgcgccgccgttctccttgagcgtcttgatcacatcgctggtgtactcc-3’。

(2)用限制性內(nèi)切酶spei分別對dna片段7、dna片段8和dna片段9進(jìn)行酶切，分別將回收得到的dna片段進(jìn)行自連，分別回收得到dna片段10、dna片段11和dna片段12。

(3)用限制性內(nèi)切酶asci分別對dna片段10，dna片段11和dna片段12進(jìn)行酶切，分別回收得到大小為126bp的dna片段；用限制性內(nèi)切酶asci對pfomv-sg載體進(jìn)行單酶切，回收得到大小19215bp的骨架載體；

(4)將序列5所示的dna片段10插入大小為19215bp的骨架載體的asci酶切位點(diǎn)間，得到fomv-sipds載體；將序列6所述的dna片段11插入大小為19215bp的骨架載體的asci酶切位點(diǎn)間，得到fomv-sicla1載體；將序列7所述的dna片段12插入大小為19215bp的骨架載體的asci酶切位點(diǎn)間，得到fomv-siisph載體。并分別對fomv-sipds、fomv-sicla1和fomv-siisph載體進(jìn)行pcr及酶切鑒定。

用引物f2/f10和f3/f10對fomv-sipds載體進(jìn)行pcr驗(yàn)證，分別擴(kuò)增出大小為383bp和435bp的片段(圖4a中的泳道1和泳道2)；用spei和xbai對fomv-sipds載體進(jìn)行雙酶切，得到大小為1109bp的片段(圖4b中的泳道7和泳道8)。

用引物f2/f11和f3/f11對fomv-sicla1載體進(jìn)行pcr驗(yàn)證，分別擴(kuò)增出大小為383bp和435bp的片段(圖4a中的泳道3和泳道4)；用spei和xbai對fomv-sicla1載體進(jìn)行雙酶切，得到大小為1109bp的片段(圖4b中的泳道9和泳道10)。

用引物f2/f12和f3/f12對fomv-siisph載體進(jìn)行pcr驗(yàn)證，分別擴(kuò)增出大小為383bp和435bp的片段(圖4a中的泳道5和泳道6)；用spei和xbai對fomv-siisph載體進(jìn)行雙酶切，得到大小為1109bp的片段(圖4b中的泳道11和泳道12)。

2、通過vigs技術(shù)下調(diào)谷子的sipds、sicla1和siisph基因的表達(dá)

(1)分別將pfomv-sg(對照)、fomv-sipds、fomv-sicla1和fomv-siisph載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌gv3101中；三天后挑取陽性克隆接種到lb液體培養(yǎng)基中(含50μg/mlkan、30μg/mlrif和25μg/mlgen)，28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜；次日收集菌體，分別得到pfomv-sg/gv3101、fomv-sipds/gv3101、fomv-sicla1/gv3101和fomv-siisph/gv3101重組菌，并用侵染懸浮液(10mmmgcl2、10mmmes和200μm乙酰丁香酮)重懸。室溫下放置4小時(shí)。

(2)選取6-8葉齡大的、生長良好的本生煙草，分別用pfomv-sg/gv3101、fomv-sipds/gv3101、fomv-sicla1/gv3101和fomv-siisph/gv3101重組菌對其進(jìn)行注射。將注射過的煙草置于光照/黑暗周期為16h/8h的溫室中培養(yǎng)。

(3)取注射10天后的煙草接種葉片，研磨，將含有pfomv-sg(對照)、fomv-sipds、fomv-sicla1和fomv-siisph的煙草汁液，用摩擦接種法接種2葉期的谷子。

(4)接種24天后，分別得到對照植株(pfomv-sg)、沉默sipds的谷子(fomv-sipds)、沉默sicla1的谷子和沉默siisph的谷子(fomv-siisph)?？捎^察在fomv-sipds、fomv-sicla1和fomv-siisph侵染的谷子第七片葉子(從基部葉片算起)上有很強(qiáng)的光漂白表型和白化的表型(圖5a)。

(5)分別收取上述表型葉片，通過real-timert-pcr檢測沉默sipds的谷子(fomv-sipds)體內(nèi)的pds、沉默sicla1的谷子(fomv-sicla1)體內(nèi)的cla1、沉默siisph的谷子(fomv-siisph)的體內(nèi)isph和對照植株(pfomv-sg)體內(nèi)pds、cla1和isph的mrna水平。具體real-timert-pcr檢測方法如下：

a、trizol法分別提取對照植株(pfomv-sg)、沉默sipds的谷子(fomv-sipds)、沉默sicla1的谷子(fomv-sicla1)和沉默siisph的谷子(fomv-siisph)的葉片；

b、分別取2μg提取的rna進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cdna；

c、以獲得的cdna為模板，分別采用f13/r13、f14/r14和f15/r15引物進(jìn)行rt-pcr，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，即為目標(biāo)基因sipds、sicla1和siisph的mrna，同時(shí)以18srrna為內(nèi)參基因，內(nèi)參基因的引物為f16/r16。引物序列如下：

f13：5’-aggagtgggttggtcggagtga-3’；

r13：5’-ttggagaggtcggcaaggttcac-3’；

f14：5’-cacagttcatggccctcgac-3’；

r14：5’-ccaggacgttgaacaccgtc-3’；

f15：5’-agaaagagaactggttacccgc-3’；

r15：5’-tttcctgacgcttgatctcgaa-3’；

f16：5’-tgattaatagggacagtcgggg-3’；

r16：5’-agactaggacggtatctgatcg-3’。

具體方法如下：儀器bio-radcfx96tmreal-timepcrdetectionsystem；試劑powersybrgreenpcrmastermix(abi，4367218)。

反應(yīng)體系如下：

配好體系后，將樣品置于伯樂real-timepcr儀(bio-radcfx96tmreal-timepcrdetectionsystem)上擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10min；循環(huán)條件為95℃15sec，60℃30sec，共40循環(huán)，檢測樣本的sipds、sicla1和siisph的mrna水平。

real-timert-pcr檢測結(jié)果所示：與對照植株(pfomv-sg)相比，沉默sipds的谷子(fomv-sipds)的植物體內(nèi)的pds表達(dá)量下調(diào)66-74％(圖5b)；沉默sicla1的谷子(fomv-sicla1)體內(nèi)的cla1表達(dá)量下調(diào)55-76％(圖5d)；沉默siisph的谷子(fomv-siisph)體內(nèi)的isph表達(dá)量下調(diào)56-73％(圖5f)。

(6)對對照植株(pfomv-sg)、沉默sipds的谷子(fomv-sipds)、沉默sicla1的谷子(fomv-sicla1)和沉默siisph的谷子(fomv-siisph)進(jìn)行表型觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對照植株(pfomv-sg)相比，沉默沉默sipds的谷子(fomv-sipds)、沉默sicla1的谷子(fomv-sicla1)和沉默siisph的谷子(fomv-siisph)的葉片，在侵染24天后有明顯的光漂白和白化現(xiàn)象，繼續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)到第39(10葉)(圖5c)和第55天(13葉)(圖5e)，表型依然可系統(tǒng)擴(kuò)散，而對照植株沒有發(fā)生任何沉默表型。

上述試驗(yàn)結(jié)果表明，fomv介導(dǎo)的vigs載體成功沈默了谷子的pds、cla1和isph，可用于谷子基因沉默。

三、fomv介導(dǎo)的vigs載體在小麥基因沉默中的應(yīng)用

1、fomv介導(dǎo)的vigs載體在小麥上的基因沉默

(1)以小麥基因組cdna為模板，采用引物f10/r10進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增得到大小為60bp的小麥pds基因(tapds,nt423-482,genbankaccession:fj517553)，將其命名為dna片段13；

以小麥基因組cdna為模板，采用引物f17/r11進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增得到大小為60bp的小麥cla1基因(tacla,nt1428-1487,genbankaccession:ak335035)，將其命名為dna片段14。引物序列如下：

f10：5’-actagtgaacgccccagtaaaccattacaggtcgtgattgctggtgc-3’；

r10：5’-ggcgcgcctgatagaccagccagtcctgcaccagcaatcacgacctgtaa-3’。

f17：5’-actagtatccacgcggccatggggggcggcacggggctcaactacttcc-3’；

r11：5’-ggcgcgccggttggggaagcggcggaggaagtagttgagccccgtgccgcc-3’。

(2)用限制性內(nèi)切酶spei分別對dna片段13和dna片段14進(jìn)行酶切，分別將回收得到的dna片段進(jìn)行自連，分別回收得到dna片段15和dna片段16。

(3)用限制性內(nèi)切酶asci分別將dna片段15和dna片段16進(jìn)行酶切，分別回收得到大小為126bp的dna片段；用限制性內(nèi)切酶asci對pfomv-sg載體進(jìn)行單酶切，回收得到大小19215bp的骨架載體；

(4)將序列8所示的dna片段15插入大小為19215bp的骨架載體的asci酶切位點(diǎn)間，連接，得到fomv-tapds載體；將序列9所示的dna片段16插入大小為19215bp的骨架載體的asci酶切位點(diǎn)間，連接，得到fomv-tacla1載體；

用引物f2/f10和f3/f10對fomv-tapds載體進(jìn)行pcr驗(yàn)證，分別擴(kuò)增出大小為383bp和435bp的片段(圖6a中的泳道1和泳道2)。用spei和xbai對fomv-tapds載體進(jìn)行雙酶切，得到大小為1109bp的片段(圖6b的泳道5和泳道6)。

用引物f2/f17和f3/f17對fomv-tacla1載體進(jìn)行pcr驗(yàn)證，分別擴(kuò)增出大小為383bp和435bp的片段(圖6a中的泳道3和泳道4)。用spei和xbai對fomv-tapds載體進(jìn)行雙酶切，得到大小為1109bp的片段(圖6b的泳道7和泳道8)。

2、通過vigs技術(shù)下調(diào)小麥的tapds和tacla1基因的表達(dá)

(1)將pfomv-sg(對照)、fomv-tapds和fomv-tacla1載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌gv3101中；三天后挑取陽性克隆接種到lb液體培養(yǎng)基中(含50μg/mlkan、30μg/mlrif和25μg/mlgen)，28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜；次日收集菌體，分別得到pfomv-sg/gv3101，fomv-tapds/gv3101和fomv-tacla1/gv3101重組菌，并用侵染懸浮液(10mmmgcl2、10mmmes和200μm乙酰丁香酮)重懸。室溫下放置4小時(shí)。

(2)選取6葉齡大的、生長良好的本生煙草，分別用pfomv-sg/gv3101、fomv-tapds/gv3101和fomv-tacla1/gv3101重組菌對其進(jìn)行注射。將注射過的煙草置于光照/黑暗周期為16h/8h的溫室中培養(yǎng)。

(3)取注射10天后的煙草接種葉片，研磨，將含有pfomv-sg、fomv-tapds和fomv-tacla1的煙草汁液，用摩擦接種法接種2葉期的小麥。

(4)接種35天后，分別得到對照植株(pfomv-sg)、沉默tapds的小麥植株(fomv-tapds)和沉默tacla1的小麥植株(fomv-tacla1)?？捎^察在fomv-tapds和fomv-tacla1侵染的小麥的第四片葉子(從基部葉片算起)上有很強(qiáng)的光漂白表型和白化的表型(圖7a)。

(5)分別收取上述表型葉片，通過real-timert-pcr檢測沉默tapds的小麥植株(fomv-tapds)體內(nèi)的pds、沉默tacla1的小麥植株(fomv-tacla1)體內(nèi)的cla1和對照植株(pfomv-sg)體內(nèi)pds和chlh的mrna水平。具體real-timert-pcr檢測方法如下：

a、trizol法分別提取對照植株(pfomv-sg)、沉默tapds的小麥植株(fomv-tapds)和沉默tacla1的小麥植株(fomv-tacla1)的葉片；

b、分別取2μg提取的rna進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cdna；

c、以獲得的cdna為模板，采用f18/r7和f19/r19引物進(jìn)行rt-pcr，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，即為目標(biāo)基因tapds和tacla1的mrna，同時(shí)以18srrna為內(nèi)參基因，內(nèi)參基因的引物為f9/r20。引物序列如下：

f18：5’-gctgcttggaaggatgaagatgg-3’；

r7：5’-ggcatggcaaatatcatggagtgt-3’。

f19：5’-ccatcatgacggtgcagaatg-3’；

r19：5’-ccatgtacatcaacgtcagtgc-3’。

f9：5’-gtgacgggtgacggagaatt-3’；

r20：5’-gacactaatgcgcccggtat-3’。

具體方法如下：儀器bio-radcfx96^tmreal-timepcrdetectionsystem；試劑powersybrgreenpcrmastermix(abi，4367218)。

反應(yīng)體系如下：

配好體系后，將樣品置于伯樂real-timepcr儀(bio-radcfx96tmreal-timepcrdetectionsystem)上擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10min；循環(huán)條件為95℃15sec，60℃30sec，共40循環(huán)，檢測樣本的tapds和tacla1的mrna水平。

real-timert-pcr檢測結(jié)果如圖7b所示：與對照植株(pfomv-sg)相比，沉默tapds的小麥植株(fomv-tapds)體內(nèi)的pds和沉默tacla1的小麥植株(fomv-tacla1)體內(nèi)的cla1表達(dá)量均下調(diào)75％左右。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，fomv介導(dǎo)的vigs載體成功沈默了大麥的pds和chlh基因，可用于小麥基因沉默。

四、fomv介導(dǎo)的vigs載體在玉米基因沉默中的應(yīng)用

1、fomv介導(dǎo)的vigs載體在玉米上的基因沉默

(1)以玉米基因組cdna為模板，采用引物f21/r21進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增得到大小為55bp的玉米pds基因(zmpds,nt2012-2026,genbankaccession:nm001111911)，將其命名為dna片段17；

引物序列如下：

f21：5’-actagtcgcactcaggagccagaaaagcctacaatcaggagaag-3’；

r21：5’-ggcgcgccctaagatgggacgggaacttctcctgattgtaggctt-3’。

(2)用限制性內(nèi)切酶spei對dna片段17進(jìn)行酶切，回收得到的dna片段進(jìn)行自連，回收得到dna片段18。

(3)用限制性內(nèi)切酶asci對dna片段18進(jìn)行酶切，回收得到大小為126bp的dna片段；用限制性內(nèi)切酶asci對pfomv-sg載體進(jìn)行單酶切，回收得到大小19215bp的骨架載體；

(4)將序列11所示的dna片段17(請?zhí)峁┬蛄?1)插入大小為19215bp的骨架載體的asci酶切位點(diǎn)間，連接，得到fomv-zmpds載體。

用引物f2/f21和f3/f21對fomv-zmpds載體進(jìn)行pcr驗(yàn)證，分別擴(kuò)增出大小為383bp和435bp的片段(圖8a中的泳道1和泳道2)。用spei和xbai對fomv-zmpds載體進(jìn)行雙酶切，得到大小為1109bp的片段(圖8b的泳道3和泳道4)。

2、通過vigs技術(shù)下調(diào)玉米的zmpds基因的表達(dá)

(1)將pfomv-sg(對照)和fomv-zmpds載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌gv3101中；三天后挑取陽性克隆接種到lb液體培養(yǎng)基中(含50μg/mlkan、30μg/mlrif和25μg/mlgen)，28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜；次日收集菌體，分別得到pfomv-sg/gv3101和fomv-zmpds/gv3101重組菌，并用侵染懸浮液(10mmmgcl2、10mmmes和200μm乙酰丁香酮)重懸。室溫下放置4小時(shí)。

(2)選取6葉齡大的、生長良好的本生煙草，分別用pfomv-sg/gv3101和fomv-zmpds/gv3101重組菌對其進(jìn)行注射。將注射過的煙草置于光照/黑暗周期為16h/8h的溫室中培養(yǎng)。

(3)取注射10天后的煙草接種葉片，研磨，將含有pfomv-sg和fomv-zmpds的煙草汁液，用摩擦接種法接種2葉期的玉米。

(4)接種21天后，分別得到對照植株(pfomv-sg)和沉默zmpds的玉米植株(fomv-zmpds)?？捎^察在fomv-zmpds侵染的玉米的第四片葉子(從基部葉片算起)上有明顯的光漂白表型(圖9)。

序列表

<110>清華大學(xué)

<120>病毒介導(dǎo)的基因沉默的vigs載體

<160>11

<210>1

<211>6237bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gaaaactcttccgaaaccgaaactgactgaaactacctcgaccgaccttagaacccaaga60

acccaacgggtgcggccactatgtctatcgaggcagttttcgaccaggttacagacccat120

cgctccgcgctgtgattcaggaggaagcgcacaaacagatcaaagatttgtttaaggaaa180

cgacgcgctgcaatccctactccataccgcaagctgggcgcaaggttttggaaaagtacg240

ccatcccctacaacccgtactctctcaaactacaccctcacgcagcctcaaaagcgtttg300

aagtgtcgctctacgaggctgcgtctaactacctcccctccacctcctcaactcctgtca360

cattcatgttcacaaaaccgggcaagctcagattctttaggcgccgaggtcacgtggaca420

aattcgttaatgctgacatagttccaagagacttggctagatacccacgcgacacagtct480

acagttatctgcccgagatcaccaccacacacgctttcattggcgacaccctacaccact540

tcggtgaggactttctcgtcgaggttttctccaggtcaccgaaactagaagtgcttctag600

ccaccatggtattaccacccgaggccttttacagaatggagtcccttcatccctcggttt660

acactctcctctacagggacgaccgattcctatacctgcctggtggcctgcctggcggtg720

agtacgaacatcgctataaggacctaaactggctaacatttggcacagttacgcacggcg780

ggatcactatcacaggagaacgcattgagactaaggccgcgaatcatcttttcctcttca840

gacgagggcgactagagacaccaaaattccgctcattcgacatgcccgagcctatggtcc900

tgcttcccaaggttttccgccccgcaaagtacaatgtacagaagccaattccccgggaga960

aagcaaacaaatggttgatgtacgttaaatccatcggcaatgccaccattcgtgacgtat1020

gggctaagctgaggcaaaccatagccaatgcagacattggactcttctcgcccactgagc1080

tcgtgcatctcacgaattacttcctgctcctgggccggcttgactcacacaactccttcg1140

accaagtactggccgacagtgtgctgaaagcatggttcagaccaatggtcgcaaagcttc1200

aggagatcaagcacaaactcatggggcagacccaattcatgcaactctgccaagcgctag1260

agatgacggaggtggacctcgtttttgaggtccgggactccaagactccccacaaacaag1320

ctgtgccgttggaccgtgaaattgaaaacgttttgttggaaggagtctcatcggagccaa1380

cttacacggaaaccgaaggcgttgctgatagtccacttccccccccaatgcaaactgcag1440

ccgagccgtccgcgacctcagacgagcccgagagctctagctcgcgtgaaattgagcacc1500

aaccggcgcctgagatcacgcttgacgaggaagaacctcagcgagacgatctgccttggg1560

acgcttggagaacacaattaagggcgcttggctttgaggcctctgaaaggcagtatgacc1620

cggacggtgaactgatctctcctatcctgagcacccgaaggttacctaagactcccatag1680

acacaacactctacgccacgctagacaagattgcacgctgcccaactttctacaagcctg1740

acacagatcgcgcgcagacttacgctcgcgatgtcatggcggggaaaaccggtgccattc1800

tcaagcaacaaccctttgagtggaaaaccacgctcaaacgcaagactaaagaggaaccga1860

aggaaattcaccttgcggtgttgcatggtgcgggcgggtcgggcaaatcctacgcactgc1920

aggaatttatgcggaacaactctgacacaccgattacggtcatcctgccgactaacgagc1980

tcagggccgactggaagaaaaaattgcccgcccacgacaaagacacatttatgacatacg2040

aaaacgcgctcttgtgccctcgtggagacatcttcattatggacgattacacaaaattgc2100

ccaggggctacattgaggctttcgtgcagaatgcacctgccctctcacttctgatactca2160

ccggtgaccccaaccaagccgaacactttgagaccactgaggacaatgaaattaacagcc2220

tcgcccccgcctcagtggtcttcggcaagttctctaggtaccacataaatgccacacacc2280

gcaaccccagaaacttggcaaacgccctcggtgtttactccgagacgcccggggaggtta2340

aagtgctttacacgaggaacatcaagaccggttatcacaatctcgtgccctcacaaatga2400

agatgagaaactacgcctcactcgggcagcgagcgtccacctatgcgggttgtcagggga2460

tcactgcgccccgcgttcaaatcatcctagactccgacacaccccggtgcaccaggcaag2520

tcatgtacactgcgctttcaagggccacgacggaagtggtgctctgcaacacgatgccgg2580

atgagaaaagctttttccagaaggttgaagcaacaccgtacctcaaagccatcctcaacc2640

tcaacaaagagattaaagtcactgagggtgacttgacagaagaaccgccgagggagcccg2700

ctcctcccaccacacacctgcctgttgaaaacagaattattcttaatgaggccctagtcg2760

aaccgctgcccgacaaacatgaccgcgagatctactccaactccactggcttttcaaact2820

gcatacagactcaagacccgtacatccaagccttccaacatcagcaagccaaggacgaga2880

cattgttctgggcaaccgtcgagaagaggctcgcagcatccacgccgaaggacaactgga2940

cagaattcaagaccaagagacctctgggtgacgtgctttggctcgcgtacaagcgggcga3000

tgatgctcccagatgagcccatcaaatttaacccagagctctggtgggcatgtgcagatg3060

aggtgcaaaagacctacctctccaagcccatacacgcgctcaagaacggaattcttcggc3120

aatcacccgactttgactggaacaaactgcagattttcctcaagtcacagtgggttaaga3180

aaattgacaaaatcgggaaaattgacgtcaacgctggacagacgattgccgccttttacc3240

aaccaaccgttatgctgtttggaaccatggcgagatacatgcgccgcatccgcgacactt3300

atcaacccggcgaaatactcatcaattgcgagaagaaccagaagcacatttcgaagtggg3360

tcgagagcaattggaaccaccgcctacccgcttacaccaatgacttcactgcttacgacc3420

aaagccaggacggggctatgttacagtttgaggtactgaaagccctgcaccatgatatcc3480

ctcatgaggttgtggaagcctacgtagcccttaaactcaactcaaaaatgtttctgggca3540

cactggcgattatgagattaactggtgagggacccaccttcgacgctaacacagagtgca3600

acattgcttacacacacgcccggttcgagatcccaaagaacgtggcgcaaatgtacgcgg3660

gtgacgactgtgcgctcaactgcaggcccgttgaacggcagtccttcttgcctcttgtgg3720

agaaattcaccctgaaatcaaaacccaaagtatttgagcaaaaagttgggtcatggcctg3780

agttctgcggcaatctgatcaccccacggggctacctcaaggatcccatgaagctacaac3840

actgcctgcaactggcacagaggaagaaaccatccgaacctgggtcgctcaaagacgttg3900

ctgagaactacgctatggacttgctacccacatacgagctaggtgatgcactctacgaaa3960

tcttcgacgagagacaaatgaacgcgcactatcagtcggtcaggacgcttatcacatgcg4020

cccacaccaaagtcctccgagtggcacaggcacttcaggaagactgcaccttctttagct4080

ccatctaacaggttttgagttaggctaactccactgacgaattaaataacaatggatagt4140

gaaatagttgaacgactaacaaagcttggtttcgtcaagacttcacacacgcacatcgct4200

ggcgagcccctcgtgattcacgccgttgctggggccggtaaaaccaccctccttcggtcc4260

ttacttgaattaccgggcgtggaagtcttcacaggcggggagcacgatcctccaaatttg4320

tcagggaaatatatccgctgcgctgcaccccctgtggccggtgcatacaacattctcgac4380

gagtaccccgcgtacccaaattggcgatcgcaaccctggaacgtcctaatcgccgacaac4440

ctacaatacaaagaacccacagctcgcgcccactacacatgcaatcgcactcaccgcctg4500

gggcagctcactgtcgacgctttgcgtagggttggtttcgacatcacctttgccggcacg4560

cagactgaagactacggattccaggaaggccatctctacaccagtcaattttacggacag4620

gtcatttcacttgacacgcaggcccataagatcgctgtgcgccacggacttgcacccctg4680

tccgctttagaaacccgggggctggaatttgatgagaccactgtgataacgactaaaacc4740

tcgctggaggaagtgaaggataggcacatggtctatgtcgctctcacacggcacaggcgc4800

acctgccatctctacaccgctcactttgcgccctccgcctgacaacacgaaagccatact4860

aactatagctataggaatagccgcctccctcgtctttttcatgctcacacgcaacaatct4920

gccacacgtcggtgataacatccactcactaccccacggaggaagttacattgacggtac4980

caagtccatcaactaccgcccacctgcgtcacgctacccctcatctaacttactcgcttt5040

cgctccaccaatactcgccgcagtgctctttttcctcacacagccatatctagctaccag5100

acgatccaggtgcgttcggtgcttcgttgtccacggcgcatgcacgaatcacacctagtt5160

gttatattagcgctgttacttttagctctgtggtgtcttagcactcgacccgttcaacca5220

tcgtgccatgtcgaaatcaacggccactccatcatcgtcaccggaaactgctggcactcc5280

actcaacgaccgcattgagggtgttagggtaaccaacatcagtgaagagaaacaacccac5340

ctcgagtgtgacctcatcatttcaggacacaatggcaccacaagatgccgacgtcactga5400

tgcgacggactacaagaaaccgcctgctgaaactgagcagaaggcactcaccattcaacc5460

acggtcaaacaaggcgcccagtgacgaggagttggtacgcatcatcaacgcggcgcagaa5520

gcgaggcctcacacccgcggactatagctgcttgaacaaaggcttcaccatggaatccat5580

ggacaagggcgccaccgactccacgattttcacgggaaaatacaacactttcccaatgaa5640

aagtctggcgctagcttgcaaagatgctggcgtgcccgtgcacaaactttgctacttcta5700

taccaagccggcttacgcgaaccgtagggtcgccaaccagccgcctgctcgctggaccaa5760

cgagaatgtgcccaaagctaacaagtgggcggctttcgacaccttcgacgcacttctcga5820

cccatacgtagtcccatcctctgtaccgtacgatgagcccacgccagaggatcgccaagt5880

caatgagattttcaagaaggacaatttgagtcaggcagcatccagaaaccaactcctagg5940

aacgcaagcctccatcacgcgcgggagactcaacggcgcaccagcactaccaaacaacgg6000

gcagtacttcatcgaggcacctcagtgatcagtagtatgataccaataaataaatcgggc6060

gaatccgcgcctcctgactatgggcaggtttacggaccaagctgtatcgagatacgacct6120

aacagtaacgcagctaaggggtgaatgcacacatcgcttataaaaaaaaaaaaaaaaaaa6180

aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaatctaga6237

<210>2

<211>1620bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

gtcgacgctttgcgtagggttggtttcgacatcacctttgccggcacgcagactgaagac60

tacggattccaggaaggccatctctacaccagtcaattttacggacaggtcatttcactt120

gacacgcaggcccataagatcgctgtgcgccacggacttgcacccctgtccgctttagaa180

acccgggggctggaatttgatgagaccactgtgataacgactaaaacctcgctggaggaa240

gtgaaggataggcacatggtctatgtcgctctcacacggcacaggcgcacctgccatctc300

tacaccgctcactttgcgccctccgcctgacaacacgaaagccatactaactatagctat360

aggaatagccgcctccctcgtctttttcatgctcacacgcaacaatctgccacacgtcgg420

tgataacatccactcactaccccacggaggaagttacattgacggtaccaagtccatcaa480

ctaccgcccacctgcgtcacgctacccctcatctaacttactcgctttcgctccaccaat540

actcgccgcagtgctctttttcctcacacagccatatctagctaccagacgatccaggtg600

cgttcggtgcttcgttgtccacggcgcatgcacgaatcacacctagttgttatattagcg660

ctgttacttttagctctgtggtgtcttagcactcgacccgttcaaccatcgtgccatgtc720

gaaatcaacggccactccatcatcgtcaccggaaactgctggcactccactcaacgaccg780

cattgagggtgttagggtaaccaacatcagtgaagagaaacaacccacctcgagtgtgac840

ctcatcatttcaggacacagttaacgcgtctcgaggcgcgccactcgacccgttcaacca900

tcgtgccatgtcgaaatcaacggccactccatcatcgtcaccggaaactgctggcactcc960

actcaacgaccgcattgagggtgttagggtaaccaacatcagtgaagagaaacaacccac1020

ctcgagtgtgacctcatcatttcaggacacaatggcaccacaagatgccgacgtcactga1080

tgcgacggactacaagaaaccgcctgctgaaactgagcagaaggcactcaccattcaacc1140

acggtcaaacaaggcgcccagtgacgaggagttggtacgcatcatcaacgcggcgcagaa1200

gcgaggcctcacacccgcggcctttgttcaagcagctatagtcttcaccatggaatccat1260

ggacaagggcgccaccgactccacgattttcacgggaaaatacaacactttcccaatgaa1320

aagtctggcgctagcttgcaaagatgctggcgtgcccgtgcacaaactttgctacttcta1380

taccaagccggcttacgcgaaccgtagggtcgccaaccagccgcctgctcgctggaccaa1440

cgagaatgtgcccaaagctaacaagtgggcggctttcgacaccttcgacgcacttctcga1500

cccatacgtagtcccatcctctgtaccgtacgatgagcccacgccagaggatcgccaagt1560

caatgagattttcaagaaggacaatttgagtcaggcagcatccagaaaccaactcctagg1620

<210>3

<211>126bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

cgaagattcttaaataccatgttgtgaagacaccaaggtctgtttacaagaccgtcccga60

actagttcgggacggtcttgtaaacagaccttggtgtcttcacaacatggtatttaagaa120

tcttcg126

<210>4

<211>116bp

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