煙草鯊烯環(huán)氧酶蛋白、煙草鯊烯環(huán)氧酶基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種煙草鯊烯環(huán)氧酶蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。煙草鯊烯環(huán)氧酶基因NtSE是煙草甾醇合成途徑的關(guān)鍵調(diào)控基因。在幼嫩組織中特異高表達(dá)，將構(gòu)建好的病毒介導(dǎo)的基因沉默載體TRV-NtSE接種本氏煙草，并得到高沉默效率的植株，檢測本氏煙草中植物甾醇的含量，發(fā)現(xiàn)基因沉默植株中甾醇含量顯著下降，下降了21.37%，表明沉默該基因可以顯著的降低植物的甾醇含量。煙草鯊烯環(huán)氧酶基因NtSE是煙草甾醇合成途徑的關(guān)鍵調(diào)控基因，可用于調(diào)節(jié)煙草的甾醇含量，有助于低甾醇優(yōu)質(zhì)煙草的基因工程育種。
【專利說明】煙草鯊烯環(huán)氧酶蛋白、煙草鯊烯環(huán)氧酶基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及煙草留醇合成及調(diào)控關(guān)鍵基因，特別是涉及煙草鯊烯環(huán)氧酶基因在減低煙草留醇含量上的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]煙草是雙子葉植物綱管花目茄科煙草屬植物。煙草屬(Nicotiana)有60多個(gè)種，2個(gè)栽培種中普通煙草(又稱紅花煙草，Nicotiana tabacum)占據(jù)主要面積，黃花煙草(Nicotiana rustica)的面積很小。栽培煙草按煙葉品質(zhì)特點(diǎn)、生物學(xué)性狀和栽培調(diào)制方法等可分為烤煙、曬煙、晾煙、白肋煙、香料煙和黃花煙六個(gè)類型，其中烤煙是栽培最廣的普通煙草。我國烤煙種植面積和總產(chǎn)量均居世界第一位。作為一種葉用經(jīng)濟(jì)作物，烤煙的栽培技術(shù)有別于其它大田作物，不僅要求有一定的煙葉產(chǎn)量，而且更注重?zé)熑~品質(zhì)。煙葉品質(zhì)決定煙葉的可用性，直接影響卷煙商品的色、香、味和商品價(jià)值，也關(guān)系到煙農(nóng)的經(jīng)濟(jì)效益，是煙草行業(yè)的生命和出發(fā)點(diǎn)。為使在未來的國內(nèi)外市場競爭中立于不敗之地，滿足國內(nèi)外卷煙企業(yè)對(duì)優(yōu)質(zhì)煙葉不斷增長的需求，必須提高煙葉品質(zhì)和安全性。
[0003]植物留醇是煙草中一類重要的化合物，歸屬于脂類化合物，其基本結(jié)構(gòu)是環(huán)戊烷多菲碳架。煙草中主要含有膽固醇，菜籽留醇，豆留醇和谷留醇，麥角留醇和菜油甾醇也少量存在。研究表明煙草的己烷萃取物(留醇、三萜等)是卷煙煙氣致癌物多環(huán)芳烴的主要前體物之一。由于留醇的結(jié)構(gòu)中都含有羥基，熱解時(shí)其母體的四輪環(huán)戊烯[α]菲環(huán)結(jié)構(gòu)可形成稠環(huán)芳烴，因此煙草中的留醇是一種潛在的影響人體健康的物質(zhì)，所以降低煙草成熟葉片中留醇含量也是卷煙降焦減害的有效途徑之一，目前尚無有效減低煙草中留醇含量的有效方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于尋找調(diào)控?zé)煵萘舸己康墓δ芑颍M(jìn)而提供一種降低煙草甾醇含量的方法，為低留醇煙草育種提供技術(shù)手段。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種煙草鯊烯環(huán)氧酶蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0006]一種煙草鯊烯環(huán)氧酶基因，編碼權(quán)利要求1所述煙草鯊烯環(huán)氧酶蛋白的基因。
[0007]一種煙草鯊烯環(huán)氧酶基因，其堿基序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0008]所述煙草鯊烯環(huán)氧酶基因的特異性核酸片段是序列表中SEQ ID Ν0:2的第629-1127位核苷酸序列。
[0009]所述的煙草鯊烯環(huán)氧酶基因在減低煙草留醇含量中的應(yīng)用。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)或瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)干擾、沉默、或敲出所述煙草鯊烯環(huán)氧酶，獲得留醇含量減低的煙草轉(zhuǎn)化植株。構(gòu)建所述煙草鯊烯環(huán)氧酶基因的病毒誘導(dǎo)沉默載體或RNAi干涉載體并轉(zhuǎn)化煙草，獲得甾醇含量減低的轉(zhuǎn)基因煙草 。所述煙草鯊烯環(huán)氧酶基因的病毒誘導(dǎo)基因沉默載體和RNAi載體通過下述方法構(gòu)建:以所述煙草鯊烯環(huán)氧酶蛋白基因的特異性核苷酸片段作為引導(dǎo)序列，將該特異性核酸片段以正反兩個(gè)方向插入到植物表達(dá)載體中。
[0010]對(duì)于栽培種煙草鯊烯環(huán)氧酶基因進(jìn)行了克隆，并利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默手段進(jìn)行功能分析，為優(yōu)質(zhì)煙草的基因工程育種提供新的策略和工具。
[0011]本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，煙草中鯊烯環(huán)氧酶基因是煙草留醇合成途徑的關(guān)鍵調(diào)控基因，通過病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)的技術(shù)，在煙草中干擾其表達(dá)，獲得基因沉默植株，檢測發(fā)現(xiàn)這些基因沉默植株中留醇含量相對(duì)于對(duì)樣品含量顯著下降。鑒于該基因的應(yīng)用價(jià)值及其利用潛力的應(yīng)用前景，有必要通過專利加以保護(hù)。
[0012]本發(fā)明提供的用于減低留醇含量的基因編碼煙草鯊烯環(huán)氧酶，來源于煙草(Nicotiana tabacum),命名為NtSE,編碼下述蛋白質(zhì)(i)或(ii):
(i)序列表中的SEQID NO:I所不氣基酸序列的蛋白質(zhì)；
(ii)序列表中的SEQID NO:1所示氨基酸學(xué)列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺少或添加而衍生的蛋白質(zhì)，并且所衍生的蛋白質(zhì)具有與(i)所述蛋白質(zhì)相同的功能。
[0013]序列表中的SEQ ID NO:1序列由531個(gè)氨基酸殘基組成，其中第5位至第27為氨基酸殘基是跨膜結(jié)構(gòu)域，所述取代、缺少或添加的一至十個(gè)氨基酸殘基可以是上述結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基，其改變不會(huì)對(duì)該蛋白的功能產(chǎn)生影響。對(duì)氨基酸殘基進(jìn)行取代、缺少或添加，以及對(duì)相對(duì)功能的檢測可以通過本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。
[0014]本發(fā)明的煙草鯊烯環(huán)氧酶SE基因NtSE可以是cDNA序列，也可以是基因組DNA序列，或者是與這些序列具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA序列。例如序列表中SEQ ID NO:2所示的DNA序列。
[0015]通過同源克隆的方法，根據(jù)高等植物中的鯊烯環(huán)氧酶基因序列，以栽培種煙草葉片的總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為材料，設(shè)計(jì)引物克隆了 NtSE的ORF全長1596bp序列(SEQ IDNO:2),其編碼的蛋白序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示，序列結(jié)果分析表明，該蛋白含有同源性很高，高度保守。其次利用通過real-time PCR發(fā)現(xiàn)該基因是在煙草各個(gè)組織中都表達(dá)，在煙草幼嫩組織中特異高表達(dá)。
[0016]本發(fā)明的有益效果是:通過病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)(VIGS)技術(shù)構(gòu)建了 NtSE基因的VIGS載體，成功獲得了抑制NtSE在本氏煙草中的沉默植株，所獲得的沉默植株擁有甾醇含量相對(duì)對(duì)照植株明顯降低的特異表型?？梢姡没虺聊夹g(shù)或敲出NtSE基因能夠獲得留醇含量降低的基因沉默植株，這使得低留醇含量煙草育種成為可能，為降低煙草甾醇含量提供了一種有效的技術(shù)手段。
[0017]煙草鯊烯環(huán)氧酶基因是煙草留醇合成途徑的關(guān)鍵調(diào)控基因。在幼嫩組織中特異高表達(dá)，將構(gòu)建好的病毒介導(dǎo)的基因沉默載體TRV-NtSE接種本氏煙草，并得到高沉默效率的植株，檢測本氏煙草中植物留醇的含量，發(fā)現(xiàn)基因沉默植株中留醇含量顯著下降，下降了 21.37%，表明沉默該基因可以顯著的降低植物的留醇含量。煙草鯊烯環(huán)氧酶基因財(cái)見是煙草留醇合成途徑的關(guān)鍵調(diào)控基因，可用于調(diào)節(jié)煙草的留醇含量，有助于低留醇優(yōu)質(zhì)煙草的基因工程育種。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為不同組織中NtSE的相對(duì)表達(dá)量；
圖2為基因沉默植株中的NtSE基因的相對(duì)表達(dá)量；圖3為病毒誘導(dǎo)基因沉默的煙葉及對(duì)照煙葉中的主要甾醇含量。
【具體實(shí)施方式】
[0019]一種煙草鯊烯環(huán)氧酶蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0020]一種煙草鯊烯環(huán)氧酶基因，編碼權(quán)利要求1所述煙草鯊烯環(huán)氧酶蛋白的基因。
[0021]一種煙草鯊烯環(huán)氧酶基因，其堿基序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0022]所述煙草鯊烯環(huán)氧酶基因的特異性核酸片段是序列表中SEQ ID NO:2的第629-1127位核苷酸序列。
[0023]所述的煙草鯊烯環(huán)氧酶基因在減低煙草留醇含量中的應(yīng)用。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)或瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)干擾、沉默、或敲出所述煙草鯊烯環(huán)氧酶，獲得留醇含量減低的煙草轉(zhuǎn)化植株。構(gòu)建所述煙草鯊烯環(huán)氧酶基因的病毒誘導(dǎo)沉默載體或RNAi干涉載體并轉(zhuǎn)化煙草，獲得甾醇含量減低的轉(zhuǎn)基因煙草。所述煙草鯊烯環(huán)氧酶基因的病毒誘導(dǎo)基因沉默載體和RNAi載體通過下述方法構(gòu)建:以所述煙草鯊烯環(huán)氧酶蛋白基因的特異性核苷酸片段作為引導(dǎo)序列，將該特異性核酸片段以正反兩個(gè)方向插入到植物表達(dá)載體中。
[0024]首先，選擇此基因中較特異的一段核算片段(序列表SEQ ID NO:2的第629位-第1127位核苷酸序列)為VIGS的引導(dǎo)序列，設(shè)計(jì)引物獲得此序列。然后將此核算片段插入VIGS載體中，構(gòu)建TRV-NtSE載體。
[0025]本氏煙草種植時(shí)間及地點(diǎn):2013年9月，鄭州。
[0026]具體沉默步驟如下:
(1)煙草種子播種于育苗缽中育苗，待發(fā)芽后兩周進(jìn)行分苗，種于塑料缽(10cmXIOcm)中，于22°C，16h光/8h暗條件下進(jìn)行日常肥水管理等；
(2)生長4-5w，選取長勢(shì)一致將含有TRV1、TRV2、TRV2-SS農(nóng)桿菌單菌落接入YEB(5ml)培養(yǎng)基中(含相應(yīng)抗生素)，28°C、250 r/min過夜振蕩培養(yǎng)至OD約為1.0 ；
(3)測OD值，計(jì)算亞培養(yǎng)需要的菌液體積X值，并吸取X體積的菌液接入50ml YEB中，內(nèi)含10 mmol/L2-N-嗎琳基乙橫酸(MES)和20 μ 1/L乙駄丁香麗(acteosyringone,As)，即在 50 mlYEB 加入 5 ml As, 500 ml MES，50 ml antibiotic，28°C 過夜振蕩培養(yǎng)至 OD約為 0.2-2.0 ；
(4)測OD 值，計(jì)算加入的 MMA(10 mmol/L MgCl2,10 mmol/L MES 和 IOOmmoI/LAS)的量Y值，調(diào)整懸浮液的濃度0D600=2.0,4000 r/min離心8 min收集農(nóng)桿菌到50 ml離心管中，倒出上清，向各菌體中加入MMA，再在TRV2、TRV2-SS MMA懸浮液中等體積加入TRVl的MMA懸浮液混勻，室溫靜止I h后即可接種，挑選長勢(shì)一致，約4-5片葉子的煙草植株，用Iml無針頭無菌注射器通過壓濾法把含有不同TRV重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌懸浮液從葉片背面壓入全部展開的葉片中，使菌液充滿整個(gè)葉片，于22°C，75%空氣濕度中培養(yǎng)。
[0027]試劑配制方法:
(1)LB 液體培養(yǎng)基(IL):10 g 細(xì)菌蛋白胨(bacteriological peptone) ; 10 g 氯化鈉(NaCl) ；5 g酵母抽提物(yeast extract),高溫高壓滅菌； (2)YEB液體培養(yǎng)基(IL):5 g牛肉浸膏(beef extract) ；5 g細(xì)菌蛋白胨(bacteriological peptone) ；5 g 鹿糖(sucrose) ;1 g 酵母抽提物(yeast extract) ；2 mlIM硫酸鎂(MgSO4),高溫高壓滅菌；(3)IM 2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)儲(chǔ)備液:ddH20溶解，過濾滅菌，_20°C儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?br> (4)200 mM乙酰丁香酮(Acetosyringone)儲(chǔ)備液:二甲基亞砜(DSMO)溶解，_20°C儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?br> (5)MMA(1L):20 g 鹿糖(sucrose);5 g MS salts (Duchefa Biochemie)；1.95 g MES ；I ml乙酰丁香酮(200 mM，)；ΡΗ:5.6，現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0028]TRV-NtSE 載體信息:
表1 S烯環(huán)氧酶(squalene monooxygenase, SE)基因沉默載體構(gòu)建引物信息
【權(quán)利要求】
1.一種煙草鯊烯環(huán)氧酶蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.一種煙草鯊烯環(huán)氧酶基因，編碼權(quán)利要求1所述煙草鯊烯環(huán)氧酶蛋白的基因。
3.一種煙草鯊烯環(huán)氧酶基因，其堿基序列如SEQ ID N0:2所示。
4.如權(quán)利要求2所述的煙草鯊烯環(huán)氧酶基因，其特征在于:所述煙草鯊烯環(huán)氧酶基因的特異性核酸片段是序列表中SEQ ID NO:2的第629-1127位核苷酸序列。
5.如權(quán)利要求2或3或4所述的煙草鯊烯環(huán)氧酶基因在減低煙草留醇含量中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的煙草鯊烯環(huán)氧酶基因的應(yīng)用，其特征在于:通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)或瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)干擾、沉默、或敲出所述煙草鯊烯環(huán)氧酶，獲得留醇含量減低的煙草轉(zhuǎn)化植株。
7.如權(quán)利要求6所述的煙草鯊烯環(huán)氧酶基因的應(yīng)用，其特征在于:構(gòu)建所述煙草鯊烯環(huán)氧酶基因的病毒誘導(dǎo)沉默載體或RNAi干涉載體并轉(zhuǎn)化煙草，獲得留醇含量減低的轉(zhuǎn)基因煙草。
8.如權(quán)利要求7所述的煙草鯊烯環(huán)氧酶基因的應(yīng)用，其特征在于:所述煙草鯊烯環(huán)氧酶基因的病毒誘導(dǎo)基因沉默載體和RNAi載體通過下述方法構(gòu)建:以所述煙草鯊烯環(huán)氧酶蛋白基因的特異性核苷酸片段作為引導(dǎo)序列，將該特異性核酸片段以正反兩個(gè)方向插入到植物表達(dá)載體中 。
【文檔編號(hào)】C12N9/02GK103805576SQ201410062817
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年2月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月24日
【發(fā)明者】陳千思, 周會(huì)娜, 劉萍萍, 王燃, 翟妞, 金立鋒, 魏春陽, 陳霞, 李鋒, 楊軍, 林福呈, 鄭慶霞 申請(qǐng)人:中國煙草總公司鄭州煙草研究院