一種靈芝酸高產(chǎn)工程菌株kmust-SQS的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種靈芝酸高產(chǎn)工程菌株kmust-SQS，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC?NO.9059，本發(fā)明提供的靈芝工程菌，是通過選用靈芝強啟動子P-gpd過表達編碼鯊烯合酶?squalenesynthase(SQS)基因，得到高產(chǎn)靈芝酸靈芝工程菌kmust-SQS；通過搖瓶發(fā)酵實驗表明，該菌在其細胞生長不受影響的情況下，SQS轉化子菌株中靈芝酸的含量比野生型菌株(WT菌株)提高了23.8%，其中單體靈芝酸GA-Me，GA-T，GA-Mk，GA-S分別比WT菌株提高了82.96%，49.84%，174.51%，31.80%，因此，本高產(chǎn)菌株可以作為生產(chǎn)靈芝酸的工程菌株，具有廣泛的應用前景。
【專利說明】—種靈芝酸高產(chǎn)工程菌株kmust-SQS
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程和代謝工程領域的，具體涉及一種通過基因工程對靈芝代謝途徑中有關靈芝酸合成的鯊烯合酶(SQS)基因過表達的方法，構建了一個靈芝酸的高產(chǎn)工程菌株。
【背景技術】
[0002]靈芝、Ganoderma Iucidum、是擔子菌綱,多孔菌科,靈芝屬真菌。靈芝真菌在我國有20多種，包括赤芝，黃芝，紫芝，黑芝，薄蓋靈芝，樹舌等。我國應用靈芝作為藥物已有兩千多年的歷史。靈芝對于增強人體免疫力，調(diào)節(jié)血糖，控制血壓，輔助腫瘤放化療，保肝護肝，促進睡眠等方面均具有顯著療效。由于其特殊的要用價值，靈芝的有效成分分析和藥理學研究已經(jīng)引起了國際上的廣泛關注，尤其在日本，美國，韓國等國家。目前，靈芝的研究已經(jīng)深入到了分子水平，一些專著相繼出版，從不同的角度介紹了靈芝的生物學特性、栽培技術、藥理學作用及臨床應用等情況。
[0003]靈芝酸是一類分子結構中含有羧基的三萜類物質，從結構來看它屬于高度氧化的羊毛留烷衍生物。自1982年Kubota T等人首次分離得到靈芝酸以來，目前已有130多種靈芝酸被分離出來。它們多為四環(huán)三萜類化合物，含有30個碳原子，結構中一般都有羥基，在IR中有較強的羥基吸收峰。在紫外光譜中也呈現(xiàn)多個波長的特征吸收，多數(shù)是在250 nm、237 nm、365 nm處有吸收峰。靈芝酸具有許多重要的藥理活性如:抗癌，靈芝酸類物質能明顯抑制小鼠肝肉瘤(HTC )細胞的增殖；護肝，靈芝中的靈芝酸提取物能加強其解毒作用；抗HIV ;降血壓；抗氧化 ；抑制血小板凝集，抑制組胺釋放，鎮(zhèn)痛，抑制真核細胞DNA多聚酶活性，抑制法尼基蛋白轉移酶活性和促進體液免疫功能等作用。
[0004]鯊烯合酶(SQS )基因是靈芝酸合成途徑中的一個較為重要的基因。它主要催化法呢酯焦磷酸FPP轉化為鯊烯，進而合成靈芝酸。靈芝酸是通過甲羥戊酸途徑合成的。這條途徑普遍存在于動物，植物，真菌。首先是由乙酰輔酶A ( Acetyl CoA )在硫解酶(Acetoacetyl CoA thiolase )催化下縮合形成乙酸乙酸輔酶A ( Acetoacetyl CoA ),乙酸乙酰輔酶A經(jīng)HMG-CoA合成酶(HMG-CoA synthase )催化與另一分子乙酰CoA縮合生成3-輕基-3甲基-戊二酸單酰輔酶A ( HMG-CoA )，然后HMG-CoA還原酶(HMG-CoA reductase,HMGR )催化HMG-CoA轉化為甲羥戊酸。甲羥戊酸經(jīng)甲羥戊酸激酶(MVK )、甲羥戊酸5-磷酸激酶(PMK)和MDD三步酶促反應轉化為IPP。IPP進一步轉化成法呢酯焦磷酸FPP。FPP在S烯合酶squalene synthase ( SQS )的催化下合成S烯SQS后經(jīng)過S烯單加氧酶的作用產(chǎn)生鯊烯2，3-氧化物，再經(jīng)過羊毛留醇合酶(LS)的作用產(chǎn)生羊毛留醇。最后通過不同酶的修飾作用產(chǎn)生不同結構的靈芝三萜。靈芝酸的合成途徑如下所示:
【權利要求】
1.一種靈芝酸高產(chǎn)工程菌株kmust-SQS，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編 號為CGMCC N0.9059。
【文檔編號】C12N15/80GK104017738SQ201410199886
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年5月13日 優(yōu)先權日:2014年5月13日
【發(fā)明者】徐軍偉, 任夢飛, 周降生, 紀森林, 賀宜龍 申請人:昆明理工大學