一種甲型流感病毒亞型檢測(cè)微孔板芯片的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種甲型流感病毒亞型檢測(cè)微孔板芯片，所述微孔板芯片包括：固相載體微孔板、固定在固相載體微孔板上的固相引物以及與固相引物相對(duì)應(yīng)的液相引物；其中，固相引物包含SEQ?ID?No.1至SEQ?ID?No.10所示的任一核苷酸序列；液相引物為引物對(duì)P1/P2，包括引物P1和引物P2，引物P1包含SEQ?ID?No.11至SEQ?ID?No.20所示的任一核苷酸序列；引物P2包含SEQ?ID?No.21至SEQ?ID?No.30所示的與引物P1相對(duì)應(yīng)的核苷酸序列。本發(fā)明利用甲型流感病毒亞型檢測(cè)微孔板芯片的檢測(cè)甲型流感病毒亞型的方法，能夠高通量、快速、靈敏、特異性檢測(cè)甲型流感病毒樣品，對(duì)常見的甲型流感病毒如H1N1、H1N2、H2N2、H3N1、H3N2、H5N1、H6N8、H7N7和H9N2亞型進(jìn)行核酸分型，具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】一種甲型流感病毒亞型檢測(cè)微孔板芯片
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種甲型流感病毒亞型檢測(cè)微孔板芯片，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]流行性感冒(Influenza，簡(jiǎn)稱流感)是由流感病毒感染引起的具有高度傳染性的急性呼吸道疾病。由于流感病毒的自然感染率高和抗原性的高度變異，使流感每年重復(fù)出現(xiàn)，甚至發(fā)生大流行，對(duì)公共健康構(gòu)成了極大威脅。根據(jù)流感病毒核蛋白和M蛋白的不同，可將流感病毒分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，其中甲型流感病毒最容易發(fā)生變異，因此甲型流感病毒的早期分型診斷對(duì)于預(yù)防與控制流感流行具有極為重要的意義。甲型流感病毒的基因組有8個(gè)單鏈RNA階段組成。根據(jù)編碼血凝素(hemagglutinin, HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase,NA)的基因序列差異，甲型流感病毒分為16種HA亞型和9種NA亞型；而核蛋白(nucleo protein,NP)基因和膜蛋白(matrix protein,MP)基因在流感病毒各型中均較為保守，具有型和種屬的特異性，這些均是甲型流感病毒分型的依據(jù)。
[0003]流感病毒株的常規(guī)鑒定方法通常需要進(jìn)行病毒株分離、培養(yǎng)、免疫學(xué)鑒定，這種方法也被認(rèn)為是鑒定體外培養(yǎng)病毒株的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，但該方法存在費(fèi)時(shí)(3-7天)費(fèi)力等缺點(diǎn)。近年來，普遍采用的是基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)的檢測(cè)或分型方法，即采用通用引物或亞型特異引物對(duì)臨床來源的甲型流感病毒進(jìn)行檢測(cè)或分型。PCR檢測(cè)可以快速、靈敏、特異地診斷流感病毒，但常規(guī)PCR對(duì)混雜樣品難以提供完整的亞型信息以及流感病毒亞型眾多限制了其的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種甲型流感病毒亞型檢測(cè)微孔板芯片，利用該微孔板芯片，能夠高通量、快速、靈敏、特異性檢測(cè)甲型流感病毒樣品，對(duì)常見的甲型流感病毒進(jìn)行核酸分型。
[0005]本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，一種甲型流感病毒亞型檢測(cè)微孔板芯片，所述微孔板芯片包括:固相載體微孔板、固定在固相載體微孔板上的固相引物以及與固相引物相對(duì)應(yīng)的液相引物；其中，
[0006]固相引物包含SEQ ID N0.1至SEQ ID N0.10所示的任一核苷酸序列；
[0007]液相引物為引物對(duì)P1/P2，包括引物Pl和引物P2，引物Pl包含SEQ ID N0.11至SEQ ID N0.20所示的任一核苷酸序列；引物P2包含SEQ ID N0.21至SEQ ID N0.30所示的與引物Pl相對(duì)應(yīng)的核苷酸序列。
[0008]所述固相載體微孔板由聚乙烯材料制成。
[0009]所述固相載體微孔板先經(jīng)過表面清潔處理，再進(jìn)行表面氨基硅烷化，使其表面覆蓋氨基基團(tuán)，具體方法為:
[0010](a)取微孔板洗凈后放入2.5M氫氧化鈉溶液中浸泡過夜；
[0011](b)取出微孔板用去離子水中清洗3遍，然后放置于去離子水中超聲振蕩15min，再用去尚子水清洗3次,晾干備用；
[0012](c)將氨基硅烷溶液(溶劑為體積比95:5的甲醇與水混合物，APS的體積濃度為1%)加入到微孔板的各個(gè)孔中，50°C烘箱放置2h ；
[0013](d)然后分別用甲醇清洗2次、去離子水清洗2次，將清洗干凈的微孔板放置120°C烘箱烘干lh，再將冷卻后的微孔板放置于真空裝置備用。
[0014]所述固相引物先用去離子水稀釋至濃度為20 μ M，然后用3XSSC，0.1%SDS稀釋至終濃度為10 μ Μ，再點(diǎn)入固相載體微孔板的微孔中，最后高溫固化和/或UV照射處理，具體方法為:
[0015]將各固相引物分別用去離子水配置成20 μ M溶液，然后與點(diǎn)樣緩沖液(3 X SSC,0.P/oSDS)等體積混合，得到終濃度為10 μ M的探針點(diǎn)樣緩沖液，用移液裝備在微孔板的每個(gè)微孔底部滴加2 μ L探針點(diǎn)樣緩沖液。點(diǎn)樣完畢后，將微孔板置于80°C烘箱30min，然后將微孔板正置于紫外燈下，輻照計(jì)量0.SJ0固定完畢后用去離子水清洗每個(gè)點(diǎn)樣孔，風(fēng)干后備用。
[0016]所述的核苷酸序列為SEQ ID N0.1的固相引物、核苷酸序列為SEQ ID N0.11和SEQ ID N0.21的液相引物序列來自于甲型流感病毒的M基因；所述的核苷酸序列為SEQ IDN0.2的固相引物、核苷酸序列為SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.22的液相引物序列來自于甲型流感病毒HlNl亞型；所述的核苷酸序列為SEQ ID N0.3的固相引物、核苷酸序列為SEQID N0.13和SEQ ID N0.23的液相引物序列來自于甲型流感病毒H1N2亞型；所述的核苷酸序列為SEQ ID N0.4的固相引物、核苷酸序列為SEQ ID N0.14和SEQ ID N0.24的液相引物序列來自于甲型流感病毒H2N2亞型；所述的核苷酸序列為SEQ ID N0.5的固相引物、核苷酸序列為SEQ ID N0.15和SEQ ID N0.25的液相引物序列來自于甲型流感病毒H3N1亞型；所述的核苷酸序列為SEQ ID N0.6的固相引物、核苷酸序列為SEQ ID N0.16和SEQ IDN0.26的液相引物序列來自于甲型流感病毒H3N2亞型；所述的核苷酸序列為SEQ ID N0.7的固相引物、核苷酸序列為SEQ ID N0.17和SEQ ID N0.27的液相引物序列來自于甲型流感病毒H5N1亞型；所述的核苷酸序列為SEQ ID N0.8的固相引物、核苷酸序列為SEQ IDN0.18和SEQ ID N0.28的液相引物序列來自于甲型流感病毒H6N8亞型；所述的核苷酸序列為SEQ ID N0.9的固相引物、核苷酸序列為SEQ ID N0.19和SEQ ID N0.29的液相引物序列來自于甲型流感病毒H7N7亞型；所述的核苷酸序列為SEQ ID N0.10的固相引物、核苷酸序列為SEQ ID N0.20和SEQ ID N0.30的液相引物序列來自于甲型流感病毒H9N2亞型。
[0017]本發(fā)明利用甲型流感病毒檢測(cè)微孔板芯片檢測(cè)甲型流感病毒亞型的方法，包括以下步驟:
[0018](1)提取待檢測(cè)的核酸樣本；
[0019](2)將固相引物固定于固相載體微孔板的微孔中；
[0020](3)以步驟(1)提取的核酸樣本為模板，加入液相引物配制PCR反應(yīng)液，然后將PCR反應(yīng)液加入已固定對(duì)應(yīng)固相引物的微孔中，進(jìn)行固相PCR擴(kuò)增病原體的靶核酸序列；
[0021](4)固相PCR擴(kuò)增結(jié)束后檢測(cè)信號(hào)并分析結(jié)果。
[0022]所述固相PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為25 μ L，包括:待檢測(cè)的核酸樣本I μ L、10 X TaqPCR 反應(yīng)液 2.5yL、液相引物 Ρ1、Ρ2 (20 μ Μ)各 0.5 μ L、dNTPs (IOmM) 2 μ L、Taq DNA 聚合酶 0.5 μ L、BSA (50mg/mL) 1 μ L和水 17μ L。[0023]所述固相PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s、50°C退火45s、72°C延伸30s，重復(fù)30個(gè)循環(huán)；最后72°C終延伸5min。
[0024]所述檢測(cè)信號(hào)的具體方法為:待固相PCR擴(kuò)增結(jié)束后，從固相載體微孔板的微孔中吸出PCR反應(yīng)液，然后將熒光染料或顯色試劑加入微孔中，以進(jìn)行后續(xù)觀察。
[0025]本發(fā)明利用甲型流感病毒亞型檢測(cè)微孔板芯片的檢測(cè)甲型流感病毒亞型的方法，能夠高通量、快速、靈敏、特異性檢測(cè)甲型流感病毒樣品，對(duì)常見的甲型流感病毒如H1N1、H1N2、H2N2、H3N1、H3N2、H5N1、H6N8、H7N7和H9N2亞型進(jìn)行核酸分型，具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為微孔板芯片陣列模式，其中，
[0027]IA-B 為:Pl-M-s ;2A_B 為:Pl-HlNl_s ;3A_B 為:Pl-HlN2_s ;4A_B 為:Pl-H2N2_s ；5A-B 為:Pl-H3Nl-s ;6A_B 為:Pl-H3N2_s ;1C_D 為:Pl-H5Nl_s ;2C_D 為:Pl-H6N8_s ;3C_D為:Pl-H7N7-s ；4C-O 為:Pl-H9N2_s ;5C_D 為:ddH20 ;6C_D 為:P1-M_s ；
[0028]圖2為單個(gè)病毒質(zhì)粒樣品的檢測(cè)結(jié)果；其中，
[0029]a 為質(zhì)粒 p-HlNl-HA，b 為質(zhì)粒 p-HlN2_HA，c 為質(zhì)粒 p-H2N2_HA，d 為質(zhì)粒P-H3N1-HA, e 為質(zhì)粒 p-H3N2_HA，f 為質(zhì)粒 p-H5Nl_HA，g 為質(zhì)粒 p-H6N8_HA，h 為質(zhì)粒P-H7N7-HA, i 為質(zhì)粒 p-H9N2_HA ；
[0030]圖3為靈敏度(熒光法)檢測(cè)結(jié)果；其中，
[0031]a 為質(zhì)粒 p-HlNl-HA 和 p-H2N2_HA 濃度為 I μ g/mL, b 為質(zhì)粒 ρ-ΗΙΝΙ-ΗΑ 和P-H2N2-HA 濃度為 I X KT1 μ g/mL, c 為質(zhì)粒 ρ-ΗΙΝΙ-ΗΑ 和 p-H2N2_HA 濃度為 I X 10-2 μ g/mL,d 為質(zhì)粒 p-HlNl-HA 和 p-H2N2-HA 濃度為 I X 10-3 μ g/mL, e 為質(zhì)粒 ρ-Η1Ν1-ΗΑ 和 p-H2N2_HA濃度為 I ΧΙΟ—4 μ g/mL;
[0032]圖4為混合病毒質(zhì)粒樣品的檢測(cè)結(jié)果；其中，
[0033]a為質(zhì)粒ρ-ΗΙΝΙ-ΗΑ、質(zhì)粒ρ-Η1Ν2_ΗΑ和質(zhì)粒p-H2N2_HA的混合物；b為質(zhì)粒P-H3N1-HA、質(zhì)粒 p-H3N2-HA 和質(zhì)粒 ρ-Η5Ν1_ΗΑ 的混合物；質(zhì)粒 p-H7N7_HA、質(zhì)粒 p-H6N8_HA和質(zhì)粒P-H9N2-HA的混合物。
【具體實(shí)施方式】
[0034]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。
[0035]本發(fā)明實(shí)施例中所涉及的主要試劑如下:
[0036](3_ 氨基丙基)三乙氧基硅烷[(3-Aminopropyl) triethoxysilane, APS],購(gòu)自sigma ；Taq DNA聚合酶,購(gòu)自天根生化有限公司；Biotin-ll_dUTP,購(gòu)自thermo ；BCIP/NBT,購(gòu)自thermo ;pGEM_T載體試劑盒,購(gòu)自Promega公司；Green_DNA Dye核苷酸膠體染料,購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。
[0037]本發(fā)明實(shí)施例中所涉及的主要儀器如下:
[0038]UV-1000/2000紫外可見分光光度計(jì)(Iabtech)、紫外交聯(lián)儀(DIY-2010)、bio-rad_mycyclerPCR儀、紫外分析儀(WFH-203B)、凝膠成像系統(tǒng)-850 (上海山富)。
[0039]實(shí)施例1單個(gè)樣品的檢測(cè)[0040]( I)本發(fā)明固相引物及液相引物的設(shè)計(jì)與合成
[0041 ]從 Genebank 庫中下載甲型流感病毒各亞型 HlNl、H1N2、H2N2、H3N1、H3N2、H5N1、H6N8、H7N7和H9N2等的M基因及HA基因序列。其中表1中的各亞型代表毒株的M基因或HA基因序列信息，作為后續(xù)質(zhì)粒構(gòu)建參考序列。
[0042]表1各亞型代表毒株的M基因及HA基因信息
[0043]
【權(quán)利要求】
1.一種甲型流感病毒亞型檢測(cè)微孔板芯片，其特征在于，所述微孔板芯片包括:固相載體微孔板、固定在固相載體微孔板上的固相引物以及與固相引物相對(duì)應(yīng)的液相引物；其中， 固相引物包含SEQ ID N0.1至SEQ ID N0.10所示的任一核苷酸序列； 液相引物為引物對(duì)P1/P2，包括引物Pl和引物P2，引物Pl包含SEQ ID N0.11至SEQID N0.20所示的任一核苷酸序列；引物P2包含SEQ ID N0.21至SEQ ID N0.30所示的與引物Pl相對(duì)應(yīng)的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲型流感病毒亞型檢測(cè)微孔板芯片，其特征在于，所述固相載體微孔板由聚乙烯材料制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲型流感病毒亞型檢測(cè)微孔板芯片，其特征在于，所述固相載體微孔板先經(jīng)過表面清潔處理，再進(jìn)行表面氨基硅烷化，使其表面覆蓋氨基基團(tuán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲型流感病毒亞型檢測(cè)微孔板芯片，其特征在于，所述固相引物先用去離子水稀釋至濃度為20 μ Μ，然后用3 X SSC, 0.1%SDS稀釋至終濃度為10 μ M，再點(diǎn)入固相載體微孔板的微孔中，最后高溫固化和/或UV照射處理。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲型流感病毒亞型檢測(cè)微孔板芯片，其特征在于， 所述的核苷酸序列為SEQ ID N0.1的固相引物、核苷酸序列為SEQ ID N0.11和SEQ IDN0.21的液相引物，來自于甲型流感病毒的M基因； 所述的核苷酸序列為SEQ ID N0.2的固相引物、核苷酸序列為SEQ ID N0.12和SEQ IDN0.22的液相引物，來自于甲型流感病毒HlNl亞型； 所述的核苷酸序列為SEQ ID N0.3的固相引物、核苷酸序列為SEQ ID N0.13和SEQ IDN0.23的液相引物序列來自于甲型流感病毒Η1Ν2亞型； 所述的核苷酸，為SEQ ID N0.4的固相引物、核苷酸序列為SEQ ID N0.14和SEQ IDN0.24的液相引物序列來自于甲型流感病毒Η2Ν2亞型； 所述的核苷酸序列為SEQ ID N0.5的固相引物、核苷酸序列為SEQ ID N0.15和SEQ IDN0.25的液相引物，來自于甲型流感病毒Η3Ν1亞型； 所述的核苷酸序列為SEQ ID N0.6的固相引物、核苷酸序列為SEQ ID N0.16和SEQ IDN0.26的液相引物，來自于甲型流感病毒Η3Ν2亞型； 所述的核苷酸序列為SEQ ID N0.7的固相引物、核苷酸序列為SEQ ID N0.17和SEQ IDN0.27的液相引物，來自于甲型流感病毒Η5Ν1亞型； 所述的核苷酸序列為SEQ ID N0.8的固相引物、核苷酸序列為SEQ ID N0.18和SEQ IDN0.28的液相引物，來自于甲型流感病毒Η6Ν8亞型； 所述的核苷酸序列為SEQ ID N0.9的固相引物、核苷酸序列為SEQ ID N0.19和SEQ IDN0.29的液相引物，來自于甲型流感病毒Η7Ν7亞型； 所述的核苷酸序列為SEQ ID N0.10的固相引物、核苷酸序列為SEQ ID N0.20和SEQID N0.30的液相引物，來自于甲型流感病毒Η9Ν2亞型。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103789453SQ201410062760
【公開日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2014年2月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月24日
【發(fā)明者】楊麗萍, 孫新城, 高愛社, 李偉, 黃睿 申請(qǐng)人:河南中醫(yī)學(xué)院, 孫新城