專利名稱：經(jīng)過修飾的流感病毒的制作方法
經(jīng)過修飾的流感病毒本發(fā)明涵蓋一種在M基因的N端附近(更具體地，在M基因核苷酸位置265-294 的任何一個處)包含至少一個核苷酸的修飾的B型流感病毒M基因，以及包含所述經(jīng)修飾 M基因的B型流感病毒。
背景技術：
由病毒性疾病引起的地區(qū)流行病(印idemics)和全球大流行病(pandemics)仍然 威脅著人類的生命，并沖擊著全球的經(jīng)濟。流感導致全世界數(shù)以百萬計的工作日損失和看 醫(yī)生，數(shù)以十萬計的住院(Couch 1993，Ann. NY. Acad. Sci685 ;803)，數(shù)以萬計的過度死亡 (Collins & Lehmann 1953 Public HealthMonographs 213:1；Glezen 1982 Am. J. Public Health 77 :712)及數(shù)十億歐元的衛(wèi)生保健費用(Williams et al. 1988, Ann. Intern. Med. 108 616)。在過去，A型和B型流感病毒均曾導致這些人類流行病，因此除了 A型流感 病毒以外，B型流感病毒表面抗原也是任何有效降低流感發(fā)病率的疫苗的重要成分。流感病毒屬于正粘病毒科，以節(jié)段性負鏈RNA基因組為特征，合計總體大小分別 為13. 6-14. 6kb?；蚪M病毒RNA必須包裝成病毒顆粒，以便使病毒傳播。子代病毒顆粒的 組裝過程和組裝期間發(fā)生的蛋白/蛋白相互作用在RNA病毒中是相似的。病毒顆粒的形成 保證了 RNA基因組在單個宿主內(nèi)或在不同宿主生物體之間從一個宿主細胞向另一個宿主 細胞的有效傳播。流感病毒體由包含單鏈RNA基因組的核糖核蛋白內(nèi)核(螺旋狀的核殼)及內(nèi)側襯 有基質(zhì)蛋白質(zhì)(Ml)的脂蛋白外被膜組成。A型流感病毒的分節(jié)段基因組由8個線性、負極 性的單鏈RNA分子組成，編碼11種(在一些A型流感病毒株中是10種)多肽，包括形成核 殼的依賴于RNA的RNA聚合酶蛋白(PB2、PB1和PA)和核蛋白(NP)；基質(zhì)膜蛋白(M1、M2或 BM2)；自含脂質(zhì)被膜凸出的兩種表面糖蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)；非結構蛋白 (NSl)和核外運蛋白(NEP)。大多數(shù)A型流感株還編碼據(jù)認為有促凋亡性質(zhì)的第11種蛋白 質(zhì)(PB1-F2)，而只有B型流感病毒表達可能有助于病毒毒力的NB蛋白(Hattaand Kawaoka, 2003，J. Virol.，77，6050-6054)。A型和B型流感病毒進一步在由病毒NA和M基因節(jié)段編 碼的基因產(chǎn)物的表達策略方面有微小的差異(Lamband Horvath, 1991, Trends Genet. 7 261-266)。顯著的生物學和流行病學差異在于B型流感病毒幾乎僅限于人類，盡管早就有 研究自海豹分離了 B型流感病毒，指示還可能存在更大的不同生物體的貯存庫。A型流感病 毒則在許多鳥類和哺乳類物種中具有非常廣泛的貯存庫。基因組的轉錄和復制發(fā)生在細胞核內(nèi)，組裝通過從細胞質(zhì)膜出芽而發(fā)生。在混合 感染期間，病毒能重排(reassert)基因。流感病毒通過HA吸附至細胞膜糖蛋白和糖脂中 的唾液酸寡糖。細胞內(nèi)吞病毒體之后，HA分子在細胞的內(nèi)體中發(fā)生構象改變，這有利于膜 融合，從而觸發(fā)脫殼。核衣殼遷移至細胞核，在那里，病毒mRNA被轉錄。病毒mRNA通過一 種獨特機制進行轉錄，其中病毒內(nèi)切核酸酶自細胞異源mRNA切下帶帽的5'端，再以其為 引物，通過病毒轉錄酶轉錄病毒RNA模板。轉錄終止于距其模板末端15-22個堿基的位點， 在那里，寡(U)序列作為添加聚(A)束的信號。在A型流感復制期間這樣產(chǎn)生的8種病毒 RNA分子中，有6種是單順反子信息，它們被直接翻譯成代表HA、NA、NP和病毒聚合酶蛋白，PB2、PBl和PA的蛋白。另外2種轉錄物經(jīng)過剪接，每種都產(chǎn)生兩種mRNA，它們按照不同的 閱讀框進行翻譯，產(chǎn)生Ml、M2、NSl和NEP。換言之，這8種病毒RNA節(jié)段編碼11種蛋白9 種結構蛋白和2種非結構蛋白(NSl和最近鑒定出的PB1-F2)。B型流感為兩種蛋白，即NB 和BM2，使用一種不同的編碼策略。前者從NA基因的重疊閱讀框翻譯獲得，后者通過一個重 疊終止_起始密碼子從M基因表達。疫苗接種目前被看作是保護人類免于流感的最佳方法。當健康的成年人獲得免疫后，當前可得的疫苗阻止70-90%的臨床病例發(fā)生。在年 齡超過65歲的人群中，這個水平降低至30-70%，而在療養(yǎng)院的65歲以上人群中，則降得更 低(Strategic Perspective 2001 :The Antiviral Market. Datamonitor. p. 59)。病毒步頁 繁改變抗原性也造成大量死亡病例，因為即使是每年疫苗接種也不能保證保護作用。疫苗接種是用商業(yè)可得的、化學滅活的(殺死的)流感病毒疫苗或減毒的活流感 病毒疫苗實現(xiàn)的。不幸的是，滅活的疫苗幾乎不能誘導交叉保護性免疫，因此疫苗株必須與 將來未知的全球大流行病毒株的抗原性質(zhì)精確匹配。復制缺陷型A型流感病毒據(jù)信可以克服病毒散發(fā)方面的安全問題。這些可以是具 有NSl蛋白刪除的A型流感突變體。缺失NSl蛋白使該病毒在接種疫苗的哺乳動物的呼吸 道內(nèi)發(fā)生復制缺陷。在鼻內(nèi)施用時，疫苗病毒能夠在粘膜組織中引發(fā)無效感染，沒有病毒散 發(fā)效果。同時，病毒刺激局部細胞因子應答，喚起B(yǎng)和T細胞介導的保護性免疫應答。B型流感病毒大多需要費力而耗時的適應，以實現(xiàn)在Vero細胞上的充分生長。 B型流感NSl突變體除了具有由于NSl功能喪失造成的干擾素敏感性表型之外，還能夠 在Vero細胞上復制到高滴度，但是在文獻中尚無介紹。目前，唯一已公開的完全缺少NSl ORF的B型流感病毒在Vero細胞中沒有有效復制(使用0. Imoi，滴度為1. 7-2. 5*102FFU/ ml,在 0. OOlmoi 、沒有檢 IlJ 至Ij 滴度。Dauber et. al Journal of Virology, Feb. 2004， p. 1865-1872)。B型流感NSl刪除突變體由氨基端16aa組成，在復制方面也被高度削弱，最 大滴度為大約 104FFU/ml (Hai et. Al Journal of Virology ；Nov2008, p. 10580-90)。反映對開發(fā)含有B型流感抗原性化合物的高安全性疫苗配制劑的需求，非常需要 開發(fā)由于NS 1功能喪失而減毒但在細胞培養(yǎng)中仍然顯示高生長性的B型流感病毒株。發(fā)明概述B型流感病毒的臨床分離株通常需要費力而耗時的適應，以實現(xiàn)在Vero細胞上的 高生長。對于A型流感病毒，不僅野生型病毒，而且表達例如38個氨基酸的截短NSl蛋白 的突變體或者完全缺失NSl ORF的突變體，均能夠在干擾素缺陷型Vero細胞上復制到高滴 度。該發(fā)現(xiàn)被用于產(chǎn)生復制缺陷型減毒A型流感活體疫苗。迄今為止，這個概念仍不能應用于B型流感病毒，因為具有無功能NSl蛋白的突變 體不能在組織培養(yǎng)中生長到高滴度?，F(xiàn)在，本發(fā)明人令人驚訝地顯示，通過對B型流感病毒基因組M基因N端區(qū)域附近 的所選核苷酸進行修飾，能大大增加生長能力。B型流感病毒M基因長度大約為l，076bp， 包含 Ml 禾口 BM2 ORF0進一步，本發(fā)明還涵蓋包含所述經(jīng)修飾M基因的重組B型流感病毒。優(yōu)選地，該B 型病毒是復制缺陷型的或者至少是減毒的，例如由于NSl蛋白內(nèi)的刪除。具體地，本發(fā)明涵蓋如下的重組B型流感病毒株，其包含在Ml蛋白氨基酸位置82-90的任何一處，優(yōu)選地在氨基酸位置85-87的任何一處，優(yōu)選地在氨基酸位置86處的修 飾，編碼缺少功能性RNA結合域和羧基端結構域的NSl蛋白的經(jīng)修飾NSl節(jié)段，和任意地位 于M基因核苷酸位置950處的沉默突變。進一步，涵蓋含有本發(fā)明病毒的疫苗配制劑和用于預防性處理流感的方法以及制 備本發(fā)明病毒的方法。本發(fā)明還涵蓋編碼本發(fā)明流感病毒M基因的分離的核酸及其生成。附圖簡述

圖1 野生型、NS14、NS38、NS57和NS80 (a)及野生型和ANSI (b)的B型流感病毒 NS基因的示意性翻譯概覽。圖2 分別表達14、38、57、80個氨基酸的NSl蛋白或野生型NSl蛋白的所指病毒 NS基因的RT-PCR產(chǎn)物。圖3 分別表達14、38、57或80個氨基酸的NSl蛋白或野生型NS 1的B/Malaysia 流感病毒在Vero細胞(a)和A549細胞(b)上的生長。圖4 具有38或80個氨基酸的NSl蛋白或wt NS 1、含有wt M基因或M1-M86V基 因的B/Malaysia流感病毒突變體在轉染后6天的病毒滴度(a)，及含有ANSI基因或具有 38或80個氨基酸的NSl蛋白或wt NS1、含有wtM基因或M1-M86V基因的B/Florida突變 體在轉染后5天的病毒滴度(b)。圖5 原始B/Malaysia/2506/04樣拭子M基因與M1-M86V基因和基因庫已公開的 其它序列的氨基酸比較。圖6:含有ANSI基因或野生型NSl的B/Florida流感病毒在Vero細胞(a)和 A549細胞(b)上的生長。圖7 含有M86V 突變的 B/Vienna/33/06Ml 蛋白(用粗體字標記，SEQ IDNo. 1) (a)， 和含有M86V突變的B/Thilringen/02/06Ml蛋白(用粗體字標記，SEQ ID No. 2) (b)的氨基
酸序列。圖8:已構建B型流感病毒NS突變體概覽。所有已構建B型流感病毒突變 體的遺傳組成(a) ；B/Vienna/33/06M基因M1-M86V的核苷酸序列，SEQ ID No. 3 (b)； B/Vienna/33/06M 基因 M1-M86V 和 C950T 的核苷酸序列，SEQ ID No. 4(c) ；B/ Thiiringen/02/06M 基因 Ml-wt 的核苷酸序列，SEQ ID No. 5 (d) ；B/Thiiringen/02/06M 基因 M1-M86V 的核苷酸序列，SEQ ID No. 6 (e) ；B/Vienna/33/06M 基因 M1-C950T 的核苷酸序列， SEQ ID No. 7(f) ；NS14 的 B/Vienna/33/06NS 基因的核苷酸序列，SEQ ID No. 8 (g) ；NS38 的 B/Vienna/33/06NS 基因的核苷酸序列，SEQ ID No. 9 (h) ；NS57 的 B/Vienna/33/06NS 基因 的核苷酸序列，SEQ ID No.lO(i) ；NS64的B/Vienna/33/06NS基因的核苷酸序列，SEQ ID No.ll(j) ；NS80 的 B/Vienna/33/06NS 基因的核苷酸序列，SEQ ID No. 12 (k) ；ANSl-B 的 B/ Vienna/33/06NS 基因的核苷酸序列，SEQ ID No. 13(1) ； Δ NS1-B 的 B/Thiiringen/02/06NS 基因的核苷酸序列，SEQ ID No. 14 (m)。圖9 具有長度分別為38、80、104和145個aa的NSl蛋白的、表達IL2的B型 流感病毒載體的示意性翻譯概覽(a)；所有已構建的表達IL2的B型流感病毒載體的 遺傳組成(b) ；NS1-38IL2 的 B/Vienna/33/06NS 基因的核苷酸序列，SEQID No. 15(c)； NS1-80IL2 的 B/Vienna/33/06NS 基因的核苷酸序列，SEQ ID No. 16(d) ；NS1-104IL2 的 B/Vienna/33/06NS 基因的核苷酸序列，SEQ ID No. 17(c) ；NS1-145IL2 的 B/Vienna/33/06NS 基因的核苷酸序列，SEQ ID No. 18(f)。圖10 :B/NSl-wt、B/NSl-38和B/NS1-38IL2流感病毒在Vero細胞上傳代5次后的 RT-PCR 產(chǎn)物。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種B型流感病毒M基因的核苷酸序列改變，其能增加B型流感病 毒株的生長能力。這些改變可以包括刪除和替代。本發(fā)明人已經(jīng)成功顯示，B型流感病毒M 蛋白內(nèi)的至少一處單氨基酸改變能導致在細胞培養(yǎng)中，尤其是在Vero細胞內(nèi)的高生長性。 這具體地能夠挽救所表達NSl蛋白與wt NSl蛋白相比長度變短的病毒或帶有完全缺失NSl ORF的突變體。具體地，根據(jù)本發(fā)明的B型流感病毒M基因在M基因核苷酸位置265-294的任何 一處包含至少一個核苷酸修飾，優(yōu)選地在核苷酸位置277-285的任何一處包含至少一個核 苷酸修飾，更優(yōu)選地在核苷酸位置280-282的任何一處包含至少一個核苷酸修飾。具體地，經(jīng)過修飾的M基因在位置280-282處包含核苷酸GTG，而不是所分離病毒 相應序列的ATG。可選擇地，經(jīng)過修飾的M基因在位置280-282也可以包含核苷酸GTA、GTC、 GTT0當然，實施方案也涵蓋相應的RNA密碼子，GUG、GUA、⑶C、GUU。根據(jù)本發(fā)明的一個可選擇實施方案，B型流感病毒M基因包括至少一個核苷酸修 飾，其導致在Ml蛋白氨基酸位置82-90的任何一處，優(yōu)選地在氨基酸位置85-87的任何一 處，優(yōu)選地在氨基酸位置86處產(chǎn)生至少一個氨基酸替代。替代的氨基酸可以是任何氨基 酸；非極性疏水氨基酸是優(yōu)選的。具體地，氨基酸改變導致氨基酸位置86處甲硫氨酸變成 纈氨酸。在Ml蛋白氨基酸位置82-90的任何一處，優(yōu)選地在氨基酸位置85_87的任何一 處，優(yōu)選地在氨基酸位置86處包含至少一個氨基酸替換的Ml蛋白當然也涵蓋在本發(fā)明的 范圍之內(nèi)。替代的氨基酸可以是任何氨基酸；非極性疏水氨基酸是優(yōu)選的。具體地，氨基酸 改變導致氨基酸位置86處甲硫氨酸變成纈氨酸。該Ml蛋白可以通過本領域已知的任何方 法產(chǎn)生。術語“氨基酸替代”是指在該分子親本氨基酸序列的特定位置處存在經(jīng)過修飾的 或不同的氨基酸。氨基酸替代相對于可占據(jù)該位置的任何其它氨基酸而發(fā)生。由氨基酸序 列改變產(chǎn)生的多肽可以包括翻譯后修飾的改變，例如糖基化、乙?；?、磷酸化，或者任何其 它氨基酸修飾以及氨基酸替代。包含本發(fā)明流感病毒M基因的重組B型流感病毒也涵蓋在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在其它方面中，含有根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)修飾M基因的復制缺陷型流感病毒可以進一 步在NS基因內(nèi)含有修飾，具體地缺少部分或者缺少整個NSl蛋白(ANSI)。由于NSl蛋白 的截短或缺少NSl蛋白的表達，這些病毒只能在干擾素缺陷型細胞中復制，但在常見宿主 或生物體內(nèi)喪失生長能力。A型流感病毒的NSl蛋白是一種多功能蛋白，由大約230個氨基酸構成，在感染中 被較早并且大量合成。它對抗細胞的抗病毒活性，是一種毒力因子。通過其羧基端區(qū)域的 活性，NSl蛋白能夠抑制宿主mRNA加工機制。第二，它通過直接與細胞翻譯起始因子相互 作用，有助于病毒mRNA的優(yōu)先翻譯。第三，通過與dsRNA結合并與推定的細胞激酶相互作用，NSl蛋白能夠阻止可被干擾素(IFN-)誘導的、dsRNA-激活的激酶(PKR)，2' 5'寡腺苷 酸合成酶系統(tǒng)和細胞因子轉錄因子的激活。第四，NSl的N端部分與RIG-I結合，并抑制下 游IRF-3的激活，阻止IFN-β的轉錄誘導。因此，NSl蛋白抑制INF-α或INF-β基因的 表達，延遲被感染細胞內(nèi)的凋亡發(fā)生，并阻止相鄰細胞內(nèi)的抗病毒狀態(tài)的形成。B型流感病毒從病毒NS節(jié)段的未剪接轉錄本表達一種281個氨基酸的非結構蛋 白，稱作NS1-B，其與其NSl-A對應物(counterpart)均具有結合相同RNA靶標和體外抑制 PKR激活的能力。與A型流感病毒相反，B型流感病毒NSl不抑制前mRNA剪接，但與干擾素 刺激基因15(ISG15)產(chǎn)物結合，并抑制其與細胞靶標的結合。在NSl蛋白內(nèi)含有修飾的A型流感病毒是本領域已知的。例如，W099/64571介紹 了 NSl基因節(jié)段的完全敲除，WO 99/64068公開了被部分刪除的各種NSl基因節(jié)段。本文引 用這些出版物的全部內(nèi)容作為參考。目前僅知道少數(shù)在NSl蛋白內(nèi)含有修飾的B型流感病 毒，并且在這些由于NSl功能缺失而具有干擾素敏感表型的病毒中，沒有一種可以在Vero 細胞內(nèi)生長到高滴度。在這里，介紹了這些在NSl蛋白內(nèi)具有修飾的病毒的構建。根據(jù)本發(fā)明，NSl蛋白內(nèi)的修飾可以是至少一個氨基酸的刪除、插入或替代，其導 致形成復制缺陷型流感病毒。優(yōu)選地，經(jīng)過修飾的B型流感病毒NSl蛋白包括至少50% NSl氨基酸，優(yōu)選地至少 70%，更優(yōu)選地至少90%的刪除?？蛇x擇地，NSl蛋白的功能性可以被完全消除。根據(jù)本發(fā)明的流感病毒NSl蛋白可以缺少功能性RNA結合域。該位于NSl蛋白氨 基端(氨基酸1-93)的結構域的主要功能是結合dsRNA并抑制PKR的激活(Dauber et al, J Virol. 2006 Dec ；80 (23) 11667-77) 根據(jù)本發(fā)明，術語功能性羧基端結構域可以包括NSl蛋白的如下區(qū)域，其能夠抑 制宿主mRNA加工機制，也就是其活性是抑制宿主細胞的IFN應答。流感B-NSl似乎缺少具有與流感A-NSl相似功能的羧基端效應器結構域。B型流感 病毒NSl蛋白的C端結構域(氨基酸位置84-281)主要負責抑制IFN-α / β應答(Dauber et al,J Virol. 2006Dec ；80(23) 11667-77) 根據(jù)本發(fā)明，B型流感病毒NSl蛋白的羧基端結構域可以被導致沒有功能。該結 構域可以被完全或部分刪除，以及可以替代或插入氨基酸，并且可以對剩余結構域的功能 性進行測試，如本領域中所述(Dauber et al, J Virol. 2006Dec ；80(23) 11667-77) M基因的本發(fā)明突變能夠產(chǎn)生如下的B型流感病毒突變體，其表達一種截短的NSl 蛋白(例如小于80個氨基酸)，因此具有干擾素敏感表型。這些突變體能特別用作具有高 安全性和效力的活減毒疫苗株。M基因內(nèi)的本發(fā)明修飾具體地能增加所述復制缺陷型B型流感病毒的生長能 力。例如，含有M1-M86V突變的、表達80個氨基酸的NSl蛋白(NS1-80)的B型流感病 毒可以獲得范圍在5*105-5*107TCID5Q的滴度，而具有wt Ml蛋白的相似病毒僅能生長到 3*103-3*105TCID5Q。含有短于80個氨基酸，也就是含有14、38、57或64個氨基酸的NSl蛋白 的病毒只能夠用M基因內(nèi)的本發(fā)明修飾加以挽救，并生長到1*104-3*108TCID5(I的滴度范圍。 M1-M86V突變也可以被引入到另一種不同遺傳亞型的B型流感病毒(例如Jiangsu/10/03 樣)的主鏈(backbone)內(nèi)，以證明特別是NSl截短突變體的提高的生長能力是具有普遍性 的，而不是菌株特異性的。在該主鏈中，本發(fā)明M1-M86V突變產(chǎn)生了一種ANSl-B病毒，其
8中NSl ORF被完全刪除，可以在Vero細胞內(nèi)生長到107-108TCID5(1/ml的高滴度范圍。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，重組流感病毒可以包括a)位于Ml蛋白氨基酸位置86處的修飾，b)經(jīng)過修飾的NSl節(jié)段，其編碼缺少功能性RNA結合域和功能性羧基端結構域的 NSl蛋白，和c)任意地，位于M基因核苷酸位置950處的沉默突變。作為本發(fā)明的一個可選擇實施方案，重組復制缺陷型B型流感病毒也可以用作表 達異源序列的載體(vehicle)，例如用于表達趨化因子或細胞因子或其片段。更具體地，它可以是一種重組流感病毒，包括a.位于Ml蛋白氨基酸位置86處的修飾，b.經(jīng)過修飾的NSl節(jié)段，其編碼缺少功能性RNA結合域和功能性羧基端結構域的 NSl蛋白，和c.插入在NSl基因節(jié)段剪接供體位點和剪接受體位點之間的異源序列。任意地，位于M基因核苷酸位置950處的沉默突變。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，該異源序列表達細胞因子或趨化因子或其片段或衍 生物。細胞因子是小分泌蛋白，其介導和調(diào)節(jié)免疫、炎癥和造血。最大一群細胞因子是促 進免疫細胞增殖和分化的細胞因子。這群細胞因子包括白介素，它們是由白細胞產(chǎn)生的細 胞因子，和干擾素，它們可以由多種類型的細胞產(chǎn)生。干擾素(IFN)是一族由脊椎動物(包括哺乳類、鳥類、爬行類和魚類)的免疫系統(tǒng) 細胞響應抗原(例如細菌、病毒、寄生物和腫瘤細胞)攻擊而產(chǎn)生的天然存在糖蛋白。在人 體內(nèi)有三大類干擾素。I型干擾素包括14個IFN-α亞型和一個IFN-β、ω、Κ和ε同等 型(isoform)。II型干擾素包括IFN-γ，而新近發(fā)現(xiàn)的第三類包括IFN-λ，其具有三個不 同的同等型。Thl細胞主要分泌IL-2、IFN_ γ、和TNF-β，而與體液免疫應答有關的Th2細胞分 泌細胞因子，例如IL-4、IL-5、和IL-10。Th2型細胞因子介導針對細胞內(nèi)病原體的遲發(fā)型 超敏反應，并抑制Thl應答。最初衍生自化學引誘物細胞因子的趨化因子實際上包括超過50個成員，代表一 個可誘導的低分子量(其單體形式為6-12kDa)小分泌蛋白家族，在免疫監(jiān)視和炎癥過程中 發(fā)揮決定性作用。根據(jù)它們在免疫和炎癥中的功能，它們可以被分成兩類。炎癥趨化因子 由許多不同的組織細胞以及移行白細胞響應細菌毒素和炎癥細胞因子如IL-1、TNF和干擾 素而產(chǎn)生。它們的主要功能是為宿主防御和在炎癥過程中招募白細胞。另一反面，歸巢趨 化因子在淋巴組織的限定區(qū)域內(nèi)組成性表達。它們指導淋巴細胞和樹突細胞在免疫系統(tǒng) 內(nèi)的運輸(traffic)和歸巢。這些趨化因子，例如80々-1，50 -1或5冗，控制淋巴細胞在成 熟、分化、激活中的重定位(relocation)和再循環(huán)(recirculation)，并保證它們在次級淋 巴器官內(nèi)正確歸巢。根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)顯示，生物學活性細胞因子或趨化因子或其衍生物或片段能用 與表達NSl蛋白的ORF不同的可讀框穩(wěn)定而高效地表達。可選擇地，天然信號肽之外的其 它前導序列可以和細胞因子或趨化因子融合，這可以進一步支持蛋白質(zhì)的有效分泌，并顯示在體內(nèi)高效誘導免疫響應。令人驚訝的是，當與成熟細胞因子/趨化因子相應的氨基酸序列通過用作信號肽 的氨基酸序列，例如可以是小鼠IgKappa信號肽的一部分，與NSl蛋白的一部分融合時，趨 化因子和細胞因子也能夠被高效表達。根據(jù)本發(fā)明，異源序列優(yōu)選地編碼白介素2(IL_2)或其片段或衍生物。IL-2包含 分泌信號序列，是一種免疫調(diào)節(jié)性τ細胞衍生分子，是抗原激活T細胞克隆擴增(clonal expansion)必需的。⑶4+T淋巴細胞分泌IL-2具有多種生物學作用，例如誘導T輔助細胞 和T殺傷細胞的增殖和刺激T細胞產(chǎn)生其它細胞因子。而且，IL-2還能激活B細胞、NK細 胞和巨噬細胞。當從感染非淋巴細胞的重組病毒表達IL-2時，其分泌能顯著降低病毒感染 的發(fā)病，并修飾免疫應答。還已知IL-2可發(fā)揮免疫佐劑的作用。根據(jù)本發(fā)明，所包含的細胞因子和趨化因子的任何片段或衍生物仍具有生物學活 性，也就是，顯示免疫調(diào)節(jié)活性?？蛇x擇地，細胞因子/趨化因子還可以從下組中選出IL_15，GM-CSF, CCL3或 CCL20或其衍生物或片段?？蛇x擇地，它還可以是衍生自結核分枝桿菌，例如ESAT-6，的任何表位或免疫調(diào)節(jié) 區(qū)域?？蛇x擇地，異源序列還可以包括嵌合蛋白，作為與抗原蛋白或抗原肽融合的細胞 因子或趨化因子或其片段或衍生物。融合可以是直接的，或者通過長度是至少4個氨基酸， 優(yōu)選地至少5個氨基酸的肽接頭序列。例如，根據(jù)本發(fā)明的接頭序列是GGGS或GGGGS。IL-2嵌合蛋白的實例是本領域已知的。例如，可以是IL-2_PE40(其中PE是假單 胞菌外毒素A)、DAB389-IL-2 (其中DAB是白喉毒素)或IL_2Bax (其中Bax是人類來源的 促凋亡蛋白)(Aqeilan R. et al.，Biochem. J.，2003，129-140)。根據(jù)本發(fā)明，引入到復制缺陷型流感病毒載體內(nèi)的異源序列的核苷酸序列與其天 然序列顯示至少80%的同一性，優(yōu)選地至少85%同一性，更優(yōu)選地至少90%同一性。包括 核苷酸序列在密碼子使用方面的任何優(yōu)化?？蛇x擇地，異源序列可以包括B細胞或T細胞表位，例如來自流感病毒血凝素的B 細胞表位(HATB)，例如來自流感病毒血凝素(HA)的A環(huán)表位或其部分，或者代表與氨基酸 序列150-159對應的HA免疫顯性表位之一的肽(Catonet al.，1982，Cell,417-427)。表位還可以衍生自與黑素瘤相關的內(nèi)源逆轉錄病毒(MERV)，如W006/119527所 述。根據(jù)一個具體的實施方案，NSl基因節(jié)段可以包含一個功能性天然剪接供體和受 體剪接位點，也就是剪接供體和受體位點被保持為天然位點，即核苷酸沒有被人工技術所 修飾。基于環(huán)境適應或自然病毒株形成，由于流感病毒修飾而自然發(fā)生的，剪接位點處 的任何核苷酸修飾均是天然修飾，不在術語合成或人工修飾的范圍內(nèi)?？蛇x擇地，剪接供體周圍和/或受體位點上游的序列可以被改變。優(yōu)選地，改變或 修飾可以在NS內(nèi)含子5’邊界的5’處3個核苷酸和/或3’處8個核苷酸內(nèi)執(zhí)行，以及在 NS內(nèi)含子3’邊界的5’處100個核苷酸和/或3’處2個核苷酸內(nèi)執(zhí)行。這優(yōu)選地通過引 入合成序列來進行，以便修飾剪接活性。
如果例如異源序列的插入會增大NS內(nèi)含子大小，可以優(yōu)選地修飾剪接供體和/或 受體位點的周圍序列，以提高剪接效力，從而提高重組NS節(jié)段的遺傳穩(wěn)定性。例如，可以進行修飾，改變剪接供體位點周圍的序列，以增加與人UlsnRNA的5’端 的同源性，和 / 或含有分支點(branch point) (Plotch et al. 1986, Proc Natl Acad Sci USA. 83 5444-8 ；Nemeroff et al. 1992，Mol Cell Biol. 12 :962_70)和嘧啶串的剪接受體 位點上游序列用提高NS節(jié)段剪接的序列替換。為了優(yōu)化剪接，引入剪接受體位點5’處的優(yōu)選序列包括套索樣共有序列和嘧啶
串ο考慮到病毒載體的穩(wěn)定性和異源序列的表達速度，重要的是在NS基因內(nèi)的特定 位置，例如剪接受體位點的直接上游，引入含有套索樣共有序列和嘧啶串的合成/修飾序 列。而且，改變套索樣共有序列與嘧啶串間的距離以修改NS節(jié)段的剪接速度可能是 必需的(Plotch S. and Krug R. ,1986, Proc. Natl. Acad. Sci. ,83,5444-5448 ；Nemeroff Μ. et al.，1992，Mol. Cell. Biol.，962-970)。例如，重組B型流感病毒株可以包括如SEQ ID. No. 1或2所示的氨基酸序列，或者 如SEQ ID Nos. 3-18中任何一個所示的核苷酸序列，或者其具有至少98%序列同一性，優(yōu)選 地至少99%序列同一性，優(yōu)選地至少99. 5%序列同一性的衍生物。根據(jù)本發(fā)明，術語“重組”包括所有的用重組技術，例如反向遺傳技術，產(chǎn)生的流感 病毒株。因此，根據(jù)本發(fā)明的流感病毒株包括M基因內(nèi)的修飾，但不需要包括與親本株相比 核苷酸或氨基酸序列內(nèi)的任何進一步修飾。還包括疫苗組合物，其包括與藥學可接受的載體混合的免疫原性誘導有效量的病 毒。組合物中還可以包含佐劑。根據(jù)本發(fā)明，術語“免疫原性”的意思是病毒能夠引發(fā)體液或細胞免疫應答，優(yōu)選 地引發(fā)這兩者。免疫原性實體(entity)也是抗原性的。當施加給動物，優(yōu)選地人類時，免 疫原性誘導有效量的病毒引發(fā)體液或細胞免疫應答，或者引發(fā)兩者。疫苗組合物可用于預防性處理流感疾病，包括向需要治療的人類患者施加免疫原 性誘導有效量的組合物。疫苗組合物可以含有根據(jù)本發(fā)明的整個B型流感病毒，也可以含有重排 (reassortant)病毒株，其中部分的病毒節(jié)段來源于不同的B型流感病毒株，而且節(jié)段，特 別地Ml蛋白來源于根據(jù)本發(fā)明的重組B型流感病毒。本發(fā)明M1-M86V突變可以被進一步 引入到任何其它的B型流感病毒株。組合物可以用于預防、管理、中和、治療和/或改善流感病毒感染的方法或者作為 藥劑。當然還包括根據(jù)本發(fā)明的流感病毒M分子在制造用于治療流感病毒感染的藥劑中的 用途。免疫原性組合物可以包含本發(fā)明的活或失活B型流感病毒。病毒可以通過本領域 技術人員眾所周知的方法加以失活。通用的方法使用福爾馬林和加熱進行失活?；蠲庖咴灾苿┛赡苁莾?yōu)選的，因為它具有更高的免疫原性。這類活的重組免疫 原性制劑的產(chǎn)生可以用傳統(tǒng)的方法完成，其涉及病毒在細胞培養(yǎng)物或含胚的卵(例如含胚 的雞蛋)內(nèi)的繁殖，隨后進行純化。
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術語“藥學可接受的”意思是經(jīng)聯(lián)邦或州政府管理機構批準的或在美國藥典 (U.S.)中列出的。術語“載體”是指與藥物組合物(例如免疫原性或疫苗制劑)伴隨施加的稀釋 劑、佐劑、賦形劑、或載體。鹽水溶液和葡萄糖和甘油水溶液也可以用作液體載體，特別 是用于可注射溶液。合適的賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面 粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石粉、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、(乙) 二醇、水、乙醇等等。合適的藥物載體的實例在E.W.Martin編寫的〃 Remington' s PharmaceuticalSciences "中有介紹。制劑應當根據(jù)給藥方式加以選擇。具體的制劑還可 以取決于病毒是活的還是失活的。術語佐劑是指能提高對抗原的免疫應答的化合物或混合物。本發(fā)明免疫原性制劑的預防和/或治療效果部分地基于獲得或誘發(fā)免疫應答(例 如體液免疫應答)。在一個方面中，免疫原性制劑在受試者或其動物模型(例如小鼠、雪貂、 大鼠或犬模型)中誘導可檢測血清滴度的針對B型流感病毒抗原的抗體?？贵w的血清滴度 可以用本領域技術人員已知的技術加以確定，例如免疫測定，例如ELISA或血凝素抑制試 驗。根據(jù)本發(fā)明，還包括產(chǎn)生病毒的方法，其中該方法包括使用表達本發(fā)明流感病 毒M分子的重組表達系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明，表達系統(tǒng)可以是任何有用的質(zhì)粒，例如Hoffmann 等((Hoffmann et al. 2000, Proc Natl Acad Sci USA. 97 :6108_13)所述，或者是根據(jù) EP07450177的線性表達構建體。為了開發(fā)重排體和/或表達經(jīng)過修飾的流感病毒株，可以使用Vero細胞上的 反向遺傳系統(tǒng)。該技術是本領域早就眾所周知的(Pleschka S. et al. , 1996, J.Virol., 70(6),4188-4192,Neumann and Kawaoka,1999,Adv. Virus Res.，53，265-300，Hoffmann et al. 2000，Proc Natl Acad Sci USA. 97 :6108_13)。用于使用培養(yǎng)基培養(yǎng)病毒的細胞可以是任何細胞，其能夠在體外在合成培養(yǎng)基內(nèi) 生長，并可用于病毒的繁殖。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術語“細胞”是指各細胞、組織、器官、昆蟲 細胞、鳥類細胞、哺乳類細胞、雜交瘤細胞、原代細胞、連續(xù)細胞系和/或遺傳工程細胞，例 如表達病毒的重組細胞的培養(yǎng)。這些可以是例如BSC-I細胞、LLC-MK細胞、CV-I細胞、CHO 細胞、COS細胞、鼠科動物細胞、人細胞、HeLa細胞、293細胞、VERO細胞、MDBK細胞、MDCK細 胞、MDOK細胞、CRFK細胞、RAF細胞、TCMK細胞、LLC-PK細胞、PK15細胞、W1-38細胞、MRC-5 細胞、T-FLY細胞、BHK細胞、SP2/0細胞、NS0、PerC6 (人視網(wǎng)膜細胞)、雞胚細胞或衍生物、 含胚的卵細胞、含胚的雞蛋或其衍生物。優(yōu)選地，細胞系是VERO細胞系。用于產(chǎn)生病毒的培養(yǎng)基可以是來自現(xiàn)有技術的、可用于病毒培養(yǎng)的任何已知培養(yǎng) 基。優(yōu)選地，培養(yǎng)基是合成培養(yǎng)基。這可以是例如基礎培養(yǎng)基，如經(jīng)修飾Eagle培養(yǎng)基MEM、 極限必需培養(yǎng)基MEM、Dulbecco修飾Eagle培養(yǎng)基D-MEM、D-MEM-F12培養(yǎng)基、William氏 E培養(yǎng)基、RPMI培養(yǎng)基及其類似物和衍生物。這些也可以是專業(yè)細胞培養(yǎng)和病毒生長培養(yǎng) 基，如 VP-SFM、OptiPro SFM, AIM V .培養(yǎng)基、HyQ SFM4MegaVir , EX-CELL VeroSFM、 EPISERF、ProVero、任何293或CHO培養(yǎng)基及其類似物和衍生物。這些培養(yǎng)基可以補充任何 先現(xiàn)有技術已知的、可用于細胞和病毒培養(yǎng)的添加劑，例如動物血清及其組分或類似物、氨 基酸、生長因子、激素、緩沖液、微量元素、胰蛋白酶、丙酮酸鈉、維生素、L-谷氨酰胺和生物學緩沖液。優(yōu)選的培養(yǎng)基是補充了 L-谷氨酰胺和胰蛋白酶的OptiPRO SFM。使用本發(fā)明的M基因修飾，在比較未修飾和改良M基因的病毒滴度(TCID5tl)時，B 型流感病毒NSl截短突變體的生長速度可以增加至少大約100-1000倍，如NS1-38病毒已 證明的。對于表達分別含有14、57或80個氨基酸的NSl蛋白的B型流感病毒，M基因中的 突變是產(chǎn)生這些病毒絕對需要的。這些病毒可以生長到大約IO6-IO8TCID5ci的滴度。本發(fā)明進一步的實施方案是編碼本發(fā)明流感病毒M基因的分離的核酸和/或含有 該經(jīng)修飾M基因的重組B型流感病毒。進一步，用于制備所述核酸的方法包括將核苷酸序列引入到編碼本發(fā)明M分子的 載體內(nèi)。如果使用DNA載體，所述載體是反義(minus sense)流感RNA的轉錄系統(tǒng)。例如， 它可以是如 Hoffmann et al. ,2000, Proc Natl Acad Sci USA. 97 :6108_13 使用的載體。通過參考如下的實施例可以對前述介紹有更完全的理解。然而，這些實施例僅僅 代表實踐本發(fā)明一個或多個實施方案的方法，不應看作對本發(fā)明的范圍具有限制。
實施例實施例1 表達截短NSl蛋白、用作復制缺陷型減毒活流感疫苗的B型流感病毒產(chǎn)生了 一種反向遺傳系統(tǒng)，用于構建適合Vero的B型流感病毒株(B/ Vienna/33/06 亞型為 B/Malaysia/2506/04)，作為 B/Victoria/2/87 譜系的一個 代表(Hoffmann et. al 2000，PNAS 97(11) :6108_13)。HA 和 NA 從流感病毒 B/ ThUringen/02/06(B/JiangSu/10/03樣)克隆。通過在Ml蛋白內(nèi)引入編碼突變(在氨基 酸位置86將甲硫氨酸變?yōu)槔i氨酸)，可以獲得表達截短形式的，14、38、57和80個氨基酸的 NSl蛋白的流感病毒突變體，并分別命名為B/MalaysiaNSl-14、NSl-38、NSl-57或NS1-80。 NSl的翻譯被兩個連續(xù)的框內(nèi)(in frame)終止密碼子終止，位于終止密碼子的下游直到 NEP剪接信號的非翻譯部分被刪除(圖la)。由于NS基因的不同長度，含有不同長度NSl 蛋白的病毒可以通過RT-PCR根據(jù)它們的大小加以區(qū)分(圖2)。所有已產(chǎn)生的突變體均可 在干擾素缺陷型Vero細胞上復制到高滴度(圖3a)，但在干擾素有效的(competent) A549 細胞上被減弱(圖3b)。M基因內(nèi)的本發(fā)明修飾能特異地增加所述復制缺陷型B型流感病毒的生長能 力。例如，在轉染后6天進行分析時，含有M1-M86V突變的、表達80個氨基酸的NSl蛋白 (NS1-80)的B型流感病毒生長到大約5. 62*104TCID5Q的滴度，相比之下，在Ml中不含任何 修飾的相似病毒的滴度為大約1. 33*104TCID50(圖4a)。在沒有適應性Ml突變時，表達38 個氨基酸的NSl蛋白(NS1-38)的B型流感病毒根本不能被挽救，但是當引入了 M1-M86V突 變時，可生長到大約3. 16*102 TCID50的平均滴度(圖4a)。根據(jù)滴度顯示，這種作用在轉染 后第二次傳代中甚至更加顯著(表1)。用表達分別為14或57個氨基酸的B型流感病毒 觀察到相同的挽救效率，其僅在存在M1-M86V突變時被挽救(數(shù)據(jù)未顯示)。在Vero細胞 上的進一步適應性傳代(adaptive passage)導致所有NSl突變體產(chǎn)生6. 5-8. 51og TCID50 的高滴度范圍，這是有效產(chǎn)生疫苗所需要的(圖3a)。本發(fā)明突變對wt NSl病毒的生長沒 有影響或者僅有微弱的影響。在轉染6天(圖4a)和轉染后第二次傳代中(表1)，含有未 修飾M基因的wt NSlB型流感病毒甚至生長到比含有M1-M86V突變的相似病毒略微更高的滴度。這可以解釋為不同傳代之間的生長差異，如轉染后第一次傳代的生長所證明的(比 較而言，具有wt M基因的為1.78*107 TCID5tl，具有M1-M86V的為2. 82*107TCID5Q，它們均含 有wt NS基因)。表1 具有wt、NS80或NS38NS1蛋白與wt或M1-M86V M基因的組合的B型流感病毒在 轉染后第二次傳代中于感染后4天的病毒滴度(TCID50)。因此，只有該新型突變能夠產(chǎn)生表達短NSl蛋白(即包含少于N端頭80個氨基 酸)的B型流感病毒突變體，其具有無功能性NS1，因此具有干擾素敏感表型。因此，這些突 變體能用作疫苗株。該突變在先前沒有介紹，在NIBSC序列數(shù)據(jù)庫中也沒有發(fā)現(xiàn)。圖5顯 示了 M基因原始B/Malaysia/2506/04樣拭子(swab)與M1-M86V基因和基因庫中公開的其 它序列的序列比較。實施例2 :M1蛋白中的本發(fā)明突變(M86V)能夠在不同B型流感病毒譜系中在Vero 細胞上產(chǎn)生具有截短NSl蛋白的B型流感病毒為了測試M1-M86V突變在其它B型流感病毒株中的影響，產(chǎn)生了一個反向遺傳系 統(tǒng)，用于產(chǎn)生流感病毒 B/Thiiringen/02/06 (B/Jiangsu/10/03 樣)，作為 B/Yamagata/16/88 譜系的一個代表，并在Ml蛋白內(nèi)引入所述突變(M86V)。為了遵循WHO關于北半球 2008/2009季流感疫苗株的推薦，使用B/Florida/04/06樣病毒的HA和NA。獲得了表達截 短形式的、38和80個氨基酸的NSl蛋白的B型流感突變體或者完全刪除NSl ORF ( Δ NS1-B) 的突變體(圖lb)，其中NS2/NEP被表達作為單順反子RNA，并分別命名為B/Florida NS1-38、NS1-80 或 ANS1-B。與 B/Victoria/2/87 譜系的一個代表，B/Malaysia 的突變體 的情況相同，M1-M86V突變對Yamagata譜系的一個代表，B/Florida的NS1-80和NSl-wt病 毒的挽救效力僅有很小的影響(圖4b)。這可以被如下地證明，即與含有wtM基因的突變體 相比，轉染后5天的滴度有略微的增加(圖4b)。含有M1-M86V突變的NS1-38突變體的病 毒滴度比wt Ml類似物高大約41og。由于M1-M86V突變，我們能夠挽救Δ NSl-B病毒，在轉 染后5天使滴度到達幾乎41og(圖4b)。為了證明ANSl-B病毒的復制缺陷表型，我們檢查了它在IFN缺陷型Vero細胞 (圖6a)和IFN有效型A549細胞(圖6b)上生長的能力，并與相應的wt病毒進行比較。兩 種病毒在Vero細胞上顯示相當?shù)纳L動力學，達到107-108TCID5(1/ml的滴度范圍。ANSl-B 病毒的復制在IFN有效型A549細胞中被完全限制，沒有展示超過檢出極限2xl02TCID5(l/ml 的生長，而NSl-wt病毒復制到了 3. 15xl08TCID50/ml的高滴度。突變病毒NS1-80和NS1-38 顯示中間的復制能力(數(shù)據(jù)未顯示)。
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這些數(shù)據(jù)顯示，適應性Ml突變不僅在一種病毒株內(nèi)具有生長優(yōu)化效果，而且在其 它流感B譜系中似乎也有效。而且，數(shù)據(jù)證明，此突變對于挽救其中NSl ORF被完全刪除的 ANSl-B病毒，使之在Vero細胞內(nèi)生長到高滴度是至關重要的。因此，這是一個廣泛適用 的用于產(chǎn)生復制缺陷型B型流感病毒的概念，其中減毒機制是基于NSl (主要的干擾素拮抗 劑)的除去。實施例3 使用雙順反子表達策略從NS基因表達人白介素2的B型流感病毒載體， 作為具有改善的免疫原性(特別是在老年人中)的潛在減毒活流感疫苗分別在B型流感病毒NSl蛋白的氨基酸位置38、80、104或145之后插入重疊的終 止-起始密碼子盒(TAATG)，之后是人IL2的編碼序列。此外，用一段29個核苷酸的合成 序列替換IL2終止密碼子和NS2剪接受體位點(EP7450176. 8)之間的部分，該合成序列包 含套索樣共有序列和之后的優(yōu)化剪接位點，一個20個堿基的嘧啶串節(jié)段(優(yōu)化剪接)(圖 9a)。通過在Ml蛋白內(nèi)引入本發(fā)明突變(M86V)，我們成功地挽救了流感B/ Thuringen/02/06 (B/Jiangsu/10/03樣)主鏈內(nèi)的B型流感病毒/NS1-38IL2。沒有本發(fā)明 Ml蛋白內(nèi)的修飾，病毒不被挽救。盡管B/NS1-38IL2的生長比“空載體”B/NS1-38略低，但 也實現(xiàn)了超過61ogl0TCID50/ml的滴度(表2)。將此儲備物(stock)在Vero細胞上進一 步傳代5次，以檢查遺傳穩(wěn)定性。沒有發(fā)現(xiàn)刪除突變體的出現(xiàn)，因為存在NS基因預期大小 的RT-PCR條帶，而沒有出現(xiàn)潛在反映刪除突變體的較小PCR條帶(圖10)。用B/NS1-38IL2感染的Vero細胞分泌高水平的超過2. 5 μ g/ml的IL2，而在未感 染細胞(模擬)、用B/NS1-38或B/NSl-wt感染的細胞內(nèi)則沒有可檢測的IL2水平(表2)。 這些載體能用作具有升高免疫原性(特別是在老年人中)的活流感疫苗，這已經(jīng)為A型流 感所證明(Ferko, Kittel et al 2006)。表2 指定病·I在Vero細胞內(nèi)的復制和人IL2的表達水平
病毒滴度人 IL2 ELISA
[TCID50/ml][pg/ml]
B/NSl-wt2. 88E+07< 19
B/NS1-381. 78E+08< 19
B/NS1-38IL22，31E+062687
模擬-< 19
我們研究了全部3個實施例中所產(chǎn)生病毒的免疫原性。從這些
論，本發(fā)明的M1-M86V突變對所構建病毒的免疫原性沒有負面影響，例如通過相應A型流感 病毒的相當免疫原性數(shù)據(jù)所證明的。
權利要求
一種B型流感病毒M基因，其包含M基因核苷酸位置265 294任何一個處至少一個核苷酸的修飾，優(yōu)選核苷酸位置277 285任何一個處至少一個核苷酸的修飾，更優(yōu)選核苷酸位置280 282任何一個處至少一個核苷酸的修飾。
2.依照權利要求1的B型流感病毒M基因，其在位置280-282處包含核苷酸GTG、GTA、 GTC、GTT、⑶G、GUA、⑶C、GUU。
3.—種B型流感病毒M基因，其包含至少一處核苷酸修飾，其導致Ml蛋白氨基酸位置 82-90任何一個處，優(yōu)選氨基酸位置85-87任何一個處，優(yōu)選氨基酸位置86處的至少一處氨 基酸替代。
4.依照權利要求1-3中任一項的B型流感病毒M基因，其中替代所用的氨基酸是非極 性疏水氨基酸。
5.依照權利要求1-4中任一項的B型流感病毒M基因，其中所述氨基酸是纈氨酸。
6.一種重組B型流感病毒，其包含權利要求1-5中任一項的流感病毒M基因。
7.依照權利要求6的重組病毒，其中所述病毒是重排病毒。
8.依照權利要求6或7的重組流感病毒，其中所述病毒是減毒的或復制缺陷的，優(yōu)選是 完全復制缺陷的。
9.依照權利要求6-8中任一項的重組流感病毒，其中所述病毒包含NS基因內(nèi)的修飾。
10.依照權利要求6-9中任一項的重組流感病毒，其中它包含經(jīng)修飾的NSl節(jié)段，其編 碼缺少功能性RNA結合域和功能性羧基端結構域的NSl蛋白。
11.一種重組流感病毒，其包含a.Ml蛋白氨基酸位置86處的修飾，b.經(jīng)修飾的NSl節(jié)段，其編碼缺少功能性RNA結合域和功能性羧基端結構域的NSl蛋 白，和c.任意地，M基因核苷酸位置950處的沉默突變。
12.—種重組流感病毒，其包含a.Ml蛋白氨基酸位置86處的修飾，b.經(jīng)修飾的NSl節(jié)段，其編碼缺少功能性RNA結合域和功能性羧基端結構域的NSl蛋 白，和c.插入在所述NSl基因節(jié)段剪接供體位點和剪接受體位點之間的異源序列，d.任意地，M基因核苷酸位置950處的沉默突變。
13.一種重組B型流感病毒，其包含如SEQ ID No. 3-18中任一項所示的核苷酸序列。
14.一種重組B型流感病毒，其包含如SEQ ID No. 1或2所示的氨基酸序列或其具有至 少98 %序列同一性的衍生物。
15.一種疫苗組合物，其包含與藥學可接受載體混合的免疫原性誘導有效量的權利要 求6-14中任一項的病毒。
16.一種用于預防性處理流感的方法，包括向需要治療的人類患者施用免疫學誘導有 效量的權利要求15的組合物。
17.一種制備依照權利要求6-14中任一項的病毒的方法，其中該方法包括在反向遺傳 系統(tǒng)中引入表達依照權利要求1-5中任一項的流感病毒M分子的重組載體。
18.一種提高復制缺陷型B型流感病毒的生長速率的方法，其中所述B型流感病毒含有2依照權利要求1-5中任一項的M基因。
19.一種分離的核酸，其編碼權利要求1-5中任一項的流感病毒M基因。
20.一種用于制備依照權利要求19的核酸的方法，該方法包括將核苷酸序列引入編碼 依照權利要求1-5中任一項的M分子的核酸中。
21.權利要求1-5中任一項的流感病毒M分子，用作治療或預防流感病毒感染的藥劑。
22.權利要求1-5中任一項的流感病毒M分子在制造用于治療流感病毒感染的藥劑中 的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了在M基因N端附近，更具體地，在M基因核苷酸位置265-294任何一個處具有至少一個核苷酸的修飾的B型流感病毒M基因，以及包含這種經(jīng)修飾M基因的B型流感病毒。進一步，公開了它用于制備疫苗的用途及用于制備所述經(jīng)修飾流感病毒的方法。
文檔編號C07K14/11GK101903043SQ200880122161
公開日2010年12月1日 申請日期2008年12月22日 優(yōu)先權日2007年12月21日
發(fā)明者克里斯琴·基特爾, 妮娜·雷斯尼格 申請人:阿維爾綠山生物技術研究發(fā)展貿(mào)易股份公司