專利名稱：抗人流感病毒人型抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對人流感A型病毒的H3N2亞型具有中和活性、與人流感A型病毒的 H3N2亞型的血凝素HAl區(qū)域結(jié)合，或?qū)θ肆鞲蠦型病毒具有中和活性的抗人流感病毒人型抗體。本申請要求通過參照而援引于此的日本申請?zhí)卦?008-330425號和特愿 2009-146832號優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
流感病毒屬于正黏液病毒科，分為A型、B型和C型三個屬，分別稱為流感A型病毒、流感B型病毒、流感C型病毒。通常，流感病毒多數(shù)是指A型和B型。A型、B型和C型的不同是基于構(gòu)成病毒粒子的蛋白質(zhì)中、Ml蛋白質(zhì)和NP蛋白質(zhì)的抗原性的不同。另外，即使相同的A型或B型，也由于作為包膜表面上的分子的紅細胞凝集素(血凝素，以下也簡稱為“HA”)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的抗原性的不同而分別分類為多個亞型和株，例如流感A型病毒分類為Hmi、H2N2、H3N2等各亞型。因為人流感A型病毒的HA和NA周期性地變異，所以即使接受對應(yīng)于從前的亞型的疫苗接種，很多時候也不能期待其效果。流感A型病毒的HA，由稱為球狀部區(qū)域(head region)和干區(qū)域(stem region) 結(jié)構(gòu)的不同區(qū)域構(gòu)成，球狀部區(qū)域含有病毒與靶細胞結(jié)合的受體結(jié)合部位、與HA的紅細胞凝集活性相關(guān)，干區(qū)域含有對病毒的包膜與細胞的核內(nèi)體膜間的膜融合必需的融合肽、與融合活性相關(guān)(非專利文獻1)。識別流感A型病毒的H1N1、H2N2各亞型的抗HA抗體大部分是識別HA的球狀部區(qū)域。但是，該區(qū)域是最容易發(fā)生抗原變異的部位，這些抗體無法通用地與人流感A型病毒的亞型反應(yīng)，伴隨著病毒的HA的抗原變化，很多時候失去了識別性。在專利文獻1和非專利文獻2中公開有利用流感A型病毒H3N2亞型的1種HA的干區(qū)域的氨基酸序列合成多肽、獲得了與該多肽對應(yīng)的抗體，但這些抗體的病毒中和活性弱(專利文獻1)，另外用作抗原的多肽本身也不顯示與用H3N2亞型免疫而得到的兔抗病毒血清發(fā)生反應(yīng)，在抗原性這方面存在問題(非專利文獻2)。如果能夠得到對流感病毒的亞型通用地識別在HA分子或NA分子等中很難發(fā)生抗原變異的抗原部位、對流感病毒具有中和活性的抗體，則可以用于因病毒感染而導(dǎo)致的發(fā)病的診斷、預(yù)防以及治療，并且該抗原部位本身也可用作疫苗。公開有對流感A型病毒的Hmi亞型和H2N2亞型具有病毒中和活性、對H3N2亞型不顯示中和活性的抗體(專利文獻2、3)。另外，公開有識別流感A型病毒的H3N2亞型的干區(qū)域的特定多肽序列、但不識別 HlNl亞型和H2N2亞型的抗體(專利文獻4)。另外，公開有中和流感A型病毒的H3N2亞型的人Fab抗體(專利文獻5、非專利文獻3)。引起世界性流行、導(dǎo)致很多死者的流感是A型的人流感(專利文獻2 4)。流感 A型病毒的H3N2亞型是過去引起世界性流行的亞型，近年來已報道即使對于金剛烷胺等具有抗流感病毒作用的藥物，耐藥性株也增多了(New York Times, January 15,2006)。但是， 對于流感A型病毒的H3N2亞型、流感B型病毒，沒有報道針對近20年高度保守的區(qū)域有效地顯示中和活性的抗體?，F(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻專利文獻1 日本特表昭59-501714號公報專利文獻2 日本特開平6-100594號公報專利文獻3 日本特開平7465077號公報專利文獻4 日本特開平7-304799號公報專利文獻5 日本特開2006-2M777號公報非專利文獻非專利文獻1 :Rev. Biochem.，56，365-394 (1987)非專利文獻2 =Cell, 28,477-487 (1982)非專利文獻3 =Microbiol. Immunol. ,52,162-170(2008)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的課題是提供對人流感病毒具有中和活性的人型抗體。更詳細而言，課題是提供對人流感A型病毒的H3N2亞型或人流感B型病毒識別高度保守的區(qū)域、具有中和活性的人型抗體。本發(fā)明人等為了解決上述課題進行了認真研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以使用從流感疫苗接種后的健康人獲得的末梢血單核細胞和能夠高效地與來自人的淋巴細胞進行細胞融合的細胞來制造雜交瘤細胞，篩選出與來自流感病毒的蛋白質(zhì)具有結(jié)合活性的抗體產(chǎn)生細胞， 由此生產(chǎn)抗人流感病毒人型抗體。在得到的抗體中，篩選出尤其對于人流感A型病毒的 H3N2亞型或人流感B型病毒可識別高度保守的區(qū)域、具有中和活性的人型抗體，由此得到本發(fā)明的抗體。S卩，本發(fā)明如下所述。1. 一種抗人流感病毒人型抗體，對人流感A型病毒H3N2亞型具有中和活性、與人流感A型病毒H3N2亞型的血凝素HAl區(qū)域結(jié)合，或?qū)θ肆鞲蠦型病毒具有中和活性。2.如前項1所述的抗人流感病毒人型抗體，其中，抗人流感病毒人型抗體對人流感A型病毒Hl亞型和人流感A型病毒H2亞型沒有中和活性。3.如前項1所述的抗人流感病毒人型抗體，其中，其是抗流感人型抗體，對人流感 A型病毒H3N2亞型具有中和活性的抗體至少對A/Hiroshima/52/05株具有中和活性，對人流感B型病毒具有中和活性的抗體至少對B/Malaysia/2506/04株具有中和活性。4.如前項1 3中任一項所述的抗人流感病毒人型抗體，其中，在構(gòu)成人流感A型病毒H3N2亞型的血凝素HAl的氨基酸序列中，抗體識別的抗原決定部位是從N末端計數(shù)包含第173-181氨基酸序列的區(qū)域和/或包含第227-239氨基酸序列的區(qū)域。5.如前項4所述的抗人流感病毒人型抗體，其中，抗原決定部位包括含有以下序列號1或2表示的氨基酸序列的氨基酸序列；或者在這些氨基酸序列中，取代、缺失、添加或?qū)? 2個氨基酸的任一種氨基酸序列，dnfdklyiwg (序列號 ι)；2) kfdklyiffg (序列號 2)。
6.如前項4所述的抗人流感病毒人型抗體，其中，抗原決定部位包括含有以下序列號3或4表示的氨基酸序列的氨基酸序列；或者在這些氨基酸序列中，取代、缺失、添加或?qū)? 2個氨基酸的任一種氨基酸序列，1) SSRISIYWTIVKP (序列號 3)；2)PSRISIYWTIVKP(序列號 4)。7. 一種抗人流感病毒人型抗體，編碼抗體可變區(qū)域的DNA堿基序列包括選自以下序列號5 12表示的任一種堿基序列中的堿基序列；或者在這些堿基序列中，取代、缺失、添加或?qū)? 多個核苷酸的任一種堿基序列，1)GAGGAGAACCTGTTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTG CAGGCTCTGGATTCACGTTTAGTACTTACGCCATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGACAGGGGCTGGAGTGGGTC TCCTCTATTAGCGGTAGTGGTGAAATTTCCTATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCTGTTCACCATCTCCAGGGACAA TTCCAAGGACACAGTGTTTCTGCAAATGACCAGCCTGAGAGCCGAAGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAATCCG ACGTTTGGGAGGGTTATCGACCCTCAAAAGATGCTCTTCATATGTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA (序列號5)；2)GACGTCCAGATGACTCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACT TGTCGGGCAAGTCAGAGCGTGAGCAATTATGTGAATTGGTATCAACAGAAGCCAGGGAGAGCCCCTAGGCTCCTCA TCTCTAGTGCGTCCAATTTGTGGGCTGGGGTCCCGCCAAGTTCAGTGGCCGTGGAGAAGAGACAGACTTCACTCTC ACCATCACCAGTCTGCAACCTGAAGATTCTGCAGTTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTGACCTTCTCAGTTTCG GCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA(序列號 6)；3)CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCA AGGCTTCTGGATACACCTTCACCTCTTATTCTATATATTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATG GGATGGATCAACACCAACACTGGGAACCCAAGCTATGCCCAGGGCTTCACAGGACGGTTTGTCTTCTCCTTCGACAC CTCTGTCAGCACGGCATATCTGGAGATCAGCAGCCTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGG GAGATTACGATATTTTGACTGGTTATTATTATTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA (序列號7)；4)CAGACTGTGGTGACCCAGGAGCCATCGTTCTCAGTGTCCCCTGGAGGGACAGTCACACTCACTTGTG GCTTGAGCTCTGGCTCAGTCTCTCCTAGTTACTACGCCAGCTGGTACCAGCAGACCCCAGGCCAGGCTCCACGCACG CTCATCTACAACACAAACACTCGCTCCTCTGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCTTCCTTGGGAGCGACGCTGC CCTCACCATCACGGGGGCCCAGGCAGATGATGAGTCTGATTATTTCTGTGTGCTGTATATGCCTAGTGGCGATTGGG TTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT(序列號 8)；5)CAGGTGCAGTTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTTACAGACCCTGTCCCTCACCTGCG TTGTCTCTGGTGACTCCATCAGCAGGGGTGGTTACTACTGGAGTTGGGTCCGCCAGCCCCCAGAGAGGGGCCTGGAG TGGATTGGGGACATCTATCACAGTGGGAGTACCAACTACAACCCGGCCCTCAAGAGTCGAACTACCATCTCAGTAGA GACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCCGTGTATTACTGTGCCAGAG AGCCTCCACCTGACTACAGTGACTACAAGGTTGGGAAGGGTTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAGCCCTGGTCACC GTCTCCTCA (序列號鍆；6)GAAATTGTGTTGGCACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCC TGCAGGGCCAGTGAGACCGTTGACACCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCA TAAATGATGCATCCAAGAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCGGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTGGTGTCAGCAGCATAGCAACTGGCCCCCCACCTTC GGCCAAGGGTCACGGCTGGAGATTAAA(序列號 10)；7)CAGGTGAAGTTGGTGCAGTCTGGCGGAGGCGCAGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTG AGGCGTCTGGATTCGACTTCACTGTGTATGACATCCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTTGAGTGGGT GGCATCTATTTGGCATAACGGAGGAAAAGCATATTATGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCGTGTCCAGAGACA ATCCCCAGAAGACAGTGTATCTGCAAATGAGTGGCCTGAGACCCGAGGACACGGCTACATATTACTGTGCGAGAGAG TTTCCTTTCATGGGCATCTATGACTACGGCATGGACGCCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCGCCTCA (序列號 11)；8)CAGTCTGTGCTGGCTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCATCATCTCTTGTT CTGGAACCTCCTCCAACATCGGCGGTAATTCTGTCAACTGGTACCAGCACCCCCCAGGGGCGGCCCCGAGACTCCTC ATCTATACTACCGATCAGCGACCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCTGCCTCCCT GGCCATCAGTGGGCTCCAATCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGAAGTTTGGGATGACAGCCTGACTCGTCCGG TGTTCGGCGGAGGGACCAAGTTGACCGTCCTACGT(序列號 12)。8.如前項7所述的抗人流感病毒人型抗體，其中，抗人流感病毒人型抗體的抗原是人流感病毒的 A/Hiroshima/52/05 株或 B/Malaysia/2506/04 株。9.如前項7所述的抗人流感病毒人型抗體，其中，在編碼抗體可變區(qū)域的DNA中， 具有序列號5 8表示的可變區(qū)域的抗體是對人流感A型病毒的H3N2亞型具有中和活性的抗體；具有序列號9 12表示的可變區(qū)域的抗體是對人流感B型病毒具有中和活性的抗體。10.如前項8所述的抗人流感病毒人型抗體，其中，在編碼抗體可變區(qū)域的DNA中， 序列號5、7、9和11所示的DNA是編碼重鏈可變區(qū)域的DNA ；序列號6、8、10和12所示的DNA 是編碼輕鏈可變區(qū)域的DNA。11.如前項1 11中任一項所述的抗人流感病毒人型抗體，其中，抗體是全 (intact)抗體。12. 一種含有多核苷酸的DNA，是編碼權(quán)利要求1 11中任一項所述的抗人流感病毒人型抗體的可變區(qū)域的DNA，該多核苷酸由下述堿基序列構(gòu)成選自以下序列號5 12 所示的任一種堿基序列的堿基序列；或者在這些堿基序列中，取代、缺失、添加或?qū)? 多個核苷酸的任一種堿基序列，1)GAGGAGAACCTGTTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTG CAGGCTCTGGATTCACGTTTAGTACTTACGCCATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGACAGGGGCTGGAGTGGGTC TCCTCTATTAGCGGTAGTGGTGAAATTTCCTATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCTGTTCACCATCTCCAGGGACAA TTCCAAGGACACAGTGTTTCTGCAAATGACCAGCCTGAGAGCCGAAGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAATCCG ACGTTTGGGAGGGTTATCGACCCTCAAAAGATGCTCTTCATATGTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA (序列號5)；2)GACGTCCAGATGACTCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACT TGTCGGGCAAGTCAGAGCGTGAGCAATTATGTGAATTGGTATCAACAGAAGCCAGGGAGAGCCCCTAGGCTCCTCA TCTCTAGTGCGTCCAATTTGTGGGCTGGGGTCCCGCCAAGTTCAGTGGCCGTGGAGAAGAGACAGACTTCACTCTC ACCATCACCAGTCTGCAACCTGAAGATTCTGCAGTTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTGACCTTCTCAGTTTCG GCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA(序列號 6)；
3)CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCA AGGCTTCTGGATACACCTTCACCTCTTATTCTATATATTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATG GGATGGATCAACACCAACACTGGGAACCCAAGCTATGCCCAGGGCTTCACAGGACGGTTTGTCTTCTCCTTCGACAC CTCTGTCAGCACGGCATATCTGGAGATCAGCAGCCTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGG GAGATTACGATATTTTGACTGGTTATTATTATTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA (序列號7)；4)CAGACTGTGGTGACCCAGGAGCCATCGTTCTCAGTGTCCCCTGGAGGGACAGTCACACTCACTTGTG GCTTGAGCTCTGGCTCAGTCTCTCCTAGTTACTACGCCAGCTGGTACCAGCAGACCCCAGGCCAGGCTCCACGCACG CTCATCTACAACACAAACACTCGCTCCTCTGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCTTCCTTGGGAGCGACGCTGC CCTCACCATCACGGGGGCCCAGGCAGATGATGAGTCTGATTATTTCTGTGTGCTGTATATGCCTAGTGGCGATTGGG TTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT(序列號 8)；5)CAGGTGCAGTTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTTACAGACCCTGTCCCTCACCTGCG TTGTCTCTGGTGACTCCATCAGCAGGGGTGGTTACTACTGGAGTTGGGTCCGCCAGCCCCCAGAGAGGGGCCTGGAG TGGATTGGGGACATCTATCACAGTGGGAGTACCAACTACAACCCGGCCCTCAAGAGTCGAACTACCATCTCAGTAGA GACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCCGTGTATTACTGTGCCAGAG AGCCTCCACCTGACTACAGTGACTACAAGGTTGGGAAGGGTTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAGCCCTGGTCACC GTCTCCTCA (序列號鍆； 6)GAAATTGTGTTGGCACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCC TGCAGGGCCAGTGAGACCGTTGACACCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCA TAAATGATGCATCCAAGAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCT CACCATCAGCGGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTGGTGTCAGCAGCATAGCAACTGGCCCCCCACCTTC GGCCAAGGGTCACGGCTGGAGATTAAA(序列號 10)；7)CAGGTGAAGTTGGTGCAGTCTGGCGGAGGCGCAGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTG AGGCGTCTGGATTCGACTTCACTGTGTATGACATCCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTTGAGTGGGT GGCATCTATTTGGCATAACGGAGGAAAAGCATATTATGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCGTGTCCAGAGACA ATCCCCAGAAGACAGTGTATCTGCAAATGAGTGGCCTGAGACCCGAGGACACGGCTACATATTACTGTGCGAGAGAG TTTCCTTTCATGGGCATCTATGACTACGGCATGGACGCCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCGCCTCA (序列號 11)；8)CAGTCTGTGCTGGCTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCATCATCTCTTGTT CTGGAACCTCCTCCAACATCGGCGGTAATTCTGTCAACTGGTACCAGCACCCCCCAGGGGCGGCCCCGAGACTCCTC ATCTATACTACCGATCAGCGACCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCTGCCTCCCT GGCCATCAGTGGGCTCCAATCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGAAGTTTGGGATGACAGCCTGACTCGTCCGG TGTTCGGCGGAGGGACCAAGTTGACCGTCCTACGT(序列號 12)。13. 一種組合物，含有前項1 11中任一項所述的抗人流感病毒人型抗體。本發(fā)明的抗人流感病毒人型抗體對人流感A型病毒H3N2亞型或人流感B型病毒各自的高度保守的區(qū)域具有中和活性。具體而言，在本發(fā)明的抗體中，針對人流感A型病毒H3N2亞型的抗體至少對A/ Hiroshima/52/05株(2005年分離)的病毒株具有中和活性，針對人流感B型病毒的抗體至少對B/Malaysia/2506/04株(2004年分離)病毒株具有中和活性。另外，對各年代的流感病毒疫苗株例如A/Aichi/2/68株(1968年分離)、A/Guizhou/54/89株(1989年分離)、A/ffyoming/3/03 株(2003 年分離)、A/New York/55/04 株(2004 年分離)和 A/ Hiroshima/52/05株(2005年分離)等人流感A型病毒H3N2亞型的各病毒也具有中和活性，或者對 B/Victoria/2/87 株(1987 年分離)、B/Malaysia/2506/04 株(2004 年分離)、 B/Mie/1/93株(1993年分離)、B/Shanghai/261/02株(2002年分離)等人流感B型病毒的各病毒也具有中和活性。另外，本發(fā)明的針對人流感A型病毒H3N2亞型的抗體，在體內(nèi)預(yù)防性或治療性給藥時，至少對于流感病毒A/Guizhou/54/89xA/PR/8/34 (H3N2)株感染而言，在生存率和體重減少方面顯示出效果。S卩，本發(fā)明的針對人流感A型病毒H3N2亞型的抗體對保守近20年的區(qū)域具有活性、對保守40年以上的區(qū)域具有活性。另外，針對人流感B型病毒的抗體對保守20年以上的區(qū)域具有活性。另一方面，本發(fā)明的抗體的HI (hemagglutination inhibition、紅細胞凝集抑制)活性在檢測限以下。


[圖1]是表示用蛋白免疫印跡試驗確認產(chǎn)生八-1、八-2、8-1、8-2、8_3、(-1、0-1、 D-2、E-I或E-2單克隆抗體的各雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清液對各流感病毒HA的反應(yīng)性的結(jié)果的圖。(實驗例1-2)[圖2]是表示確認雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清液對各年代的流感病毒疫苗株的中和活性的結(jié)果的圖。(實驗例1-4)[圖3]是表示B-I單克隆抗體的重鏈可變區(qū)域的序列的圖。(實驗例1-5)[圖4]是表示B-I單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)域的序列的圖。(實驗例1-5)[圖5]是表示D-I單克隆抗體的重鏈可變區(qū)域的序列的圖。(實驗例1-5)[圖6]是表示D-I單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)域的序列的圖。(實驗例1-5)[圖7]是表示E-2單克隆抗體的重鏈可變區(qū)域的序列的圖。(實驗例1-5)[圖8]是表示E-2單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)域的序列的圖。(實驗例1-5)[圖9]是表示B-3單克隆抗體的重鏈可變區(qū)域的序列的圖。(實驗例1-5)[圖10]是表示B-3單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)域的序列的圖。(實驗例1-5)[圖11]是表示確認產(chǎn)生A-2、B-1、B-2、D_1各單克隆抗體的雜交瘤細胞上清液對流感病毒疫苗株感染細胞的染色圖像的結(jié)果的圖。(實驗例1-6)[圖12]是表示確認產(chǎn)生B-3和E-2單克隆抗體的各單克隆抗體的雜交瘤細胞上清液對流感病毒疫苗株感染細胞的染色圖像的結(jié)果的圖。(實驗例1-7)[圖13]是表示B-I和D-I各單克隆抗體對于人流感A型病毒H3H2亞型的各流感病毒疫苗株的血凝素HAl區(qū)域進行識別的肽鏈(抗原決定部位)的序列的圖。(實驗例 1-8)[圖14]是表示B-I和D-I各單克隆抗體所識別的肽鏈在人流感A型病毒H3H2亞型的血凝素HAl區(qū)域的立體結(jié)構(gòu)上的配置的圖。(實驗例1-8)[圖15]是表示B-I和D-I各單克隆抗體所識別的肽鏈與數(shù)據(jù)庫上的抗原決定部位的對比的圖。(實施例1-8)
[圖16]是表示將B-I和D-I各單克隆抗體對各5只鼠進行預(yù)防性給藥時的生存率的圖。(實驗例2-1)[圖17]是表示將B-I或D-I各單克隆抗體對各5只鼠進行預(yù)防性給藥時的體重變化的圖。曲線表示各個體的體重變化。(實驗例2-1)[圖18]是表示將B-I或D-I各單克隆抗體對各5只鼠進行治療性給藥時的生存率的圖。(實驗例2-2)
[圖19]是表示將B-I或D-I各單克隆抗體對各5只鼠進行治療性給藥時的體重變化的圖。曲線表示各個體的體重變化。(實驗例2-2)
具體實施例方式本發(fā)明涉及具有下述特性(a) (C)的抗人流感病毒人型抗體。(a)對人流感A型病毒H3N2亞型的A/Hiroshima/52/05株(2005年分離)的病毒株具有中和活性，或?qū)θ肆鞲蠦型病毒的B/Malaysia/2506/04株(2004年分離)病毒株具有中和活性。(b)HI (hemagglutination inhibition，紅細胞凝集抑制)在檢測限以下。(c)另外，本發(fā)明的各抗體對人流感A型病毒Hmi亞型和人流感A型病毒H2N2亞型沒有中和活性。針對人流感A型病毒H3N2亞型的本發(fā)明的抗體至少對A/Hiroshima/52/05株 (2005年分離)具有中和活性，還對各年代的流感病毒疫苗株如A/Aichi/2/68株(1968年分離)、A/Guizhou/54/89 株(1989 年分離)、A/Wyoming/3/03 株(2003 年分離)和 A/New York/55/04株(2004年分離)等人流感A型病毒H3N2亞型的各病毒具有中和活性。另外， 針對人流感B型病毒的本發(fā)明的抗體至少對B/Malaysia/2506/04株(2004年分離)具有中和活性，還對各年代的流感病毒疫苗株、B/Victoria/2/87株(1987年分離)、B/Mie/l/93 株(1993年分離)、B/Shanghai/261/02株(2002年分離)等人流感B型病毒的各病毒具有中和活性。在具有上述特性的本發(fā)明的抗體中，針對人流感A型病毒H3N2亞型的抗體識別從構(gòu)成上述人流感A型病毒的血凝素HAl的氨基酸序列的N末端計數(shù)包含第173-181氨基酸序列的區(qū)域和/或包含第227-239氨基酸序列的區(qū)域。其中，關(guān)于構(gòu)成人流感A型病毒 H3N2 亞型的氨基酸序列，A/Hiroshima/52/05 株公開在 GenBank Accession No. EU501660, A/Guizhou/54/89 株公開在 GenBank Accession No. D49963, A/ffyoming/3/03 株公開 ^t GenBank Accession No. AY531033, A/New York/55/04 W7^Jf ^ GenBank Accession No.EU501486。在構(gòu)成上述人流感A型病毒的血凝素HAl的氨基酸序列中，從N末端計數(shù)第227 位氨基酸是S(絲氨酸)或P(脯氨酸)，但這種不同對中和活性沒有影響。即使在文獻上 (Karoline et al Virology J. 2008，5，40)，相同位置也是S或P。該第173位的變異是 N(天冬酰胺)或K(賴氨酸)，除1968年的A/Aichi以外為K，文獻上是K或E(谷氨酸)。 另外，對于第229和第230位，在文獻上(Underwood, Mol. Immunol.，1987，21，7)，分別是 R(精氨酸)或G(甘氨酸)、1(異亮氨酸)或V(纈氨酸)的不同，對于第238和239位，也是在GenBank的登記序列中分別是K或N、P或R的不同氨基酸。
鑒于上述情況，包含第173-181氨基酸序列的區(qū)域的肽鏈(抗原決定部位)具體包括含有序列號1或2表示的氨基酸序列的氨基酸序列；另外在這些序列中，可取代、缺失、添加、導(dǎo)入1 2個氨基酸的氨基酸序列。包含第227-239氨基酸序列的區(qū)域的肽鏈 (抗原決定部位)具體包括含有序列號3或4表示的氨基酸序列的氨基酸序列；或在這些序列中，可取代、缺失、添加、導(dǎo)入1 2個氨基酸的氨基酸序列。1) NFDKLYIffG (序列號 1) 2) KFDKLYIffG (序列號 2)3) SSRISIYWTIVKP (序列號 3)4)PSRISIYWTIVKP(序列號 4)編碼具有上述特性的本發(fā)明抗體的可變區(qū)域的DNA堿基序列具體如下所示。A-1.針對人流感A型病毒H3N2亞型的人型抗體(B_l)重鏈可變區(qū)域序列GAGGAGAACCTGTTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCGGGGGGGTCCC TGAGACTCTCCTGTGCAGGCTCTGGATTCACGTTTAGTACTTACGCCATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGACAG GGGCTGGAGTGGGTCTCCTCTATTAGCGGTAGTGGTGAAATTTCCTATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCTGTTCAC CATCTCCAGGGACAATTCCAAGGACACAGTGTTTCTGCAAATGACCAGCCTGAGAGCCGAAGACACGGCCGTATATT ACTGTGCGAAATCCGACGTTTGGGAGGGTTATCGACCCTCAAAAGATGCTCTTCATATGTGGGGCCAAGGGACAATG GTCACCGTCTCTTCA(序列號 5)。輕鏈可變區(qū)域序列GACGTCCAGATGACTCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACA GAGTCACCATCACTTGTCGGGCAAGTCAGAGCGTGAGCAATTATGTGAATTGGTATCAACAGAAGCCAGGGAGAGCC CCTAGGCTCCTCATCTCTAGTGCGTCCAATTTGTGGGCTGGGGTCCCGCCAAGTTCAGTGGCCGTGGAGAAGAGACA GACTTCACTCTCACCATCACCAGTCTGCAACCTGAAGATTCTGCAGTTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTGACCT TCTCAGTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA(序列號 6)。A-2.針對人流感A型病毒H3N2亞型的人型抗體(D_l)重鏈可變區(qū)域序列CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAG TGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCTCTTATTCTATATATTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAA GGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACACCAACACTGGGAACCCAAGCTATGCCCAGGGCTTCACAGGACGGTTTGT CTTCTCCTTCGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGGAGATCAGCAGCCTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTATT ACTGTGCGAGAGAGGGAGATTACGATATTTTGACTGGTTATTATTATTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTG GTCACCGTCTCCTCA(序列號 7)。輕鏈可變區(qū)域序列CAGACTGTGGTGACCCAGGAGCCATCGTTCTCAGTGTCCCCTGGAGGGACAG TCACACTCACTTGTGGCTTGAGCTCTGGCTCAGTCTCTCCTAGTTACTACGCCAGCTGGTACCAGCAGACCCCAGGC CAGGCTCCACGCACGCTCATCTACAACACAAACACTCGCTCCTCTGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCTTCCT TGGGAGCGACGCTGCCCTCACCATCACGGGGGCCCAGGCAGATGATGAGTCTGATTATTTCTGTGTGCTGTATATGC CTAGTGGCGATTGGGTTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT(序列號 8)。B-1.針對人流感B型病毒的人型抗體(E-2)重鏈可變區(qū)域序列CAGGTGCAGTTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTTACAGACCC TGTCCCTCACCTGCGTTGTCTCTGGTGACTCCATCAGCAGGGGTGGTTACTACTGGAGTTGGGTCCGCCAGCCCCCA GAGAGGGGCCTGGAGTGGATTGGGGACATCTATCACAGTGGGAGTACCAACTACAACCCGGCCCTCAAGAGTCGAAC TACCATCTCAGTAGAGACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGAGCCTCCACCTGACTACAGTGACTACAAGGTTGGGAAGGGTTATTTTGACTACTGGGGCCAG GGAGCCCTGGTCACCGTCTCCTCA(序列號 9)。輕鏈可變區(qū)域序列GAAATTGTGTTGGCACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAA GAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTGAGACCGTTGACACCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCT CCCAGGCTCCTCATAAATGATGCATCCAAGAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGAC AGACTTCACTCTCACCATCAGCGGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTGGTGTCAGCAGCATAGCAACTGGC CCCCCACCTTCGGCCAAGGGTCACGGCTGGAGATTAAA(序列號 10)。B-2.針對人流感B型病毒的人型抗體(B-3) 重鏈可變區(qū)域序列CAGGTGAAGTTGGTGCAGTCTGGCGGAGGCGCAGTCCAGCCTGGGAGGTCCC TGAGACTCTCCTGTGAGGCGTCTGGATTCGACTTCACTGTGTATGACATCCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAG GGGCTTGAGTGGGTGGCATCTATTTGGCATAACGGAGGAAAAGCATATTATGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCAC CGTGTCCAGAGACAATCCCCAGAAGACAGTGTATCTGCAAATGAGTGGCCTGAGACCCGAGGACACGGCTACATATT ACTGTGCGAGAGAGTTTCCTTTCATGGGCATCTATGACTACGGCATGGACGCCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACC GTCGCCTCA(序列號 11)。輕鏈可變區(qū)域序列CAGTCTGTGCTGGCTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGG TCATCATCTCTTGTTCTGGAACCTCCTCCAACATCGGCGGTAATTCTGTCAACTGGTACCAGCACCCCCCAGGGGCG GCCCCGAGACTCCTCATCTATACTACCGATCAGCGACCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGG CACCTCTGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAATCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGAAGTTTGGGATGACA GCCTGACTCGTCCGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGTTGACCGTCCTACGT(序列號 12)。本發(fā)明的抗體只要是具有上述特性的抗體即可，沒有特別限定。例如，針對人流感 A型病毒H3N2亞型的人型抗體的可變區(qū)域的堿基序列不限定于上述序列號5 8中任一項所示的堿基序列，只要是對人流感A型病毒H3N2亞型具有中和能力的堿基序列，則可以是在上述序列中取代、缺失、添加或?qū)? 多個核苷酸的堿基序列。作為取代1 多個核苷酸的例子，例如可以通過密碼子的簡并等從而具有中和能力但堿基序列不同。優(yōu)選對A 型病毒H3N2亞型具有中和能力的抗體可以是進一步識別上述各肽鏈(抗原決定部位)中任一種的抗體。另外，針對人流感B型病毒的人型抗體的可變區(qū)域的堿基序列也同樣地不限定于上述序列號9 12中任一項所示的堿基序列。只要是對人流感B型病毒具有中和能力的堿基序列，則可以是在上述序列中取代、缺失、添加或?qū)? 多個核苷酸的堿基序列。作為取代1 多個核苷酸的例子，例如可以通過密碼子的簡并等從而具有中和能力但堿基序列不同。使用細胞融合法得到的單克隆抗體通常是來自免疫動物、例如來自鼠，但是因為當(dāng)把鼠型抗體給予人時作為異物而被代謝，所以鼠型抗體在人體中的半衰期較短、不能充分地發(fā)揮期待的效果。另外，對給予的鼠型抗體而產(chǎn)生的人抗鼠抗體(HAMA)會引起血清病或其它過敏反應(yīng)等，對患者來說是不利的且引起危險的免疫應(yīng)答。因此，其它動物型的單克隆抗體用于人的醫(yī)學(xué)療法的價值受到限制。因而，在將單克隆抗體作為醫(yī)藥品等給藥人時， 強烈希望是人型抗體。人型抗體的制造方法可以采用本身公知的方法或今后開發(fā)的所有方法，但不存在能普遍適用于人型抗體中任意抗體的統(tǒng)一的方法，為了制造對特定抗原顯示充分的結(jié)合活性、中和活性的人型抗體，需要各種努力。例如可以參照Sato，K. et al, Cancer Res.，53，851-856，1993、日本特開2008-161198號公報。作為人型抗體的類型，沒有特別限定，可以是Fab型也可以是Intact型。為了有效地發(fā)揮抗體活性，優(yōu)選Intact型的抗體。Intact 型的抗體，沒有特別限定，例如可以形成如下抗體抗體的互補決定區(qū)(complementarity determinig region ⑶R)來自原來的動物類，恒定區(qū)(C區(qū)域)來自適當(dāng)?shù)娜?。嵌合抗體是通常將含有免疫動物類抗體的CDR的可變區(qū)域連結(jié)到人抗體的恒定區(qū)而形成的抗體，可以通過基因重組技術(shù)而容易地構(gòu)建。另外，也可以是將免疫動物類抗體的CDR移植到人型抗體的可變區(qū)域的基于CDR接枝的人型化抗體。因為CDR區(qū)域頻繁發(fā)生氨基酸取代，所以從抗原性的觀點出發(fā)，可以具有含有來自人的CDR的人型抗體和來自免疫動物類的CDR。具有上述特性(a) (C)的本發(fā)明的抗人流感病毒人型抗體，具體而言可通過以下的方法制造。流感疫苗接種后，從2 4周后的健康人采取IOmL血液中的末梢血單核細胞，使用與來自人的淋巴細胞能高效進行細胞融合的來自人的配偶體細胞(partner cell)、例如SPYMEG細胞(MBL公司制)和聚乙二醇法等方法來進行細胞融合從而簡便且有效率地制造雜交瘤細胞，通過利用使HA等來自流感 病毒的純化蛋白質(zhì)固相化的ELISA法、 或以流感病毒感染細胞作為抗原的染色法來篩選出與來自流感病毒的蛋白質(zhì)具有結(jié)合活性的抗體產(chǎn)生細胞，由此可以產(chǎn)生抗人流感病毒人型抗體。作為其它制造方法，例如構(gòu)建在大腸桿菌噬菌體的表面呈現(xiàn)人型抗體片段的、所謂人組合抗體文庫，利用生物淘選篩選抗體，從而可以得到期望的人型抗體。此時，可以在不經(jīng)由對動物進行免疫操作的情況下篩選期望的抗體。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的抗體的組合物。另外，在將本發(fā)明的組合物用于醫(yī)藥用途時，可以有效量含有本發(fā)明的抗人流感病毒人型抗體中的1種或多種，進一步可以含有藥學(xué)上容許的載體。在本發(fā)明中，作為藥學(xué)上容許的鹽，可舉出以下。作為堿性添加鹽，可舉出例如鈉鹽、鉀鹽等堿金屬鹽；例如鈣鹽、鎂鹽等堿土類金屬鹽；例如銨鹽；例如三甲胺鹽、三乙胺鹽，二環(huán)己基胺鹽、乙醇胺鹽、二乙醇胺鹽、三乙醇胺鹽、普魯卡因鹽等脂肪族胺鹽；例如N，N- 二芐基乙二胺等芳香胺鹽；例如吡啶鹽、甲基吡啶鹽、喹啉鹽、異喹啉鹽等雜環(huán)芳香族胺鹽；例如四甲基銨鹽、四乙基銨鹽、芐基三甲基銨鹽、芐基三乙基銨鹽、芐基三丁基銨鹽、甲基三辛基銨鹽、四丁基銨鹽等季銨鹽；精氨酸鹽、 賴氨酸鹽等堿性氨基酸鹽等。作為酸添加鹽，可舉出例如鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、碳酸氫鹽、過氯酸鹽等無機酸鹽；例如乙酸鹽、丙酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、酒石酸鹽、蘋果酸鹽、檸檬酸鹽、抗壞血酸鹽等有機酸鹽；例如甲磺酸鹽、羥乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽等磺酸鹽；例如天冬胺酸鹽、谷氨酸鹽等酸性氨基酸等。該組合物作為醫(yī)藥組合物可以口服或非口服給藥?？诜o藥時，本發(fā)明的抗人流感病毒人型抗體可以以通常的制劑例如片劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑等固形劑，水劑、油性懸浮劑、糖漿劑或酏劑等液劑中任一種劑型來使用。非口服給藥時，本發(fā)明的抗人流感病毒人型抗體可以以水性或油性懸浮注射劑、點鼻液來使用。在其制備時，可任意使用慣用的賦形劑、粘合劑、潤滑劑、水性溶劑、油性溶劑、乳化劑、懸浮化劑、保存劑、穩(wěn)定劑等。實施例為了幫助理解本發(fā)明，以下例示實施例和實驗例來具體說明本發(fā)明，但并不能說本發(fā)明受這些限定。
(實施例1)抗人流感病毒人型抗體的制造本實施例中，針對使用雜交瘤細胞、制造單克隆抗體進行說明。1)病毒的制備使用從國立感染癥研究所得到的人流感疫苗株即作為A型病毒Hmi亞型的A/New Caledonia/20/99株、作為H3N2亞型的A/Hiroshima/52/05株、作為人流感B型病毒的B/ Malaysia/2506/04株，使它們分別感染MDCK細胞(狗腎上皮細胞株)，在胰蛋白酶存在下 37°C培養(yǎng)2 3天后，采取病毒。2)流感病毒HA抗原的純化流感病毒HA抗原的純化可用本領(lǐng)域人員所周知的方法進行。將上述各流感病毒疫苗株接種到孵化雞蛋，在33 35°C培養(yǎng)2天后，在4°C放置一晚，采取感染尿膜腔液。接著，以超濾法等濃縮，用蔗糖密度梯度離心法純化病毒粒子。即在0 60%的蔗糖密度梯度中以旋轉(zhuǎn)數(shù)35000rpm進行超離心，采取蔗糖密度40 %左右的部分。將該濃縮病毒部分醚處理后，添加甲醛溶液，用蔗糖密度梯度離心法進一步純化，得到流感HA抗原。 3)雜交瘤細胞的制造從接種2006/2007年季節(jié)流感疫苗、具體而言為由作為人流感A型病毒H3N2亞型的A/Hiroshima/52/05株或作為人流感B型病毒的B/Malaysia/^2506/04株制備的流感疫苗后的健康人中，在疫苗接種2 4周后，采取IOmL末梢血，使用Ficoll Paque Plus (GE Healthcare公司制)等來采取單核細胞部分、作為雜交瘤細胞制造用細胞部分。在細胞融合前用不添加血清的DMEM清洗單核細胞部分，得到作為雜交瘤細胞制作用細胞的單核細胞。作為制作雜交瘤細胞的配偶體細胞，使用作為鼠骨髓瘤細胞和人原巨核細胞的雜交骨髓瘤細胞的SPYMEG細胞(MBL公司制)。在細胞融合前用不添加血清DMEM清洗以添加10% 胎牛血清DMEM培養(yǎng)基傳代SPYMEG細胞后培養(yǎng)2天而得到的產(chǎn)物。然后，將上述得到的單核細胞和SPYMEG細胞按照細胞數(shù)1 5 1 10的比例混合，進行離心分離除去上清液。充分松散沉淀的細胞塊后，邊攪拌邊經(jīng)1分鐘緩慢添加50% 聚乙二醇1500-PBS溶液0. 6mL,然后經(jīng)2分鐘緩慢加入IOmL不添加血清DMEM。再添加IOmL 不添加血清DMEM后，添加ImL胎牛血清，結(jié)束細胞融合。接著，離心分離后除去上清液，用 20mL不添加血清DMEM清洗。最后，慢慢地分散細胞，加入120mL HAT培養(yǎng)基{在添加15%胎牛血清DMEM中加入HAT(次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶脫氧核苷)和BM condimed(Roche 公司制)等的人雜交瘤細胞用培養(yǎng)基添加劑而形成的培養(yǎng)基}，用移液管慢慢地將細胞懸浮。4)雜交瘤細胞的克隆將上述3)的細胞懸浮液分注到6個培養(yǎng)用96孔微型板中，在含有5% CO2的培養(yǎng)器中、在37°C培養(yǎng)10 14天。在此期間，間隔3 4天交換HAT培養(yǎng)基的一半量。接著， 取培養(yǎng)上清液的一部分、篩選雜交瘤細胞。在ELISA用96孔微型板中，將上述2)中制備的純化HA抗原(1 μ g/孔)固相化， 進一步用5%脫脂乳粉的PBS-0. 1% Tween 20 (TBS-T)溶液封閉。之后，將上述的細胞懸浮液培養(yǎng)后的培養(yǎng)上清液50 μ L加入到該ELISA用微型板的各孔中，在37°C反應(yīng)30分鐘，在孔的固相上形成由純化HA抗原和抗HA抗原抗體(抗人流感病毒人型抗體)構(gòu)成的一次免疫復(fù)合物。該一次免疫復(fù)合物與過氧化物酶標(biāo)記抗山羊抗體反應(yīng)后，利用著色過氧化物酶反應(yīng)從而檢出培養(yǎng)上清液中的抗人流感病毒人型抗體。接著，將確認有該抗體產(chǎn)生的細胞進行增殖的培養(yǎng)用微型板的各孔中所含有的細胞取出，進行3次有限稀釋法，利用上述相同方法克隆目的細胞。將克隆的雜交瘤細胞株設(shè)為 R1D8、K4E7 和 G4G11。5)抗體的純化將各雜交瘤細胞株在使培養(yǎng)液中的胎牛血清含量從10%降到2%、最終為無血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。將在無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 7天的各雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清液IOOmL 以2000rpm離心處理10分種，用0. 45 μ m過濾器過濾得到的上清液、除去固體成分，利用 ImL 使 Protein G 固定化的 6%瓊脂凝膠(HiTrap Protein G HPTM、GE Healthcare 公司制)進行純化。將雜交瘤細胞株R1D8、K4E7和G4G11產(chǎn)生的單克隆抗體分別命名為B-1、 D-I和E-2。同樣地，純化作為單克隆抗體的來自其它雜交瘤細胞上清液的A-l、A-2、B-2、 B-3、C-l、D-2和E-I等單克隆抗體。(實驗例1-1)各雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清液的性狀 1)中和活性各雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液的對各流感病毒的中和活性測定按照Arch. Virol.，86， 129-135(1985)、Microbiol. Immunol.，29，327-335 (1985)進行。在96孔微型板(中和活性測定用)中，以2X IO4個/孔分注MDCK細胞，在37°C 培養(yǎng)一晚。等量混合通過RDE處理除去非特異抑制劑的各抗體的培養(yǎng)上清液的8倍稀釋液、 與將從以下的流感病毒疫苗株得到的病毒溶液分別按照100病灶(focus)形成單位/孔的方式制備而成的物質(zhì)，在37°C保溫1小時。然后將30 μ L該混合液分注到加入了上述培養(yǎng)的MDCK細胞的微型板的各孔中，在37°C保溫30分鐘。接著，除去各孔的溶液、用PBS清洗各孔，加入不添加胎牛血清MEM。在37°C保溫6 10小時后，除去添加液，室溫下用無水乙醇處理細胞10分鐘，固定細胞。干燥各孔，利用與染色試驗同樣的酶抗體染色法進行細胞染色。染色后，用自來水清洗細胞，干燥后，在光學(xué)顯微鏡下數(shù)出染色的病灶數(shù)。中和活性用病灶減數(shù)率表示。將其結(jié)果示于表1。人流感病毒疫苗株A.流感 A 型A/New Caledonia/20/99 株(HI)、A/Hiroshima/52/05 株(H3N2)B.流感 B 型B/Malaysia/2506/04 株2)抗體的紅細胞凝集抑制活性(HI)向96孔微型板(紅細胞凝集抑制活性(HI)測定用)的各孔中加入25 μ L的RDE 處理后的雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液的梯度稀釋液(2 64倍)，接著，與各上述1)中用到的病毒(8ΗΑ單位/50 μ L) 25 μ L混合，在室溫反應(yīng)30分鐘。之后，加入0. 75%土撥鼠紅細胞 50 μ L充分混和，研究雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液中的抗體給予各病毒的紅細胞凝集活性的影響。將其結(jié)果示于表1。[表 1]表1針對流感病毒的人型單克隆抗體
權(quán)利要求
1.一種抗人流感病毒人型抗體，其特征在于，對人流感A型病毒H3N2亞型具有中和活性、與人流感A型病毒H3N2亞型的血凝素HAl區(qū)域結(jié)合，或?qū)θ肆鞲蠦型病毒具有中和活性。
2.如權(quán)利要求1所述的抗人流感病毒人型抗體，其中，抗人流感病毒人型抗體對人流感A型病毒Hl亞型和人流感A型病毒H2亞型沒有中和活性。
3.如權(quán)利要求1所述的抗人流感病毒人型抗體，其是抗流感人型抗體，對人流感A型病毒H3N2亞型具有中和活性的抗體至少對A/Hiroshima/52/05株具有中和活性，對人流感B 型病毒具有中和活性的抗體至少對B/Malaysia/2506/04株具有中和活性。
4.如權(quán)利要求1 3中任一項所述的抗人流感病毒人型抗體，其中，抗體識別的抗原決定部位是，構(gòu)成人流感A型病毒H3N2亞型的血凝素HAl的氨基酸序列中從N末端計數(shù)包含第173-181氨基酸序列的區(qū)域和/或包含第227-239氨基酸序列的區(qū)域。
5.如權(quán)利要求4所述的抗人流感病毒人型抗體，其中，抗原決定部位包括含有以下序列號1或2表示的氨基酸序列的氨基酸序列；或者在這些氨基酸序列中，取代、缺失、添加或?qū)? 2個氨基酸的任一種氨基酸序列，1)序列號1 =NFDKLYIffG,2)序列號2 :KFDKLHWG。
6.如權(quán)利要求4所述的抗人流感病毒人型抗體，其中，抗原決定部位包括含有以下序列號3或4表示的氨基酸序列的氨基酸序列；或者在這些氨基酸序列中，取代、缺失、添加或?qū)? 2個氨基酸的任一種氨基酸序列，1)序列號3 :SSRISIYWTIVKP,2)序列號4 :PSRISIYWTIVKPo
7.一種抗人流感病毒人型抗體，編碼抗體可變區(qū)域的DNA堿基序列包括選自以下序列號5 12表示的任一種堿基序列中的堿基序列；或者在這些堿基序列中，取代、缺失、添加或?qū)? 多個核苷酸的任一種堿基序列，1)序列號5 :GAGGAGAACCTGTTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTC CTGTGCAGGCTCTGGATTCACGTTTAGTACTTACGCCATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGACAGGGGCTGGAGT GGGTCTCCTCTATTAGCGGTAGTGGTGAAATTTCCTATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCTGTTCACCATCTCCAGG GACAATTCCAAGGACACAGTGTTTCTGCAAATGACCAGCCTGAGAGCCGAAGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAA ATCCGACGTTTGGGAGGGTTATCGACCCTCAAAAGATGCTCTTCATATGTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCT CTTCA，2)序列號6 :GACGTCCAGATGACTCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACCAT CACTTGTCGGGCAAGTCAGAGCGTGAGCAATTATGTGAATTGGTATCAACAGAAGCCAGGGAGAGCCCCTAGGCTCC TCATCTCTAGTGCGTCCAATTTGTGGGCTGGGGTCCCGCCAAGTTCAGTGGCCGTGGAGAAGAGACAGACTTCACTC TCACCATCACCAGTCTGCAACCTGAAGATTCTGCAGTTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTGACCTTCTCAGTTTC GGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA，3)序列號7 :CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTC CTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCTCTTATTCTATATATTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGT GGATGGGATGGATCAACACCAACACTGGGAACCCAAGCTATGCCCAGGGCTTCACAGGACGGTTTGTCTTCTCCTTC GACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGGAGATCAGCAGCCTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGGGAGATTACGATATTTTGACTGGTTATTATTATTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCT CCTCA，4)序列號8 :CAGACTGTGGTGACCCAGGAGCCATCGTTCTCAGTGTCCCCTGGAGGGACAGTCACACTCAC TTGTGGCTTGAGCTCTGGCTCAGTCTCTCCTAGTTACTACGCCAGCTGGTACCAGCAGACCCCAGGCCAGGCTCCAC GCACGCTCATCTACAACACAAACACTCGCTCCTCTGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCTTCCTTGGGAGCGAC GCTGCCCTCACCATCACGGGGGCCCAGGCAGATGATGAGTCTGATTATTTCTGTGTGCTGTATATGCCTAGTGGCGA TTGGGTTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT,5)序列號9 :CAGGTGCAGTTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTTACAGACCCTGTCCCTCAC CTGCGTTGTCTCTGGTGACTCCATCAGCAGGGGTGGTTACTACTGGAGTTGGGTCCGCCAGCCCCCAGAGAGGGGCC TGGAGTGGATTGGGGACATCTATCACAGTGGGAGTACCAACTACAACCCGGCCCTCAAGAGTCGAACTACCATCTCA GTAGAGACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCCGTGTATTACTGTGC CAGAGAGCCTCCACCTGACTACAGTGACTACAAGGTTGGGAAGGGTTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAGCCCTGG TCACCGTCTCCTCA,6)序列號10 :GAAATTGTGTTGGCACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCC TCTCCTGCAGGGCCAGTGAGACCGTTGACACCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTC CTCATAAATGATGCATCCAAGAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCAC TCTCACCATCAGCGGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTGGTGTCAGCAGCATAGCAACTGGCCCCCCACCT TCGGCCAAGGGTCACGGCTGGAGATTAAA，7)序列號11 :CAGGTGAAGTTGGTGCAGTCTGGCGGAGGCGCAGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTC TCCTGTGAGGCGTCTGGATTCGACTTCACTGTGTATGACATCCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTTGA GTGGGTGGCATCTATTTGGCATAACGGAGGAAAAGCATATTATGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCGTGTCCA GAGACAATCCCCAGAAGACAGTGTATCTGCAAATGAGTGGCCTGAGACCCGAGGACACGGCTACATATTACTGTGCG AGAGAGTTTCCTTTCATGGGCATCTATGACTACGGCATGGACGCCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCGCCTC A,8)序列號12 :CAGTCTGTGCTGGCTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCATCATCT CTTGTTCTGGAACCTCCTCCAACATCGGCGGTAATTCTGTCAACTGGTACCAGCACCCCCCAGGGGCGGCCCCGAGA CTCCTCATCTATACTACCGATCAGCGACCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCTGC CTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAATCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGAAGTTTGGGATGACAGCCTGACTC GTCCGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGTTGACCGTCCTACGT。
8.如權(quán)利要求7所述的抗人流感病毒人型抗體，其中，抗人流感病毒人型抗體的抗原是人流感病毒的 A/Hiroshima/52/05 株或 B/Malaysia/2506/04 株。
9.如權(quán)利要求7所述的抗人流感病毒人型抗體，其中，在編碼抗體可變區(qū)域的DNA中， 具有序列號5 8表示的可變區(qū)域的抗體是對人流感A型病毒的H3N2亞型具有中和活性的抗體；具有序列號9 12表示的可變區(qū)域的抗體是對人流感B型病毒具有中和活性的抗體。
10.如權(quán)利要求8所述的抗人流感病毒人型抗體，其中，在編碼抗體可變區(qū)域的DNA中， 序列號5、7、9和11所示的DNA是編碼重鏈可變區(qū)域的DNA ；序列號6、8、10和12所示的DNA 是編碼輕鏈可變區(qū)域的DNA。
11.如權(quán)利要求1 11中任一項所述的抗人流感病毒人型抗體，其中，抗體是全抗體。
12. —種含有多核苷酸的DNA，其特征在于，是編碼權(quán)利要求1 11中任一項所述的抗人流感病毒人型抗體的可變區(qū)域的DNA，該多核苷酸由下述堿基序列構(gòu)成選自以下序列號5 12所示的任一種堿基序列的堿基序列；或者在這些堿基序列中，取代、缺失、添加或?qū)? 多個核苷酸的任一種堿基序列，1)序列號5 :GAGGAGAACCTGTTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTC CTGTGCAGGCTCTGGATTCACGTTTAGTACTTACGCCATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGACAGGGGCTGGAGT GGGTCTCCTCTATTAGCGGTAGTGGTGAAATTTCCTATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCTGTTCACCATCTCCAGG GACAATTCCAAGGACACAGTGTTTCTGCAAATGACCAGCCTGAGAGCCGAAGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAA ATCCGACGTTTGGGAGGGTTATCGACCCTCAAAAGATGCTCTTCATATGTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCT CTTCA，2)序列號6 :GACGTCCAGATGACTCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACCAT CACTTGTCGGGCAAGTCAGAGCGTGAGCAATTATGTGAATTGGTATCAACAGAAGCCAGGGAGAGCCCCTAGGCTCC TCATCTCTAGTGCGTCCAATTTGTGGGCTGGGGTCCCGCCAAGTTCAGTGGCCGTGGAGAAGAGACAGACTTCACTC TCACCATCACCAGTCTGCAACCTGAAGATTCTGCAGTTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTGACCTTCTCAGTTTC GGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA，3)序列號7 :CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTC CTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCTCTTATTCTATATATTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGT GGATGGGATGGATCAACACCAACACTGGGAACCCAAGCTATGCCCAGGGCTTCACAGGACGGTTTGTCTTCTCCTTC GACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGGAGATCAGCAGCCTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAG AGAGGGAGATTACGATATTTTGACTGGTTATTATTATTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCT CCTCA，4)序列號8 :CAGACTGTGGTGACCCAGGAGCCATCGTTCTCAGTGTCCCCTGGAGGGACAGTCACACTCAC TTGTGGCTTGAGCTCTGGCTCAGTCTCTCCTAGTTACTACGCCAGCTGGTACCAGCAGACCCCAGGCCAGGCTCCAC GCACGCTCATCTACAACACAAACACTCGCTCCTCTGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCTTCCTTGGGAGCGAC GCTGCCCTCACCATCACGGGGGCCCAGGCAGATGATGAGTCTGATTATTTCTGTGTGCTGTATATGCCTAGTGGCGA TTGGGTTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT,5)序列號9 :CAGGTGCAGTTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTTACAGACCCTGTCCCTCAC CTGCGTTGTCTCTGGTGACTCCATCAGCAGGGGTGGTTACTACTGGAGTTGGGTCCGCCAGCCCCCAGAGAGGGGCC TGGAGTGGATTGGGGACATCTATCACAGTGGGAGTACCAACTACAACCCGGCCCTCAAGAGTCGAACTACCATCTCA GTAGAGACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCCGTGTATTACTGTGC CAGAGAGCCTCCACCTGACTACAGTGACTACAAGGTTGGGAAGGGTTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAGCCCTGG TCACCGTCTCCTCA,6)序列號10 :GAAATTGTGTTGGCACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCC TCTCCTGCAGGGCCAGTGAGACCGTTGACACCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTC CTCATAAATGATGCATCCAAGAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCAC TCTCACCATCAGCGGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTGGTGTCAGCAGCATAGCAACTGGCCCCCCACCT TCGGCCAAGGGTCACGGCTGGAGATTAAA，7)序列號11 :CAGGTGAAGTTGGTGCAGTCTGGCGGAGGCGCAGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTC TCCTGTGAGGCGTCTGGATTCGACTTCACTGTGTATGACATCCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTTGAGTGGGTGGCATCTATTTGGCATAACGGAGGAAAAGCATATTATGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCGTGTCCA GAGACAATCCCCAGAAGACAGTGTATCTGCAAATGAGTGGCCTGAGACCCGAGGACACGGCTACATATTACTGTGCG AGAGAGTTTCCTTTCATGGGCATCTATGACTACGGCATGGACGCCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCGCCTC A，8)序列號 12 :CAGTCTGTGCTGGCTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCATCATCT CTTGTTCTGGAACCTCCTCCAACATCGGCGGTAATTCTGTCAACTGGTACCAGCACCCCCCAGGGGCGGCCCCGAGA CTCCTCATCTATACTACCGATCAGCGACCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCTGC CTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAATCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGAAGTTTGGGATGACAGCCTGACTC GTCCGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGTTGACCGTCCTACGT。
13. —種組合物，含有權(quán)利要求1 11中任一項所述的抗人流感病毒人型抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及對人流感病毒具有中和活性的人型抗體。更詳細而言，涉及識別人流感A型病毒的H3N2亞型或人流感B型病毒的高度保守的區(qū)域、具有中和活性的人型抗體?？谷肆鞲胁《尽と诵涂贵w對人流感A型病毒H3N2亞型具有中和活性、與人流感A型病毒H3N2亞型的血凝素HA1區(qū)域結(jié)合，或?qū)θ肆鞲蠦型病毒具有中和活性；編碼抗體可變區(qū)域的DNA堿基序列包含序列號5～12所示任一種的序列。
文檔編號C07K16/10GK102264896SQ20098015293
公開日2011年11月30日 申請日期2009年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月25日
發(fā)明者久原基樹, 井手野祥次, 大下昌利, 奧野良信, 柚木干弘, 生田和良, 百田匡壽, 纐纈律子 申請人:一般財團法人阪大微生物病研究會, 國立大學(xué)法人大阪大學(xué), 株式會社醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所