專利名稱：抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及可與促甲狀腺素(TSH)受體(TSHR)反應的人單克隆自身抗體(MAb)。 一種人MAb (K1-18)具有結合TSHR并刺激TSHR環(huán)AMP活性的能力。另外一種人MAb (Kl-70) 具有結合TSHR并且阻斷由TSH和TSHR刺激抗體介導的對環(huán)AMP的刺激的能力。這兩種人 MAb都是從表現(xiàn)出甲狀腺機能減退臨床癥狀的患者的外周淋巴細胞中分離得到的。
背景技術：
甲狀腺的功能由垂體分泌的TSH調節(jié)(kkudlinski MW, et al，2002. Physiological Reviews 82 :473-502)。TSH與甲狀腺細胞表面上的TSHR結合，并且這是引發(fā)TSHR信號級聯(lián)反應的第一步。TSH與TSHR的結合導致對甲狀腺激素甲狀腺素(T4)和三碘甲狀腺原氨酸CH)的形成和釋放的刺激。涉及循環(huán)中的T4和T3和由下丘腦分泌的促甲狀腺素釋放激素(TRH)的水平的反饋機制控制TSH的釋放，TSH轉而控制甲狀腺刺激作用和甲狀腺激素在血清中的水平(kkudlinski MW, et al，2002，文獻見上文)。TSHR是 G蛋白偶聯(lián)的受體，由三個結構域組成富含亮氨酸的重復結構域(LRD)、切割結構域(CD) 和跨膜結構域(TMD) (Nunez Miguel R，et al 2004. Thyroid 14:991-1011)。本領域詳盡地記載了一些自身免疫甲狀腺疾病(AITD)患者出現(xiàn)了可與TSHR反應的自身抗體(Rees Smith B，et al 1988. Endocrine Reviews 9:106—121)。有兩種主要的 TSHR自身抗體(TRAb)類型刺激型和阻斷型。甲狀腺刺激型自身抗體與TSHR結合并且模仿TSH的作用從而刺激甲狀腺產(chǎn)生高水平的T4和T3 ；這些自身抗體還被描述為具有刺激活性或 TSH激動活性的 TRAb (Rees Smith B，et al 2007. Thyroid 17 :923-938)。甲狀腺功能的所述反饋控制機制在甲狀腺刺激自身抗體存在下不再有效，并且患者表現(xiàn)出亢進甲狀腺臨床癥狀，特征是在血清中有過多的甲狀腺激素及其代謝產(chǎn)物。這種病癥被稱為格雷夫斯病(Graves，s disease)。具有刺激活性的TRAb還可與眶后組織中的TSHR相互作用并且促使格雷夫斯氏病眼部癥狀的出現(xiàn)。作為強力甲狀腺刺激物起作用的人單克隆自身抗體 (hMAb TSHRl ；也被稱作 M22)已經(jīng)在 WO 2004/050708A2 中詳細描述。如 W02008/025991A1 所述，已通過χ射線結晶學在2.55人分辨率下解析了與TSHR LRD結合的M22 Fab復合物的結構。對所述TSHR-M22復合物結構的分析為參與相互作用的受體殘基和刺激自身抗體殘基提供了詳細信息。為測量TSHR 抗體，已在 ELISA 中使用 M22(Z0phel，K et al, Clinica Chimica Acta 2009 and Zophel, K et al, Clinica Chimica Acta 2008)。阻斷型TRAb比刺激性自身抗體出現(xiàn)在AITD患者中的頻率更小。阻斷型自身抗體與TSHR結合，防止TSH與所述受體結合，但是不能刺激TSHR活性。結果甲狀腺激素(T4 和T3)的形成和分泌大量減少，而且具有該類型TRAb的患者可表現(xiàn)出甲狀腺活化不足的臨床癥狀(甲狀腺機能減退)。阻斷型自身抗體被稱為具有阻斷活性或TSH拮抗活性的 TRAb (Rees Smith B, et al 1988 文獻見上文，和 Rees Smith B, 2007 et al，文獻見上文)。具有阻斷活性的TRAb當存在于孕婦血清中時會穿過胎盤并且可阻斷胎兒甲狀腺中的TSHR，導致新生兒甲狀腺機能減退和嚴重的發(fā)育后果。此外，具有阻斷活性的TRAb可存在于患病母親的乳汁中找到并且可在嬰兒中引起臨床甲狀腺機能減退(Evans C,et al 2004 European Journal of Endocrinology 150:265-268)。具有 TSH 拮抗活性的 TSHR 人自身抗體(5C9)已在WO 2008/099185A1中詳細描述?；加蠥ITD并具有循環(huán)TRAb的患者的臨床癥狀與自身抗體對TSHR活性的作用即TRAb是否引起刺激或阻斷有關。但是，已經(jīng)提出在一些患者中刺激和阻斷TRAb的混合物可同時出現(xiàn)，總的臨床表現(xiàn)與一種類型的TRAb的更高的濃度和/或活性相關(Rees Smith B et al 1988文獻見上文；Furmaniak J et al 1993 Springer Seminars in lmmunopathology 14 :309-321 and Schott M et al 2005 Trends in Endocrinology and Metabolism 16 :243-248)。此夕卜，朿Ij激或阻斷 TRAb 的濃度和/或活性在同一患者的病程中有所變化，并且已報道，隨著時間的變化，在同一患者中確實有從甲狀腺機能減退到甲狀腺機能亢進的癥狀波動(Rees Smith B et al 1988文獻見上文；Furmaniak J and Rees Smith B 1993 文獻見上文和 Schott M et al 2005 文獻見上文)。但是，使用目前可用的生物測定來分開具有不同生物學活性的TRAb或者區(qū)分血清樣本中的這些TRAb的嘗試是困難的。最近，W02006/016121A1中描述的發(fā)明提供了用使用在R255突變的TSHR的生物測定來區(qū)分刺激型或阻斷型TRAb的方法。人重組TSH (Thyrogen )是根據(jù)cGMP規(guī)范生產(chǎn)的重組蛋白形式的人TSH制品，并被美國FDA批準作為一種診斷殘留或復發(fā)甲狀腺癌的輔助物(Dimtas LH,Cooper DS 2008 Thyroid 18:509-516)。治療后監(jiān)測甲狀腺癌患者包括用重組人TSH刺激甲狀腺殘余物或轉移灶，之后進行甲狀腺掃描和/或血清甲狀腺球蛋白水平測量(Dimtas LH and Cooper DS 2008文獻見上文)。人絨毛膜促性腺激素是在懷孕時產(chǎn)生的激素，具有輕微的甲狀腺刺激作用(Grossmann M et al 1997 Endocrine Reviews 18 :476-501)。對刺激型或阻斷型 TRAb的表征以及它們與TSHR如何相互作用對于診斷和治療不同形式的AITD的改良方法的開發(fā)是至關重要的。此外這些研究對于開發(fā)用于治療與對TSHR的自身免疫應答相關的疾病的新方法至關重要。重組人TSH以外的強力甲狀腺刺激物的可利用性會提供檢測監(jiān)測和治療甲狀腺癌患者的新選擇。相關的在先專利申請W02004/050708A2中描述的發(fā)明提供了具有強刺激活性的人單克隆自身抗體 (MAb)特性及其與TSHR的相互作用的詳情。如W02008/025991A1所述，該自身抗體(M22)與所述TSHR LRD之間的相互作用已從對所述兩個分子的復合物的X-射線衍射分析(2. 55 A 分辨率)中在分子水平上得到解析。W02006/016121A1公開了包括至少一個點突變的突變 TSHR制品，所述TSHR制品可被用在對來自被篩查患者的體液中的患者血清刺激TSHR自身抗體、患者血清阻斷TSHR自身抗體和TSH的差示篩選和鑒定中。W02004/050708A2中還描述了具有TSHR阻斷活性的小鼠MAb (9D33)的產(chǎn)生和表征。9D33與TSHR以高親和力O X IO10L/ mol)結合并且是TSH、hMAb TSHRl (M22)和具有刺激或阻斷活性的患者血清TRAb的有效拮抗劑。W02008/099185A1公開了 TSHR的人MAb(5C9)的分離和表征，所述人MAb (5C9)是患者血清中的TSH和刺激TRAb的有效拮抗劑。已意外地發(fā)現(xiàn)5C9會抑制TSHR組成性活性(也被稱作TSHR基礎活性)，即在沒有TSH或M22的測試系統(tǒng)中的環(huán)AMP的產(chǎn)生。此外，還發(fā)現(xiàn)5C9能夠抑制與TSHR激活突變相關的TSHR環(huán)AMP活性。W02008/091981A2描述了具有抑制TSHR組成性活性能力的小鼠MAb和使用所述MAb治療包括甲狀腺機能亢進和甲狀腺癌的甲狀腺疾病的方法。W02008/091981A2中描述的MAb的特性也在Chen CR et al 2007 Endocrinology 148 :2375-2382 中被公開。本發(fā)明已從一名患有甲狀腺機能減退并且具有高水平TSHR自身抗體的M歲女性患者的外周血淋巴細胞中分離到抗體K1-18和K1-70。所述患者有8年的AITD病史并且最初呈現(xiàn)甲狀腺機能亢進和對持續(xù)3年的甲巰咪唑(methimazone)治療有反應。但是，在達到甲狀腺機能正常狀態(tài)(即具有正常功能)大約10個月后，所述患者出現(xiàn)了甲狀腺機能減退并且接受甲狀腺素治療。在收集血液時所述患者已出現(xiàn)甲狀腺機能減退約4. 5年。在淋巴細胞分離時，TSH結合抑制試驗測得血清TRAb水平是160單位/L。所述血清還表現(xiàn)出阻斷TSH對 TSHR的刺激作用的能力(基于環(huán)AMP的試驗)。血清甲狀腺過氧化物酶自身抗體在>500
/mL (g National Institute for Standards and Control (NIBSC) Potters
Bar, UK的參照制品66/387的單位)時為陽性。通過以Epstein Barr病毒(EBV)感染使所述患者的淋巴細胞無限增殖化并且就其抑制125I-TSH與TSHR包被管結合的能力對所述感染細胞培養(yǎng)物的上清液進行篩選。將來自陽性細胞培養(yǎng)物的細胞與小鼠/人細胞系融合并且如上所述篩選。得到2個分泌TSHR自身抗體的穩(wěn)定克隆。從所述克隆培養(yǎng)物的上清液中純化IgG并且評估所述2個MAb (K1-18和K1-70) IgG結合TSHR并影響TSHR活性的能力。具體地，研究了 K1-18或K1-70抑制TSH與TSHR結合的能力。還研究了 K1-18刺激 TSHR的能力并且將之與各種其他甲狀腺刺激物的活性比較。研究了 K1-70抑制TSH刺激 TSHR的能力并且將之與其他TSH拮抗劑比較。此外，評估了刺激或阻斷患者血清TRAb抑制 K1-18和K1-70的TSHR結合以及生物活性的能力。此外，研究了 K1-18和K1-70在TSHR抗體、TSH和相關化合物的測定中的用途。對K1-18和K1-70的重鏈(HC)和輕鏈(LC)的可變區(qū)(V區(qū))基因進行測序并且找出互補決定區(qū)(CDR)。此外，使Kl-70Fab的純化制品結晶并用X-射線衍射法分析。這些分析提供了關于Kl-70Fab總體結構和K1-70的抗原結合位點的拓撲結構的分子水平的細節(jié)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個方面提供分離的人抗體分子，所述分離的人抗體分子會與TSHR結合并且會減少配體誘導的對所述TSHR的刺激，但對所述TSHR的組成性活性沒有作用。優(yōu)選地，提供分離的人抗體分子或其片段，所述分離的人抗體分子或其片段會結合所述TSHR并且會減少配體誘導的對所述TSHR的刺激，但對所述TSHR的組成性活性沒有作用，其中所述人抗體或其片段具有患者血清TSH受體自身抗體抑制TSH和M22結合所述 TSHR的特性。更優(yōu)選地，所述分離的人抗體分子或其片段具有選自以下的至少一個另外的患者血清TSH受體自身抗體的特性對所述TSHR具有至少l(fL/m0l的結合親和力；和具有以少于10μ g/mL的抗體濃度引起可檢測的對配體誘導的TSHR刺激的阻斷的能力。甚至更優(yōu)選地，所述另外的患者血清TSH受體自身抗體的特性選自對TSHR具有至少IO9LAioI的結合親和力和具有以少于1 μ g/mL、優(yōu)選少于0. 1 μ g/mL的抗體濃度引起可檢測的對配體誘導的TSHR刺激的阻斷的能力。所述分離的人抗體可以是TSH和/或甲狀腺刺激自身抗體、和/或甲狀腺刺激動物抗體和/或人絨毛膜促性腺激素的拮抗劑。所述分離的抗體分子可以是會與TSH、M22或K1-18中的至少一種結合的TSH受體的抑制劑。所述分離的抗體分子可包含抗體VH區(qū)，所述抗體VH區(qū)選自圖恥和5d的氨基酸序列(分別是SEQ ID No 41和51)。所述分離的抗體分子可包含抗體VH區(qū)，所述抗體VH 區(qū)優(yōu)選由圖恥和圖5d的氨基酸序列(分別是SEQ ID No 41和51)組成。所述分離的抗體分子可包含選自分別示于圖5b和5d的CDR I (SEQ ID No 42和52)、II (SEQ ID No 43 和53)和III (SEQ ID No 44和的CDR。本發(fā)明的抗體分子可包含VH區(qū)，所述VH區(qū)包含一段或多段與這些⑶R有很大同源性的氨基酸序列。本發(fā)明的抗體優(yōu)選地顯示出與圖5d 所示的⑶R(SEQ ID No 52、53和54)有70-99. 9%的氨基酸同源性。所述分離的抗體分子優(yōu)選地包含圖5d的⑶R I、II*III(SEQ ID No 52、53和Μ)。在優(yōu)選的實施方案中，所述分離的抗體分子的相應部分具有與這些CDR之一至少70%的同一性，更優(yōu)選至少80%的同一性，高度優(yōu)選至少90%的同一性，特別優(yōu)選至少95%的同一性并且尤其優(yōu)選99. 9%的同一性。所述分離的抗體分子可包含抗體VL區(qū)，所述抗體VL區(qū)優(yōu)選地選自圖6d的氨基酸序列(SEQ ID No 69)。所述分離的抗體分子可包含優(yōu)選由圖6d的氨基酸序列(SEQ ID No 69)構成的抗體VL區(qū)。所述分離的抗體分子可包含選自圖6d的⑶R I (SEQ ID No 70)、 IKSEQ ID No 71)或III(SEQ ID No 72)的⑶R。并且/或者，本發(fā)明的分離的抗體分子可包含一段或多段與這些CDR有很大同源性的氨基酸序列。本發(fā)明的分離的抗體分子的CDR 優(yōu)選地顯示出與圖6d顯示的⑶R(SEQ ID No 70、71和72)有70-99. 9%的氨基酸同源性。 在優(yōu)選的實施方案中，所述分離的抗體分子具有至少70%的同一性，更優(yōu)選至少80%的同一性，高度優(yōu)選至少90%的同一性，特別優(yōu)選至少95%的同一性并且尤其優(yōu)選至少99. 9% 的同一性。所述分離的抗體分子優(yōu)選地包含圖6d的CDR I、II和III (SEQ ID No 70、71和 72)。所述分離的抗體分子可具有如圖9a所示的分子結構，且抗原結合位點中的帶電和芳香族殘基的分布如圖％和9c所示。本發(fā)明的另一方面提供會與所述TSHR結合以刺激所述TSHR的分離的抗體分子，所述抗體分子包含選自圖4b和4d的氨基酸序列(分別為 SEQ ID No 23和33)的抗體VL區(qū)，和/或包含選自分別示于圖4b和4d的⑶R I (SEQ ID No 24 和；34)、II (SEQ ID No 25 和 35)和 III (SEQ ID No 26 和 36)的一個或多個 CDRjP /或選自圖北和3d的氨基酸序列(分別為SEQ ID No 5和15)的抗體VH區(qū)，和/或包含選自分別示于圖 3b 和 3d 的 CDR I (SEQ ID No 6 和 16)、II (SEQ ID No 7 和 17)和 III (SEQ ID No 8和18)的一個或者多個CDR。所述抗體分子優(yōu)選包含(i)抗體VL區(qū)，所述抗體VL 區(qū)包含一個或多個選自分別示于圖4b和4d的CDR I (SEQ ID No M*34)、II(SEQ ID No 25和35)和III (SEQ ID No 26和36)的CDR ；禾口 /或(ii)抗體VH區(qū)，所述抗體VH區(qū)包含一個或多個選自分別示于圖3b和3d的CDR I (SEQ ID No 6和16)、II (SEQ ID No 7和17) 和 III (SEQ ID No 8 禾口 18)的 CDR。所述分離的抗體分子與所述TSHR的結合可被具有甲狀腺刺激或阻斷活性的患者血清TSHR抗體抑制。所述分離的抗體分子與所述TSHR的結合可被M22、K1-70、5C9、9D33和甲狀腺刺激小鼠單克隆抗體中的至少一種抑制。所述分離的抗體分子可包含抗體VL區(qū)和抗體VH區(qū)，所述抗體VL區(qū)選自圖4b和4d的氨基酸序列(分別為SEQ ID No 23和33)，所述抗體VH區(qū)選自圖北和3d的氨基酸序歹丨J (分別為SEQ ID No 5和15)。所述分離的抗體分子優(yōu)選地包含分別示于圖北和3d的⑶R KSEQ ID No 6和 16) ,11 (SEQ ID No 7和17)和III (SEQ ID No 8禾口 18)。本發(fā)明的抗體可包含VH區(qū)，所述 VH區(qū)包含一段或多段與這些⑶R有很大同源性的氨基酸序列。本發(fā)明的抗體分子優(yōu)選顯示出與分別示于北和3d的CDR(SEQ ID No 6-8和16-18)有70-99. 9%的氨基酸同源性。在優(yōu)選的實施方案中，所述分離的抗體分子具有至少70 %的同一性，更優(yōu)選至少80%的同一性，高度優(yōu)選至少90%的同一性，特別優(yōu)選95%的同一性并且尤其優(yōu)選99. 9%的同一性。所述分離的抗體分子可包含由圖4b或4d的氨基酸序列(分別為SEQ ID No 23 和33)組成的抗體VL區(qū)。所述分離的抗體分子可包含由圖北或3d的氨基酸序列(分別為SEQ ID No 5和15)組成的VH區(qū)。所述分離的抗體分子優(yōu)選地包含分別示于圖4b和4d 的 CDR I (SEQ ID No M*;34)、II(SEQ ID No 25 和 35)和 III (SEQ ID No 洸和 36)。并且/或者，本發(fā)明的抗體可包含一段或多段與這些⑶R有很大同源性的氨基酸序列。所述抗體優(yōu)選地表現(xiàn)出與圖4b和4d分別顯示的CDR(SEQ ID No 2446和34-36)有70-99. 9% 的氨基酸同源性。在優(yōu)選的實施方案中，所述分離的抗體分子具有至少70%的同一性，更優(yōu)選至少80%的同一性，高度優(yōu)選至少90%的同一性，特別優(yōu)選至少95%的同一性并且尤其優(yōu)選99. 9%的同一性。在大部分應用中，本發(fā)明的抗體分子的VH區(qū)與VL區(qū)會排列在一起以提供TSHR結合位點。在一些應用中，可僅提供VH區(qū)以結合TSHR。接枝抗體結構域的方法是本領域熟知的，這樣使用來自不同來源的VH和VL區(qū)或其部分可構建本發(fā)明的抗體分子。本文使用的關于本發(fā)明的抗體分子的術語“抗體分子”根據(jù)上下文包括基于免疫球蛋白的結合部分，如單克隆抗體、重組抗體、合成抗體和多克隆抗體、單鏈抗體、多特異性抗體以及結合部分，所述結合部分可由技術人員代替所述基于免疫球蛋白的結合部分，如結構域抗體、雙鏈抗體(diabody)以及 lgG[Delta]CH2、F(ab，)2)、Fab、scFv、VL、VH、dsFv、 微型抗體(Minibody)、三鏈抗體(Triabody)、四鏈抗體(Tetrabody)、(ScFv)2, scFv-Fc、 F(ab，)3 部分(Holliger P, et al 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90:6444-6448·)， (Carter PJ 2006 Nat Rev Immunol 6:343-357)。所述術語還涵蓋這些實體的片段，優(yōu)選會結合TSHR的片段，并且更優(yōu)選具有K1-18或K1-70的效應的片段。術語“促甲狀腺素受體”和“TSHR”是指全長人TSHR，所述全長人TSHR具有圖7a所示的氨基酸序列(SEQ ID No 74)或其與所述TSHR有高度同源性的變體或片段。這樣的變體和片段優(yōu)選具有與圖7a所示氨基酸序列(SEQ ID No 74)70至99. 9%的同源性。在優(yōu)選的實施方案中，這樣的變體或片段與所述序列具有至少70%的同一性，更優(yōu)選至少80%的同一性，高度優(yōu)選至少90%的同一性，特別優(yōu)選至少95%的同一性并且尤其優(yōu)選99. 9%的同一性。本發(fā)明的分離的抗體可優(yōu)選地是單克隆抗體、重組抗體或合成抗體的形式。K1-18 或K1-70的VH或VL區(qū)的CDRI、II或III可被納入合適的構架中。K1-18和K1-70的VH 和VL區(qū)及其CDR的變體可使用本領域技術人員熟知的方法通過修飾產(chǎn)生。這樣的變體可包含一個或多個氨基酸序列變化，包括添加、缺失、置換或插入突變。K1-18或K1-70的構架還可在本發(fā)明的抗體分子中被修飾。本發(fā)明的分離的抗體可具有人或非人構架。
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本發(fā)明的另一個方面提供編碼本發(fā)明的分離的抗體分子或其片段的分離的核苷酸，所述抗體分子或其片段包含抗體VL區(qū)、抗體VH區(qū)或CDRI、II或III、或其結合，其中所述抗體 VL 區(qū)包含圖 4b (SEQ ID No 23)或 4d (SEQ ID No 33)或 6d (SEQ ID No 69)的氨基酸序列；所述抗體VH區(qū)包含圖北(SEQ ID No 5)、3d (SEQ ID No 15)或釙(SEQ ID No 41)和 5d(SEQ ID No 51)的氨基酸序列；所述 CDRI、II 或 III 示于圖 3b (SEQ ID No 6-8) ,3d(SEQ ID No 16-18),4b(SEQ ID No 24-26)、4d(SEQ ID No 34-36)、5b(SEQ ID No 42-44)、5d(SEQ ID No 52-54)或 6d(SEQ ID No 70-72)。所述分離的核苷酸可包含圖3a (SEQ ID No 1) ,3c (SEQ ID No 10) ,4a (SEQ ID No 19) ,4c (SEQ ID No 28) ,5a (SEQ ID No 37) ,5c (SEQ ID No 46)或 6c (SEQ ID No 64)的核
苷酸序列。可在例如噬菌體展示文庫中提供多種這樣的核苷酸。這樣的噬菌體展示文庫可被用于表達多種抗體分子或其片段，如分離的結構域。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的分離的核苷酸的載體，或包含本發(fā)明的所述載體或核苷酸的宿主細胞。所述載體可以是質粒、病毒或其片段。很多不同類型的載體是本領域技術人員已知的。所述分離的細胞可表達本發(fā)明的抗體。所述分離的細胞優(yōu)選地分泌本發(fā)明的抗體。本發(fā)明的分離的細胞優(yōu)選地來自穩(wěn)定的異源雜交瘤細胞系。本發(fā)明的另一方面提供生產(chǎn)分離的抗體分子或其片段例如本發(fā)明分離的結構域的方法，所述方法包括表達編碼這樣的抗體分子或其片段的核苷酸。本發(fā)明的另一方面提供生產(chǎn)本發(fā)明的抗體的方法，所述方法包括培養(yǎng)一種或多種本發(fā)明的分離的宿主細胞，藉此所述抗體由所述細胞表達。所述抗體優(yōu)選地由所述細胞分泌。本發(fā)明的另一方面提供包含本發(fā)明的分離的抗體分子和載體的藥物組合物。本發(fā)明的藥用組合物可適于對人給藥。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選地對受試者的免疫系統(tǒng)沒有顯著不良作用?？紤]到用于本發(fā)明的藥物組合物的多種形式。用于治療甲狀腺相關病癥的本發(fā)明的藥物組合物可以是可注射形式。用于治療眼的格雷夫斯病的本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選為滴眼劑的形式。本發(fā)明的藥物組合物包含本發(fā)明的分離的抗體，以及可藥用載體、輔助劑或媒介?？捎迷诒景l(fā)明的藥物組合物中的可藥用載體、輔助劑或媒介包括但不局限于離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白(如人血清白蛋白)、緩沖物質(如磷酸鹽)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、鹽或電解質(如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠態(tài)二氧化硅、三硅酸鎂)、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素基物質、聚乙二醇、羥甲基纖維素鈉、聚丙烯酯、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。本發(fā)明的藥物組合物可經(jīng)口、腸胃外、經(jīng)吸入噴霧、局部、通過滴眼劑、經(jīng)直腸、經(jīng)鼻、經(jīng)口含、經(jīng)陰道或通過植入貯庫給藥。發(fā)明人優(yōu)選口服給藥或注射給藥。本文使用的術語“腸胃外”包括皮下、皮內、靜脈內、肌肉內、關節(jié)內、滑膜內、胸骨內、鞘內、病灶內(intralesional)和顱骨內注射或輸注技術。所述藥物組合物可以是無菌可注射制品的形式，例如，作為無菌可注射水性或油性懸浮劑?？筛鶕?jù)本領域已知的技術使用合適的分散或潤濕劑(如，吐溫80)和懸浮劑來制備該懸浮劑。所述無菌可注射制品還可以是在無毒可腸胃外使用的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液劑或懸浮劑，例如，作為1，3 丁二醇中的溶液劑。在可接受的媒介和溶劑中，可使用的是甘露醇、水、林格溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，無菌不揮發(fā)性油一般被用作溶劑或懸浮介質。為此目的，可使用任何溫和不揮發(fā)性油，包括合成的甘油單酯或甘油二酯。脂肪酸如油酸及其甘油酯衍生物可用于可注射劑的制備，天然可藥用油如橄欖油或蓖麻油特別是它們的聚氧乙基化形式也可用于可注射劑的制備。這些油溶液劑或懸浮劑還可包含長鏈醇稀釋劑或分散劑如Ph. Helv或類似的醇。 本發(fā)明的藥物組合物可以任意可口服劑型經(jīng)口給藥，所述可口服劑型包括但不局限于膠囊劑、片劑以及水懸浮液和水溶液。對于口服用的片劑，通常使用的載體包括乳糖和玉米淀粉。通常還加入如硬脂酸鎂的潤滑劑。對于膠囊劑形式的口服給藥，可用的稀釋劑包括乳糖和干玉米淀粉。當經(jīng)口給予水懸浮液時，所述活性成分與乳化劑和助懸劑結合。若需要，可加入一些甜味劑和/或調味劑和/或著色劑。本發(fā)明的藥物組合物還可以用于直腸給藥的栓劑的形式提供。這些組合物可通過將本發(fā)明的化合物和在室溫下是固體而在直腸溫度下是液體(從而在直腸內溶化以釋放活性成分)的合適的無刺激性賦形劑混合來制備。這樣的材料包括但不局限于可可脂、蜂蠟和聚乙二醇。本發(fā)明的藥物組合物的局部給藥尤其可用于當所需要的治療涉及局部施用容易到達的部位或器官時。對于對皮膚的局部施用，所述藥物組合物應該用包含懸浮或溶解在載體中的所述活性成分的合適的軟膏劑制備。用于本發(fā)明的化合物的局部給藥的載體包括但不局限于礦物油、液體石油、白石油、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蠟和水。或者，所述藥物組合物可用含有懸浮或溶解于載體中的所述活性化合物的合適的洗劑或膏劑配制。合適的載體包括但不局限于礦物油、失水山梨糖醇單硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蠟、鯨蠟硬脂醇(cetearyl alcohol)、2_辛基十二烷醇、苯甲醇和水。本發(fā)明的藥物組合物還可通過直腸栓劑制劑或在合適的灌腸劑制劑中被局部施用于下腸道。本發(fā)明還包括局部經(jīng)皮給藥貼劑。本發(fā)明的藥物組合物可通過鼻噴霧劑或吸入給藥。這樣的組合物可根據(jù)藥物制劑領域熟知的技術制備并且可被制備為鹽水中的溶液劑，使用苯甲醇或其他合適的防腐劑、增加生物利用度的吸收促進劑、碳氟化合物和/或其他本領域已知的增溶劑或分散劑。本發(fā)明最初提到的方面的抗體如K1-70具有治療和控制與TSHR激活有關的病癥的潛在用途，所述病癥例如格雷夫斯病、TSH或hCG異常水平引起的格雷夫斯眼病 (Graves' opthalmopathy)或甲狀腺機能亢進。本發(fā)明其次提到的方面的抗體如K1-18具有在不同的臨床情況和治療情況下刺激所述TSHR的用途。這些情況包括甲狀腺癌及其轉移灶、多結節(jié)性甲狀腺腫或先天性甲狀腺功能低下的診斷和治療。本發(fā)明的另一方面提供本發(fā)明的分離的抗體分子或藥物組合物用于治療的用途。 本發(fā)明還提供用于治療的本發(fā)明的分離的抗體分子或藥物組合物。本發(fā)明的另一方面提供表征TSHR抗體、TSH或人絨毛膜促性腺激素的活性的方法，所述方法包括一個步驟，所述步驟包括本發(fā)明的分離的抗體分子的使用。本發(fā)明的另一方面提供刺激哺乳動物細胞中的TSHR的體外方法，所述方法包括使所述細胞接觸本發(fā)明的分離的抗體分子。本發(fā)明的另一方面提供刺激哺乳動物細胞中的TSHR的體內方法，所述方法包括使所述細胞接觸本發(fā)明的分離的抗體分子。優(yōu)選地使患有甲狀腺癌及其轉移灶、多結節(jié)性甲狀腺腫和/或先天性甲狀腺功能低下的受試者的細胞與本發(fā)明的分離的抗體接觸。
本發(fā)明的另一方面提供防止哺乳動物細胞中配體誘導的對TSHR的刺激的體內方法，所述方法包括使所述TSHR與本發(fā)明的分離的抗體接觸。所述配體可以是甲狀腺刺激自身抗體、TSH或人絨毛膜促性腺激素。所述哺乳動物細胞可以是甲狀腺細胞或甲狀腺外細胞(extrathyroidal cell)。哺乳動物甲狀腺外細胞可以在眶后組織或脛骨前組織中。在本發(fā)明該方面的方法中，所述分離的抗體分子可與另外的TSHR結合抗體如上文提到的5C9或9D33結合使用。所述甲狀腺相關病癥可選自甲狀腺機能亢進、格雷夫斯病、眼格雷夫斯病和新生兒甲狀腺機能亢進。或者，所述甲狀腺相關的病癥可以是與患有AITD的患者中具有阻斷活性的TRAb的存在相關的甲狀腺機能減退、因母體TRAb轉移(經(jīng)胎盤或母乳)引起的新生兒甲狀腺機能減退。在上文描述的本發(fā)明的各種方法中受治療的受試者優(yōu)選是人。本發(fā)明的另一方面提供檢測TSHR的自身抗體的診斷方法，所述方法包括使樣本和本發(fā)明的抗體分子與TSHR接觸，所述樣本從被認為含有所述自身抗體的受試者中分離。本發(fā)明的另一方面提供檢測TSHR的本發(fā)明的抗體(優(yōu)選人抗體)或人血清中的TSHR的抗體的診斷方法，所述方法包括使所述TSHR的任一種抗體與包含所述 TSHR(TSHR260)(圖 7b ；SEQ ID No 75)的氨基酸 22-260 的 TSHR 片段接觸?？捎糜诒景l(fā)明的方法的合適的可檢測標簽可選自酶標簽、同位素標簽、化學發(fā)光標簽、熒光染料等。因此在使用放射性標簽(如1251、14(、力或^5)的情況下，監(jiān)測可包括測量依賴于本發(fā)明的抗體分子的結合的放射性。一般使用Y計數(shù)器或液體閃爍計數(shù)器來測量放射性。 本發(fā)明的另一方面提供鑒定會與TSHI^60(SEQ ID No 75)結合的小分子的方法，所述方法包括例如在ELISA中使候選小分子與TSHR260接觸并且選出會與TSHI^60結合的小分子。 此外，提供鑒定有防止TSHR自身抗體與TSHR260結合的能力的小分子的方法，所述方法包括確定在候選小分子存在下對TSHR自身抗體(刺激的或阻斷的)與TSHR260結合的抑制并且選出會抑制TSHR自身抗體結合的小分子。可開發(fā)以這種方法鑒定到的小分子以提供控制由TSHR自身抗體(刺激的或阻斷的)引起的自身免疫甲狀腺疾病的新藥物。本發(fā)明提供新的和/或改善的方法，目的是1刺激甲狀腺或表達所述TSHR的組織如甲狀腺癌和甲狀腺癌轉移灶中的所述 TSHR。2防止甲狀腺刺激自身抗體與甲狀腺中的TSHR結合并且從而提供針對格雷夫斯病的新療法。3防止TSHR自身抗體與甲狀腺外TSHR(例如眶后組織或脛骨前組織中)結合并且從而提供治療格雷夫斯眼病和脛骨前粘液性水腫更好的機會。4確定對結合具有刺激活性的TRAb關鍵的TSHR氨基酸。5確定對結合具有阻斷活性的TRAb關鍵的TSHR氨基酸。6比較對結合具有刺激活性的TRAb關鍵的TSHR氨基酸和對結合具有阻斷活性的 TRAb關鍵的TSHR氨基酸。7為TRAb開發(fā)區(qū)分阻斷和刺激抗體的新測定。8為TRAb開發(fā)基于使用熱穩(wěn)定TSHR片段的新測定。
9確定對配體誘導的TSHR激活關鍵的TSHR氨基酸。10確定對配體誘導的TSHR失活關鍵的TSHR氨基酸。11確定對結合至所述TSHR關鍵的阻斷自身抗體氨基酸。12確定對影響TSH或甲狀腺刺激抗體介導的TSHR激活關鍵的阻斷自身抗體氨基酸。13控制格雷夫斯病的甲狀腺機能亢進、新生兒甲狀腺機能亢進和格雷夫斯病的眼部癥狀?；蛘撸黾谞钕傧嚓P的病癥可以是與AITD患者中具有阻斷活性的TRAb的存在相關的甲狀腺機能減退，或由母體阻斷型TRAb轉移(通過胎盤或母乳)引起的新生兒甲狀腺機能減退。14開發(fā)篩選控制由結合所述TSHR的自身抗體引起的甲狀腺疾病的小分子藥物候選物方法。15理解由同一患者的免疫系統(tǒng)或由不同患者的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的具有甲狀腺刺激或阻斷活性的TSHR自身抗體之間的分子差異。16理解在刺激和阻斷TSHR自身抗體的出現(xiàn)和產(chǎn)生中涉及的免疫學機制。17理解包括進化驅動力的機制，所述機制是TSH和TSHR自身抗體之間的分子模擬的基礎。


現(xiàn)在將參考附圖的圖1-9——僅為了舉例——來描述本發(fā)明的抗體分子和方法， 所述附圖中圖1顯示125I-標志的K1-70或125I-標志的K1-18與所述TSHR結合的結合和解離特性(a) 125I標志的Kl-70IgG和Fab與全長TSHR結合的時間過程；(b) 125I-標志的 Kl-70IgG與TSHR260結合的時間過程；(C)125I-標志的Kl_70Fab與TSHR260結合的時間過程；(d)在各種配體存在下125I-標志的Kl-70IgG從所述TSHR(全長)上的解離；(e) 在Kl-18Fab存在下125I標志的Kl-70IgG從TSHR(全長)上的解離；(f)在各種配體存在下125I標志的Kl-70Fab從所述TSHR(全長)上的解離；(g)在各種配體存在下125I標志的 Kl-70IgG 從 TSHR260 上的解離；(h)在 Kl_18Fab 存在下 125I 標志的 Kl_70IgG 從 TSHR260 上的解離；⑴在各種配體存在下125I標志的Kl-70Fab從TSHI^eo上的解離；(j) 125I標志的 Kl-18IgG與全長TSHR和TSHR260結合的時間過程；(k)在各種配體存在下125I標志的K1-18 IgG從全長TSHR上的解離；和⑴在各種配體存在下125I標志的Kl-18IgG從TSHR260上的解離；圖2顯示患者血清中TSHR自身抗體的測量結果(a)在TRAb包被管測定(基于對TSH結合的抑制)中與在TSHR260-AP ELISA中測量結果的比較；(b)基于對M22與全長 TSHR結合的抑制的ELISA中和基于對M22Fab與TSHR260結合的抑制的ELISA中測量結果的比較；(c)在TRAb包被管測定中(基于對TSH結合的抑制)和基于對M22Fab與TSHI^60 包被的板結合的抑制的ELISA中測量結果的比較；和(d)在TRAb ELISA (基于對M22結合的抑制)中和在TSHI^60-AP ELISA中測量結果的比較；圖3給出了 K1-18重鏈(HC)的可變區(qū)序列(a)以未注解形式和注解形式顯示的 K1-18HC的寡核苷酸序列(SEQ ID No 1)。在注解形式中，在用于PCR引物的序列下有劃線；方框框出的是各互補決定區(qū)(CDR)；粗體是恒定區(qū)；(b)以未注解和注解形式顯示的由(圖 3a)顯示的寡核苷酸序列產(chǎn)生的K1-18HC的氨基酸序列(SEQ ID No 5) ； (c)以未注解和注解形式顯示的優(yōu)選的帶有真實N-末端序列(前導序列)的K1-18HC的寡核苷酸序列(SEQ ID No 10)。在注解形式中，用于PCR引物的序列下有劃線，所述前導序列以小寫字母顯示； 方框框出的是各個CDR;粗體是恒定區(qū)；和(d)未注解和注解形式的由圖3c所示寡核苷酸序列產(chǎn)生的優(yōu)選的具有前導序列的K1-18HC的氨基酸序列(SEQ ID No 15)；圖4給出了 K1-18輕鏈(LC)的可變區(qū)序列(a)以未注解和注解形式顯示的 K1-18LC的寡核苷酸序列(SEQ ID No 19)。在注解形式中，用于PCR引物的序列下有劃線； 方框框出的是各個CDR;而粗體是恒定區(qū)；(b)未注解和注解形式的由圖如顯示的所述寡核苷酸序列產(chǎn)生的K1-18LC的氨基酸序列(SEQ ID No 23) ； (c)以未注解和注解形式顯示的優(yōu)選的具有實際N末端序列(前導序列)的Kl-18 LC的寡核苷酸序列(SEQ ID No 28) 0 在注解形式中，用于PCR引物的序列下有劃線，所述前導序列以小寫字母顯示；方框框出的是各個CDR ；而粗體是恒定區(qū)；和(d)未注解和注解形式的由圖如顯示的寡核苷酸序列產(chǎn)生的優(yōu)選的具有前導序列的K1-18LC的氨基酸序列(SEQ ID No 33)；圖5給出了 K1-70重鏈(HC)的可變區(qū)序列(a)以未注解和注解形式顯示的 K1-70HC的寡核苷酸序列(SEQ ID No 37)。在注解的形式中，用于PCR引物的序列下有劃線；方框框出的是各個CDR;而粗體是恒定區(qū)；(b)未注解和注解形式的由圖fe所示的寡核苷酸序列產(chǎn)生的K1-70HC的氨基酸序列(SEQ ID No 41) ； (c)以未注解和注解形式顯示的優(yōu)選的具有實際N-末端序列(前導序列)的K1-70HC的寡核苷酸序列(SEQ ID No 46)。 在注解的形式中，用于PCR引物的序列下有劃線，所述前導序列以小寫字母顯示；方框框出的是各個CDR ；而粗體是恒定區(qū)；和(d)未注解和注解形式的由圖5c顯示的寡核苷酸序列產(chǎn)生的優(yōu)選的具有前導序列的K1-70HC的氨基酸序列(SEQ ID No 51)；圖6給出了 K1-70輕鏈(LC)的可變區(qū)序列(a)以未注解和注解形式顯示的 K1-70L C的寡核苷酸序列(SEQ ID No 55)。在注解的形式中，用于PCR引物的序列下有劃線；方框框出的是各個CDR;而粗體是恒定區(qū)；(b)未注解和注解形式的由圖6a所示的寡核苷酸序列產(chǎn)生的K1-70LC的氨基酸序列(SEQ ID No 59) ； (c)以未注解和注解形式顯示的優(yōu)選的具有實際N-末端序列(前導序列)的K1-70LC的寡核苷酸序列(SEQ ID No 64)。 在注解的形式中，用于PCR引物的序列下有劃線，所述前導序列以小寫字母顯示；方框框出的是各個CDR ；而粗體是恒定區(qū)；和(d)未注解和注解形式的由圖6c顯示的寡核苷酸序列產(chǎn)生的優(yōu)選的具有前導序列的K1-70LC的氨基酸序列(SEQ ID No 69)；和(e)由Edman降解反應確定的實際N-末端氨基酸序列(氨基酸2-21) (SEQ ID No 73)；圖7給出了人TSHR的氨基酸序列(a)描述了人TSHR(氨基酸1-764) (SEQ ID No 74)(登錄號 P16473, http://www. ncbi. nlm. nih. gov/entrez/viewer, fcgi ？ db = protein&val = 62298994)的共有氨基酸序列；(b)描述了人TSHR氨基酸H60的共有氨基酸序列。前導序列(氨基酸1-21)以小寫字母顯示，而為純化目的附加在C-末端的組氨酸序列以粗體顯示(SEQ ID No 75)；和(c)描述了人TSHR LRD C-CAP的氨基酸序列。前導序列(氨基酸1-21)以小寫字母顯示，而為純化目的附加在C-末端的組氨酸序列以粗體顯示(SEQ ID No 76)；圖8給出了在2.22人分辨率下Kl_70Fab的坐標。圖9顯示(a)Kl-70Fab的結構-以Joy格式表示的結構；(b)Kl_70Fab結合位點的靜電勢；和(c)Kl-70Fab結合位點的芳香族氨基酸。
具體實施例方式方法淋巴細胞分離和人單克隆TSHR自身抗體的克隆。使用W02004/050708A2中描述的方法分離單克隆自身抗體K1-18和K1-70。從采自有8年AITD臨床病史和高水平TRAb的患者的血液樣本中分離淋巴細胞。獲得患者的同意和地方倫理委員會的批準。所述患者最初被診斷為甲狀腺機能亢進，在用甲巰咪唑治療后達到甲狀腺機能正常狀態(tài)，然而，在血液收集前約4. 5年她出現(xiàn)了甲狀腺機能減退。在血液收集時所述患者正在接受甲狀腺素(每天50 μ g)治療。用Epstein Barr病毒(EBV) (European Collection of Cell Cultures-ECACC ；Porton Down,SP4 0JG，UK)感染所述淋巴細胞并且在小鼠巨噬細胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)，如W02004/050708A2所述。將無限增殖化的分泌TSHR自身抗體的淋巴細胞與小鼠/人雜交細胞系K6H6/B5 (ECACC)融合，并且通過有限稀釋克隆4次來得到單集落。通過對標志的TSH與TSHR結合的抑制來檢測TSHR自身抗體在克隆的不同階段在細胞培養(yǎng)物上清液中的存在(W02004/050708A》。擴大培養(yǎng)兩個產(chǎn)生所述TSHR自身抗體的單克隆并且收集來自所述培養(yǎng)物的上清液用于自身抗體純化。一個克隆被命名為K1-18而另一個被命名為K1-70。K1-18和K1-70的純化、表征和標志如Sanders J et al 2004. Thyroid 2004 14 :560-570 中所述在 MabklectTM(GE Healthcare, UK)上使用蛋白A親和色譜法從培養(yǎng)物上清液中純化TSHR人MAb IgG，并且通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)評估純度。使用輻射狀擴散測定(The Binding Site ； Birmingham, B29 6AT，UK)確定重鏈同種型，并用抗人-κ鏈和抗-人λ鏈特異性小鼠單克隆抗體(Sigma-Aldrich Company Ltd, Poole, UK)通過蛋白質印跡確定輕鏈同種型。將純化的 Kl-18IgG 在 37°C在磷酸鹽緩沖鹽水中(PBS ;137謹ol/L NaCl,8. lmmol/L Na2HPO4, 2. 7mmol/L KCL、1. 47mmol/L KH2PO4, pH 7. 4，含有終濃度為lmmol/L的半胱氨酸和終濃度為 2mmol/L 的 EDTA)用氧化汞合木瓜蛋白酶(mercuripapain) (Sigma Aldrich,Poole,UK)以 100 1的IgG/酶比例處理4個小時。通過在室溫下加入碘乙酰胺(50mmol/L的終濃度)30 分鐘停止所述反應。然后使所述反應混合物通過Mabklect柱以從所述Tab制品中除去任何完整IgG或Fc片段。將所述含有Fab的溶液用含有3. lmmol/L Ni^3WPBS透析，并且當合適時用Centripr印濃縮器(Millipore, Watford, WD18 8YH, UK)濃縮。使用類似的方法得到Kl-70Fab，但是使用的IgG/酶比例是200 1，并且酶消化是在37°C下進行1小時。 通過SDS-PAGE進行的分析表明在所述Fab制品中檢測不到完整的IgG。用125I (Sanders J et al 1999. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 199984 :3797-3802) 或者用生物素酰胼(Perbio Science,Cramlington,UK) (Rees Smith et al 2004. Thyroid 14 :830-835)標志 IgG 制品。對125I-TSH或125I-標志的人MAb與所述TSHR結合的抑制如W02004/050708A2中所描述用TSHR包被管進行結合抑制測定。在所述測定中， 將100 μ L的測試樣本(MAb制品、患者血清或未標志的TSH)和50 μ 1的起始緩沖液在室溫下在TSHR包被管中輕微震蕩孵育2小時。抽吸之后，洗滌所述管并加入100 μ L的125I-標志的蛋白質(5X 104cpm)，并且在室溫下震蕩孵育1小時。然后對所述管進行抽吸、洗滌并且在Y計數(shù)器中計數(shù)。對標志蛋白質結合的抑制被計算為100X [1_(在測試材料存在下結合的cpm/在對照材料存在下結合的cpm)]。這些實驗中使用的MAb制品是上文描述的 K1-18、K1-70、M22、5C9 和 9D33。TSMAb 1-7 是小鼠甲狀腺刺激 MAb (W0 03/01863 和 Sanders J et al 2002文獻見上文)。對照材料是合并的健康血液供體血清或單名健康血液供體的血清或在各實驗的結果中指出的其他材料。對人MAb IgG與所述TSHR結合的katchard分析分別將50 μ L 測定緩沖液(50mmol/L NaCl、10mmol/L Tris pH 7· 8 和 0· 1 % Triton X-100)和 50 μ L 起始緩沖液(RSR Ltd)中的未標志 K1-18 或 Kl_70IgG 與 50 μ L 125I-標志的Κ1-18或Kl-70IgG(30000cpm，在測定緩沖液中)在室溫下在TSHR包被管中震蕩孵育2小時(在這些條件下出現(xiàn)最大結合)，抽吸，用ImL測定緩沖液洗滌兩次并且在、 計數(shù)器中計數(shù)。將結合的IgG濃度對結合/游離作圖(katchard G 1949. Annals of the New York Academy of Sciences 51 :660-672)以得到締合常數(shù)。通過ELISA測量的對TSH與所述TSHR結合的抑制如前所述使用基于TSH-生物素與TSHR包被的ELISA孔的結合的TRAb ELISA(Bolton J, et al 1999Clinical Chemistry 45:2285-2287)。在所述測定中，將 75 μ L測試樣本加至所述板的孔中的75 μ L起始緩沖液中并且在室溫下以約500轉/分鐘的速度震蕩孵育2小時。洗滌后加入IOOyL TSH-生物素并且繼續(xù)孵育25分鐘，不進行震蕩。再次洗滌所述孔，使用所述標準方法使反應物顯色，并且在450nm讀取吸光度。對TSH-生物素結合的抑制被計算為100X[l-(450nm處的測試樣本吸光度 /450nm處的陰性對照樣本吸光度)]。這些實驗中使用的MAb制品是上文描述的K1-18、 K1-70、M22、5C9 和 9D33。TSMAb 1-7 是小鼠甲狀腺刺激 MAb (W003/01863 和 Sanders J, et al 2002文獻見上文)。對照樣本材料是合并的健康血液供體血清或如各實驗的結果中指出的其他材料。在ELISA中對M22與所述TSHR結合的抑制使用基于標志的M22 (M22 Fab-POD)與TSHR包被的ELISA孔結合的TRAb ELISA (Rees Smith B, et al 2004文獻見上文)。如基于TSH-生物素的ELISA進行測定， 但是首次孵育是1小時。使用以下公式將結果表述為對M22結合的抑制100X [l-(450nm 處的測試樣本吸光度/450nm處的陰性對照樣本吸光度)]。這些實驗中使用的MAb制品是上文描述的1(1-18、1(1-70^22、509和9033。TSMAb 1-7是小鼠甲狀腺刺激MAb (申請?zhí)枮?W003/01863的專利和Sanders J, 2002文獻見上文)。對照材料是合并的健康血液供體血清或如各實驗的結果中指出的其他材料。對TSHR刺激的分析如W02004/050708A2所述測試K1-18或Kl_70IgG以及其他制品刺激人TSHR轉染的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中環(huán)AMP的產(chǎn)生的能力。將每個細胞表達約5X IO4或約 5X IO5TSHR的CHO細胞以每孔3X IO4個細胞接種在96孔板中，更換為沒有胎牛血清的 DMEM(Invitrogen Ltd, Paisley, UK)，然后加入測試樣本(TSH、IgG 或患者血清)(100 μ L, 稀釋在環(huán)AMP測定緩沖液中，即含有l(wèi)g/L葡萄糖、20mmol/L HEPES、222mmol/L蔗糖、15g/L 牛血清白蛋白和0. 5mmol/L 3異丁基-1-甲基黃嘌呤的無NaCl Hank' s緩沖鹽溶液(pH7.4)；環(huán)AMP測定低滲緩沖液)并在37°C下孵育1小時。除去測試溶液后，裂解細胞，使用來自 Assay Designs ；Cambridge Bioscience, UK 的 Direct Cyclic AMP Correlate-EIA 試劑盒測定裂解液中的環(huán)AMP濃度。結果被表達為所述細胞裂解液QOO μ L)中環(huán)AMP的 pmol/mL。一些實驗在等滲緩沖條件下進行。在這些實驗中使用了 Krebs Ringer !fepes緩沖液(KRH 緩沖液)(124mmol/L NaCl、5mmol/L KCl U. 25mmol/L MgSO4U. 45mmol/L CaCl2, 1. 25mmol/L KH2PO4、25mmol/L HEPES、8mmol/葡萄糖、0. 5g/L 牛血清白蛋白、0. 5mmol/L 3 異丁基-1-甲基黃嘌呤，PH 7.4)。使細胞達到所需要的密度，除去培養(yǎng)基并且用ImL of KRH緩沖液洗滌所述細胞。然后加入新鮮的KRH緩沖液并且在37°C下孵育所述細胞30分鐘。然后除去所述緩沖液并用含有測試樣本(TSH、MAb制品、血清樣本等)的新鮮KRH緩沖液代替。下一步驟是隨后如上文對等滲條件下(即在環(huán)AMP測定緩沖液中)進行的實驗的描述進行。在一些實驗中，評估了各種Mab對如上文所述測量的各種制品(例如，TSH、人 MAb和患者血清)的TSHR刺激活性的作用。這通過比較(a)僅所述樣本的刺激活性和(b) 在各種MAb存在下的刺激活性來進行。拮抗(阻斷)活性的測量評估了 Kl_70IgG和其他制品在表達TSHR的CHO細胞中抑制豬(p)TSH、天然人(h) TSH和重組人(rh)TSH、MAb M22、MAb K1-18和患者血清TRAb的刺激活性的能力。這是通過比較不存在Kl-70IgG(或被測試的其他制品)或存在Kl-70IgG(或被測試的其他制品) 的情況下TSH、M22、K1-18或TRAb的刺激效應來進行的。如上文所述進行所述測定，但是將 50 μ L稀釋在環(huán)AMP測定緩沖液中的Kl-70 (或被測試的其他制品)加入所述細胞孔中，隨后加入50 μ L的TSH或Μ22或Κ1-18或患者血清(視需要稀釋在環(huán)AMP測定緩沖液中)，并且如上文對刺激測定所述進行孵育和測試。除了 Κ1-70，在該測定中還測試了其他MAb和具有阻斷型TRAb的患者血清。Κ1-18和Κ1-70與所述TSHR結合的締合和解離使用如Nakatake N, et al Thyroid 2006，16 ;1077_1084 中所述的方法研究了 Kl-18IgG、Kl-18Fab、Kl_70IgG 和 Kl_70Fab 與全長 TSHR 和 TSHI^60 結合的締合和解離。 將所述全長TSHR或TSHR260包被在塑料管上，所述塑料管已被合適的小鼠TSHR MAb預包被。在締合實驗中，在所述TSHR包被管中在37°C下將100 μ L的125I-標志的IgG或Fab孵育5-180分鐘。然后對所述管進行抽吸、用測定緩沖液洗滌并且在Y計數(shù)器中計數(shù)。在解離實驗中，將100 μ 1的125I-標志的IgG或Fab在TSHR包被管中在室溫下孵育180分鐘， 隨后加入10 μ L的lmg/ml的各種MAb IgG或Fab制品并且在室溫下孵育0-180分鐘。在不同的時間點對于所述管進行抽吸、洗滌和計數(shù)。在一些實驗中，加入TSH或緩沖液而不是 MAb制品。所述TSHR中的氨基酸突變用于向TSHR序列引入具體突變的方法已在專利申請W02006/016121A中描述。此外，在W02006/016121A中還描述了使用FlpHn系統(tǒng)將突變的TSHR構建體轉染進入CHO細胞。將表達野生型或突變的TSHR的Flp-In-CHO細胞接種至96孔板并用于測試各種制品刺激表達包含氨基酸突變的TSHR的CHO細胞中的環(huán)AMP的活性的能力。將這些實驗與使用表達野生型THSR的CHO細胞進行的類似實驗進行了比較。還在實驗中使用了表達野生型或突變的TSHR的Flp-In-CHO細胞，以研究各種制品阻斷如上文所述的TSH、刺激抗體或患者血清TRAb的刺激活性的能力。TSHI^60-堿性磷酸酶(TSHR260-AP)構建體的產(chǎn)生將全長人TSHR用作模板擴增所述TSHR 260構建體(編碼人TSHR的氨基酸H60 ； 氨基酸 1-21 是前導序列)(Oda Y，et al 1998. Journal of Molecular Endocrinology 20: 233-244)并且使用克隆載體pSEAP2-basiC (Clontech)作為模板將其與所述分泌的堿性磷酸酶的編碼序列(沒有17個氨基酸的堿性磷酸酶前導序列)連接。進行兩個PCR反應，第一個使用全長TSHR并用特異性引物SEQ ID No 77和SEQ ID No 78引物(Sigma Genosys) 擴增，所述引物在N-末端添加了 EcoRI限制性位點，在C-末端添加了 1個氨基酸接頭(天冬酰胺)和分泌的堿性磷酸酶的前8個氨基酸(不包括所述17個氨基酸的前導序列)。第二個PCR使用克隆載體pSEAP2-basic進行并用引物SEQ ID No 79和SEQ ID No 80擴增， 所述引物在所述分泌的堿性磷酸酶的N-末端添加了 TSHR的氨基酸2M-260和1個氨基酸接頭(天冬酰胺)，并在所述分泌的堿性磷酸酶基因的C-末端添加了 6組氨酸標簽、終止密碼子和Biol限制性位點。所述PCR反應如下進行30個循環(huán)的94°C 1分鐘，40°C 1分鐘和 72°C 1分鐘，之后是72°C7分鐘。所述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳并且按照制造商的說明使用geneclean II試劑盒(Anachem Ltd, Luton)提取所述DNA。然后使用純化的 PCR產(chǎn)物1和2進行第三個PCR以構建完整的TSHR 260-堿性磷酸酶基因。所述PCR 3反應包含200ng PCR 1產(chǎn)物和200ng PCR 2產(chǎn)物并且PCR 3如下進行-J個循環(huán)的94°C 1. 5 分鐘，65°C 1. 5分鐘和72°C 1. 5分鐘。然后將溫度再次升至94°C持續(xù)2分鐘，然后加入引物 SEQ ID No 77和80，之后進行30個循環(huán)的94°C 1分鐘，52°C 1分鐘和72°C 2分鐘。使用 EcoRI和B10I限制性位點將所述PCR 3產(chǎn)物克隆進入pFastBad，并且使用桑格-庫森法測序方法(Sanger F et al 1997. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 74 :5463-5467)確認突變的存在。如 W02008/025991A1 所述，使用 Bac to Bac 桿狀病毒表達系統(tǒng)(Irwitrogen，UK)制造重組DNA并將其轉染至Sf_9細胞中以得到并擴增重組桿狀病毒原種。如W02008/025991A1所述在昆蟲細胞中表達TSHR260-AP?；赥SHR260-AP 的 ELISA基于二價TSHR抗體通過一個抗原結合位點與包被在ELISA板孔上的TSHR結合并且通過另一個抗原結合位點與液相中的TSHI^eo-AP結合即形成橋連的能力建立ELISA。如前所述((Bolton J et al 1999，文獻見上文)通過C-末端抗體將CHO細胞中表達的全長的洗滌劑溶解的受體形式的TSHR包被在ELISA板孔上。在所述測定中，將75 μ L起始緩沖液 (如對TRAb ELISA所描述的；Bolton J，et al 1999文獻見上文)和75 μ L測試樣本(患者血清或單克隆抗體)加入至由所述全長的洗滌劑溶解的TSHR包被的ELISA板孔中并且在室溫下震蕩(500rpm)孵育2小時。然后除去所述孔中的內含物，用洗滌緩沖液(50mmol/ L NaCl、20mmol/L Tris pH 7. 8,1% Triton X-100)將所述孔洗滌 3 次，隨后加入 100 μ L 的TSHR260-AP (稀釋在含有0. 2g/L MgCl2_6H20和2g/L BSA的洗滌緩沖液中)。在室溫下震蕩(500rpm)孵育1小時后將所述孔清空、洗滌(3次)并且加入100 μ L對硝基苯基磷酸鹽(PNpp)底物(Europa Bioproducts Ltd,Ely, Cambridge UK)，然后將所述板在黑暗中孵育45分鐘。之后加入100 μ L停止溶液(lmol/L NaOH)并在ELISA酶標儀中在405nm下讀取吸光度。結果以OD4tl5Iim吸光度值表示，高于以集合的健康血供體(HBD)血清觀察到的吸光度的值表明，所述樣本中存在TSHR自身抗體。在一些實驗中，用CHO細胞中表達的包含突變R255D的重組TSHR的溶解制品來包被所述ELISA板孔。TSHR LRD C-CAP構建體的產(chǎn)生使用全長人TSHR作為模板擴增TSHR LRD C-CAP構建體，所述構建體編碼除去了氨基酸 306-384 的人 TSHR 的氨基酸 1-409 (Oda Y, et al 1998. Journal of Molecular Endocrinology 20 :233-244)。進行兩個PCR反應，第一個使用所述全長TSHR，用T7引物 (SEQ ID No 81)和特異性引物 SEQ ID No 82 (Sigma Genosys, Gillingham, Dorset, UK)擴增，所述特異性引物SEQ ID No 82在所述TSHR的氨基酸305的C末端添加所述TSHR的氨基酸385-342。使用全長TSHR進行第二個PCR，用BGH反向引物SEQ ID No 83和特異性引物(SEQ ID No 84)擴增，所述特異性引物(SEQ ID No 84)在所述TSHR的氨基酸385的N 末端添加所述TSHR的氨基酸四8-305。所述PCR反應如下進行30個循環(huán)的94°C 1分鐘， 400C 1分鐘和72°C 2分鐘，之后是72°C 7分鐘。將所述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳并且按照制造商的說明使用Geneclean II試劑盒(Anachem Ltd, Luton, UK)提取所述DNA。 然后使用純化的PCR產(chǎn)物1和2進行第三個PCR以構建將kr305連接至Tyr385 (除去了氨基酸306-384)的連續(xù)的TSHR序列。所述PCR 3反應包含200ng PCR 1產(chǎn)物和200ng PCR 2產(chǎn)物并且PCR 3如下進行7個循環(huán)的94°C 1. 5分鐘，65°C 1. 5分鐘和72°C 1. 5分鐘。然后將溫度再次升至94°C持續(xù)2分鐘，然后加入T7引物(SEQ ID No 81)和BGHR引物(SEQ ID No 83)，之后進行30個循環(huán)的94°C 1分鐘，52°C 1分鐘和72°C 2分鐘。然后將包含除去了氨基酸306-384的TSHR序列的PCR3產(chǎn)物在1 %瓊脂糖凝膠上電泳并且按照制造商的說明使用Geneclean II試劑盒(Anachem Ltd)提取所述DNA。使用純化的PCR3產(chǎn)物作為模板以在PCR4中構建所述TSHR LRD C-CAP基因。所述PCR 4反應包含200ng的PCR 3作為模板DNA，并且使用T7引物(SEQ ID No 81)和特異性引物(SEQ ID No 85)擴增，所述特異性引物(SEQ ID No 85)在所述TSHR序列(1_409，其中氨基酸306-384被刪除)的氨基酸409的C-末端添加6組氨酸標簽、終止密碼子和Biol限制性位點。PCR 4如下進行 30個循環(huán)的94°C 1分鐘，40°C 1分鐘和72°C 2分鐘，之后是72°C 10分鐘。使用BamHI和 XhoI限制性位點將所述PCR 4產(chǎn)物克隆進入pFastBad，并且使用桑格-庫森法測序方法 (Sanger F et al 1997. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 74 :5463-5467)確認突變的存在。如W02008/025991A1所述，使用Bac to Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)(InvitrogenJaisleyjK)制造重組DNA，并將其轉染至Sf_9細胞中以得到并擴增重組桿狀病毒原種。使用W02008/025991A1所述方法在昆蟲細胞中表達TSHR LRD C-CAP (圖 7c ； SEQ ID No 76)。不同TSHR制品穩(wěn)定性的比較比較了重組TSHR的不同制品的溫度穩(wěn)定性。測試了 CHO細胞中表達的全長的溶解的TSHR、在昆蟲細胞中表達的TSHI^60、在昆蟲細胞中表達的TSHR260-AP和在昆蟲細胞中表達的TSHR LRD C-CAP。從_80°C的保存取出上文所列的每種制品的等分試樣，在冰上融化，將一份樣本放回到_80°C作為對照，而主要部分在室溫下O0-25°C)保存對或48小時。室溫下保存對或48小時后將所述TSHR制品保存在-80°C，隨后如下述進行測試。用包被緩沖液中的 1 μ g/mL 的小鼠 TSHR MAb 14C4 的 F(ab，)2 制品(Jeffreys J et al 2002， Thyroid 12:1051-1061 and Sanders J et a/2007 Thyroid 17:395-410)包被 ELISA 板孔(Bolton J et al 1999 文獻見上文)。被研究的 TSHR 制品在 20mmol/L NaClUOmmol/
20L Tris pH7. 8,1% v/v Triton X_100、lg/L BSA、200mg/L NaN3 中稀釋，并將 150 μ L 加入 ELISA板孔中(一式四份)。在4°C過夜孵育以使所述TSHR制品與所述抗體(14C4F(ab’)2) 包被的孔結合之后，洗滌所述孔并用75yL的測定緩沖液(50mmol/L NaCl, 20mmol/L Tris ρΗ7· 8,1% v/v Triton Χ-100，lg/L BSA)和75 μ L的健康供體血清在室溫下在ELISA板震蕩器上以每分鐘500次震動的速度孵育1小時。之后清空所述孔的內容物，洗滌所述孔并向每孔加入100 μ L的M22Fab-過氧化物酶綴合物(參加上文)。在室溫下不震蕩條件下孵育25分鐘后，再次洗滌所述孔，之后加入100 μ L的四甲基聯(lián)苯胺，并且在室溫下不震蕩條件下再孵育25分鐘。通過加入50yL的0. 5mol/L 終止反應并且在ELISA酶標儀中在450nm下讀出每孔的吸光度?？勺儏^(qū)基因分析如W02004/050708A2所述確定K1-18或K1-70重鏈和輕鏈的可變(V)區(qū)基因， 其中使用從IXio7個異源雜交瘤細胞(分泌Kl-18IgG或Kl-70IgG)制備的總RNA來生產(chǎn)用于RT-PCR (逆轉錄酶PCR)反應的mRNA。將使用Medical Research Council' s V~base (http: //vbase. mrc-cpe. cam, ac. uk/)設計并由 Invitrogen (Paisley, PA4 9RF, UK)合成的特異性IgGl HC和κ LC有義和反義鏈寡核苷酸引物與Kl-ISmRNA —起用在 RT-PCR反應中。如上所述制備的特異性IgGlHC和λ LC引物與Kl_70mRNA —起用在RT-PCR 反應中。在50°C下進行RT反應15分鐘，之后進行PCR，所述PCR如下進行40個循環(huán)的 940C 15秒，50°C 30秒和72°C 30秒。將DNA產(chǎn)物克隆進入pUC18并用桑格-庫森法(Sanger F，et al 1977 文獻見上文)測序。用 Ig blast (http //www, ncbi. nlm. nih. gov/igblast/) 將V區(qū)序列與可用的人Ig基因序列比較。通過Kabat法(Kabat E et al 1991 Sequences of proteins of immunological interest(US Public Health service, Bethesda, MD) Fifth edition)禾口 Ig blast (http: //www, ncbi. nlm. nih. gov/igblast/)找出 CDR。從已通過有限稀釋進一步再克隆的K1-70和K1-18雜交瘤細胞系兩者中進行第二輪mRNA分離。 通過 RT-PCR 從 mRNA 得到 V-區(qū)序列(K1-18HC、K1-18LC、K1_70HC 和 K1-70LC)，然后如上所述進行克隆和測序。此外，使用與每個V區(qū)各自的前導序列的5’末端相對應的特地設計的 PCR引物進行所述RT-PCR反應。這使得可鑒定K1-18和K1-70的HC和LC V區(qū)的N-末端實際寡核苷酸序列(和所來源的氨基酸序列)。此外，通過Alta Bioscience (Birmingham, UK)由Edman降解反應分析了 K1-70LC蛋白的N-末端氨基酸序列。這在用焦谷氨酰氨肽酶將所述K1-70LC蛋白制品的N-末端“去封閉”后是可行的。將純化的Kl-70Fab(10y g) 在75°C下用2. 5mU的焦谷氨酰氨肽酶(在50mmol/L Na2HPO4 pH 7. 0中；10mmol/L 二硫蘇糖醇和lmmol/L EDTA)處理6小時。加入等體積的SDS-PAGE樣本緩沖液，并且在100°C加熱5分鐘后，將Kl-70Fab在15 % SDA-PAGE上解析為HC (Fd部分)和LC。小心地將所述LC 條帶從凝膠上切下并且確定所述N-末端蛋白質序列。重復進行的對K1-18HC、K1-18LC和 K1-70HC的RT-PCR和測序證實V區(qū)序列與之前得到的是相同的，而K1-70LC V區(qū)則不同。 在重復的實驗中得到的K1-70LC序列與通過Edman反應得到的2_21連續(xù)N-末端氨基酸的蛋白質序列(圖6e ；SEQ ID No 73)和Kl_70Fab的晶體結構中的LC氨基酸的電子密度 (圖8) —致，并且因此被認為是優(yōu)選的K1-70LC序列(圖6c和6d ；分別是SEQ ID No 64 和 69)。Kl-70Fab的X-射線衍射分析
使用具有9000Da 截留值的 iCON 濃縮器(ThermoFisher Scientific, Loughborough,UK)將如上文所述制備的Kl_70Fab溶液濃縮至15. 5mg/mL并分成小份儲存在-20°C。使用蒸汽擴散懸滴法(使用 Molecular Dimensions (Newmarket, UK) &Mructure Screen 1稀釋矩陣篩)來生長Kl_70Fab的晶體。一些晶體可在許多條件下得到，并且全部進行篩選以鑒定最適于Biofocus DPI (Saffron Walden, UK)上的X_射線衍射分析的晶體。選擇在30% PEG 400,0. IM !fepes鈉pH 7. 5、0. 2M氯化鎂中生長的晶體。將它用孔溶液清洗并通過放入液氮中迅速冷凍。在Rigaku R-Axis IV圖像板檢測器上收集所述數(shù)據(jù)集并用 MOSFLM 和 SCALA(來自 CCP4 程序組(Collaborative computational project, number 4.1994. " The CCP4 Suite Programs for Protein Crystallography" . Acta Cryst.D50, 760-763)對其建立索引、整合以及估算?；谛蛄袑Ρ冗x擇來自蛋白質數(shù)據(jù)庫(http //www. rcsb. ora/pdb/home/home. do)的三個結構 ILIL (VL 禾口 CL 區(qū))、2B0S (VH 區(qū))和2EH7(VL區(qū))用于分子置換。在不對稱單元中有兩個完整的Fab K1-70分子，并且使用REFMAC5 (CCP4)以嚴格的幾何重量(tight geometric weight)對得到的模型進行10 輪原子精修(atomici refinement)。在模型創(chuàng)建程序 COOT (Emsley P, Cowtan K 2004. Nature 355 =472-475)中檢查分子置換和初始精修之后計算出的電子密度圖，并且使用 BUCCANEER(CCP4)進行自動化模型重建。重新檢查所述模型并手動建立任何剩余的不明特點，并使用REFMAC5 (CCP4)精修所述模型。然后使用C00T中的水放置(water placement) 選項加入水分子并使用REFMAC5 (CCP4)精修。使用PR0CHECK (CCP4)和RAMPAGE (CCP4)檢查Fab K1-70的結構幾何形狀。最后，根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)(Kabat E et al 1991文獻見上文)對所述模型中的殘基重新編號。在大腸桿菌中重組Kl_70Fab的克隆和表達用Xhol和Spel限制性內切酶切所述K1-70HC RT-PCR產(chǎn)物，用&icl和Xbal限制性內切酶切所述K1-70LC PCR產(chǎn)物，并且將HC和LC cDNA都克隆進入IacZ啟動子控制下的 Immunozap H/L 載體(Stratagene Europe ；Amsterdam, Netherlands) (Matthews I，et al 2002 Laboratory Investigation 82:1-11)。使用 Qiagen midi 質粒純化試劑盒(Qiagen Ltd, Crawley, UK)制備質粒DNA并且通過桑格-庫森法(Sanger F，et al 1977文獻見上文)測序確認K1-70HC和LC cDNA的存在。將質粒DNA轉化進入大腸桿菌菌株HB2151 (GE Life Sciences,Little Chalfont,UK)并在 37°C下在 LB 氨芐青霉素(胰蛋白胨 10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、100 μ g/mL終濃度的氨芐青霉素)瓊脂平板上(15g/L瓊脂) 培養(yǎng)過夜。在30°C下震蕩過夜培養(yǎng)預培養(yǎng)物(3mL LB氨芐青霉素培養(yǎng)基+1%葡萄糖中的一個菌落)。在葡萄糖存在下所述重組Fab的產(chǎn)生被抑制。將過夜培養(yǎng)后的預培養(yǎng)物以1/100 稀釋(0. 5mL稀釋于50mL LB氨芐青霉素)并且在30°C培養(yǎng)直到0D_達到1. 2，之后加入蔗糖(終濃度為0. 3mol/L)，在30°C培養(yǎng)培養(yǎng)物直到OD600回到1. 2。之后加入異丙基- β -D 硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為lmmol/L，在23°C下繼續(xù)震蕩培養(yǎng)培養(yǎng)物對小時。然后將培養(yǎng)物在4°C在3000rpm下離心30分鐘并回收培養(yǎng)物上清液。將所述培養(yǎng)物上清液通過 0. 45 μ m 的過濾器過濾并且用 PBS (8. lmmol/L Na2HPO4U. 5mmol/L KH2PO4,2. 7mmol/L KCl、 137mmol/L NaCl pH 7.4)中透析過夜。使用在無IPTG下用葡萄糖培養(yǎng)的即未誘導的被 K1-70質粒(HB2151/K1-70)轉化的HB2151細胞的培養(yǎng)物上清液作為陰性對照。對所述培養(yǎng)物上清液測定(a)它們抑制THS與所述THSR結合的能力和(b)它們抑制表達TSHR的CHO細胞中TSH介導的對環(huán)AMP產(chǎn)生的刺激的能力。結果分泌K1-18或K1-70的穩(wěn)定細胞系的分離和克隆用EBV感染從20mL患者血液中得到的淋巴細胞Q6X106)并且以每孔IX IO6個細胞鋪在48孔板中的小鼠巨噬細胞飼養(yǎng)層上。EBV感染后第13天監(jiān)測所述板孔上清液的 125I-TSH結合抑制。對陽性克隆進一步測試它們對所述TSHR的作用(刺激或阻斷)。擴增來自陽性孔(在任何所使用的測定中都是陽性)的細胞并且與K6H6/B5雜交瘤細胞系融合并且鋪在96孔板上。得到了穩(wěn)定產(chǎn)生具有125I-TSH結合抑制活性抗體的兩個克隆并且再克隆4次。分泌人MAb的克隆之一被命名為K1-18，所述K1-18具有TSHR刺激活性。從異源雜交瘤培養(yǎng)物上清液中純化的K1-18抗體是具有κ輕鏈的亞類IgGl。分泌人MAb的另一個穩(wěn)定克隆被命名為K1-70，所述K1-70具有阻斷TSHR轉染的CHO細胞中TSH刺激的環(huán) AMP產(chǎn)生的能力。從異源雜交瘤培養(yǎng)物上清液中純化的K1-70抗體是具有λ輕鏈的亞類 IgGl0125I-TSH與TSHR包被管的結合的抑制不同濃度的Κ1-18或Kl_70IgG抑制標志的TSH與TSHR包被管的結合的能力在表 Ia和Ib中示出。如表Ia所示，稀釋在健康血液供體(HBD)血清中的Kl_18IgG在1 μ g/mL 的濃度表現(xiàn)出約95%的對125I-TSH結合的最大程度抑制。在1-0. 001 μ g/mL之間的濃度下 Kl-ISIgG的抑制效應是劑量依賴的。在相同濃度下K1-18的抑制效應與M22IgG的效應相當。與 5C9IgG、TSMAb l_7IgG 或 9D33IgG 相比，1 μ g/mL 下的 Kl_18IgG 是 125I-TSH 結合的更強的抑制劑(表la)。Kl-70IgG或Fab對125I-TSH結合的抑制效應在表Ib中顯示。稀釋在HBD血清中的Kl-70IgG顯示出劑量依賴的抑制，范圍從0. 03 μ g/mL下的13. 5士2. 3%至 100 μ g/mL下的95. 9士0. 8%。Kl_70Fab的抑制效應與Kl_70IgG的效應在相同濃度下相當 (表lb)。表Ia和Ib還顯示出稀釋在所述包被管測定緩沖液中的K1-18和K1-70和不同的 MAb IgG對125I-TSH與TSHR結合的效應；對于除了 5C9的所有MAb，這些效應與當MAb稀釋在 HBD血清中時觀察到的結果相當。表加顯示出K1-18、K1供體血清和Kl-供體血清IgG的不同制品對125I-TSH與TSHR包被管的結合的抑制。在該實驗中，用少到0. 01 μ g/mL的稀釋在HBD血清中的Kl-ISIgG觀察到約12%的抑制，并且所述抑制以劑量依賴的方式升高到在 10 μ g/mL的Kl-18IgG下的95%的最大抑制。HBD血清中0. 01 μ g/mL的Kl_18Fab顯示出 5. 6 士 7. 3%的抑制并且所述抑制以劑量依賴的方式升高到在10 μ g/mL下的82. 2 士0. 9% 的最大抑制。這可以與稀釋在HBD血清中的供體血清IgG對125I-TSH結合的抑制相比；在 0. 125mg/mL下的13. 7士 1. 3%抑制以劑量依賴的方式升高到lmg/mL下76. 5士 1. 5%的抑制。不同稀釋度下的供體血清還顯示出對125I-TSH結合的劑量依賴的抑制從1/160稀釋度下的9. 1 士0.8%的抑制到1/10稀釋度下的81. 1 士0.4%的抑制。表加中的數(shù)據(jù)顯示從對TSH結合的抑制方面來說純化的Kl-18IgG的活性比Kl供體血清IgG的高6600倍。當 Kl-ISIgG和供體血清IgG被稀釋在測定緩沖液中時，Kl-ISIgG抑制TSH結合的能力比所述供體血清IgG的大4700倍(表加)。表2b顯示不同的K1-18制品對125I-TSH與包被管中的 TSHR 結合的抑制，所述抑制與來自 National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC ；Potters Bar, UK)的甲狀腺刺激自身抗體參考制品90/672的效應相比。稀釋在HBD血清中的Kl-18IgG顯示出69NIBSC 90/672單位/mg(以Kl_18IgG的三種濃度計算的活性平均值，所述濃度為30ng/mL、100ng/mL和300ng/mL)的125I-TSH結合抑制活性(表2b)。在相同實驗中計算的Kl-ISFab (稀釋在血清中)的125I-TSH結合抑制活性是 46NIBSC 90/672 單位 /mg (Kl_18Fab 在 30ng/mL、100ng/mL 和 300ng/mL 下的活性被用于所述計算)(表2b)。這可與131NIBSC單位/mg的M22IgG125I_TSH結合抑制活性相比。 供體血清和供體血清IgG的稀釋物的125I-TSH結合抑制活性在表2c中顯示，所述活性與 NIBSC 90/672的活性相比。所述供體血清的125I-TSH結合抑制活性是0. 075NIBSC90/672 單位/mL(40X和20 X稀釋物的平均值)，而稀釋在HBD血清中的供體血清IgG的125I-TSH 結合抑制活性是0.011單位/mg (在0. 1、0. 3和1. Omg/mL下的平均值)(表2c)。這可與在相同試驗中測量的為63. 3NIBSC 90/672單位/mg (在30、100和300ng/mL下的平均值)的 Kl-18IgG(稀釋在HBD血清中)的活性和為114單位/mg(在10,30和100ng/mL下的平均值)的Kl-70IgG(稀釋在HBD血清中)的活性相比(表2c)。因此在該測定系統(tǒng)中Kl-ISIgG 的比活度是所述供體血清IgG的比活度的5755X。類似地，Kl-70IgG的比活度是所述供體血清IgG的比活度的10364X。K1-18 和 K1-70 與 TSHR 包被管的結合的 katchard 分析 Kl_18IgG 對 TSHR(全長)的結合親和力是6. 7士 1.0X109L/mol(平均值士SD ；η = 3)而Kl_18Fab的結合親和力是1. 8士 1. 0X109L/mol(平均值士SD ;n = 3)。Kl_18IgG對所述TSHI^60的結合親和力是5.9士1.0\1091711101(平均士50;11 = 3)。Kl_70IgG 對 TSHR(全長)的結合親和力是 3. 9 士 0. 8X 10lclL/mol (平均值士 SD ;n = 3)，而 Kl_70Fab 的結合親和力是 2. 3 士 0. 3 X IO10L/ mol(平均值+SD ；η = 3)。Kl_70IgG對與所述TSHI^60的結合親和力是3. 1 士0. 4X IO10L/ mol (平均值士SD ;n = 3)而Kl_70Fab對所述TSHI^60的結合親和力是9. 3士0. 4X IO9L/ mol(平均值士 SD ;n =幻。這可與6. 0 士0. 9X 109L/mol (平均值士 SD ;n = 5)的豬TSH對所述TSHR(全長)的結合親和力相比(Nakatake et al 2006文獻見上文)。通過ELISA測量的對TSH-生物素與所述TSHR結合的抑制對Kl-18IgG對TSH-生物素與TSHR包被的ELISA板孔結合的效應進行了研究并與各種其他MAb的效應進行了比較。如表3a所示，稀釋在HBD血清中的Kl-ISIgG具有對TSH-生物素結合劑量依賴的抑制，在0. 01 μ g/mL下為10. 0士0. 8%抑制，在1 μ g/mL下是96. 2士0. 2%的基本最大抑制并且在3 μ g/mL及以上濃度達到最大抑制平臺。這可與 0. 01 μ g/mL 下 17. 5士2. 0%和 1 μ g/mL 下 98. 3士0. 0%的 M22IgG(稀釋在 HBD 血清中)的抑制效應相比(表3a)。如表3a所述的實例所述，Kl-ISIgG (稀釋在HBD血清中)在lyg/ mL下的TSH-生物素結合抑制活性比5C9IgG、TSMAb l_7IgG和9D33IgG的大。當對稀釋在 ELISA 測定緩沖液(50mmol/L NaCl、10mmol/L Tris pH 7. 8,0. 1% v/v Triton Χ-100 和lmg/mL BSA)中的Kl_18IgG進行測試時，所述抑制效應與在HBD血清中制造稀釋物時的效應基本相同(表3a)。如表北的實例所示，稀釋在HBD血清或ELISA測定緩沖液中的 Kl-18Fab在所述ELISA中也是TSH-生物素結合的有效抑制劑。稀釋在加入了 100 μ g/mL 的對照MAb IgG (谷氨酸脫羧酶的人MAb——5B3)的ELISA測定緩沖液中的K1-18的抑制效應在表3c中顯示。當稀釋在含有對照MAb的緩沖液中時，Kl-18IgG顯示出與稀釋在含有BSA的緩沖液或稀釋在HBD血清中相似的TSH-生物素結合抑制活性(表3c)。因此，高濃度(100 μ g/mL)無關人MAb IgG的存在不會影響Kl_18IgG和M22IgG以及5C9IgG的抑制活性。表3d顯示出K1-70對TSH-生物素與所述TSHR的結合的效應，并且這些與K1-18或M22的效應是相當?shù)?表3a和3b)。稀釋在HBD血清中的Kl_70IgG對TSH-生物素結合有劑量依賴的抑制效應，在0.011^/1^、0.11^/1^和11^/1^下分別為13.6 士 1.4%、 74. 1 士0. 4%禾口 97. 4士0. 2% 的抑制。Kl_70Fab 有相似的活性，在 0. 01 μ g/mL、0. 1 μ g/mL 和 1 μ g/mL 下分別為 18. 2+0. 6%,88. 3士0. 3%和 96. 9士0. 的抑制。當 Kl_70IgG 或Fab 制品被稀釋在ELISA緩沖液中時，抑制活性與用HBD血清制備的稀釋物基本相同(表3d)。 Kl-18IgG對M22Fab-P0D與TSHR包被的ELISA板孔結合的抑制能力在表如中顯示。稀釋在HBD血清中的Kl-18IgG以劑量依賴的方式抑制M22Fab_P0D結合；具體地，觀察到在 0. 03 μ g/mL、0. 3 μ g/mL 禾口 3 μ g/mL 下分另Ij為 21. 0士 1. 3%,81. 6士0. 5%和 97. 2士0. 的抑制。該效應與M22IgG(稀釋在HBD血清中)的抑制效應(在0. 03 μ g/mL、0. 3 μ g/mL和 3 μ g/mL 下分別為 51. 0士2. 4%,93. 2士0. 3%禾口 98. 0士0. 2% )相當。Kl_18Fab 顯示出與 Kl-18IgG相似的抑制M22Fab-P0D結合的能力(表4b)。如表如所示，K1-18和M22抑制標志的M22與TSHR結合的能力比5C9、TSMAb 1-7和9D33的抑制活性更大。研究的所有MAb 當稀釋在ELISA測定緩沖液中時的抑制效應與當稀釋在HBD血清中時觀察到的相似(表 4a和b)?？杀容^K1-18對M22Fab-P0D與所述TSHR結合的抑制效應和K1-70的效應(表 4c)。稀釋在HBD血清中的Kl-70IgG表現(xiàn)出在0. 03 μ g/mL、0. 3 μ g/mL和3 μ g/mL下分別為 34. 5士3. 8%、91. 1 士0.3%和 97. 6士0. 的抑制。當 Kl_70IgG 稀釋在 ELISA 測定緩沖液中時觀察到相似的抑制百分比(表4c)。如表如所示，稀釋在HBD血清或ELISA測定緩沖液中的Kl-70Fab顯示出與Kl-70IgG相似的M22-P0D結合抑制活性。125I-標志的Kl_18IgG或Fab與TSHR包被管結合的抑制在濃度為0.01-100 μ g/mL(稀釋在HBD血清)的對照人MAb 4B4IgG存在下， 125I-Kl-18IgG的結合基本上未受影響(表fe)。這可與不同濃度的未標志的Kl-18IgG(稀釋在HBD血清)的效應相比較；增加的劑量——0.001、0.01、0. 1和1.0 μ g/mL分別引起對 125I-標志的 K1-18 結合的 11. 1 士4. 4%,22. 9士2. 4%,69. 0士0. 5%和 91. 7士0. 8%的抑制。在0. 001-100μ g/mL濃度下測試的未標志的Kl-18Fab顯示出10. 3 士 2. 2% (0. 03 μ g/ mL 下)至 84. 8 士 0.9% (100 μ g/mL 下)的抑制范圍(表 5b)。Kl_70IgG 和 Fab (都在 0. 001-100 μ g/mL的濃度范圍內測試)也以劑量依賴方式抑制125I-Kl-ISIgG結合，并在 10 μ g/mL的Kl-70IgG下有95. 1 士0. 3 %的基本完全抑制和3 μ g/mL的Kl_70Fab下有 92. 8士 1. 的基本完全抑制(表5b)。此外，125I-Kl-18IgG的結合被M22IgG、M22Fab、 5C9IgG、TSMAb l_7IgG和9D33IgG以劑量依賴的方式抑制(表fe和恥)。當使用稀釋在包被管測定緩沖液中的各種MAb制品進行相同的實驗時，各個制品(除了 5C9IgG)的抑制效應與當稀釋在HBD血清中時觀察到的效應相當(表fe)。對于稀釋在測定緩沖液中的5C9，100 μ g/mL下的最大抑制是91. 3士0. 4 %，相比之下，稀釋在HBD血清中的抑制為 57.7 士 2.4%，在 0.01yg/mL 下抑制分別為 11. 7 士 1. 8 % 和-1. 8 士 2. 7 % (圖 fe)。 125I-Kl-ISIgG與TSHR包被管的結合被淋巴細胞供體血清抑制，在1 20和1 10的血清稀釋度下分別導致35. 2%和59. 3%的抑制(圖5c)。來自20位格雷夫斯病患者的血清抑制125I-Kl-ISIgG的結合并且所述抑制效應與對125I-TSH結合的抑制效應相當(圖5c)。 表5c還顯示來自具有阻斷TRAb的兩位患者的血清稀釋物(Bi和B》和來自具有刺激TRAb 的兩位患者的血清稀釋物(Si和S2)對125I-Kl-ISIgG結合和125I-TSH結合的效應。各種 MAb對25I-Kl-18Fab與所述TSHR包被管結合的效應在表5d中示出。未標志的Kl_18IgG和Kl-18Fab都對125I-Kl-18Fab結合有劑量依賴的抑制效應并且這些效應與M22IgG、M22Fab 和 Kl-70IgG 的效應相當(圖 5d)。5C9IgG、TSMAb l_7IgG 和 9D33IgG 也抑制 125I_Kl_18Fab 結合，但是，與M22、K1-18和K1-70制品相比，它們的效應較小(圖5d)。對表達所述TSHR的CHO細胞中環(huán)AMP產(chǎn)生的刺激如表6a所示，Kl-18IgG以劑量依賴的方式刺激表達所述TSHR的CHO細胞中的環(huán)AMP的生產(chǎn)。在低滲緩沖液中，在0. Ing/mL Kl_18IgG存在下環(huán)AMP的水平是 1. 56士0. 32pmol/L，在 1. Ong/mL 下為 4. 08士0. ^pmol/L，在 10ng/mL 下是 31. 66士5. 06pmol/L，在 100ng/mL 下是 64. 95士9. 61pmol/L 而在 1000ng/mL 下是67. 90士 10. 44pmol/L。在低滲緩沖液中不同濃度的Kl_18Fab下的環(huán)AMP水平在 Ing/mL、10ng/mL、100ng/mL 和 1000ng/mL 的 Kl_18Fab 下分別是 1. 72士0. 82pmol/L、 9. 99士3. 52pmol/L、53. 22pmol/L和 66. 94士6. 93pmol/L。在低滲緩沖液中 Ing/mL 的M22Fab 刺激產(chǎn)生 29. 80士0. 97pmol/L 的環(huán) AMP，而在 10ng/mL 下產(chǎn)生 57. 41 士5. 05pmol/L 的環(huán) AMP (表6a)。表6a還顯示在等滲條件下測試的Kl_18IgG或Fab對表達所述TSHR的CHO 細胞中環(huán)AMP刺激的效應。如表6a中的實例所示，K1-18和K1-70在等滲條件下都引起環(huán)AMP產(chǎn)生的升高，但是產(chǎn)生的環(huán)AMP的水平比使用低滲條件的實驗低。在低滲緩沖液中測試的M22IgG和Kl-18IgG刺激活性的比較在表6b中顯示。在3ng/mL濃度下，M22IgG刺激 24. 3士2. 3pmol/mL 的環(huán) AMP，而 Kl_18IgG 刺激 8. 3士0. 5pmol/mL 的環(huán) AMP。在 10ng/mL 下，M22IgG和Kl-18IgG分別引起環(huán)AMP的50. 3士 1. 6和25. O士 1. Opmol/mL的刺激，而在 100ng/mL下分別引起環(huán)AMP的64. 6士 1. 9和62. 6士2. 7pmol/mL的刺激。還相對于NIBSC參考制品90/672的活性評估了 Kl-ISIgG和Fab的刺激活性(表6c)。計算到的Kl-ISIgG的
環(huán) AMP 刺激活性是 155NIBSC 90/672 單位 /mg (在 3 個濃度-Ing/mL、3ng/mL 和 10ng/mL
下計算的平均活性)(圖6c)。在相同實驗中計算的Kl-ISFab的環(huán)AMP刺激活性是22NIBSC 90/672 單位 /mg (使用 1 Ong/mL、30ng/mL 和 100ng/mL 的 Kl_18Fab 的活性進行計算)(圖 6c)。這可與286NIBSC單位/mg的M22IgG環(huán)AMP刺激活性相比較(表6c)。為了比較的目的，豬TSH、天然人TSH和重組人TSH在等滲緩沖液和低滲緩沖液中的刺激活性在表6d中顯
7J\ ο表6e顯示的其他實例涉及Kl_18IgG、M22IgG或pTSH以不同的組合混合在一起時的刺激效應。當兩個刺激物混合在一起時，pTSH、M22或K1-18的刺激效應看來比僅相同濃度的所述刺激物的效應增強了。具體地，在僅0. Ing/mL的pTSH下環(huán)AMP產(chǎn)生為 11. 01 士0. 99pmol/mL(平均值士SD)，Ing/mL 的 M22IgG 為 35. 17士6. 38pmol/mL(平均值 士SD)，而當 0. Ing/mL pTSH 和 Ing/mL M22IgG 混合在一起時增加至 47. 22士3. 89pmol/ mL (平均值士SD)。同樣，0. Ing/mL的pTSH和10ng/mL的Kl_18IgG混合物比僅這些刺激物時的刺激效應大(表6e)。此外，混合在一起的兩種刺激抗體比同樣濃度的單種抗體更有效。例如,應答5ng/mL的Kl-18IgG產(chǎn)生四.95士 1. 18pmol/mL (平均值士SD)的環(huán)AMP，應答0. 5ng/mL的M22IgG產(chǎn)生20. 20 士 2. 48pmol/mL (平均值士 SD)的環(huán)AMP，而應答混合在一起的 5ng/mL K1-18 和 0. 5ng/mL M22 產(chǎn)生 44. 01 士7. 19pmol/mL (平均值士SD)的環(huán) AMP (表 6e) ο比較K1-18和K1-70供體血清和供體血清IgG刺激環(huán)AMP的能力與NIBSC 90/672 的刺激活性的兩個實驗的結果在表6f和6g中顯示。在實驗1中，在30倍稀釋度下供體血
26清的刺激活性是4. 7士0. lpmol/mL的環(huán)AMP，相比之下，在相同稀釋度下HBD血清的效應為 1. 7 士0. 4pmol/mL的環(huán)AMP，而供體血清IgG在30 μ g/mL下的刺激活性是7. 7 士 1. Opmol/ mL(代表相對于0.013單位/mg的NIBSC 90/672的活性)(表6f)。在實驗2中，30倍稀釋的供體血清引起9. 5 士0. 7pmol/mL的環(huán)AMP刺激，而30 μ g/mL的供體血清IgG引起 15. 6 士 0. 7pmol/mL的刺激(代表相對于0. 014單位/mg的NIBSC 90/672的活性)(表6g)。 如表Mi所示的實例所述，Kl-18IgG的TSHR刺激活性被具有TSH拮抗活性的人MAb (K1-70 和5C9)抑制。具體地，10ng/mL的Kl_18IgG引起50. 0士3. 3pmol/mL的環(huán)AMP刺激，并且這在 0. 1 μ g/mL Kl-701gG 存在下被降低至 3. 8士 1. Opmol/mL (92 %抑制)。在 10ng/mL 的 Kl-18IgG 和 0. 1 μ g/mL 的 5C9IgG 存在下環(huán) AMP 水平是 4. 4士 1. 5pmol/mL (91 %抑制)。在更高濃度的Kl-70IgG或5C9IgG下，抑制效應是完全的(100%抑制)(表他)。在另外的實驗中，研究了與5C9IgG混合在一起的Kl-70IgG對Kl_18IgG刺激活性的效應(表6i)。如表 6i 所示，10ng/mL 的 Kl_18IgG 刺激被 0. 1 μ g/mL 的 5C9IgG 或 0· 1 μ g/mL 的 Kl_70IgG 有效地抑制。當混合Kl-70IgG和5C9IgG得到0. 1 μ g/mL的總最終濃度時，Kl_18IgG的刺激活性也被有效地抑制(97. 3%抑制)。但是在較低濃度下，與僅一種抗體相比，Kl-70IgG和 5C9IgG在混合在一起時是Kl-18IgG刺激活性的更有效抑制物。例如，在0. 001 μ g/mL下， Kl-70IgG和5C9IgG單獨地不引起抑制(分別為0%和1 % )，而當一起混合為相同的總IgG 終濃度(即0.001 μ g/mL)時抑制是25. 5%。表6i還顯示在Kl_70IgG(100 μ g/mL)存在下環(huán)AMP濃度與在測定緩沖液存在下觀察到的環(huán)AMP濃度相似，而在5C9IgG(100 μ g/mL)存在下環(huán)AMP的濃度較低(分別為0. 89士0. 13,0. 89士0. 15和0. 55士0. 14)( 一式三份測定的平均值士SD)。當Kl-70IgG和5C9IgG混合在一起時(100 μ g/mL的總IgG終濃度)，環(huán) AMP濃度沒有降到低于在緩沖液存在下觀察到的水平(即不低于基礎或組成性活性水平)。 為進行比較，在1 μ g/mL的5C9IgG或1 μ g/mL的Kl_70IgG下觀察到對M22IgG (3ng/mL)刺激活性的基本完全的抑制(分別為97. 1 %和96. 6%抑制)，并且在0. 1 μ g/mL的5C9IgG或 0. 1 μ g/mL的Kl-70IgG下的抑制分別為92. 8%和75. 5% (表6j)。但是，當5C9和K1-70 混合在一起達到0. 1 μ g/mL的總IgG終濃度時觀察到了 91. 9%的抑制(表6j)。Kl_70IgG 和9D33IgG的混合物對Kl-18IgG刺激活性的效應在表故中顯示。對于9D33IgG，在1 μ g/mL 下觀察到了 95%抑制，而對于Kl-70IgG，在0. lyg/mL下顯示出相同的抑制(95%抑制)。 當所述兩種阻斷MAb (9D33和K1-70)混合在一起達到0. 1 μ g/mL的總IgG終濃度時也觀察到了 95%的抑制(表。10 μ g/mL的9D33IgG能夠基本完全抑制M22IgG的環(huán)AMP刺激 (94%抑制)而較低濃度的Kl-70IgG(l μ g/mL)具有相似的效應(96%抑制)(表61)。對 M22活性基本完全的抑制(96%抑制)在1 μ g/mL的9D33和K1-70混合物下是明顯的(表 61)。這與9D33和K1-70混合物(1 μ g/mL)對TSH刺激活性的抑制效應(97%抑制)是相當?shù)?表6m)。但是，應注意TSH刺激活性被僅Kl-70IgG抑制(1 μ g/mL下98%抑制)比被僅9D33IgG抑制(100 μ g/mL下95%抑制)更有效(圖6m)。表6η顯示淋巴細胞供體血清和包含具有阻斷活性的TRAb (Β1-Β3)的3位患者的血清對TSH、M22IgG和Kl_18IgG的TSHR 刺激活性的效應。所述供體血清抑制TSH、M22IgG和Kl-ISIgG刺激活性(分別為63. 8%, 80. 1 %和79. 5%抑制)。含有對TSH和M22IgG刺激具有強烈抑制效應的阻斷TRAb的3種不同血清還抑制Kl-18IgG的刺激活性(表6n)。不同患者血清對TSH、M22IgG或Kl_18IgG 刺激活性的抑制效應是相當?shù)摹?br> 拮抗(阻斷)活性的測量表達所述TSHR的CHO細胞與3ng/mL的豬TSH的孵育引起62. 6士3. 9pmol/mL的環(huán) AMP產(chǎn)生刺激(表7a)。在漸增量的Kl-70IgG存在下，豬TSH的刺激活性被以劑量依賴的方式抑制。具體地，在0. 01,0. 05,0. 1和1 μ g/mL的Kl_70IgG存在下，環(huán)AMP的水平分別為 60. 1 士 1. 6,31. 4士 1. 9,5. 8士2. 8 和 2. 0+0. 2pmol/mL，分別代表相對于對照 MAb IgG (5B3) 的4. 0%,49. 8%,90. 7%和96. 8%的抑制(表7a)。表7a還顯示出用于比較的5C9IgG的抑制效應。在兩種不同實驗條件下Kl-70Fab對豬TSH的刺激活性的效應在表7b中顯示。在兩種條件下(即在等滲介質和在低滲介質中)在1 μ g/mL Kl-70Fab存在下，豬TSH刺激活性都基本被完全抑制。Kl-70Fab的效應在所研究的濃度范圍內(0. 003 μ g/mL至3 μ g/mL) 是劑量依賴的，低至0. 05 μ g/mL的Fab顯示出在1 μ g/mL對照MAb存在下將豬TSH刺激的環(huán) AMP 從 39. 5 士 1. 9pmol/mL 降低至沘· 9 士 1. lpmol/mL (在等滲條件下)(表 7b)。Kl_70Fab 在低滲條件下的效能與在等滲條件下的效能相似(表7b)。如表7c所示的實例所顯示，濃度漸增的Kl-70IgG(范圍為0. 001-100 μ g/mL)沒有顯示出抑制TSHR組成性(基礎)活性的任何能力。這與在表7c中顯示的用于比較的5C9IgG的效應不同。在同一實驗中測試的阻斷小鼠抗體9D33沒有影響TSHR組成性活性的能力(表7c)并且在高濃度的9D33情況下觀察到一些微弱的刺激活性(約2X基礎活性)。如表7d所示Kl_70IgG的阻斷活性與所述淋巴細胞供體血清的阻斷活性進行比較。環(huán)AMP水平在與Ing/mL豬TSH孵育后為61. 7士4. 3pmol/mL，并且所述水平在供體血清 (10 X稀釋)存在下下降到14. 9士 1. 2pmol/mL(75. 9%抑制)，而當血清稀釋20倍時下降到 51. 6+2. 6pmol/mL(16. 4%抑制)。較高稀釋度的供體血清沒有可檢測的對TSH刺激活性的效應?？杀容^供體血清的效應與Kl-70IgG的效應(在0. 1 μ g/mL下與稀釋10倍的血清有相似的效應)(分別為67. 6%和75. 9%抑制)(表7d)。如表7e中的實例所示，Kl_70IgG 具有阻斷豬TSH、人TSH和人重組TSH的環(huán)AMP刺激活性的能力。0. 1 μ g/mL的Kl_70IgG 是在低滲介質條件下測試的所有三種TSH制品的刺激活性的有效阻斷物。Kl-70IgG的阻斷活性在等滲介質條件下有效性較低(表7e)。Kl-70IgG對表達所述TSHR的CHO細胞中 M22IgG介導的環(huán)AMP產(chǎn)生的刺激的效應在表7f中顯示。在3ng/mL的M22IgG下觀察到的環(huán)AMP水平為33. 1 士 1. 8pmol/mL并且這些在Kl_70IgG存在下下降，例如在0. 1 μ g/mL下為4. 3士2. 4pmol/mL(87%抑制)(表7f)。Kl_70IgG的效應與在相同實驗中測試的5C9IgG 的效應相當(表7f)。此外，Kl-70IgG顯示出阻斷來自格雷夫斯病患者的血清中的TRAb的環(huán)AMP刺激活性的能力，并且表7g1k中的實例示出了濃度為100 μ g/mL的Kl_70IgG引起所研究的全部15種血清中刺激活性的完全抑制(T1-T15的抑制范圍為90. 8%至98. 7% )。 除一種血清即Tll以外，Kl-70IgG對血清T1-T15刺激活性的效應與相同實驗中測試的 5C9IgG和9D33IgG的效應相當(表7j)。血清Tll的刺激活性僅被100 μ g/ml的5C9IgG微弱地抑制(8. 5%抑制)，而在100 μ g/mL的K1-70存在下所述抑制基本是完全的(95. 1 %抑制)(表7j)。在100 μ g/mL 9D33下也觀察到了對Tll的有效抑制(87. )(表7j)。不同阻斷MAb在不同濃度(0.01-100 μ g/mL)下對三種格雷夫斯血清(包括血清Tll)的刺激活性的效應在表71-7n中更詳細地展示。這些實驗顯示Kl-70IgG、5C9IgG和9D33IgG在低至0. 1 μ g/mL的濃度下都是有效的抑制物，但是在血清Tll的情況下，5C9IgG對它有很少或沒有效應(表7n)。表7o顯示在一個實驗中Kl-70IgG和5C9IgG當這兩種阻斷Mab混合在一起時對豬TSH刺激的抑制。這些實驗顯示所述兩種阻斷Mab在結合時能夠有效抑制 TSH刺激的環(huán)AMP產(chǎn)生。此外，測試了混合在一起的Kl-70IgG和5C9IgG對所述TSHR的組成性活性的效應。如表7c和7p所示，與5C9IgG不同，Kl_70IgG對TSHR基礎活性沒有影響。當K1-70和5C9IgG混合在一起得到2 μ g/mL的IgG終濃度時，環(huán)AMP水平在緩沖液存在下從58. 04士8. 52pmol/mL(平均值士SD，n = 3)僅略微下降至55.沘士6. 17pmol/mL(平均值士SD，n = 3)，即4. 8%抑制(表7p)。但是，當5C9IgG與5B3IgG (谷氨酸脫羧酶的對照抗體)混合得到2 μ g/mL的IgG終濃度時，所述TSHR的組成性活性被抑制至基礎值的 52. 1% (環(huán)AMP水平27. 78 士 2. 96pmol/mL ；平均值士 SD，n = 3)(表7p)。這些實驗顯示在 Kl-70IgG存在下，5C9IgG不能夠作為TSHR組成性活性的有效抑制劑起作用。TSHR突變對K1-18刺激活性的效應使用表達具有以下氨基酸突變的TSHR的CHO細胞測試Kl_18IgG對環(huán)AMP產(chǎn)生的刺激的效應Lys58Ala、Arg80Ala、Tyr82Ala、Glul07Ala、Argl09Ala、Lysl29Ala、 Phel30Ala、Phel34Ala、Lysl83Ala、Asp203Ala 和 Arg255Asp (表 8a_k 并且在表 10 中做了總結)。TSHR 氨基酸 Lys58、Arg80、Tyr82、Glul07、Argl09、Lysl29、Phel30、Phel34 和 Asp203突變?yōu)楸彼釋l-18IgG刺激環(huán)AMP產(chǎn)生的能力沒有影響。K_18IgG刺激環(huán)AMP 產(chǎn)生的能力在表達包含突變Lysl83Ala和Arg255Asp的TSHR的CHO細胞中完全喪失，并且響應Kl-ISIgG的環(huán)AMP濃度與在僅有環(huán)AMP緩沖液存在下觀察到的濃度相似(表8i 和8k)。但是，對TSH的響應性對于突變Lysl83Ala和Arg255Asp得以保留。在另外的一系列實驗中進一步測試了 TSHR的多個氨基酸突變對Kl-18IgG的環(huán)AMP刺激活性的效應 (表 14a-14v 并且在表 16 中做了總結)。TSHR 殘基 Asp43、Ile60、Glu61、Thrl04、Hisl05、 Lys250、Arg255、Thr257、Asp276和kr281的突變(突變?yōu)楸彼?對Kl_18IgG的刺激環(huán) AMP產(chǎn)生的能力沒有影響。TSHR的Aspl51、Glul78、Lys209、Gln235和Glu251突變?yōu)楸彼嵋餕l-ISIgG刺激活性的較小的下降，但是這些突變也會影響TSH刺激活性，因此認為與這些TSHR殘基的相互作用對K1-18不是特異的。相反地，TSHR Glul57Ala、Lysl83Asp、 Tyrl85Ala和Asp232Ala的突變致使Kl_18IgG刺激環(huán)AMP的能力的喪失(少于野生型活性的 20% ；表 14g、14i、14j 和 14m)。此外，Kl_18IgG 刺激 Tyr206、1"印258 和 Arg274 突變?yōu)楸彼岬腡SHR的能力下降至野生型活性的約40-60% (表14k、Hs和14t)。TSHR突變對K1-70阻斷活性的效應在表達包含以下氨基酸突變?yōu)楸彼岬腡SHR的CHO細胞中測試Kl_70IgG對TSH 刺激的環(huán) AMP 產(chǎn)生的效應Lys58、Arg80、Tyr82、Glul07、Argl09、Lysl29、Phel30、Phel34、 Lysl83和Asp203。此外，測試了 TSHR突變Arg255Asp的效應(表9a_k并且在表10中做了總結)。TSHR 氨基酸 Arg80、Glul07、Lysl29、Phel30、Phel34 和 Asp203 突變?yōu)楸彼釋l-70IgG抑制TSH刺激的環(huán)AMP生產(chǎn)的能力沒有影響。TSHR Lys58、Tyr82、Argl09和 Lysl83突變?yōu)楸彼崾筀1-70抑制TSH刺激的環(huán)AMP產(chǎn)生的能力下降。突變Lys58Ala有最大的效應(表9a)，之后是Argl09Ala、Lysl83Ala和具有最小效應的Tyr82Ala(分別示于表9e、9i和9c以及表10)。但是，研究的突變沒有一個引起Kl_70IgG阻斷TSH刺激的環(huán)AMP生產(chǎn)的能力完全喪失。在其他系列的實驗中，進一步測試了 TSHR的多個氨基酸突變對Kl-70IgG阻斷活性的效應(表15a-15v并在表16中做了總結)。在TSHR轉染的CHO細胞中K1-70抑制TSH刺激的環(huán)AMP產(chǎn)生的能力未受TSHR Asp43、Thrl04、Hisl05、Aspl51、Tyrl85、Tyr206、Lys209、Asp232、Gln235、Glu251、Arg255、Thr257、Trp258 和 Arg274 突變?yōu)楸彼峄駻spl60Lys和Lysl83Asp突變的影響。TSHR Glul78和kr281 (突變?yōu)楸彼? 的突變對Kl-70IgG阻斷TSH的刺激活性的能力有較小影響(野生型活性的80-100%，表 15h和15v)。TSHR Glu61、Lys250和Asp276突變?yōu)楸彼嵋饘l_70IgG阻斷活性的一些效應(野生型的60-80% )(表15c、15ο和15u)，而TSHR突變Ile60Ala引起Kl_70IgG 的阻斷活性下降至野生型活性的40-60% (表15b)。125I-標志的Kl_70IgG或Fab結合TSHR的抑制125I-Kl-70IgG與TSHR包被管的結合被未標志的Kl_70IgG以劑量依賴的形式抑制，并且在0. 003 μ g/mL、0. 03 μ g/mL、0. 3 μ g/mL和3 μ g/mL(稀釋在HBD血清中)的濃度下，所述抑制分別是 10. 2士2. 4%、36. 5士 1. 9%、84. 4士0. 8%和 92. 0士0. 5% (表 Ila)。 如表Ila所示，125I-Kl-70IgG的結合被M22IgG(稀釋在HBD血清中)以非常類似的方式抑制在 0. 003 μ g/mL、0. 03 μ g/mL、0. 3 μ g/mL 和 3 μ g/mL 濃度下分別為 6. 2% ( —式兩份測定的平均值)>33. 8士0. 9%、84· 6士 1. 禾口 91. 6士0. 5%抑制。M22Fab顯示出在較低濃度下抑制 125I-Kl-70IgG 結合的較大效能，在 0. 003 μ g/mL、0. 03 μ g/mL、0. 3 μ g/mL 和 3 μ g/ mL(稀釋在HBD血清中)濃度下的抑制分別為16. 7士6. 0%、60. 2士 1.8%、89. 9士01%和 92. 0士0.3% (表11a)。同樣，Kl_18IgG和Fab以劑量依賴的方式抑制125I_Kl_70IgG與 TSHR 結合(表 lib)。0. 03 μ g/mL、0. 3 μ g/mL 和 3 μ g/mL 的 Kl_18IgG 稀釋物(在 HBD 血清中)分別顯示出 20. 0 士 1. 9%,73. 9 士 0. 6% 禾口 91. 0 士 0. 3% 的抑制，而 0. 03 μ g/mL、0. 3 μ g/
(在 HBD血清中)分別顯示出 10. 2士2· 1%,60. 9士 1. 和80. 5士0. 6%的抑制(表lib)。相反地，需要較高濃度的5C9IgG來抑制125I-Kl_70IgG結合15. 4士3. 4%抑制需要 1μ g/mL，而 100 μ g/mL 顯示出 68. 5士0. 7%抑制(表 Ila)。表 Ila和lib還顯示出多種人MAb在測定緩沖液中對125Ι-Κ1-70結合的效應。當稀釋物在測定緩沖液中制備時比用HBD制備的效應更強。所述TSHR具有TSHR刺激活性(TSMAb 1-7) 和具有TSHR阻斷活性(9D33)的不同小鼠單克隆抗體對125I_Kl-70IgG與TSHR結合的效應在表Ilc中顯示。測試的全部TSMAb均具有抑制125I-Kl-70IgG結合的能力并且100 μ g/ ml的濃度(在HBD血清中)引起的抑制范圍為33. 5士3. 7% (TSMAb 3)至59. 6士0.6% (TSMAb 5)(表 11c)。100yg/ml 的 9D33IgG(在 HBD 血清中)顯示出 51. 1 士 1.7%的抑制 (表lie)。當這些MAb稀釋在測定緩沖液中時，在一些情況下，與使用HBD稀釋相比，抑制％ 略高，而在另一些情況下則抑制％略低(表11c)。其他實驗顯示125Ι-Κ1-70與TSHR的結合還被 Kl-18IgG、Kl-18Fab、M22IgG、M22Fab、Kl_70IgG、Kl_70Fab 和小鼠 TSMAb 以劑量依賴方式有效地抑制(表lid)。含有TSHR自身抗體(125I-TSH結合抑制活性的范圍為15.9% 至80.0% (在所述TSHR包被管測定中))的格雷夫斯病患者血清(n = 20)還顯示出抑制 125I-Kl-7OIgG 或 Fab 與 TSHR 結合的能力(分別為 19. 2%至 77. 6%和 15. 9%至 72.8% ) (表lie)。測試的所述三種標志的配體的抑制％對于每種血清是相當?shù)?表lie)。所述 HBD血清(n = 10)全都對125I-標志的TSH、Kl_70IgG或Fab結合沒有影響(表lie)。表 lie示出了使用具有TSHR刺激活性的兩種血清(Si和S》和具有TSHR阻斷活性的兩種血清(Bi和B2)的實驗的實例。有任一類型活性的血清以劑量依賴的方式抑制125I-標志的 TSH、Kl-70IgG或Fab結合，并且每種血清對不同配體結合的抑制程度是相當?shù)?表lie)。K1-18和K1-70與TSHR結合的動力學
室溫下125I-標志的Kl_70IgG和Fab與TSHR(全長)包被管的結合在180分鐘后達到最大(分別為45.5%和37.1%結合)。50%最大結合出現(xiàn)在約35分鐘后(圖la)。 25I-標志的Kl-70IgG與TSHR260包被管的結合在180分鐘達到36. 2%而在孵育60分鐘后觀察到50%最大結合(圖lb)。125I-標志的Kl-70Fab與TSHR260結合的時間過程與對 Kl-70IgG觀察到的時間過程相似，60分鐘孵育后的最大結合為37. 3%而50%最大結合出現(xiàn)在約60分鐘后(圖Ic)。向與TSHR (全長)包被管結合的125I-Kl-70IgG或125I-Kl-70Fab 中加入未標志的 Kl-70IgG 或 Fab、Kl-18IgG 或 Fab、M22IgG(都是 lmg/mL)，豬 TSH(100mU/ mL)或測定緩沖液，即使在孵育180分鐘后也不會導致可檢測的解離(圖ld，Ie和If)。但是，向與TSHR包被管結合的125I-Kl-70IgG或125I-Kl-70Fab中加入未標志的M22Fab (lmg/ mL)之后分別41. 2%和27. 9%的結合總數(shù)在孵育180分鐘后解離(圖Id和If)。各種未標志的配體對與TSHI^60結合的125I-標志的Kl-70IgG的解離效應在圖Ig中示出。豬TSH、 M22IgG和Kl-18IgG沒有作用而M22Fab和Kl_70Fab在30分鐘的孵育后引起約30%的結合的125I-標志的Kl-70IgG從TSHR260上解離，并且之后直至180分鐘解離不再增加(圖 lg)。Kl-18Fab具有類似效應，如圖Ih所示。125I-Kl_70Fab與TSHR260包被管的結合不會通過用未標志的 Kl-70IgG、Kl-18IgG、M22IgG(都是 lmg/mL)、豬 TSH(100mU/mL)或測定緩沖液的孵育而解離。用未標志的M22Fab或Kl-70Fab(lmg/mL)孵育引起125I-Kl_70Fab與 TSHR260結合的解離(分別為58. 9%和62% )(圖li)。125I-標志的Kl_18IgG與TSHR包被管在室溫下的結合在180分鐘后在全長TSHR包被管的情況下達到最大值32. 7%，而在 TSHR260包被管的情況下達到23. 3% (圖Ij)。在全長TSHR情況下在約45分鐘后觀察到 50%最大結合而在TSHR260的情況下在約50分鐘后觀察到50%最大結合(圖Ij)。與全長 TSHR包被管結合的125I-標志的Kl-ISIgG不會在用未標志的豬TSH孵育時幾近不解離(not dissociated to a smau extent)，而用未標志的 Kl_18IgG、M22IgG、Kl_70IgG、Kl_18Fab 和Kl-70Fab孵育有略大的效應(180分鐘后約25%解離)(圖Ik)。相反地，M22Fab導致 60分鐘孵育后與全長TSHR結合的125I-Kl-18IgG的解離，在180分鐘孵育后增加至 43%解離(不存在M22Fab時有34. 5%結合的125I_Kl_18IgG，相比之下，用M22Fab孵育60 和180分鐘后分別有24. 5%和19. 8%結合的125I_Kl_18IgG)(圖lk)。對于與TSHR260包被管結合的125I-標志的Kl-18IgG，用豬TSH孵育沒有解離效應(圖11)。相反，用未標志的 M22Fab 孵育，Kl_70Fab 和 Kl_18Fab 引起結合的 125I_Kl_18IgG 從 TSHR260 上解離。在 M22Fab和Kl-70Fab存在下解離很快(30分鐘孵育后約50% )，而用Kl_18Fab孵育90分鐘后引起 50%解離(圖 11)。完整 M22IgG、Kl-70IgG 和 Kl-18IgG 使 125I-K1-18 從 TSHR260 上解離的能力較小，180分鐘孵育后觀察到約30%的解離(圖11)。另一系列實驗顯示125I-標志的豬TSH不能夠與TSHR260包被管結合。以前描述過125I-TSH與全長TSHR包被管的結合(Nakatake et al 2006 文獻見上文)。在基于TSHR260-AP 的 ELISA 中 K1-18 或 Kl_70IgG 的效應Kl-18IgG在固定在ELISA板孔上的全長TSHR與液相中的TSHR260-AP之間形成 “橋連”的能力由表12a中的實例描述。0D405nm值以劑量依賴的方式隨著Kl-ISIgG(稀釋在HBD血清中)濃度的上升而上升。具體地，與僅存在HBD血清情況下-0. 002的0D405nm 相比，0D405nm 值在 0. 005,0. 05,0. 5、10 禾口 100 μ g/mL 的 Kl_18IgG 下分別為 0. 013,0. 191、 0. 511、0. 660 和 0. 706。Kl_70IgG(稀釋在 HBD 血清中)也在所述橋連 ELISA(bridging
31ELISA)中結合良好并且在0. 005,0. 05,0. 5、10和100 μ g/mL的Kl_70IgG濃度下分別顯示出 0. 045,0. 290,0. 661,0. 738 和 0. 794 的 0D405nm 值(表 12a)。如表 12a 所示，K1-18 和 Kl-70IgG的效應可與M22IgG結合TSHI^eO-AP制品的能力相比較。在所述測定中，劑量增加的M22IgG (稀釋在HBD血清中，0. 005 μ g/mL至10 μ g/mL)結合增加量的所述TSHR，0D405nm 值范圍為0. 045至0. 796。當MAb稀釋物在ELISA測定緩沖液中制備而不是在HBD血清中制備時，450nm處的吸光度較高，尤其是對于5C9 (表12a)。二價IgG與TSHR的兩個分子結合的“橋式” ELISA原理已被表12b中所示的實驗結果進一步證實。TSHR的人Mab的完整 IgG(M22、5C9、Kl-18和K1-70)在所述ELISA中顯示出劑量依賴的結合，而相同MAb的單價 Fab片段顯示出很小的反應或沒有反應(表12b)。如表12c中的實例所示，小鼠TSMAb 1-7 也在所述TSHR260-AP ELISA中結合良好。OD 405nm信號在10 μ g/mL的TSMAb 1_7濃度下為0. 103至0. 561(表12c)。小鼠TSHR阻斷MAb 9D33也在該測定系統(tǒng)中結合，在10 μ g/ mL下OD 405nm信號為0. 481 (表12d)。含有具有刺激活性的TRAb的患者血清，即顯示出在表達所述TSHR的CHO細胞中刺激環(huán)AMP活性的能力的血清，在所述TSffi^60_AP ELISA 中反應良好。表1 示出了在不同稀釋度下測試的6種不同血清的實例，并且在HBD血清中的1/5稀釋物中，所述0D405nm信號在HBD血清中為0.407至0.924。此外，如表12f的實例所描述，來自具有阻斷型TSHR自身抗體的患者的血清在TSHI^eO-AP ELISA中結合良好，在HBD血清中的1/10稀釋物中，OD 405nm信號為0. 323至0. 896。表12g示出了在 TSHR260-AP ELISA中患者血清結合的更多實例。TSHR260-AP ELISA中TRAb濃度由校準曲線(由NIBSC參考制品90/672得到)計算并與在相同血清中使用TSHR包被管測定測量的 TRAb濃度(表示為NIBSC U/L)相比較。使用所述TSHR260-AP ELISA和通過對TSH與全長 TSHR結合的抑制(包被管測定)得到的TRAb測量結果有良好的總體一致性(r = 0.913， η = 57)(圖加)。表1 顯示出患者血清TRAb具有抑制過氧化物酶標志的M22Fab與包被在ELISA板孔上的TSHR260結合的能力?；趯22Fab與全長TSHR結合的抑制的測定中 TRAb測量結果的比較與基于對M22Fab與TSHR260結合的抑制的測定中的結果非常相關(r =0. 761 ；η = 56)(圖沘)。其他比較數(shù)據(jù)在圖2c和2d中顯示。測試了 TSHR R255突變對 TSHR260-AP ELISA中的抗體結合的效應。在這些實驗中，含有突變R255D的全長TSHR制品被包被在所述板孔上并且使用上文所述的標準方法進行ELISA。如表12i所示，Kl-70IgG 或9D33IgG的結合僅被TSHR R255D突變略微影響。相反地，M22IgG結合被TSHR R255D突變顯著地影響，在所有研究濃度下OD信號都降低(表12i)。TSHR R255D突變對較高濃度的Kl-ISIgG幾乎沒有影響，但是較低的濃度(0. lyg/mL及以下)在使用所述突變受體的測定中有效性低得多(表12i)。表12j還顯示當使用TSHR R255D包被的板時，與野生型 TSHR比較，10種格雷夫斯血清(沒有就TSHR刺激或阻斷活性而進行選擇)的OD 405nm信號都降低。所述信號降低的程度隨不同血清而變化(圖12j)?；颊逿SHR阻斷血清在所述 TSHR260-AP ELISA中結合良好(表12f)，并且相同血清與TSHRR255D的結合在表12k中顯示。在使用野生型TSHR和R255D突變的TSHR的實驗中，所述OD 405nm信號值相似，因此TSHR R255D突變對阻斷血清的結合的效應在該測定系統(tǒng)中似乎不明顯。在TSHI^60-AP ELISA中R255D突變對患者阻斷血清的結合的效應可與所述相同突變對具有甲狀腺刺激活性的患者血清的結合的效應進行比較。表121顯示6種刺激血清(S1-S6血清與表12e中所示的相同)與TSHR R255D的結合。對于全部6種血清，OD 405nm值在使用TSHR R255D的測定中均比使用野生型TSHR的測定中低。信號降低的程度是變化的對于血清S4、S5和 S6(以1 5稀釋在HBD合并血清中)，所述信號從使用所述野生型TSHR的實驗中的0.646、
0.407和0. 531分別降低至使用TSHR R255D的實驗中的0. 193,0. 133和0. 342 (表121)。 對于具有高水平TRAb的血清(表1 和121中的血清S1-S3)，OD 405nm值的下降在較高血清稀釋度下非常明顯。例如，對于血清S1、S2和S3(以1 20稀釋在HBD合并物中)，OD 405nm信號在使用野生型TSHR的實驗中為0. 583,0. 407和0. 453，它們在使用TSHR R255D 的實驗中分別明顯地下降至0. 193,0. 117和0.210。表1 和121中所示的實例表明具有 TSHR刺激活性的血清在一些情況下至少基于與含有R255D突變的TSHR的結合的差異而與具有TSHR阻斷活性的血清不同。具有刺激活性的患者血清的結合傾向于被所述突變影響， 而具有阻斷活性的患者血清的結合傾向于不被影響。不同TSHR制品的溫度穩(wěn)定性在溫度穩(wěn)定性實驗中，在所述ELISA中M22Fab_過氧化物酶與全長TSHR結合的 OD45tlIim值對于以下三種處理的制品分別為1. 748,0. 268和0. 126 (a)儲存在_80°C下的制品(未處理)；(b)在室溫下孵育M小時，之后放回-80°C的制品；以及(c)在室溫下孵育 48小時，之后放回_80°C的制品。因此在室溫下保存48和M小時的全長TSHR制品分別顯示出相對于未處理的制品的僅和15%的活性。M22Fab-過氧化物酶結合OD45tlIim值對于未處理的TSHR260是2. 293,對于在室溫下保存M和48小時的TSHR260分別是1. 836和
1.676。在室溫下保存M和48小時的TSHI^60的活性相對于未處理的制品分別為80%和 73%。對于TSHI^60-AP觀察到了類似的結果，在室溫下保存M和48小時的樣本的0D45(1nm 分別為2. 106和1. 983，相比之下，未處理樣本的OD45tlIim是2. 395。這代表在室溫保存M小時和48小時之后相對未處理TSHR260-AP有88%和83%的結合活性。在使用未處理TSHR LRD C-CAP的實驗中，0D45(1nm為1. 826，而在對和48小時室溫保存后分別為1. 158和1. 155。 TSHR LRD 00々？在對和48小時室溫保存后顯示出相對于未處理制品的63%的活性。以上描述的實驗顯示室溫處理后TSHI^60、TSHR260-AP和TSHR LRD C-CAP的結合M22的能力比全長TSHR制品的強。這表明TSHI^60、TSHR260-AP和TSHR LRD C-CAP在室溫下與全長 TSHR相比更穩(wěn)定?？勺儏^(qū)序列對為K1-18編碼的基因的序列分析表明HC V區(qū)基因來自VH5-51*01家族，D基因來自D3-16*02(或D3-16*01)家族而JH基因來自J3*02家族。對于LC，V區(qū)基因來自V3_20*01 家族而J區(qū)基因來自JK-f01種系。HC核苷酸和氨基酸序列在圖3中顯示(SEQ ID No 1-18) 而LC核苷酸和氨基酸序列在圖4中顯示(SEQ ID No 19-36)。與種系序列相比，在HC基因序列中有體細胞突變；具體地，在CDRl中有1個沉默突變和1個替換突變，在CDR2中有1 個沉默突變和3個替換突變，在FRW3中有3個替換突變而在CDR3中有1個沉默突變和1個替換突變。對于所述CDR的替換/沉默突變(R/幻率為2. 7，但是，除了所述突變以外，在所述⑶R3中還有8個堿基對長的插入。所述HC⑶Rl (SEQ ID No 6和16)是5個氨基酸長， CDR 2 (SEQ ID No 7禾口 17)是17個氨基酸長而所述CDR 3 (SEQ ID No 8禾口 18)是13個氨基酸長(分別示于圖北和3d)。在所述LC序列中有在CDRl中的2個替換突變，F(xiàn)WR2中的1個沉默突變和在⑶R 3中的3個替換突變，總R/S突變率為5. 0 (FffR和OTR)。所述LC CDR 1(SEQ ID No 24和34)由12個氨基酸組成，CDR 2 (SEQ ID No 25和35)由7個氨基酸組成而CDR 3 (SEQ ID No沈和36)由9個氨基酸組成(分別示于圖4b和4d)。K1-70HC V區(qū)來自VH5-51*01種系，D基因來自Dl-7*01家族而所述JH基因來自J4*02家族。LC基因來自于所述LVl-5f01種系，與來自LJ7*01的幾基因結合。所述HC核苷酸和氨基酸序列在圖5中顯示(SEQ ID No 37-M)，優(yōu)選的LC核苷酸和氨基酸序列在圖6c和6d中顯示 (SEQ ID No 63-72)。在所述K1-70HC序列中在FWRl中有3個替換突變，在CDRl中有3個替換突變，在FWR2中有1個替換突變，在CDR2中有2個沉默突變，在FWR3中有4個替換突變而在FWR4中有1個替換突變?？?FWR和OTR) R/S突變率為6. 0。此外，在所述⑶R3中有2個插入在ν和D基因的聯(lián)結處有5個堿基對的插入以及在D和J基因的聯(lián)結處有12 個堿基對的插入(圖5b和5d ； SEQ ID No 41和51)。所述HC CDR 1 (SEQ ID No 42和52) 是5個氨基酸長，CDR 2 (SEQ ID No 43和53)是17個氨基酸長而CDR 3 (SEQ ID No 44和 54)是10個氨基酸長(分別示于圖恥和5(1)。K1-70LC基因在FWRl中有1個沉默突變，在 FWR2中有1個沉默突變和1個替換突變而在FWR3中有1個替換突變。在所述CDRl中有1 個沉默突變和2個替換突變而在所述CDR3中有2個替換突變?？?FWR和CDR) R/S突變率為2.0。此外，在所述LC V和J基因之間有2個堿基對的插入。所述LC⑶Rl (SEQ ID No 70)由13個氨基酸組成，CDR2 (SEQ ID No 71)由7個氨基酸組成而CDR 3 (SEQ ID No 72) 由11個氨基酸組成(圖6d)。Kl_70Fab 結構Fab K1-70的結構已在2.22人分辨率下確定(圖8)。Ramachandran作圖參數(shù)和精修統(tǒng)計數(shù)據(jù)在正確結構精修的可接受范圍內。不對稱的單元包含兩個完整Fab K1-70分子，F(xiàn)ab A和Fab B。Fab A包含重鏈A和輕鏈B，而Fab B包含重鏈C和輕鏈D。所述兩個 Fab 分子由于彎角(elbow angle)的不同(Fab A = 145. 5°，!^ab B = 163. 1° )而未通過非晶體學對稱性關聯(lián)起來。在所述結構中在主鏈電子密度沒有斷裂，但是在末端有一些殘基失去。在Fab A中重鏈A和輕鏈B分別由1至227殘基和4至211殘基組成，而在Fab B 中重鏈C和輕鏈D分別由殘基1至227和2至212組成。根據(jù)Kabat系統(tǒng)(Kabat E et al 1991文獻見上文)對Fab A和Fab B中的殘基編號。細節(jié)參見圖8和9a。對于重鏈A的殘基1、58、129和213的側鏈，輕鏈B的殘基18、94、110、126、156、163和166的側鏈，重鏈C 的殘基1、58和218的側鏈以及輕鏈D的殘基17、18、94、108、156、172、184、187和190的側鏈觀察不到電子密度。這些側鏈在電子密度圖中不存在表明它們是高度可移動的，主要是因為它們位于所述晶體結構的溶劑可達區(qū)域。使用LSQKAB (CCP4)計算所述兩個Fab分子的均方根偏差(r.m. s. d)，對于VH區(qū)(117個Ca原子)是0.20人、對于VL區(qū)(106個Ca 原子)是0.23 A、對于CH區(qū)(％個C α原子)是0.22人而對于CL區(qū)(97個C α原子) 是0.29人。這證明即使所述兩個Fab分子之間的彎角不同，但是該結構域本身卻顯示出最少的差異。Kl-70Fab的結構是標準的(圖9a)所述6個⑶R采用的正則結構(canonical structure)對于LC CDRULC CDR2和 LC CDR3 分別是 1、1 和 2，而對于HC CDRl 禾PHC CDR21 分別為1和2A。所述HC CDR3由于在序列和構象方面更大的差異而未被分派為任何正則類。 二硫鍵出現(xiàn)在半胱氨酸殘基LC23-LC88、LCi;34-LC194、HC22-HC92和HC142-HC208之間。在 Kl-70Fab的晶體結構中，LC CDRl是13個殘基長，LC CDR2是7個殘基長而LC CDR3是11 個殘基長。HC⑶Rl由5個殘基組成，HC⑶R2由17個殘基組成而HC⑶R3由12個殘基組成。為了進一步分析所述結構，加入了 LC CDR3Arg94和HC CDR2Arg58的側鏈(在所述衍射數(shù)據(jù)組中沒有其電子密度)。在以下對所述結構的描述中，括號中的值是指包括這些側鏈得到的值。在所述LC中有158個氫鍵，在所述HC中有177個氫鍵。來自所述LC的52 (52)個殘基參與與來自所述HC的44 個殘基的界面接觸。有7個氫鍵和2個鹽橋使所述兩條鏈保持在它們的相對位置上。溶劑可達表面區(qū)域(ASA)對于所述LC⑶Ri是525(485)人2, 對于 LC CDR2 是508(508) A2，對于 LC CDR3 是257(442) A2，對于 HC CDRl 是 120ΑΛ 對于 HC CDR2 是759 (842) A 2而對于 HC CDR3 是557(528) Λ2。已經(jīng)分析了在 Kl-70Fab
的抗原結合位點表面上帶電氨基酸的分布并在圖9b中示出。結合位點表面的一側主要是帶負電的殘基，另一側主要是帶正電的殘基?？乖Y合表面的酸性小塊區(qū)域由來自LC的殘基 Asp27B (CDRl)、Asp50 (CDR2)、Asp92 (CDR3)和來自 HC 的殘基 Asp31 (CDRl)、Asp54 和 Asp56(CDR2)以及Asp96 (CDR3)形成。堿性小塊區(qū)域由來自LC的殘基Lys53和Arg54 (CDRl) 和Arg94(CDR3)與來自所述HC的殘基Arg58 (CDR2)和ArglOl (CDR3)形成。此外，所述CDR 區(qū)域外的LC Lys 66還形成所述表面上的堿性小塊區(qū)域?？偟膩碚f，K1-70的抗原結合表面上的帶正電的區(qū)域主要由LC殘基組成，而帶負電的區(qū)域主要由HC殘基組成。K1-70的抗原結合表面還富含芳香族殘基，有來自所述HC和LC CDR的5個酪氨酸、1個苯丙氨酸和 3個色氨酸(圖9c)。此外，來自所述FRW區(qū)域的4個酪氨酸和1個苯丙氨酸形成了所述表面區(qū)域。K1-70抗原結合區(qū)域的整個表面是高度不規(guī)則的，在靠近中央處有空腔。所述空腔主要被芳香族殘基和LC Asp50圍繞(圖9b和9c)。此外，所述空腔的內部也主要為芳香族殘基。這表明芳香族接觸對于K1-70和所述TSHR之間的相互作用是重要的，所述TSHR表面上的凸出的芳香族殘基“契合”進入所述K1-70表面的空腔中。重組Kl_70Fab表17a顯示大腸桿菌培養(yǎng)物上清液中的重組Kl_70Fab有抑制125I-TSH與所述 TSHR結合的能力。所述抑制效應在所述培養(yǎng)物上清液的較低程度的稀釋下是完全的(在 1 2稀釋度下為91.9%)，而漸增的所述上清液稀釋度導致劑量依賴的抑制效應(在 1 256稀釋度下為27. 9%抑制)(表17a)。重組Kl_70Fab對在表達所述TSHR的CHO細胞中TSH介導的對環(huán)AMP產(chǎn)生的刺激的效應在表17b中顯示。培養(yǎng)物上清液的不同稀釋度顯示出對環(huán)AMP刺激的劑量依賴抑制從1 5稀釋度下的89. 3%抑制至1 40稀釋度下的39. 7%抑制(表17b)。來自未誘導大腸桿菌培養(yǎng)物的對照培養(yǎng)物上清液沒有產(chǎn)生可檢測的對TSH結合的抑制或對TSH介導的環(huán)AMP刺激的抑制(表17a和b)?？偨Y和結論上文描述的實驗顯示兩種具有非常不同的生物活性的所述TSHR的單克隆自身抗體(K1-18刺激而K1-70阻斷)可從一位患者的淋巴細胞的單一制品中分離出來。因此，所述患者的免疫系統(tǒng)在同時產(chǎn)生兩種類型的TSHR自身抗體，即刺激型和阻斷型。一旦以單克隆自身抗體的形式被分離(如上文所述)，所述兩種類型的TSHR自身抗體的特性可以相互不受干擾地被研究。所述具有TSHR刺激活性的新的人MAb(Kl-IS)已經(jīng)被描述并且與一些其他已知的TSHR MAb進行了比較。具體為刺激人MAb (M22)、阻斷人MAb (5C9)、阻斷人 MAb (K1-70)、阻斷小鼠MAb (9D33)和小鼠刺激MAb (TSMAb 1-7)。還描述了具有TSH拮抗活性的新的人MAb(Kl-70)的特征并與已知MAb的特性進行了比較。特別是阻斷人MAb (5C9)、 阻斷小鼠MAb (9D33)、刺激人MAb (M22)、刺激人MAb (K1-18)和小鼠刺激MAb (TSMAb 1-7)。已經(jīng)證明新的人刺激TSHR MAb K1-18在以下方面具有與M22相似的特性對標志的TSH與所述TSHR結合的抑制、對相互與所述TSHR結合的抑制、對阻斷人MAb (5C9和K1-70)與所述 TSHR結合的抑制以及對小鼠阻斷和刺激MAb (9D33和TSMAb 1-7)結合的抑制。所述患者血清TARb還抑制K1-18與所述TSHR的結合。此外，M22和K1-18都與所述TSHR以高親和力結合并且都能夠與同堿性磷酸酶連接的由氨基酸22-260組成的TSHR片段結合。如M22和 K1-18的抗體具有刺激TSHR環(huán)AMP活性的能力，但是所述兩種抗體的效能有約1. 5倍的差異。所述研究顯示TSHR刺激自身抗體的特性在不同的患者中是相似的并且到目前為止它們是所有格雷夫斯病患者中TSHR刺激自身抗體的代表性特性。K1-18性質的總結在表13a 中顯示。發(fā)明人的實驗還顯示所述新的阻斷型人Mab Kl-70(與刺激MAb Κ1-18從相同的淋巴細胞樣本中得到)具有以下能力抑制標志的TSH與所述TSHR的結合、抑制人MAb (Μ22、 Κ1-18和5C9)與所述TSHR的結合以及抑制小鼠阻斷和刺激MAb (9D33和TSMAb 1-7)與所述TSHR的結合。此外，Κ1-70與所述TSHR的結合被患者血清TRAb抑制。Κ1-70顯示出很強的TSH拮抗活性和阻斷被測試的全部患者血清TRAb刺激所述TSHR的能力。Κ1-70被證明是比5C9更有效的TSH與所述TSHR結合的抑制劑。Κ1-70與所述TSHR以高親和力結合并且能夠與同堿性磷酸酶連接的由氨基酸22-260組成的TSHR片段結合。因此，Κ1-70具有含有阻斷TRAb的患者血清的性質，包括對所述TSHR的高結合親和力、抑制TSH和Μ22與所述TSHR結合的能力和在低濃度的抗體下阻斷配體誘導的TSHR刺激的能力。但是，Κ1-70對 TSHR組成性活性沒有影響而5C9有影響。Κ1-70性質的總結在表13b中顯示。當TSHR發(fā)生 Glul57Ala、Lysl83Ala、TyM85Ala、Asp232Ala 或 Arg255Asp 突變時 K1-18 刺激表達 TSHR 的CHO細胞中的環(huán)AMP活性的能力喪失。K1-70阻斷表達TSHR的CHO細胞中TSH介導的環(huán) AMP 活性的能力對于 TSHR 突變 Lys58Ala, Ile60Ala, Argl09Ala, Lysl83Ala, Lys250Ala 降低，對于TSHR突變Tyr82Ala略微降低。在基于TSHR260-AP的ELISA中，K1-18和K1-70 以及M22與22-260的TSHR片段反應良好。此外，在相同測定中，集合的患者血清TSHR自身抗體與TSHR氨基酸22-260反應良好。在所述ELISA中，含有任一類型TRAb活性(刺激和阻斷)的患者血清均與所述TSHR260結合。此外，被氨基酸22-260的TSHR片段包被的 ELISA板孔與M22-過氧化物酶(RSR Ltd)結合良好并且該M22-過氧化物酶結合被集合的患者血清TSHR自身抗體抑制。這種所述患者血清TSHR自身抗體對M22-過氧化物酶結合的抑制與對M22-過氧化物酶與全長TSHR結合的抑制相似。因此，令人意外的是，氨基酸 22-260的TSHR片段(或者更小的片段)對于TSHR自身抗體常規(guī)測定來說似乎足矣。此外，M22還與所述TSHR的更長片段(TSHR LRD C-CAP)結合良好。在穩(wěn)定性研究中，M22與在室溫下預孵育后的TSHR260、TSHR260-AP和TSHR LRD C-CAP結合的能力比與在同樣條件下預孵育后的全長TSHR制品結合的能力更強。這表明TSHR260、TSHR260-AP和TSHR LRD C-CAP與全長TSHR相比在室溫下更穩(wěn)定。所述TSHR突變Arg255Asp對Kl_70IgG的結合沒有影響而Kl-ISIgG (在較低濃度下，即0. 1 μ g/mL及以下)與所述突變受體的結合有效性降低。所述使用不同患者血清TRAb的實驗表明，基于與含有R255D突變的TSHR結合的差異，具有TSHR刺激活性的血清可與具有TSHR阻斷活性的血清區(qū)分開。具有刺激活性的患者血清的結合受所述突變的影響，而具有阻斷活性的患者血清的結合受影響的程度較低或者根本不受影響。所述實驗提供K1-18和K1-70的核苷酸和氨基酸序列。盡管K1-18、 K1-70的重鏈V基因來自于與其他刺激人MAb M22重鏈V基因屬于同一家族的同一種系，然而它們都與來自不同家族的D和J基因結合；此外K1-18使用κ鏈，而M22和K1-70使用λ輕鏈。5C9(另一種阻斷型人MAb)種系基因與Μ22、Κ1-18和Κ1-70不同，但是5C9和 Κ1-70均使用J4重鏈基因。刺激MAb (Μ22和Κ1-18)和阻斷MAb (5C9和Κ1-70)的CDR的氨基酸序列有很大不同，特別是在重鏈和輕鏈CDR3內。這些觀察結果表明所述4種人自身抗體的每一種都來自不同的種系。不同的CDR序列也可以顯示相似的對所述TSHR的生物學活性。所述X-射線衍射數(shù)據(jù)提供Kl-70Fab結構的分子詳情，包括抗原結合位點的拓撲結構。通過在大腸桿菌中克隆和表達所述K1-70HC(SEQ ID No 46)和K1-70LC (SEQ ID No 63與SEQ ID No 64)產(chǎn)生的重組Kl_70Fab顯示出抑制125I標志的TSH與所述TSHR結合的能力和抑制TSH介導的對TSHR環(huán)AMP活性刺激的能力?？傊鼋Y果表明本發(fā)明的抗體如K1-18和K1-70顯示出與之前描述的TSHR MAb (M22和5C9)和在自身免疫甲狀腺疾病患者的不同血清中發(fā)現(xiàn)的TSHR自身抗體相似的TSHR結合活性和相似的對TSHR功能的生物效應。表la Kl-18IgG和不同的TSHR單克隆抗體對125I-TSH與TSHR包被管的結合的
抑制測試樣本測定緩沖液中的稀釋物結合抑制<%) (乎均值± SD)HBD中的稀釋物結合抑制 (平均值± SD)K1-18 IgG100 Mg/mL91.4 ±0.795.9 ± 0.230 gg/mL89.5 ± 1.096.0 ±0.310 pg/mL91.1 ± 1.196.0 ± 0.53 pg/mL89.1 ± 0.495.3 ± 0.51 pg/mL89.3 ±1.394.0 ± 0.70.3 μ /πτι 89.7 ± 0.782.6 ±1.00.1 pg/mL78.5 ± 0.662.0 ±1.60.03 pg/mL45.2 ± 2.326.6 ±1.20.01 pg/mL21.1 ±2.39.3 ± 2.10.003 pg/mL0.5*11.4 ±3.00.001 μοι/mL-4.6*1.6 ±3.2M22 IgG100 pg/mL91.4 ± 1.896.5 ± 0.130 pg/mL89.2 ± 0.596.1 ± 0.510 gg/mL89.3 ± 0.696.1 ± 0.53 pg/mL89.6 士 0.496.0 ± 0.61 pg/mL89.9 ±1.795.5 ± 0.30.3 pg/mL88.6 ±1.289.9 ±0.20.1 pg/mL·87.2 ±1.276.1 ± 2.20.03 μQlmL·58.3 ±1.541.6 ±3.50.01 pg/mL23.4 ± 3.418.0 ± 0.80.003 ng/mL7.1*11.1 ±2.90.001 pg/mL1.5*10.6 ± 8.75C9lgG100 pg/mL82.9 ± 1.035.3 ± 2.810 “g/mL40.5 ±0.340.9 ±1.11 pg/mL23.5 ±2.919.7 ±1.20.1 pg/mL21.3*16.2 ± 4.30.01 pg/mL15.9*4.1 ± 2.2TSMAb 11gG100 pg/mL61.1 ±4.154.1 ±4.110pg/mL48.1 ±1.743.4 ± 1.11 pg/mL29.3 ±1.526.5 ± 0.50.1 pg/mL11.0±1.76.8 ±1.70.01 pg/mL2.6 土 2.12.4*TSMAb 2 IgG100 μ^πΑ.77.6 ±7.748.0 ± 4.410 μρ/π 37.7 ± 2.639.0 ± 0.51 pg/mL29.1 ±2.533.6*0.1 pg/mL23.4 ±2.715.9 ± 0.80.01 pg/mL1.6 ±1.50.7 ±1.7TSMAb 3 IgG100 pg/mL81.1 ±2.954.3 ± 3.310 pg/mL58.1 ±1.144.7 ± 2.8
權利要求
1.分離的人抗體分子，所述分離的人抗體分子會與TSHR結合并且會減少配體誘導的對所述TSHR的刺激，但對TSHR組成性活性沒有作用，其中所述分離的人抗體分子具有患者血清TSHR自身抗體抑制TSH和M22與所述TSHR結合的特性。
2.權利要求1的分離的人抗體分子，所述分離的人抗體分子具有選自以下的至少一個另外的患者血清TSHR自身抗體的特性對所述TSHR具有至少l(fL/mol、優(yōu)選至少109L/mol 的結合親和力；和具有以少于1 μ g/mL、優(yōu)選少于0. 1 μ g/mL的抗體濃度阻斷配體誘導的 TSHR刺激的能力。
3.權利要求1或2的分離的人抗體分子，所述分離的人抗體分子是TSH、甲狀腺刺激自身抗體或人絨毛膜促性腺激素的拮抗劑。
4.前述權利要求任一項的分離的人抗體分子，所述分離的人抗體分子是會與TSH、M22 或K1-18中的至少一種結合的TSH受體的抑制劑。
5.前述權利要求任一項的分離的人抗體分子，所述分離的人抗體分子是單克隆抗體、 重組抗體或合成抗體，或者它們的片段。
6.前述權利要求任一項的分離的抗體分子，所述分離的抗體分子包含抗體VH區(qū)，所述抗體VH區(qū)選自圖恥和5(1的氨基酸序列(分別是SEQ ID No 41和51)，優(yōu)選地所述分離的抗體分子包含由圖恥和5d的氨基酸序列(分別是SEQ ID No 41和51)組成的抗體VH 區(qū)。
7.前述權利要求任一項的分離的抗體分子，所述分離的抗體分子包含選自圖恥和5d 的CDR I、II和III (分別為SEQ ID No 42-44和52-54)的CDR，優(yōu)選地所述分離的抗體分子包含圖 5b 禾口 5d 的 CDR I、II 和 III (分別為 SEQ ID No 42-44 和 52-54)。
8.前述權利要求任一項的分離的抗體分子，所述分離的抗體分子包含抗體VL區(qū)，所述抗體VL區(qū)選自圖6d的氨基酸序列(SEQ ID No 69)，優(yōu)選地所述分離的抗體分子包含由圖 6d的氨基酸序列(SEQ ID No 69)組成的抗體VL區(qū)。
9.前述權利要求任一項的分離的抗體分子，所述分離的抗體分子包含選自圖6d的CDR I、II和III (SEQ ID No 70-72)的CDR，優(yōu)選地所述分離的抗體分子包含圖6d的CDR I、II 和 III(SEQ ID No 70-72)。
10.權利要求1-9任一項的分離的抗體分子或其片段，所述分離的抗體分子或其片段具有人或非人的構架。
11.會與TSHR結合以刺激所述TSHR的分離的抗體分子，所述抗體分子包含選自圖4b 和4d的氨基酸序列(分別為SEQ ID No 23和33)的抗體VL區(qū)，和/或包含選自圖4b (SEQ ID No 24-26)和 4d(SEQ ID No 34-36)的 CDR I、II 和 III 的一個或多個 CDR，和 / 或選自圖!3b(SEQ ID No 5)和3d(SEQ ID No 15)的氨基酸序列的抗體VH區(qū)，和/或包含選自圖 3b (SEQ ID No 6-8)和 3d(SEQ ID No 16-18)的 CDR I、II 和 III 的一個或者多個 CDR。
12.權利要求11的分離的抗體分子，其中所述分離的抗體分子與所述TSHR的結合被具有甲狀腺刺激或阻斷活性的患者血清TSHR抗體抑制。
13.權利要求11或12的分離的抗體分子，其中所述分離的抗體分子與所述TSHR的結合被M22、K1-70、5C9、9D33和甲狀腺刺激小鼠單克隆抗體中的至少一種抑制。
14.權利要求11至13任一項的分離的抗體分子，所述分離的抗體分子包含抗體VL區(qū)和抗體VH區(qū)，所述抗體VL區(qū)選自圖4b (SEQ ID No 23)和4d(SEQ ID No 33)的氨基酸序列，所述抗體VH區(qū)選自圖3b (SEQ ID No 5)和3d (SEQ ID No 15)的氨基酸序列。
15.權利要求11至14任一項的分離的抗體分子，所述分離的抗體分子包含圖!3b(SEQ ID No 6-8)或 3d(SEQ ID No 16-18)的 CDR I、II 和 III。
16.權利要求14或15的分離的抗體分子，所述分離的抗體分子包含由圖4b(SEQID No 23)或4d(SEQ ID No 33)的氨基酸序列組成的抗體VL區(qū)。
17.權利要求14、15或16的分離的抗體分子，所述分離的抗體分子包含由圖!3b(SEQID No 5)或3d (SEQ ID No 15)的氨基酸序列組成的抗體VH區(qū)。
18.權利要求16或17任一項的分離的抗體分子，所述分離的抗體分子包含圖4b(SEQ ID No 24-26)或 4d(SEQ ID No 34-36)的 CDR I、II 和 III。
19.權利要求11至18任一項的分離的抗體分子，所述分離的抗體分子是單克隆抗體、 重組抗體或合成抗體。
20.權利要求11至19任一項的分離的抗體分子，所述分離的抗體分子具有人或非人的構架。
21.分離的核苷酸，所述分離的核苷酸編碼a.權利要求1至20任一項的分離的抗體分子；或b.包含圖4b (SEQ ID No 23)、4d(SEQ ID No 33)或 6d(SEQ ID No 69)的氨基酸序列的抗體VL區(qū)；或c.包含圖3b(SEQ ID No 5) ,3d (SEQ ID No 15) ,5b (SEQ ID No 41)或 5d(SEQ ID No 51)的氨基酸序列的抗體VH區(qū)；或d.圖3b(SEQID No 6-8)、3d(SEQ ID No 16-18)、4b(SEQ ID No 24-26)、4d(SEQ ID No 34-36)、5b(SEQ ID No 42-44)、5d(SEQ ID No 52-54)或6d(SEQ ID No 70-72)的 CDR I、 II或ΠΙ ；或e.它們的組合。
22.權利要求21的分離的核苷酸，所述分離的核苷酸包含圖3a(SEQID No 1), 3c (SEQ ID No 10),4a(SEQ ID No 19),4c (SEQ ID No 28),5a(SEQ ID No 37),5c (SEQ ID No 46) 或6c (SEQ ID No 64)的核苷酸序列。
23.包含權利要求21或22的分離的核苷酸的載體。
24.包含權利要求21或22的分離的核苷酸或權利要求23的載體的宿主細胞。
25.包含權利要求1-20任一項的分離的抗體分子的藥物組合物。
26.權利要求1-20任一項的分離的抗體分子或權利要求25的藥物組合物用于治療的用途。
27.用于治療的權利要求1-20任一項的分離的抗體分子或權利要求25的藥物組合物。
28.表征TSHR抗體、TSH或人絨毛膜促性腺激素活性的方法，所述方法包括一個步驟， 所述步驟包括權利要求1-20任一項的分離的抗體分子的使用。
29.刺激哺乳動物細胞中的TSHR的體外方法，所述方法包括使所述細胞接觸權利要求 11-20任一項的分離的抗體分子或權利要求25的藥物組合物。
30.刺激哺乳動物細胞中的TSHR的體內方法，所述方法包括使所述細胞接觸權利要求 11-20任一項的分離的抗體分子或權利要求25的藥物組合物。
31.權利要求30的方法，其中使患有甲狀腺癌和其轉移灶、多結節(jié)性甲狀腺腫和/或先天性甲狀腺功能低下的受試者的細胞與權利要求1-10任一項的分離的抗體或權利要求25 的藥物組合物接觸。
32.防止哺乳動物細胞中配體誘導的對TSHR的刺激的體內方法，所述方法包括使所述 TSHR與權利要求1-20任一項的分離的抗體分子或權利要求25的藥物組合物接觸。
33.權利要求32的方法，其中所述配體是甲狀腺刺激自身抗體、TSH或人絨毛膜促性腺激素。
34.權利要求32或33的方法，其中所述哺乳動物細胞是甲狀腺細胞或甲狀腺外細胞。
35.權利要求34的方法，其中所述哺乳動物甲狀腺外細胞在眶后組織或脛骨前組織中。
36.權利要求32-35的方法，其中所述分離的抗體分子與另外的TSHR結合抗體結合使用。
37.權利要求36的方法，其中所述另外的TSHR結合抗體是5C9和/或9D33。
38.檢測分析物TSHR的自身抗體的診斷方法，所述方法包括使樣本和權利要求1-20任一項的抗體分子與TSHR或其片段接觸，所述樣本從被認為含有所述分析物自身抗體的受試者中分離。
39.檢測分析物TSHR的抗體的診斷方法，所述方法包括使包含所述分析物抗體的樣本與包含所述TSHR (SEQ ID No 75)的氨基酸22-260的TSHR片段接觸。
40.權利要求38或39的檢測分析物TSHR的抗體的診斷方法，其中所述TSHR或其片段在精氨酸255處突變，從而在所述診斷方法中，與分析物刺激型TSHR抗體相比，所述突變的 TSHR或其片段優(yōu)先與分析物阻斷型TSHR抗體相互作用。
41.權利要求39或40的診斷方法，包括a.提供來自動物受試者的體液樣本；b.提供一種或多種第一來源的TSHR；c.提供一種或多種第二來源的TSHR，其中所述第二來源的TSHR是TSHR260或在精氨酸255處突變的TSHI^60 ；d.使所述第一和第二來源的TSHR同時或相繼與所述體液樣本接觸，由此所述TSHR的抗體形成包含[第一來源的TSHR]-[TSHR抗體]-[第二來源的TSHR]的一種或多種復合物；e.在步驟(d)之前、同時或之后，提供固定化方式，由此在步驟(d)中形成的復合物中存在的所述第一來源的TSHR在步驟(d)之前、同時或之后被固定至固體支持物上；f.在步驟(d)之前、同時或之后，提供直接或間接的可檢測標志手段，由此使得在步驟 (d)中形成的復合物中存在的所述第二來源的TSHR在步驟(d)之前、同時或之后被提供以所述直接或間接的標志手段；和g.根據(jù)(e)檢測在(d)中形成的復合物的存在以提供TSHR抗體在所述體液樣本中存在的指示。
42.權利要求41的診斷方法，其中在(b)中提供的所述第一來源的TSHR是全長TSHR， 包括TSH受體的一個或多個表位或包含TSH受體的一個或多個表位的多肽。
43.權利要求41或42的診斷方法，其中在(b)中提供的所述第一來源的TSHR是全長 TSHR，包括TSH受體的一個或多個表位或包含TSH受體的一個或多個表位的多肽，其中所述第一來源的TSHR在精氨酸255處突變。
44.權利要求39或40的診斷方法，其中通過對直接或間接標志的TSHR抗體或其片段與TSHR260或在精氨酸255處突變的TSHR260結合的抑制來檢測與所述TSHR260或在精氨酸255處突變的TSHR260結合的分析物TSHR抗體。
45.權利要求44的診斷方法，其中所述標志的TSHR抗體是單克隆抗體、重組抗體或合成抗體，或它們的片段。
46.鑒定防止TSHR自身抗體與TSHR260結合的小分子的方法，所述方法包含在包含至少一種候選小分子的樣本存在下確定對TSHR自身抗體與TSHR260結合的抑制，并且從所述樣本中選出那些抑制TSHR自身抗體結合的候選小分子。
47.權利要求46的方法，其中所述TSHR自身抗體是單克隆抗體、重組抗體、合成抗體， 或它們的片段。
48.權利要求46的方法，其中所述TSHR自身抗體與所述TSHR的結合是通過權利要求 41,42或43任一項的方法檢測的。
全文摘要
本文一方面提供了會與TSHR結合并且會減少配體誘導的對所述TSHR的刺激、但對TSHR組成性活性沒有作用的分離的人抗體分子，其中所述分離的人抗體分子具有抑制TSH和M22與所述TSHR結合的患者血清TSHR自身抗體的特性。
文檔編號C07K16/28GK102264764SQ200980152452
公開日2011年11月30日 申請日期2009年12月23日 優(yōu)先權日2008年12月24日
發(fā)明者B·瑞斯史密斯, J·桑德斯, J·福爾曼克 申請人:Rsr有限公司