用于生成抗體混合物的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于在單一重組宿主細胞中生成包含兩種或更多種不同抗體的混合物的方法。在一個實施方案中，生成了不同單價抗體的混合物不同。在另一個實施方案中，生成了單價和二價抗體的混合物。本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明的方法可獲得的抗體混合物及在本發(fā)明的方法中特別有用的輕鏈序列。
【專利說明】用于生成抗體混合物的方法
[0001] 本申請是中國申請201080013765.9的分案申請，該母案的國際申請日為2010年 1月26日，本分案采用了與該母案一致的發(fā)明名稱。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明提供了用于生成抗體混合物的方法、通過本發(fā)明的方法可獲得的混合物及 此類混合物的用途，特別是在治療癌癥中的用途。本發(fā)明還涉及在本發(fā)明的方法中特別有 用的輕鏈。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 當前，有多種人類疾病是通過治療性單克隆抗體，例如人源化的或完全人源的單 克隆抗體來治療的。然而，一些疾病通過單克隆抗體不能充分有效地治療，或者治療效果隨 單克隆抗體應用的時間而降低，例如由于靶物下調(diào)或致病途徑的轉(zhuǎn)換。因此，一種備選方案 可以是用多克隆抗體或抗體混合物來治療。此類抗體混合物可包含兩種或更多種針對同一 靶物上不同表位的抗體，或者，針對不同靶物的抗體的混合物。
[0005] US7262028記載了一種通過表達一種輕鏈和不同重鏈從單一宿主細胞克隆生成二 價抗體或二價抗體混合物的方法。US7262028中披露的發(fā)明提供了一種用于生成抗體組合 的方法，可以對該抗體組合篩選在多種應用中的有用性。
[0006] 治療性抗體的期望特征可依照要治療的具體狀況而變化。對于一些適應證，只需 要抗原結(jié)合，例如其中抗體的治療效應是阻斷抗原與一種或多種原本能夠結(jié)合抗原的特定 分子之間的相互作用。對于其它適應證，可能還需要別的由抗體介導的效應，諸如誘導補體 活化、結(jié)合Fc受體等的能力。對于此類用途，抗體分子中抗原結(jié)合部分以外的部分諸如Fc 區(qū)可能是重要的。一些全長抗體在結(jié)合靶抗原時可展現(xiàn)激動效應（這可能被認為是不期望 的，特別是對于癌癥治療而言）。在一些情況下，此效應可歸于通過二價抗體的"交聯(lián)";"交 聯(lián)"促進二聚化，而二聚化可導致活化，尤其當靶物是受體時。在可溶性抗原的情況下，二 價革巴向性（bivalent targeting)可形成不期望的免疫復合物。因此，對于一些治療性適應 證，單價抗體可能是優(yōu)選的。
[0007] 單價抗體的例子包括Fab片段、scFv抗體和納米抗體。另一類包含一條重鏈和 一條輕鏈的單價抗體（UniBody?分子）已記載于W02007/059782、W0/2008/145137、 W0/2008/145138、W0/2008/145139和W0/2008/145140。在這些分子中，重鏈的序列已經(jīng)被 修飾，使得不形成重鏈間鍵，從而不形成二價抗體。UniBody?分子的特征在于與Fab片 段相比有利的藥動學。
[0008] 需要改良的基于抗體的療法，將使用多克隆抗體或抗體混合物的優(yōu)點與單價抗原 結(jié)合的優(yōu)點結(jié)合起來。本發(fā)明提供了用于生成單價抗體的混合物或單價和二價抗體的混合 物的方法。
[0009] 發(fā)明概述
[0010] 在第一個主要方面，本發(fā)明涉及一種用于在單一重組宿主細胞中生成包含兩種或 更多種不同抗體的混合物的方法，包括在所述宿主細胞中表達：
[0011] a)至少一種編碼共同輕鏈的核酸構(gòu)建體，和
[0012] b)兩種或更多種編碼重鏈的核酸構(gòu)建體，所述兩種或更多種核酸構(gòu)建體包含
[0013] bl)編碼兩種或更多種不同第一重鏈的兩種或更多種核酸構(gòu)建體，其中所述各第 一重鏈的每個恒定區(qū)的氨基酸序列經(jīng)過修飾，使得鉸鏈區(qū)及如免疫球蛋白亞型所要求的CH 區(qū)的其它區(qū)域，諸如CH3區(qū)，不含有任何能夠在IVIG存在下或在施用于哺乳動物或人類時 與相同的CH區(qū)形成二硫鍵或共價或穩(wěn)定非共價重鏈間鍵的氨基酸殘基，
[0014] 或
[0015] b2)至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建體，其中恒定區(qū)的氨基酸序列經(jīng)過修飾，使 得鉸鏈區(qū)及如免疫球蛋白亞型所要求的CH區(qū)的其它區(qū)域，諸如CH3區(qū)，不含有任何能夠在 IVIG存在下或在施用于哺乳動物或人類時與相同的CH區(qū)形成二硫鍵或共價或穩(wěn)定非共價 重鏈間鍵的氨基酸殘基，和
[0016] 至少一種核酸編碼第二重鏈的構(gòu)建體，所述第二重鏈能夠在IVIG存在下或在施 用于哺乳動物或人類時與相同的CH區(qū)形成二硫鍵或共價或穩(wěn)定非共價重鏈間鍵，
[0017] 其中每種所述重鏈能夠與所述輕鏈配對以形成功能性抗體。
[0018] 因此，所述第一重鏈的序列經(jīng)過修飾而不形成穩(wěn)定的重鏈間鍵，并且由此所得抗 體是單價的（參見例如W02007/059782)。
[0019] 因而，在備選方案bl的情況下，在同一細胞中生成不同單價抗體的混合物。此類 混合物可例如用于治療疾病，特別是單克隆單價抗體和/或多克隆二價抗體的有效性不是 最好的疾病，如上文解釋的。
[0020] 在備選方案b2的情況下，在同一細胞中生成單價和二價抗體的混合物。此類混合 物可例如用于治療疾病，諸如癌癥。在一個特別有趣的實施方案中，所述單價抗體通過對靶 蛋白的拮抗性結(jié)合或阻斷來抑制細胞增殖，且所述二價抗體結(jié)合另一種靶抗原，例如在同 一靶細胞上的，并募集效應器功能進行靶細胞殺傷。
[0021] 在另一個主要方面，本發(fā)明涉及一種包含通過本發(fā)明的方法獲得的或可獲得的抗 體混合物的組合物，諸如藥物組合物。
[0022] 在另一個方面，本發(fā)明提供了一種適合依照上述方法用于生成抗體混合物的重組 宿主細胞。
[0023] 本發(fā)明還提供了依照上述發(fā)明的組合物用于治療疾病的用途。
[0024] 本發(fā)明還公開了一種特別適合于在本發(fā)明中使用的共同輕鏈，因為它能替換各種 不同抗原特異性抗體的輕鏈而不損失特異性。此類輕鏈可更一般性地用于這樣的含有抗體 產(chǎn)品的應用，其中將一種輕鏈與多種重鏈組合，諸如在重組多克隆或雙特異性抗體中組合。
[0025] 因此，在另一個方面，本發(fā)明涉及一種包含重鏈和輕鏈的重組抗體，其中所述輕鏈 包含SEQ ID NO :8所示的序列。
[0026] 附圖和序列表簡述
[0027] 圖1。在ELISA中測量經(jīng)轉(zhuǎn)染的HEK-293F細胞的細胞培養(yǎng)物上清液中存在的單 價抗體對可溶性的帶His標簽的CD38的結(jié)合。"單價Uni-005"指示經(jīng)單價Uni-005 (抗 CD38)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的HEK-293F細胞的上清液；"單價組合"指示表達Uni-7D8 (抗CD20)和 Uni-005的重鏈與抗⑶38抗體005的輕鏈的組合的細胞的上清液。
[0028] 圖2。在ELISA中測量經(jīng)轉(zhuǎn)染的HEK-293F細胞的細胞培養(yǎng)物上清液中存在的單 價抗體對一種抗HuMab-7D8的抗獨特型抗體（其也結(jié)合Uni-7D8)的結(jié)合。"單價Uni-7D8" 指示經(jīng)Uni-7D8構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的HEK-293F細胞的上清液；"單價組合"指示表達Uni-7D8和 Uni-⑶38的重鏈與抗⑶38抗體005的輕鏈的組合的細胞的上清液。
[0029] 圖3 :對人K輕鏈種系文庫篩選對各種重鏈的結(jié)合以鑒定共同輕鏈。在使用重組 可溶性抗原作為包被物的ELISA中篩選經(jīng)瞬時轉(zhuǎn)染的HEK-293F細胞的上清液的結(jié)合，其中 所述細胞表達帶有對EGFr (A)、c-Met(B)或Her2 (C)特異性的可變域的鉸鏈修飾（F273T、 Y275E)的重鏈，以及一條來自該文庫的種系K輕鏈。每個點代表一種獨特的重鏈和輕鏈組 合，并顯示了結(jié)合（0D405)和表達（1:20稀釋后的y g/mL)。形成功能性結(jié)合抗體的重鏈和 輕鏈組合標有1、2和3。（1'、2'和3'是該測定法中1、2和3的重復）。每項實驗中用伴隨 各重鏈的原來的K輕鏈作為陽性對照（矩形）
[0030] 圖4 :通過共表達和對重組靶物的結(jié)合ELISA對共同輕鏈的確認。在使用重組可 溶性抗原（分別為EGFR(A)、c-Met⑶或Her2(C))作為包被物的ELISA中，對經(jīng)瞬時轉(zhuǎn)染 的HEK-293F細胞的上清液篩選結(jié)合，其中所述細胞共表達三種分別帶有對EGFR、c-Met和 Her2特異性的可變域的鉸鏈修飾（F273T、Y275E)的重鏈、以及一條在初篩選中鑒定的共同 K輕鏈種系序列（圖3中的1、2或3)。每項實驗中包括伴隨各重鏈的原來的K輕鏈作為 陽性對照。
[0031] 圖5 :用交聯(lián)ELISA確定抗體單價性。用交聯(lián)ELISA對經(jīng)瞬時轉(zhuǎn)染的HEK-293F細 胞的上清液測試單價性，其中所述細胞共表達三種帶有分別對EGFR和c-Met特異性的可變 域的鉸鏈修飾（F273T、Y275E)的重鏈、以及一條在初篩選中鑒定的共同K輕鏈種系序列； 所述交聯(lián)ELISA使用重組可溶性抗原（EGFr(A)和C-Met(B))作為包被物，且將相同抗原 與生物素綴合作為二價分子的檢測（圖3中的1、2和3)。在該測定法中使用針對EGFR和 c-Met的IgGl抗體作為陽性對照，針對EGFR和c-Met的對照批次的單價抗體作為陰性對 照。
[0032] SEQ ID NO :1 :人IgG4的野生型重鏈恒定域（CH)的氨基酸序列（編號P01861)。 斜體的序列代表CHl區(qū)，高亮的序列代表鉸鏈區(qū)，正常字體的序列代表CH2區(qū)，加下劃線的 序列代表CH3區(qū)。
[0033] SEQ ID NO :2 :鉸鏈區(qū)被刪除的人IgG4的突變型重鏈恒定區(qū)（CH)的氨基酸序列
[0034] SEQ ID NO :3 :人入輕鏈（CL)的恒定域的氨基酸序列（編號S25751)。
[0035] SEQ ID NO :4 :人K輕鏈（CL)的恒定域的氨基酸序列（編號P01834)。
[0036] SEQ ID NO :5 :人IgGl的重鏈恒定域（CH)的氨基酸序列（編號P01857)。斜體的 序列代表CHl區(qū)，高亮的序列代表鉸鏈區(qū)，正常字體的序列代表CH2區(qū)，加下劃線的序列代 表CH3區(qū)。
[0037] SEQ ID NO :6 :人IgG2的重鏈恒定域（CH)的氨基酸序列（編號P01859)。斜體的 序列代表CHl區(qū)，高亮的序列代表鉸鏈區(qū)，正常字體的序列代表CH2區(qū)，加下劃線的序列代 表CH3區(qū)。
[0038] SEQ ID NO :7 :人IgG3的重鏈恒定域（CH)的氨基酸序列（編號P01860)。斜體的 序列代表CHl區(qū)，高亮的序列代表鉸鏈區(qū)，正常字體的序列代表CH2區(qū)，加下劃線的序列代 表CH3區(qū)。
[0039] SEQ ID NO :8 :V 區(qū)段 VKVI-2-l-(l)-A14(IGKV6D-41*01)的氨基酸序列。
[0040] SEQ ID NO :9 :JK 區(qū)段 JKl (IGKJ1*01)的氨基酸序列
[0041] SEQ ID NO :10 :JK 區(qū)段 JK2(IGKJ2*01)的氨基酸序列
[0042] SEQ ID NO :11 :JK 區(qū)段 JK3(IGKJ3*01)的氨基酸序列
[0043] SEQ ID NO :12 :共同輕鏈I的氨基酸序列
[0044] SEQ ID NO : 13 :共同輕鏈2的氨基酸序列
[0045] SEQ ID NO : 14 :共同輕鏈3的氨基酸序列
[0046] 發(fā)明詳述
[0047]
[0048] 除非另有規(guī)定，在本文中提到時，術(shù)語"抗體"包括完整抗體分子、抗原結(jié)合片段、 單價抗體、及其單鏈?？贵w分子屬于血漿蛋白質(zhì)中稱作免疫球蛋白的一個家族，其基本構(gòu)建 模塊，免疫球蛋白折疊或域，以各種形式在免疫系統(tǒng)和其它生物學識別系統(tǒng)的多種分子中 被使用。天然抗體和免疫球蛋白通常是約150, 000道爾頓的異四聚體糖蛋白，由兩條相同 的輕（L)鏈和兩條相同的重（H)鏈構(gòu)成。每條重鏈和輕鏈還可具有間隔有規(guī)律的鏈內(nèi)二硫 橋。每條輕鏈包含一個輕鏈可變區(qū)（在本文中縮寫為VL)和一個輕鏈恒定區(qū)（在本文中縮 寫為CL)。每條重鏈包含一個重鏈可變區(qū)（VH)和一個重鏈恒定區(qū)（CH)，其中重鏈恒定區(qū)由 三個同源域（CH1、CH2和CH3)和鉸鏈區(qū)組成。輕鏈的恒定域與重鏈的第一恒定域（CHl)排 列在一起，而輕鏈可變域與重鏈可變域排列在一起，形成稱作"Fab"，即抗原結(jié)合片段的東 西。重鏈的CHl和CH2被鉸鏈區(qū)彼此分開，該柔性容許抗體分子的Fab "臂"在一定程度上 相對于Fc部分活動。鉸鏈區(qū)在正常情況下包含一個或多個半胱氨酸殘基，其能夠與同一個 抗體分子內(nèi)的另一條重鏈的鉸鏈區(qū)的半胱氨酸殘基形成二硫橋。
[0049] 重鏈和輕鏈的可變區(qū)形成與抗原相互作用的結(jié)合域?？贵w主要經(jīng)由位于六個重鏈 和輕鏈互補決定區(qū)（CDR)中的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。因為這個原因，CDR內(nèi)的氨 基酸序列比CDR以外的序列在各抗體間更加多樣?？贵w的恒定區(qū)可介導免疫球蛋白對宿主 組織或因子的結(jié)合，包括免疫系統(tǒng)的各種細胞（例如效應細胞）和經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一成 分（Clq)。
[0050] 根據(jù)它們重鏈恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可歸入至少五（5)個主要免疫球 蛋白類：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM。這些類中的數(shù)個可細分成亞類（同種型），例如IgGU IgG2、IgG3和IgG4 ;IgAl和IgA2。編碼免疫球蛋白重鏈恒定域的基因，IgA的稱作阿爾法 (a )，IgD的稱作德爾塔（S )，IgE的稱作厄普西?。╡ )，IgG的稱作伽馬U )，而IgM的 稱作謬（U)。IgG亞類由不同基因編碼：Yl編碼IgGl，Y2編碼IgG2，Y3編碼IgG3,而 Y 4編碼IgG4?？贵w輕鏈根據(jù)它們恒定域的氨基酸序列可分成兩個截然不同的類型，稱為 卡帕（K)和拉姆達（X)。不同類的免疫球蛋白的三維結(jié)構(gòu)是公知的，且可分成亞基。在 IgG重鏈內(nèi)進行比較而規(guī)定出CHI、CH2和CH3同源區(qū)。在本文中的序列表中標明了不同 IgG同種型的這些區(qū)。四種IgG亞類中每一個的同源區(qū)間的比較揭示>95%的序列同一性 (Jefferis, R. 1990. F. Shakib, ed. Pergamon Press, Oxford, p. 15)。人類群體內(nèi)存在不同 同種異型的免疫球蛋白，諸如IgGl重鏈的Glm(a)、Glm(x)、Glm(f)和Glm(Z)和K輕鏈的 Kml、Kml，2和Km3。這些同種異型區(qū)別在于它們恒定區(qū)中的不同氨基酸。CHl和CH2域之 間的序列稱作鉸鏈區(qū)，因為它容許分子的柔性。一個抗體內(nèi)的兩條重鏈的CH3域配對，而且 非共價相互作用足以使IgG分子在重鏈間二硫橋在溫和條件下還原后維持其結(jié)構(gòu)完整性。 CH3域配對是緊湊的，且與Fab中的配對相似，兩個域之間幾乎恰好形成二分（Saphire, et al. ,2002. J Mol Biol 319:9)。這與CH2域形成對照：CH2域不緊密聯(lián)合，它們的接觸主要 由兩條搭接在Asn297殘基上的碳水化合物鏈來介導（Saphire, et al.，2002. J Mol Biol 319:9)。因此，兩個重鏈-輕鏈異二聚體連接的特征性IgG結(jié)構(gòu)通過鉸鏈區(qū)的重鏈間二硫 橋和CH3域的非共價相互作用來維持。
[0051] 在本發(fā)明的語境中，"共同輕鏈"是這樣的多個輕鏈，它們可以相同或者可以具有 氨基酸序列差異。在不背離本發(fā)明的范圍的條件下，共同輕鏈可包含與同一重鏈組合時不 改變抗體特異性的突變。例如，在如本文中使用的共同輕鏈的定義的范圍內(nèi)，有可能制備或 找到不相同但仍在功能上等同的輕鏈，例如通過引入并測試保守氨基酸變化或在與重鏈配 對時對結(jié)合特異性沒有貢獻或僅有部分貢獻的區(qū)域中的氨基酸變化。在一個例示性實施方 案中，本發(fā)明提供了共同輕鏈，一種相同的輕鏈，用來與不同重鏈組合以形成帶有功能性抗 原結(jié)合域的抗體的用途。一種共同輕鏈的使用避免了異二聚體的形成。異二聚體中輕鏈和 重鏈的配對產(chǎn)生沒有功能的（換言之，不能結(jié)合靶抗原的）抗原結(jié)合域。
[0052] 在本發(fā)明的語境中，"不同的重鏈"意指可變區(qū)不同的重鏈。不同的重鏈可具有相 同的或不同的恒定區(qū)。
[0053] 如本文中使用的，術(shù)語"人抗體"意圖包括具有自人種系免疫球蛋白序列衍生的可 變和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人抗體可包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼選自的氨基 酸殘基（例如通過體外隨機或定點誘變或通過體內(nèi)體細胞突變引入的突變）。然而，如本文 中使用的，術(shù)語"人抗體"并非意圖包括在人框架序列中嫁接衍生自另一哺乳動物物種（諸 如小鼠）的種系的CDRl或CDR2序列，或衍生自人以外的另一物種（諸如小鼠）的抗體的 ⑶R3區(qū)而得到的抗體。
[0054] 如本文中使用的，術(shù)語"KD"指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數(shù)，以摩爾 (M)計。
[0055] 如本文中使用的，術(shù)語"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物"指單一分子組成的抗 體分子的制備物。單克隆抗體組合物展示對特定表位的單一結(jié)合特異性和親和力。因而， 術(shù)語"人單克隆抗體"指展示單一結(jié)合特異性，具有自人種系免疫球蛋白序列衍生的可變和 恒定區(qū)的抗體。
[0056] 如本文中使用的，術(shù)語"核酸"、"核酸構(gòu)建體"或"核酸分子"意圖包括DNA分子和 RNA分子。核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的。
[0057] 如本文中使用的，"特異性結(jié)合"指抗體或其抗原結(jié)合片段對預定抗原的結(jié)合。典 型地，在例如使用BIAcore上的表面等離振子共振或作為基于FACS或ELISA中IC5tl值的表 觀親和力度量時，抗體以相當于約KT7M或更小、諸如約KT8M或更小、諸如約KT9M或更小、 約KTkiM或更小、或約KT11M或甚至更小的Kd的親和力結(jié)合預定的抗原，且以與比其結(jié)合預 定抗原或密切相關(guān)抗原以外的非特異性抗原（例如BSA、酪蛋白）的結(jié)合的親和力低至少 10倍、諸如低至少100倍、例如低至少1，〇〇〇倍、諸如低至少10, 〇〇〇倍、例如低至少100, 〇〇〇 倍的Kd對應的親和力結(jié)合預定抗原。親和力低出的量取決于抗體的K D，所以在抗體的Kd很 低時（即抗體是高度特異性的），對抗原的親和力比對非特異性抗原的親和力所低出的量 可以是至少10, 〇〇〇倍。
[0058] 術(shù)語"非人轉(zhuǎn)基因動物"指具有包含一個或多個在轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體上的人重鏈 和/或輕鏈基因座的基因組且能夠表達人抗體的非人動物。例如，轉(zhuǎn)基因小鼠可具有轉(zhuǎn)基 因上的人輕鏈基因座，且具有轉(zhuǎn)基因上的人重鏈基因座或轉(zhuǎn)染色體上的人重鏈基因座，使 得小鼠在用抗原和/或表達抗原的細胞免疫時生成人抗體。人重鏈轉(zhuǎn)基因可整合入小鼠的 染色體DNA，正如轉(zhuǎn)基因例如HuMAb?小鼠那樣，諸如HCo7或HCol2小鼠，或者人重鏈轉(zhuǎn)基 因可在人染色體片段內(nèi)在染色體外維持，如WO 02/43478中記載的轉(zhuǎn)染色體KM-小鼠?那 樣。通過經(jīng)歷V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換，此類轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體小鼠能夠生成多種同種型 的結(jié)合選定抗原的人抗體（例如IgG、IgA和/或IgE)。
[0059] 術(shù)語"抗體的效價"意指抗體能與之反應的抗原決定簇的最大數(shù)目。例如，野生型 IgG抗體含有兩個Fab區(qū)，能結(jié)合兩分子的抗原或同一顆粒上的兩個相同位點，因而具有兩 個效價（"二價"）。術(shù)語"單價抗體"在本發(fā)明的語境中意味著抗體分子至多含有一個Fab 區(qū)且在正常情況下只能夠結(jié)合一分子的抗原，并且因此不能介導抗原交聯(lián)。
[0060] 術(shù)語"表位"意指能夠特異性結(jié)合抗體的蛋白質(zhì)決定子。表位通常由化學活性表面 群組，諸如氨基酸或糖側(cè)鏈組成，且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征，以及特定的電荷特征。 構(gòu)象和非構(gòu)象表位的區(qū)別在于對前者的結(jié)合在變性溶劑存在下會喪失，但是后者不會。
[0061] 如本文中使用的，術(shù)語"宿主細胞"（或"重組宿主細胞"）意圖指其中已導入重組 表達載體的細胞。應當理解，此類術(shù)語意圖不僅指特定主題細胞，而且還指此類細胞的后 代。因為后續(xù)傳代中可存在突變或環(huán)境影響所致某些修飾，此類后代事實上可以與親本細 胞不同，但是仍包括在如本文中使用的術(shù)語"宿主細胞"的范圍內(nèi)。單數(shù)形式的術(shù)語"宿主細 胞"也可表示特定種類的宿主細胞的培養(yǎng)物。依照本發(fā)明的抗體的表達可經(jīng)由使用任何能 夠表達重組DNA分子的宿主細胞來發(fā)生，所述宿主細胞包括細菌，諸如大腸桿菌（E. coli)、 腸桿菌屬（Enterobactor)、沙門氏菌屬（Salmonella)、芽孢桿菌屬（Bacillus)、假單胞菌 屬（Pseudomonas)和鏈霉菌屬（Streptomyces)，酵母，諸如釀酒酵母（S.cerevisiae)、乳 克魯維氏酵母（K. Iactis)、巴斯德畢赤氏酵母（P.pastoris)、假絲酵母屬（Candida)和 耶羅酵母屬（Yarrowia),絲狀真菌，諸如脈胞霉屬（Neurospora)、米曲霉（Aspergillus oryzae)、構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans)和黑曲霉（Aspergillus niger)，植物細胞， 諸如擬南芥（Arabidopsis),昆蟲細胞，諸如草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda)SF_9和 SF-21細胞，哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢（CH0細胞）、BHK細胞、小鼠細胞包括SP2/0 和NS-O骨髓瘤細胞，靈長類動物細胞諸如COS和Vero細胞、MDCK細胞、BRL 3A細胞，雜交 瘤，腫瘤細胞，永生化原代細胞，人細胞，諸如町38、11印62、他1^、冊1(-293、111'1080或胚胎視 網(wǎng)膜細胞諸如PER. C6?等等。細胞等的選擇取決于要獲得的糖基化樣式。
[0062] 術(shù)語" IVIG"指靜脈內(nèi)免疫球蛋白（intravenous immunoglublin),如由 荷蘭 Sanquin 制備的。簡言之，IVIG 是通過由 Brummelhuis (1983) Acta Pharmac Scand(suppl)4:91記載的改良的Cohn乙醇分級技術(shù)自至少I, 000名供體的人血楽集合制 備的。通過在痕量胃蛋白酶存在下于pH 4處理Cohn級分II，該制備物制成適合于靜脈內(nèi) 施用。該材料以凍干形式提供。以規(guī)定體積溶解后，該產(chǎn)物含有約60g/l蛋白質(zhì)。該蛋白 質(zhì)級分含有至少95 %的IgG和少量的IgA (<2g/l)和IgM和痕量的其它血漿蛋白質(zhì)。IgG 亞類的含量與正常人血漿相當：60% IgGl，33% IgG2,3% IgG3和3% IgG4。該制備物每升 含有0. 24mol葡萄糖和37mmol鈉。
[0063] 本發(fā)明的其他方面和實施方案
[0064] 如上文解釋的，在一個方面，本發(fā)明涉及一種用于在單一重組宿主細胞中生成包 含兩種或更多種不同抗體的混合物的體外方法，包括在所述宿主細胞中表達：
[0065] a)至少一種編碼共同輕鏈的核酸構(gòu)建體，和
[0066] b)兩種或更多種編碼重鏈的核酸構(gòu)建體，所述兩種或更多種核酸構(gòu)建體包含 [0067]bl)兩種或更多種編碼兩種或更多種不同第一重鏈的核酸構(gòu)建體，其中所述第一 重鏈的每個恒定區(qū)的氨基酸序列經(jīng)過修飾，使得鉸鏈區(qū)及如免疫球蛋白亞型所要求的CH 區(qū)的其它區(qū)域，諸如CH3區(qū)，不含有任何能夠在IVIG存在下或在施用于哺乳動物或人類時 與相同的CH區(qū)形成二硫鍵或共價或穩(wěn)定非共價重鏈間鍵的氨基酸殘基，
[0068]或
[0069] b2)至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建體，其中恒定區(qū)的氨基酸序列經(jīng)過修飾，使 得鉸鏈區(qū)及如免疫球蛋白亞型所要求的CH區(qū)的其它區(qū)域，諸如CH3區(qū)，不含有任何能夠在 IVIG存在下或在施用于哺乳動物或人類時與相同的CH區(qū)形成二硫鍵或共價或穩(wěn)定非共價 重鏈間鍵的氨基酸殘基，和
[0070] 至少一種編碼第二重鏈的核酸構(gòu)建體，其中所述第二重鏈能夠在IVIG存在下或 在施用于哺乳動物或人類時與相同的CH區(qū)形成二硫鍵或共價或穩(wěn)定非共價重鏈間鍵，
[0071] 其中每種所述重鏈能夠與所述輕鏈配對以形成功能性抗體。
[0072] 因而，在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括在所述宿主細胞中表達：
[0073] 兩種或更多種編碼兩種或更多種不同第一重鏈的核酸構(gòu)建體，其中所述各第一重 鏈的每個恒定區(qū)的氨基酸序列經(jīng)過修飾，使得鉸鏈區(qū)及如免疫球蛋白亞型所要求的CH區(qū) 的其它區(qū)域，諸如CH3區(qū)，不含有任何能夠在IVIG存在下或在施用于哺乳動物或人類時與 相同的CH區(qū)形成二硫鍵或共價或穩(wěn)定非共價重鏈間鍵的氨基酸殘基。
[0074] 所得的組合物因而包含兩種或更多種不同的單價抗體。
[0075] 在一個備選實施方案中，本發(fā)明的方法包括在所述宿主細胞表達：
[0076] -至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建體，其中恒定區(qū)的氨基酸序列經(jīng)過修飾，使 得鉸鏈區(qū)及如免疫球蛋白亞型所要求的CH區(qū)的其它區(qū)域，諸如CH3區(qū)，不含有任何能夠在 IVIG存在下或在施用于哺乳動物或人類時與相同的CH區(qū)形成二硫鍵或共價或穩(wěn)定非共價 重鏈間鍵的氨基酸殘基，和
[0077] -至少一種編碼第二重鏈的核酸構(gòu)建體，其中所述第二重鏈能夠在IVIG存在下或 在施用于哺乳動物或人類時與相同的CH區(qū)形成二硫鍵或共價或穩(wěn)定非共價重鏈間鍵。
[0078] 所得組合物如此包含單價和二價抗體的混合物。
[0079] 通過本發(fā)明的方法生成的抗體混合物內(nèi)包含的單價抗體理論上可以是任何同種 型的，包括但不限于 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2。
[0080] 因而，在一個實施方案中，所述單價抗體是自IgGl衍生的，但是經(jīng)過修飾以進一 步降低分子間相互作用。因此，在本發(fā)明方法的一個實施方案中，所述至少一種編碼第一重 鏈的核酸構(gòu)建體包含編碼SEQ ID NO :5所示的CH3區(qū)的序列，但是其中所述CH3區(qū)經(jīng)過修 飾，從而發(fā)生了一處或多處下述的氨基酸替代：第238位Arg(R)已被Gln(Q)替換；第239 位Asp (D)已被Glu (E)替換；第249位Thr (T)已被Ala (A)替換；第251位Leu (L)已被 Ala(A)或 Val (V)替換；第 288 位 Phe (F)已被 Ala (A)或 Leu (L)替換；第 290 位 Tyr (Y)已被 Ala(A)替換；第 292 位 Lys (K)已被 Arg (R)或 Ala (A)替換；第 302 位 Gln (Q)已被 Glu (E) 替換；和第328位Pro (P)已被Leu (L)替換。在一個優(yōu)選實施方案中，第292位Lys (K)已 被Arg (R)替換。
[0081] 在又一個優(yōu)選實施方案中，所述至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建體進一步包含 編碼SEQ ID NO : 5所示的CHl和/或CH2區(qū)的序列。
[0082] 在CH區(qū)為IgGl同種型的情況下，恒定區(qū)可任選經(jīng)過進一步修飾，這是因為在IgGl 中，輕鏈的一個游離半胱氨酸殘基能潛在地使抗體保持二價形式，即使在鉸鏈區(qū)中不存在 半胱氨酸時。
[0083] 因此，在一個實施方案中，輕鏈的恒定區(qū)經(jīng)過修飾，使得它不含有任何能夠在IVIG 存在下或在施用于哺乳動物或人類時與相同的恒定區(qū)形成二硫鍵或其它共價鍵的氨基酸。 例如，所述至少一種編碼共同輕鏈的核酸構(gòu)建體包含編碼具有SEQ ID NO :4所示的氨基酸 序列的K CL區(qū)的序列，但是其中所述序列經(jīng)過修飾，使得第106位末端半胱氨酸殘基已被 另一種氨基酸殘基替換或已被刪除，或所述至少一種編碼共同輕鏈的核酸構(gòu)建體包含編碼 具有SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列的A CL區(qū)的序列，但是其中所述序列經(jīng)過修飾，使得 第104位半胱氨酸殘基已被另一種氨基酸殘基替換或已被刪除。
[0084] 或者，重鏈的恒定區(qū)經(jīng)過修飾，使得它含有能夠與輕鏈形成二硫鍵或其它共價鍵 的殘基。例如，所述至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建體包含編碼SEQ ID NO :5所示的CHl 區(qū)的序列，但是其中所述CHl區(qū)經(jīng)過修飾，使得第14位Ser(S)已被半胱氨酸殘基替換。 [0085] 在又一個實施方案中，所述單價抗體是自IgG2衍生的，但是經(jīng)過修飾以進一步降 低分子間相互作用。因此，在本發(fā)明方法的一個實施方案中，所述至少一種編碼第一重鏈的 核酸構(gòu)建體包含編碼SEQ ID NO :6所示的CH3區(qū)的序列，但是其中所述CH3區(qū)經(jīng)過修飾， 從而發(fā)生了一處或多處下述的氨基酸替代：第234位Arg(R)已被Gln(Q)替換；第245位 Thr (T)已被 Ala (A)替換；第 247 位 Leu (L)已被 Ala (A)或 Val (V)替換；第 276 位 Met (M) 已被Val (V)替換；第284位Phe(F)已被Ala(A)或Leu(L)替換；第286位Tyr(Y)已被 Ala (A)替換；第 288 位 Lys (K)已被 Arg (R)或 Ala (A)替換；第 298 位 Gln (Q)已被 Glu (E) 替換；和第324位Pro (P)已被Leu (L)替換。在一個優(yōu)選實施方案中，第288位Lys (K)已 被Arg (R)替換。
[0086] 在又一個優(yōu)選實施方案中，所述至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建體進一步包含 編碼SEQ ID NO :6所示的CHl和/或CH2區(qū)的序列。
[0087] 在又一個實施方案中，所述單價抗體是自IgG3衍生的，但是經(jīng)過修飾以進一步降 低分子間相互作用。因此，在本發(fā)明方法的一個實施方案中，所述至少一種編碼第一重鏈的 核酸構(gòu)建體包含編碼SEQ ID NO :7所示的CH3區(qū)的序列，但是其中所述CH3區(qū)經(jīng)過修飾， 從而發(fā)生了一處或多處下述的氨基酸替代：第285位Arg(R)已被Gln(Q)替換；第296位 Thr (T)已被 Ala (A)替換；第 298 位 Leu (L)已被 Ala (A)或 Val (V)替換；第 314 位 Ser (S) 已被Asn (N)替換；第322位Asn (N)已被Lys (K)替換；第327位Met (M)已被Val (V)替換； 第335位Phe (F)已被Ala (A)替換；第335位Phe (F)已被Leu (L)替換；第337位Tyr (Y) 已被Ala (A)替換；第339位Lys (K)已被Arg (R)或Ala (A)替換；第349位Gln (Q)已被 Glu(E)替換；第352位Ile(I)已被Val (V)替換；第365位Arg(R)已被His(H)替換；第 366位Phe (F)已被Tyr (Y)替換；和第375位Pro (P)已被Leu (L)替換。在一個優(yōu)選實施 方案中，第339位Lys (K)已被Arg (R)替換。
[0088] 在又一個優(yōu)選實施方案中，所述至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建體進一步包含 編碼SEQ ID NO : 7所示的CHl和/或CH2區(qū)的序列。
[0089] 在本發(fā)明的一個特別有趣的方面，通過本發(fā)明的方法生成的混合物內(nèi)包含的單價 抗體為IgG4同種型的。因此，在又一個方面，本發(fā)明涉及一種用于在單一重組宿主細胞中 生成包含兩種或更多種不同抗體的混合物的方法，包括在所述宿主細胞中表達：
[0090] a)至少一種編碼共同輕鏈的核酸構(gòu)建體，和
[0091] b)兩種或更多種編碼重鏈的核酸構(gòu)建體，所述兩種或更多種核酸構(gòu)建體包含
[0092] bl)兩種或更多種編碼兩種或更多種不同的第一 IgG4重鏈的核酸構(gòu)建體，其中 所述第一 IgG4重鏈的每個恒定區(qū)的氨基酸序列經(jīng)過修飾，使得鉸鏈區(qū)不含有任何能夠在 IVIG存在下或在施用于哺乳動物或人類時與相同的CH區(qū)形成二硫鍵或共價或穩(wěn)定非共價 重鏈間鍵的氨基酸殘基，
[0093] 或
[0094] b2)至少一種編碼第一 IgG4重鏈的核酸構(gòu)建體，其中恒定區(qū)的氨基酸序列經(jīng)過修 飾，使得鉸鏈區(qū)不含有任何能夠在IVIG存在下或在施用于哺乳動物或人類時與相同的CH 區(qū)形成二硫鍵或共價或穩(wěn)定非共價重鏈間鍵的氨基酸殘基，和
[0095] 至少一種編碼第二重鏈的核酸構(gòu)建體，其中所述第二重鏈能夠在IVIG存在下或 在施用于哺乳動物或人類時與相同的CH區(qū)形成二硫鍵或共價或穩(wěn)定非共價重鏈間鍵，前 提是所述第二重鏈不是野生型IgG4重鏈，
[0096] 其中每種所述重鏈能夠與所述輕鏈配對以形成功能性抗體。
[0097] 在一個實施方案中，所述單價抗體是自IgG4衍生的，但是經(jīng)過修飾以進一步降低 分子間相互作用。因此，在本發(fā)明方法的一個實施方案中，所述至少一種編碼第一重鏈的核 酸構(gòu)建體包含編碼SEQ ID NO :2所示的CH3區(qū)的序列，但是其中所述CH3區(qū)經(jīng)過修飾，從而 發(fā)生了一處或多處下述的氨基酸替代：第217位Tyr (Y)已被Arg (R)替換；第219位Leu (L) 已被 Asn (N)或 Gln (Q)替換；第 225 位 Glu (E)已被 Ala (A)、Thr (T)、Val(V)或 lie (I)替 換；第 232 位 Ser (S)已被 Arg (R)或 Lys (K)替換；第 234 位 Thr (T)已被 Ala (A)、Arg (R)、 Lys (K)或 Asn (N)替換；第 236 位 Leu (L)已被 Ala (A)、Val (V)、Glu (E)、Gly (G)、Ser (S)或 Thr (T)替換；第 238 位 Lys (K)已被 Ala (A)、Arg (R)或 Thr (T)替換；第 267 位 Asp (D)已被 Ala (A)、Thr (T)或 Ser (S)替換；第 273 位 Phe (F)已被 Ala (A)、Leu (L)、Thr (T)、Asp (D)、 Arg(R)、Gln(Q)、Lys(K)或 Tyr(Y)替換；第 275 位 Tyr(Y)已被 Ala(A)、Glu(E)、Gln(Q)、 Lys(K)或 Phe (F)替換；第 277 位 Arg (R)已被 Ala (A)、Lys(K)或 Glu (E)替換；第 279 位 Thr(T)已被Asp (D)、Val (V)或Asn (N)替換。在一個優(yōu)選實施方案中，第236位Leu (L)已 被Val (V)替換。
[0098] 在又一個實施方案中，所述至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建體包含編碼SEQ ID NO :2所示的CH3區(qū)的序列。
[0099] 在又一個實施方案中，第273位Phe (F)已被Asp (D)替換和/或第275位Tyr (Y) 已被Glu (E)替換。
[0100] 在又一個實施方案中，第273位Phe (F)已被Thr (T)替換和/或第275位Tyr (Y) 已被Glu (E)替換。
[0101]在又一個實施方案中，第275位Tyr(Y)已被Ala(A)替換。
[0102] 在又一個實施方案中，所述至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建體進一步包含編碼 SEQ ID NO :2所示的CH2區(qū)的序列，但是其中第118位Thr (T)已被Gln(Q)替換和/或第 296 位 Met (M)已被 Leu (L)替換。
[0103] 在又一個實施方案中，所述至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建體進一步包含編碼 SEQ ID NO :2所示的CH2區(qū)的序列，但是其中已進行一處、兩處或所有三處下述替代：第120 位Met (M)已被Tyr (Y)替換；第122位Ser (S)已被Thr (T)替換；且第124位Thr (T)已被 Glu(E)替換。
[0104] 在又一個實施方案中，所述至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建體進一步包含編碼 SEQ ID NO :2所示的CH2區(qū)的序列，但是其中第302位Asn(N)已被Ala⑷替換。
[0105] 在又一個實施方案中，所述至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建體進一步包含編碼 SEQ ID NO :2所示的CH2區(qū)的序列，但是其中第302位Asn(N)已被Ala(A)替換且第175位 Thr(T)已被Ala (A)替換和第248位Glu (E)已被Ala (A)替換。
[0106] 對鉸鏈區(qū)的修飾可以以數(shù)種方式來實施。
[0107] 在一個實施方案中，所述至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建體包含編碼CH區(qū)的 序列，其經(jīng)過修飾，使得鉸鏈區(qū)中的所有半胱氨酸殘基已被刪除或已被其它氨基酸殘基替 代。
[0108] 在又一個實施方案中，所述CH區(qū)經(jīng)過修飾，使得所述鉸鏈區(qū)的半胱氨酸殘基已被 具有不帶電荷的極性側(cè)鏈或非極性側(cè)鏈的氨基酸殘基替代。
[0109] 在又一個實施方案中，所述至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建體包含編碼IgG4 CH區(qū)的序列，其中與SEQ ID No :1之CH序列的氨基酸106和109對應的氨基酸已被刪除。
[0110] 在又一個實施方案中，所述至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建體包含編碼IgG4 CH區(qū)的序列，其中與SEQ ID No :1之序列的氨基酸殘基106和109對應的氨基酸殘基之一 已被不同于半胱氨酸的氨基酸殘基替代，且另一與SEQ ID No :1之序列的氨基酸殘基106 和109對應的氨基酸殘基已被刪除。
[0111] 在又一個實施方案中，所述至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建體包含編碼IgG4 CH區(qū)的序列，其中至少與SEQ ID No :1之CH序列的氨基酸殘基106至109對應的氨基酸 殘基已被刪除。
[0112] 在又一個實施方案中，所述至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建體包含編碼IgG4 CH區(qū)的序列，其中至少與SEQ ID No :1之序列的氨基酸殘基99至110對應的氨基酸殘基 已被刪除。
[0113] 在又一個實施方案中，所述至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建體包含編碼CH區(qū) 的序列，所述CH區(qū)除前述權(quán)利要求任一項中限定的任何突變外，包含SEQ ID No :2之氨基 酸序列。
[0114] 在甚至又一個實施方案中，所述至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建體包含編碼 IgG4 CH區(qū)的序列，其中所述CH區(qū)經(jīng)過修飾，使得整個鉸鏈區(qū)已被刪除。
[0115] 所述單價抗體可任選包含別的修飾。在一個實施方案中，所述至少一種編碼第一 重鏈的核酸構(gòu)建體包含編碼CH區(qū)的序列，所述CH區(qū)經(jīng)過修飾，使得它不包含任何供N-連 接糖基化的受體位點。優(yōu)選地，CH2區(qū)中供N-連接糖基化的NST受體位點已被修飾成選自 下組的序列：GST，MST，CSE，DSE，DSP，ESP，GSP，HSE，NSE，PSP 和 SSE。
[0116] 在本發(fā)明方法的又一個實施方案中，所述混合物中的至少一種、至少兩種、例如所 有抗體是人抗體。
[0117] 在本發(fā)明方法的又一個實施方案中，所述共同輕鏈包含SEQ ID NO :8所示的序列。
[0118] 在本文的甚至又一個實施方案中，所述共同輕鏈進一步包含選自下組的序列：SEQ ID NO :9,10和11，諸如包含選自下組的序列的共同輕鏈：SEQ ID NO :12,13和14。
[0119] 在本發(fā)明方法的另一個實施方案中，生成三種或更多種不同抗體的混合物，諸如 四種或更多種不同抗體的混合物，例如五種或更多種不同抗體的混合物。
[0120] 在又一個實施方案中，生成不到20種不同抗體的混合物。
[0121] 在甚至又一個實施方案中，所述宿主細胞包含超過一種編碼輕鏈的核酸構(gòu)建體， 優(yōu)選地，其中每種所述重鏈能夠與每種所述輕鏈配對以形成功能性抗體。
[0122] 在甚至又一個實施方案中，所述方法包括將所述宿主細胞培養(yǎng)至少20個群體倍 增（population doublings)〇
[0123] 在甚至又一個實施方案中，所述方法包括自所述細胞培養(yǎng)物收獲所述混合物的進 一步步驟。
[0124] 在甚至又一個實施方案中，所述方法進一步包括純化所述抗體混合物的步驟。
[0125] 在甚至又一個實施方案中，所述核酸穩(wěn)定整合入所述宿主細胞的基因組。
[0126] 在又一個方面，本發(fā)明涉及一種包含可通過本發(fā)明的方法獲得的抗體混合物的組 合物。在一個實施方案中，所述組合物用作藥物。
[0127] 在甚至又一個方面，本發(fā)明涉及一種適合于在生成包含兩種或更多種不同抗體的 混合物中使用的重組宿主細胞，其中所述宿主細胞包含：
[0128] a)至少一種編碼共同輕鏈的核酸構(gòu)建體，和
[0129] b)兩種或更多種編碼重鏈的核酸構(gòu)建體，所述兩種或更多種核酸構(gòu)建體包含
[0130] bl)兩種或更多種編碼兩種或更多種不同第一重鏈的核酸構(gòu)建體，其中所述第一 重鏈的每個恒定區(qū)的氨基酸序列經(jīng)過修飾，使得鉸鏈區(qū)及如免疫球蛋白亞型所要求的CH 區(qū)的其它區(qū)域，諸如CH3區(qū)，不含有任何能夠在IVIG存在下或在施用于哺乳動物或人類時 與相同的CH區(qū)形成二硫鍵或共價或穩(wěn)定非共價重鏈間鍵的氨基酸殘基，
[0131] 或
[0132] b2)至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建體，其中恒定區(qū)的氨基酸序列經(jīng)過修飾，使 得鉸鏈區(qū)及如免疫球蛋白亞型所要求的CH區(qū)的其它區(qū)域，諸如CH3區(qū)，不含有任何能夠在 IVIG存在下或在施用于哺乳動物或人類時與相同的CH區(qū)形成二硫鍵或共價或穩(wěn)定非共價 重鏈間鍵的氨基酸殘基，和
[0133] 至少一種編碼第二重鏈的核酸構(gòu)建體，其中所述第二重鏈能夠在IVIG存在下或 在施用于哺乳動物或人類時與相同的CH區(qū)形成二硫鍵或共價或穩(wěn)定非共價重鏈間鍵。
[0134] 在一個實施方案中，所述宿主細胞是哺乳動物細胞，諸如CHO細胞。
[0135] 單價和二價抗體的混合物
[0136] 如上文解釋的，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種用于在單一重組宿主細胞中 生成包含兩種或更多種不同抗體的混合物的方法，包括在所述宿主細胞中表達：
[0137] a)至少一種編碼共同輕鏈的核酸構(gòu)建體，和
[0138]b)兩種或更多種編碼重鏈的核酸構(gòu)建體，所述兩種或更多種核酸構(gòu)建體包含
[0139] 至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建體，其中恒定區(qū)的氨基酸序列經(jīng)過修飾，使得 鉸鏈區(qū)及如免疫球蛋白亞型所要求的CH區(qū)的其它區(qū)域，諸如CH3區(qū)，不含有任何能夠在 IVIG存在下或在施用于哺乳動物或人類時與相同的CH區(qū)形成二硫鍵或共價或穩(wěn)定非共價 重鏈間鍵的氨基酸殘基，和
[0140] 至少一種編碼第二重鏈的核酸構(gòu)建體，其中所述第二重鏈能夠在IVIG存在下或 在施用于哺乳動物或人類時與相同的CH區(qū)形成二硫鍵或共價或穩(wěn)定非共價重鏈間鍵，
[0141] 其中每種所述重鏈所述輕鏈能夠與配對以形成功能性抗體。
[0142] 因此，在此實施方案中，在同一細胞中生成單價和二價抗體的混合物。這樣的混合 物可例如用于治療疾病，諸如癌癥。在一個特別有趣的實施方案中，所述單價抗體通過阻斷 靶蛋白質(zhì)來抑制細胞增殖且所述二價抗體結(jié)合另一種靶抗原，例如在同一靶細胞上的靶抗 原，并募集效應器功能來進行靶細胞殺傷。
[0143] 優(yōu)選地，所述第二重鏈為IgGl、IgG2、IgG3、IgA或穩(wěn)定化IgG4重鏈。
[0144] 最優(yōu)選地，所述第二重鏈為這樣的同種型，例如IgGL其容許形成能夠活化效應器 功能（諸如ADCC和⑶C)的二價抗體。
[0145] 在另一個實施方案中，所述第二重鏈是基于IgG4的，但是經(jīng)過修飾以穩(wěn)定化IgG4 分子（即防止如 van den Neut Kolfschoten(2007)Science 317:1507 中記載的動態(tài) Fab 臂交換）。此類穩(wěn)定化IgG4不活化效應器機制，但是確實可交聯(lián)受體。穩(wěn)定化的IgG4抗體 已記載于 PCT/DK2008/050129。
[0146] 對IgG4的穩(wěn)定化可通過修飾CH3區(qū)或通過修飾鉸鏈區(qū)來實現(xiàn)。
[0147] 因此，在一個實施方案中，所述重鏈包含如下的人IgG4恒定區(qū)，其在與SEQ ID NO : 1中的289位對應的位置處具有選自下組的殘基：Lys，Ala，Thr，Met，Leu和Trp和/或與 SEQ ID NO :1中285位對應的位置處具有選自下組的殘基：Ala，Val，Gly，Ile和Leu，且其 中所述抗體任選包含一處或多處別的替代、刪除和/或插入。優(yōu)選地，所述抗體包含與289 位對應的位置處的Lys、Met或Leu殘基，或者所述抗體包含與285位對應的位置處的Ala 或Leu殘基。在另一個實施方案中，所述穩(wěn)定化IgG4抗體包含與SEQ ID NO :1中229位 對應的位置處的Asp和/或與第231位對應的位置處的Lys和/或與第237位對應的位置 處的Thr和/或與第244位對應的位置處的Thr或Asp和/或與第250位對應的位置處的 Thr、Gln或Glu和/或與SEQ ID NO :1中第291位對應的位置處的Phe或Val。所述抗體 任選在SEQ ID NO :1所示的恒定區(qū)中包含一處或多處別的替代、刪除和/或插入。
[0148] 在另一個實施方案中，所述IgG4抗體經(jīng)過修飾以在鉸鏈區(qū)中包含 Cys-Pro-Pro-Cys 序列。
[0149] 靶分子
[0150] 在一個實施方案中，通過本發(fā)明的方法生成的混合物的所有抗體針對同一靶物 (即同一抗原）。優(yōu)選地，所述混合物的抗體不競爭對所述靶物的結(jié)合。
[0151] 在另一個實施方案中，所述混合物中的兩種或更多種抗體針對不同靶物。
[0152] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所得混合物是單價和二價抗體的混合物，其中所述 二價抗體針對期望免疫能力的靶物（例如腫瘤細胞的表面上的靶物，其中期望經(jīng)由效應器 機制進行的殺傷）且所述單價抗體針對免疫調(diào)節(jié)性分子，例如免疫抑制性分子，由此抑制 它們結(jié)合它們的受體或阻斷補體防御分子。
[0153] 在一個實施方案中，本發(fā)明的單價抗體混合物特異性結(jié)合在受體二聚化時活化的 細胞表面受體。單價抗體常常可用于治療不期望受體活化的疾病或病癥，因為本發(fā)明的抗 體分子由于它們的單價性質(zhì)而不能誘導這樣的二聚化，從而不能誘導這樣的活化。不限于 具體受體，此類受體的例子可以是erb-Bl、erb-B2、erb-B3、erb-B4和肝配蛋白和肝配蛋白 受體的成員諸如肝配蛋白-Al至A8和eph-Bl至eph_B6。
[0154] 在另一個實施方案中，通過本發(fā)明的方法生成的單價抗體混合物在結(jié)合靶分子時 抑制靶分子多聚化（諸如二聚化）。再次，此類單價抗體可用于治療不期望靶抗原多聚化的 疾病或病癥，因為本發(fā)明的抗體分子由于它們的單價性質(zhì)而不能誘導此類多聚化。在可溶 性抗原的情況下，多聚化可形成不期望的免疫復合物。不限于具體靶物，此類靶物的例子可 以是Toll樣受體如TLR-3和TLR-9的配體、或血管生成素-1、或血管生成素-2、或TNF受 體家族成員諸如⑶30、⑶40和⑶95。
[0155] 如先前描述的，在某些病理狀況中，必須和/或希望利用單價抗體。通過本發(fā)明的 方法生成的混合物中的單價抗體在活化效應器功能（諸如ADCC和CDC)方面是缺陷的。
[0156] 在本發(fā)明的一個實施方案中，通過本發(fā)明的方法來生成單價和二價抗體的混合 物。因此，所得混合物通常會（除非例如所述二價抗體為IgG4同種型）既含有能夠活化效 應器功能（諸如ADCC和⑶C)的二價抗體，又含有不能活化這些功能的單價抗體。
[0157] 本發(fā)明的抗體混合物用于特定目的的具體選擇和效用取決于所述抗體的具體靶 物。關(guān)于可以使用本發(fā)明的抗體混合物來治療和預防的靶物的選擇，可以基于施用對靶物 特異性的，或?qū)Π形锷系慕o定表位特異性的抗體的治療價值來進行。這樣的考慮在本領(lǐng)域 技術(shù)人員的技術(shù)范圍之內(nèi)。
[0158] 本發(fā)明的一個實施方案涉及可用于治療實體瘤，諸如乳房、胃腸、肺、卵巢、前列 腺腫瘤等的抗體混合物。通過例如靶向同一靶物上的不同表位（其中所述和混合物的抗 體不競爭對所述靶物的結(jié)合）或針對不同靶物的單價抗體的混合物或通過結(jié)合不同靶物 的單價和二價抗體的混合物，來靶向下文所述的癌癥靶物。在本發(fā)明的一個實施方案中， 所述癌癥靶物選自cMet、EGFr、Her2或HERV包膜蛋白。在一個實施方案中，針對骨膜素 (periostin)、Bigh3和SPARC的單價抗體的混合物可用于治療實體瘤。
[0159] 本發(fā)明的一個實施方案涉及可用于治療淋巴瘤的抗體混合物。在一個實施方案 中，所述靶物是⑶20、⑶38、BCR、⑶19、⑶79、⑶37。在一個實施方案中，淋巴瘤是B-CLL。 在上述的一個實施方案中，通過本發(fā)明生成的抗體混合物針對⑶38和RANKL的組合。
[0160] 本發(fā)明的另一個實施方案涉及可用于治療多發(fā)性骨髓瘤的抗體混合物。針對CD38 和CXCR4的單價抗體或單價與二價抗體的混合物可靶向此適應證。
[0161] 本發(fā)明的另一個實施方案涉及可用于治療CLL的抗體混合物。通過針對⑶20和 CXCR4的單價抗體或單價和二價抗體的混合物可靶向此適應證。或者，單價抗體的混合物或 單價和二價抗體的混合物可靶向⑶20和CXCR4和/或CCR7和/或CXCR5。
[0162] 本發(fā)明的又一個實施方案涉及可用于治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的抗體混合物。通過依照本 發(fā)明的針對EGFrwt、EGFrvIII和MRP3的抗體混合物可靶向此類治療。
[0163] 本發(fā)明的甚至又一個實施方案涉及可用于治療血管發(fā)生的抗體混合物。單價抗體 的混合物可靶向下文所述的血管發(fā)生靶物。所述抗體可針對同一靶物上的不同表位（其中 所述混合物的抗體不競爭對所述靶物的結(jié)合）或針對不同靶物。在一個實施方案中，這些 靶物是成纖維細胞生長因子（FGF)、粒細胞集落刺激因子（G-CSF)、肝細胞生長因子（HGF)、 白介素-8、血小板衍生內(nèi)皮細胞生長因子（PD-ECGF)、血小板衍生生長因子-BB(TOGF-BB)、 多營養(yǎng)因子（Pleiotrophin) (PTN)、原顆粒體蛋白（Progranulin)、多育曲菌素、轉(zhuǎn)化生長 因子-a (TGF-a)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-P)、腫瘤壞死因子-a (TNF-a)、血管內(nèi)皮生長 因子（VEGF)、VEGF-C、VEGF-D 等等。
[0164] 在另一個實施方案中，所述靶物包括血管發(fā)生抑制劑，包括但不限于血管他汀 (Angiostatin)(纖溶酶原片段）、抗血管發(fā)生性抗凝血酶III、內(nèi)皮他?。‥ndostatin) (膠原XVIII片段）、纖連蛋白片段、Gro-爲、肝素酶、干擾素-a / @ / Y、干擾素誘生蛋白 (IP-IO)、白介素-12、金屬蛋白酶抑制劑（TMP)、纖溶酶原激活物抑制劑、和血小板反應蛋 白-I (TSP-I)。
[0165] 在本發(fā)明的又一個實施方案中，針對VEGF或P2GP1與乳粘附素（Iactadherin) 的組合的抗體混合物可用于治療不期望的血管發(fā)生。
[0166] 在一個實施方案中，通過施用通過本發(fā)明生成的抗體混合物來進行的上述癌癥治 療可組合以與上文所述相同的方式的抗血管發(fā)生靶物。
[0167] 在一個實施方案中，上文的抗血管發(fā)生靶物可以按照與上文所述相同的方式與抗 蛋白酶靶物組合。
[0168] 在一個實施方案中，通過施用通過本發(fā)明生成的抗體混合物來進行的上述癌癥治 療可以按照與上文所述相同的方式與針對補體防御分子諸如CD55、CD59、和CD46的抗體組 合。
[0169] 在一個實施方案中，通過施用通過本發(fā)明生成的抗體混合物來進行的上述癌 癥治療可以與調(diào)控和活化免疫系統(tǒng)（例如但不限于⑶80、⑶86、⑶200或⑶200R途徑、 FcyRI (CD64)、FcyRIIa(CD32a)、FcyRIIc (CD32c)和 FcyRIII (CD16))和 / 或抑制下調(diào)受體 (包括但不限于KIR、FcyRIIb (⑶32b))的單價抗體混合物組合，導致免疫刺激效果。
[0170] 在一個實施方案中，依照本發(fā)明生成的抗體混合物可用于通過靶向⑶20和RANKL 來治療炎性疾病，諸如關(guān)節(jié)炎。通過提供通過本發(fā)明生成的針對靶物CH3L1和幾丁質(zhì)結(jié)合 蛋白的抗體混合物，可靶向另一種炎性疾病，如IBD。
[0171] 在一個實施方案中，通過靶向陶（T)蛋白、淀粉狀蛋白0樣單體結(jié)構(gòu)組合寡聚結(jié) 構(gòu)的APP差異結(jié)構(gòu)（differential structure)和原纖維結(jié)構(gòu)，依照本發(fā)明生成的抗體混合 物可用于治療阿爾茨海默（Alzheimer)氏病。
[0172] 在另一個實施方案中，用依照本發(fā)明的抗體混合物來治療感染性疾病。所述感染 性疾病可以為細菌、病毒、真菌、原生動物或寄生物起源的，而且通過本發(fā)明生成的抗體混 合物可針對適合于治療所述疾病的靶物。所述抗體可針對同一靶物上的不同表位（其中所 述混合物中的抗體不競爭對所述靶物的結(jié)合）或針對不同的靶物。
[0173] 感染性疾病可以由細菌引起，例如但不限于Bacillus antracis、博氏疏 螺旋體（Borrelia burgdorferi)、空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni)、沙眼衣 原體（Chlamydia trachomatis)、肉毒梭菌（Clostridium botulinum)、破傷風梭菌 (Clostridium tetani)、白喉（Diptheria)、大腸桿菌（E. coli)、嗜肺軍團桿菌（Legionella pneumofila)、幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori)、結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis)、牛分支桿菌（Mycobacterium bovis)、非洲分支桿菌（Mycobacterium africanum)、麻風分枝桿菌（Mycobacterium leprae)、分支桿菌屬（Mycobacterium)立 克次氏體（rikettsia)、支原體屬（Mycoplasma)奈瑟氏菌屬（neisseria)、腦膜炎奈瑟 氏菌（Neisseria meningitidis)、百日咳（Pertussis)、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis)、鏈球菌屬（Streptococcus)和鼠疫耶爾森氏菌（Yersinia pestis)。
[0174] 在本發(fā)明的一個實施方案中，源自梭菌毒素的破傷風和結(jié)腸炎可通過提供依照本 發(fā)明生成的抗體混合物來治療，其中所述抗體靶向所述毒素上的特定抗原。
[0175] 感染性疾病也可由病毒引起，例如但不限于腺病毒、巨細胞病毒、埃巴二氏病毒、 甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、己型肝炎、庚型肝炎、I型單純皰疹、 II型單純皰疹、人免疫缺陷病毒（HIV或HIV-1)、人T細胞親淋巴病毒III、人乳頭瘤病毒 (HPV)、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腦膜炎（病毒性）、麻疹、乳多泡病毒、脊髓灰質(zhì)炎病 毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、輪狀病毒、風疫病毒、SARS病毒、和天花。
[0176]感染性疾病也可由真菌引起，例如但不限于曲霉屬（Aspergillus)、假絲酵母屬 (Candida)、球菌、和組織胞漿菌病。
[0177]感染性疾病也可由原生動物和寄生物引起，例如但不限于衣原體屬（Chlamydia)、 溶組織內(nèi)阿米巴（Entamoeba histolytica)、利什曼蟲屬（Ieishmania)、痕原蟲屬 (Plasmodia)(惡性（falciparum)、間日（vivax)和三日（malariae))、立克次氏體 (rickettsia)、和維蟲。
[0178] 在一個實施方案中，通過靶向AMA-UMSP和GLURP的組合，依照本發(fā)明生成的抗體 混合物可靶向瘧疾。
[0179] 在另一個實施方案中，上述感染性疾病治療可組合調(diào)控和活化免疫系統(tǒng)的單 價抗體混合物，例如但不限于CD200或CD200R途徑、FcyRI (CD64)、FcyRIIa (CD32a)、 FcyRIIc (CD32c)、FcyRIII (CD16)、和0X40 (CD134)和/或抑制下調(diào)受體的單抗抗體混合物， 包括但不限于KIR、FcyRIIb (CD32b)，從而導致免疫刺激效果。
[0180] 在一個實施方案中，用針對下述兩項或更多項的單價抗體的組合來治療HIV : CD4, CCR5, CXCR4 和 LFA-1。
[0181] 在本發(fā)明的又一個實施方案中，要治療的疾病是炎性疾病，例如但不限于急性呼 吸窘迫綜合征（ARDS)、關(guān)節(jié)炎（例如急性膿毒性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎和類風濕性關(guān)節(jié)炎 包括活動性類風濕性關(guān)節(jié)炎和幼年型類風濕性關(guān)節(jié)炎）、哮喘、克羅恩（Chron)氏病、C0PD、 腦炎、腎小球腎炎、格雷夫斯（Graves)病、炎性腸病、多發(fā)性硬化、重癥肌無力、原發(fā)性膽汁 性肝硬化、天皰瘡、類天皰瘡、感染性休克、斯耶格倫(SjSgren)綜合征、血栓性血小板減少 性紫癜、I型糖尿病、潰瘍性結(jié)腸炎、移植排斥。
[0182] 本發(fā)明的抗體混合物也可組合一種或多種別的治療劑，諸如抗炎藥、DMRD(緩解 疾病的抗風濕藥）、免疫抑制藥、化療藥、和抗銀屑病藥。
[0183]本發(fā)明的混合物中表達的抗體還涵蓋單價抗體的"衍生物"，其中一個或多個氨基 酸殘基已被衍生化，例如通過?；蛱腔?，而不顯著影響或改變含有所述氨基酸序列的 抗體的結(jié)合特征。在本發(fā)明的語境中，單價抗體的衍生物可以例如是單價抗體，其中所述單 價抗體的一個或多個氨基酸殘基已被化學修飾（例如通過烷化/烴化、?；Ⅴバ纬?、或酰 胺形成）或聯(lián)合一個或多個非氨基酸有機和/或無機原子或分子取代基（例如聚乙二醇 (PEG)基團、親脂取代基（其任選可通過間隔物殘基或基團諸如￠-丙氨酸、Y-氨基丁酸 (GABA)、L/D-谷氨酸、琥珀酸、等等連接至肽的氨基酸序列）、熒光團、生物素、放射性核素、 等），且另外/或者，可包含非必需、非天然存在、和/或非L型氨基酸殘基，除非另有陳述 或與上下文矛盾。此類氨基酸殘基的非限制性例子包括例如2-氨基己二酸、3-氨基己二 酸、￠-丙氨酸、￠-氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨 基異丁酸、3-氨基異丁酸、2-氨基庚二酸、2, 4-二氨基丁酸、鎖鏈素、2, 2' -二氨基庚二酸、 2, 3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羥基-賴氨酸、別羥基賴氨酸、3-羥基 脯氨酸、4-羥基脯氨酸、異鎖鏈素、別異亮氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基異亮氨酸、6-N-甲 基賴氨酸、N-甲基纈氨酸、正纈氨酸、正亮氨酸、鳥氨酸、和抑胃酶氨酸（statine)鹵代氨基 酸。
[0184] 本發(fā)明中表達的抗體也可融合其它肽、蛋白質(zhì)或治療活性化合物。
[0185] 可例如通過修飾Ig恒定域或Ig樣恒定域的補救受體表位使得該分子不包含完整 CH2域或完整Ig Fc區(qū)來改進所述抗體的體內(nèi)半衰期，參見US 6121022和US 6194551。可 因此通過進行Fc區(qū)中的突變，例如通過用蘇氨酸替代與完整抗體分子的第252位對應的位 置處的亮氨酸，用蘇氨酸替代與完整抗體分子的第254位對應的位置處的絲氨酸，或用蘇 氨酸替代與完整抗體分子的第256位對應的位置處的苯丙氨酸，來延長體內(nèi)半衰期，參見 US 6277375。
[0186] 在一個實施方案中，抗原是人蛋白質(zhì)分子且受試者是人受試者。在一個實施方案 中，受試者可以是表達本發(fā)明抗體與之結(jié)合的抗原的非人哺乳動物。此外，本發(fā)明的單價抗 體混合物可施用于表達免疫球蛋白與之交叉反應的抗原的非人哺乳動物（例如靈長類動 物、豬或小鼠），用于獸醫(yī)目的或作為人疾病的動物模型。關(guān)于后者，此類動物模型可用于評 估本發(fā)明抗體的治療功效（例如測試施用的劑量和時間過程）。
[0187] 本發(fā)明的抗體混合物可單獨地或與其它組合物組合地在治療中使用。例如，本發(fā) 明的抗體混合物可與一種或多種其它抗體諸如依照本發(fā)明生成的抗體、一種或多種化療 劑（包括化療劑雞尾酒）、一種或多種其它細胞毒劑、一種或多種抗血管發(fā)生劑、一種或多 種細胞因子、一種或多種生長抑制劑、一種或多種抗炎藥、一種或多種緩解疾病的抗風濕藥 (DMRD)、或一種或多種免疫抑制藥一起共施用，這取決于要治療的疾病或狀況。在本發(fā)明 的抗體混合物抑制腫瘤生長的情況下，可能特別希望將它與一種或多種也抑制腫瘤生長的 其它治療劑組合?；蛘?另外，患者可接受組合放射療法（例如外部線束輻照或用放射性 標記的藥劑諸如抗體的療法）。上文所述此類組合療法包括組合施用（其中在同一或各別 的配制劑中包括兩種或更多種藥劑）和各別施用，在該各別施用的情況下，本發(fā)明抗體的 施用可在輔助療法的施用之前和/或之后。
[0188] 本發(fā)明的抗體混合物可以以與符合優(yōu)良醫(yī)學實踐的方式配制、劑量給藥和施用。 在此語境中要考慮的因素包括所治療的具體病癥、所治療的具體哺乳動物、個別患者的臨 床狀況、病癥的原因、投遞藥劑的部位、施用的方法、施用的時間表、和醫(yī)學從業(yè)人員知道的 其它因素。在一個實施方案中，單價抗體混合物可以與一種或多種當前用于預防或治療所 討論病癥的藥劑一起配制。此類其它藥劑的有效量取決于配制劑中存在的本發(fā)明抗體的 量、病癥或治療的類型、和上文討論的其它因素。
[0189] 本發(fā)明的抗體混合物（和輔助治療劑）可通過任何合適手段來施用，包括胃腸外， 諸如靜脈內(nèi)或皮下施用。另外，抗體混合物可通過脈沖輸注來合適地施用，特別是以遞減劑 量的抗體混合物。
[0190] 為了預防或治療疾病，本發(fā)明抗體混合物的適宜劑量（在單獨地或與其它藥劑諸 如化療劑組合地使用時）會取決于要治療的疾病的類型、抗體的類型、疾病的嚴重性和過 程、施用抗體混合物是為了預防、治療還是診斷目的、先前的療法、患者的臨床史和對抗體 的響應、和主治醫(yī)師的判斷?？贵w混合物可一次性或在一系列治療里合適施用于患者。
[0191] 本發(fā)明的范圍內(nèi)還涵蓋包含本發(fā)明藥物組合物和使用說明的試劑盒，其中所述藥 物組合物包含一種或多種本發(fā)明抗體。所述試劑盒可進一步包含一種或多種別的藥劑，諸 如免疫抑制劑、細胞毒劑或放射性毒劑，這取決于所治療的疾病或病癥，或者一種或多種額 外的本發(fā)明抗體（例如具有互補活性的抗體的混合物）。
[0192] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了 一種包含本發(fā)明抗體的混合物的藥物組合 物。所述藥物組合物可依照常規(guī)技術(shù)與藥學可接受載體或稀釋劑以及任何其它已知佐 劑和賦形劑一起配制，諸如 Remington:The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed.，Mack Publishing Co.，Easton, PA, 1995 中記載的那些。
[0193] 無論所選擇的施用路徑如何，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的常規(guī)技術(shù)將本發(fā)明的抗 體（其可以以藥學可接受鹽的形式或以合適水合形式使用）和/或本發(fā)明的藥物組合物配 制成藥學可接受劑量形式。
[0194] 如上文描述的，在又一個方面，本發(fā)明涉及一種包含重鏈和輕鏈的重組抗體，其中 所述輕鏈包含SEQ ID NO :8所示的序列。
[0195] 在一個實施方案中，所述輕鏈進一步包含選自下組的序列：SEQ ID N0:9，10和 11，諸如包含選自下組的序列的輕鏈：SEQ ID NO :12,13和14。
[0196] 在一個實施方案中，所述抗體是雙特異性抗體。在又一個實施方案中，所述抗體是 單價抗體。在甚至又一個實施方案中，所述抗體是多克隆抗體，諸如多克隆二價抗體或多克 隆單價抗體。
[0197] 在一個實施方案中，所述抗體用作藥物，例如用于治療癌癥。 實施例
[0198] 實施例1 :在單一細胞中表達兩種具有共同輕鏈的單價人抗體
[0199] 修飾用于兩種抗體即抗CD20抗體7D8 (W02004035607)和抗CD38抗體 005(W02006099875)的重鏈（HC)的表達載體，將同種型改變成IgG4并刪除編碼鉸鏈區(qū)的序 列（刪除編碼ESKYGPPCPSCP的序列）（還可參見W02007/059782)。通過瞬時過表達將所得 的構(gòu)建體在HEK-293F細胞（Invitrogen，依照制造商的推薦）中與005的輕鏈（LC) 一起共 表達。表達水平通過濁度法來測量，且在此系統(tǒng)的正常表達范圍中。通過ELISA來測試上 清液中兩種不同單價抗體的潛在組合，通過如W02006099875中記載的ELISA檢測在可溶性 CD38上的結(jié)合及對針對7D8的抗獨特型抗體的結(jié)合（記載于W02004035607實施例16)。在 圖1和2中，顯示了單價7D8和單價抗CD38二者的細胞培養(yǎng)物上清液中均能檢測到結(jié)合。 因此，可以通過使用共同輕鏈在單一細胞中表達兩種功能性單價抗體。
[0200] 實施例2 :在單一細胞系中生成并評估多種帶有共同輕鏈的單價抗體
[0201] 首先，在含有鉸鏈經(jīng)修飾的單價（鉸鏈區(qū)E99-P110被刪除且在CH3區(qū)中含有替代 ?273!'和￥275￡(5￡0 1〇勵：2)，如記載于冊2008145140)人1864抗體的恒定區(qū)的哺乳動物 表達載體（pcDNA3. 3，Invitrogen)中克隆編碼一組抗體（分別對EGFr (克隆LC1006-018， 記載于W02009030239)、c-Met和Her2特異性的）的VH區(qū)的序列。為了鑒定共同輕鏈，與一 個編碼單一人LC K種系序列的表達載體文庫一起，在HEK-293F細胞中瞬時共轉(zhuǎn)染每種HC 載體。該文庫包含自公眾可得數(shù)據(jù)庫 VBASE (Tomlinson, I. M.，Williams, S. C.，Corbett, S. J. , Cox, J. B. L. , Winter, G. , 1996. VBASE Sequence Directory. MRC Centre for Protein Engineering，Cambridge，UK(http://vbase. mrc-cpe. cam, ac. uk/))獲得的一套 200 種種 系K序列（40種已知的功能性V-K區(qū)段中的每一種與5種功能性J-K人種系序列分別 組合）。為了鑒定共同輕鏈，轉(zhuǎn)染后5天收集所有瞬時轉(zhuǎn)染的細胞培養(yǎng)物的上清液，稀釋20 倍并通過實施結(jié)合ELISA，使用包被在板上的重組純化的可溶性抗原靶物來篩選功能性抗 體的存在，如下文描述的。通過Octet Dip和Read?測定法（ForteBio)來測定上清液中的 IgG濃度，其中使用包被在尖頭表面上的抗人IgG Fc生物傳感器。
[0202] 在圖3中，顯示了通過結(jié)合ELISA進行的篩選的結(jié)果。鑒定出在200種LCk種 系序列中有3種（共同輕鏈1、2和3)可與所有三種不同鉸鏈修飾（F273T、Y275E)的 重鏈組合形成功能性抗體，并各自具有不同的抗原特異性。所鑒定的共同輕鏈由V區(qū) 段 VKVI-2-l-(l)-A14(IGKV6D-41*01)[DVVMTQSPAFLSVTPGEKVTITCQASEGIGNYLYWYQQK PDQAPKLLIKYASQSISGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLEAEDAATYYCQQGNKHP(SEQ ID N0:8)]與 JK 區(qū)段 JKl (IGKJ1*01) [WTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO :9)](共同輕鏈 I)、JK2(IGKJ2*01) [丫丁卩60611(1^11((5￡010勵：10)](共同輕鏈2)或13(161^3*01)[卩丁卩6?61'1^011((5￡010 NO :11)](共同輕鏈3)中任一組合而構(gòu)成。
[0203] 因此，所鑒定的共同輕鏈序列如下：
【權(quán)利要求】
1. 一種用于在單一重組宿主細胞中生成包含兩種或更多種不同抗體的混合物的方法， 包括在所述宿主細胞中表達： a) 至少一種編碼共同輕鏈的核酸構(gòu)建體，和 b) 兩種或更多種編碼重鏈的核酸構(gòu)建體，所述兩種或更多種核酸構(gòu)建體包含 bl)兩種或更多種編碼兩種或更多種不同的第一重鏈的核酸構(gòu)建體，其中所述第一重 鏈的每個恒定區(qū)的氨基酸序列經(jīng)過修飾，使得鉸鏈區(qū)及如免疫球蛋白亞型所要求的CH區(qū) 的其它區(qū)域，諸如CH3區(qū)，不含有任何在IVIG存在下或在施用于哺乳動物或人類時能夠與 相同的CH區(qū)形成二硫鍵或共價或穩(wěn)定非共價重鏈間鍵的氨基酸殘基， 或 b2)至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建體，其中恒定區(qū)的氨基酸序列經(jīng)過修飾，使得鉸 鏈區(qū)及如免疫球蛋白亞型所要求的CH區(qū)的其它區(qū)域，諸如CH3區(qū)，不含有任何能夠在IVIG 存在下或在施用于哺乳動物或人類時與相同的CH區(qū)形成二硫鍵或共價或穩(wěn)定非共價重鏈 間鍵的氨基酸殘基，和 至少一種編碼第二重鏈的核酸構(gòu)建體，其中所述第二重鏈能夠在IVIG存在下或在施 用于哺乳動物或人類時與相同的CH區(qū)形成二硫鍵或共價或穩(wěn)定非共價重鏈間鍵， 其中每種所述重鏈能夠與所述輕鏈配對以形成功能性抗體。
2. 依照權(quán)利要求1的方法，其中所述方法包括在所述宿主細胞中表達：兩種或更多種 編碼兩種或更多種不同第一重鏈的核酸構(gòu)建體，其中所述第一重鏈的每個恒定區(qū)的氨基酸 序列經(jīng)過修飾，使得所述鉸鏈區(qū)和如免疫球蛋白亞型所要求的CH區(qū)的其它區(qū)域，諸如CH3 區(qū)，不含有任何能夠在IVIG存在下或在施用于哺乳動物或人類時與相同的CH區(qū)形成二硫 鍵或共價或穩(wěn)定非共價重鏈間鍵的氨基酸殘基。
3. 依照權(quán)利要求1的方法，其中所述方法包括在所述宿主細胞中表達： -至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建體，其中恒定區(qū)的氨基酸序列經(jīng)過修飾，使得鉸鏈 區(qū)及如免疫球蛋白亞型所要求的CH區(qū)的其它區(qū)域，諸如CH3區(qū)，不含有任何能夠在IVIG存 在下或在施用于哺乳動物或人類時與相同的CH區(qū)形成二硫鍵或共價或穩(wěn)定非共價重鏈間 鍵的氣基酸殘基，和 -至少一種編碼第二重鏈的核酸構(gòu)建體，其中所述第二重鏈能夠在IVIG存在下或在施 用于哺乳動物或人類時與相同的CH區(qū)形成二硫鍵或共價或穩(wěn)定非共價重鏈間鍵。
4. 一種用于在單一重組宿主細胞中生成包含兩種或更多種不同抗體的混合物的方法， 包括在所述宿主細胞中表達 a) 至少一種編碼共同輕鏈的核酸構(gòu)建體，和 b) 兩種或更多種編碼重鏈的核酸構(gòu)建體，所述兩種或更多種核酸構(gòu)建體包含 bl)兩種或更多種編碼兩種或更多種不同第一 IgG4重鏈的核酸構(gòu)建體，其中所述第一 IgG4重鏈的每個恒定區(qū)的氨基酸序列經(jīng)過修飾，使得鉸鏈區(qū)不含有任何能夠在IVIG存在 下或在施用于哺乳動物或人類時與相同的CH區(qū)形成二硫鍵或共價或穩(wěn)定非共價重鏈間鍵 的氨基酸殘基， 或 b2)至少一種編碼第一 IgG4重鏈的核酸構(gòu)建體，其中恒定區(qū)的氨基酸序列經(jīng)過修飾， 使得鉸鏈區(qū)不含有任何能夠在IVIG存在下或在施用于哺乳動物或人類時與相同的CH區(qū)形 成二硫鍵或共價或穩(wěn)定非共價重鏈間鍵的氨基酸殘基，和 至少一種編碼第二重鏈的核酸構(gòu)建體，其中所述第二重鏈能夠在IVIG存在下或在施 用于哺乳動物或人類時與相同的CH區(qū)形成二硫鍵或共價或穩(wěn)定非共價重鏈間鍵，前提是 所述第二重鏈不是野生型IgG4重鏈， 其中每種所述重鏈能夠與所述輕鏈配對以形成功能性抗體。
5. 依照前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建體 包含編碼SEQ ID N0:5所示的CH3區(qū)的序列，但是其中所述CH3區(qū)經(jīng)過修飾，從而發(fā)生了 一處或多處下述的氨基酸替代：第238位Arg (R)已被Gin (Q)替換；第239位Asp (D)已被 Glu(E)替換；第249位Thr(T)已被Ala(A)替換；第251位Leu(L)已被Ala(A)替換；第 251位Leu (L)已被Val (V)替換；第288位Phe (F)已被Ala (A)替換；第288位Phe (F)已 被Leu (L)替換；第290位Tyr (Y)已被Ala㈧替換；第292位Lys (K)已被Arg (R)替換；第 292位Lys(K)已被Ala(A)替換；第302位Gln(Q)已被Glu(E)替換；和第328位Pro(P) 已被Leu (L)替換。
6. 依照權(quán)利要求5的方法，其中第292位Lys (K)已被Arg (R)替換。
7. 依照前述權(quán)利要求5或6中任一項的方法，其中所述至少一種編碼第一重鏈的核酸 構(gòu)建體進一步包含編碼SEQ ID NO :5所示的CH1和/或CH2區(qū)的序列。
8. 依照前述權(quán)利要求5至7中任一項的方法，其中輕鏈的恒定區(qū)經(jīng)過修飾，使得它不含 有任何能夠在IVIG存在下或在施用于哺乳動物或人類時與相同的恒定區(qū)形成二硫鍵或其 它共價鍵的氨基酸。
9. 依照權(quán)利要求8的方法，其中所述至少一種編碼共同輕鏈的核酸構(gòu)建體包含編碼具 有SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列的kCL區(qū)的序列，但是其中所述序列經(jīng)過修飾，使得第 106位末端半胱氨酸殘基已被另一種氨基酸殘基替換或已被刪除。
10. 依照權(quán)利要求8的方法，其中所述至少一種編碼共同輕鏈的核酸構(gòu)建體包含編碼 具有SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列的λα區(qū)的序列，但是其中所述序列經(jīng)過修飾，使得 第104位半胱氨酸殘基已被另一種氨基酸殘基替換或已被刪除。
11. 依照前述權(quán)利要求5至7中任一項的方法，其中所述重鏈的恒定區(qū)經(jīng)過修飾，使得 它含有能夠與所述輕鏈形成二硫鍵或其它共價鍵的殘基。
12. 依照前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建 體包含編碼SEQ ID NO :5所示的CH1區(qū)的序列，但是其中所述CH1區(qū)經(jīng)過修飾，使得第14 位Ser(S)已被半胱氨酸殘基替換。
13. 依照前述權(quán)利要求1至6中任一項的方法，其中所述至少一種編碼第一重鏈的核酸 構(gòu)建體包含編碼SEQ ID NO :6所示的CH3區(qū)的序列，但是其中所述CH3區(qū)經(jīng)過修飾，從而發(fā) 生了一處或多處下述的氨基酸替代：第234位Arg(R)已被Gin(Q)替換；第245位Thr(T) 已被Ala㈧替換；第247位Leu (L)已被Ala㈧替換；第247位Leu (L)已被Val (V)替換； 第276位Met (M)已被Val (V)替換；第284位Phe (F)已被Ala (A)替換；第284位Phe (F) 已被Leu (L)替換；第286位Tyr (Y)已被Ala㈧替換；第288位Lys (K)已被Arg (R)替換； 第288位Lys (K)已被Ala (A)替換；第298位Gin (Q)已被Glu (E)替換；和第324位Pro (P) 已被Leu (L)替換。
14. 依照權(quán)利要求13的方法，其中第288位Lys (K)已被Arg (R)替換。
15. 依照前述權(quán)利要求13至14中任一項的方法，其中所述至少一種編碼第一重鏈的核 酸構(gòu)建體進一步包含編碼SEQ ID NO :6所示的CH1和/或CH2區(qū)的序列。
16. 依照前述權(quán)利要求1至6中任一項的方法，其中所述至少一種編碼第一重鏈的核酸 構(gòu)建體包含編碼SEQ ID N0:7所示的CH3區(qū)的序列，但是其中所述CH3區(qū)經(jīng)過修飾，從而發(fā) 生了一處或多處下述的氨基酸替代：第285位Arg(R)已被Gin (Q)替換；第296位Thr(T) 已被Ala㈧替換；第298位Leu (L)已被Ala㈧替換；第298位Leu (L)已被Val (V)替換； 第314位Ser (S)已被Asn (N)替換；第322位Asn (N)已被Lys (K)替換；第327位Met (M) 已被Val (V)替換；第335位Phe (F)已被Ala (A)替換；第335位Phe (F)已被Leu (L)替換； 第337位Tyr (Y)已被Ala㈧替換；第339位Lys (K)已被Arg (R)替換；第339位Lys (K) 已被Ala㈧替換；第349位Gin (Q)已被Glu(E)替換；第352位lie (I)已被Val (V)替換； 第365位Arg (R)已被His (H)替換；第366位Phe (F)已被Tyr (Y)替換；和第375位Pro (P) 已被Leu (L)替換。
17. 依照權(quán)利要求16的方法，其中第339位Lys (K)已被Arg (R)替換。
18. 依照前述權(quán)利要求16至17中任一項的方法，其中所述至少一種編碼第一重鏈的核 酸構(gòu)建體進一步包含編碼SEQ ID NO :7所示的CH1和/或CH2區(qū)的序列。
19. 依照前述權(quán)利要求1至6中任一項的方法，其中所述至少一種編碼第一重鏈的核酸 構(gòu)建體包含編碼SEQ ID NO :2所示的CH3區(qū)的序列，但是其中所述CH3區(qū)經(jīng)過修飾，從而發(fā) 生了一處或多處下述的氨基酸替代：第234位Thr(T)已被Ala (A)替換；第236位Leu (L) 已被Ala㈧替換；第236位Leu (L)已被Val (V)替換；第273位Phe (F)已被Ala㈧替換； 第273位Phe (F)已被Leu (L)替換；第275位Tyr (Y)已被Ala (A)替換。
20. 依照前述權(quán)利要求1至6任一項的方法，其中所述至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu) 建體包含編碼SEQ ID NO :2所示的CH3區(qū)的序列。
21. 依照權(quán)利要求20的方法，但是其中第225位Glu(E)已被Ala(A)替換。
22. 依照前述權(quán)利要求20至21中任一項的方法，但是其中第234位Thr(T)已被 Ala㈧替換。
23. 依照前述權(quán)利要求20至22中任一項的方法，但是其中第236位Leu(L)已被 Ala㈧替換。
24. 依照前述權(quán)利要求20至22中任一項的方法，但是其中第236位Leu(L)已被 Val (V)替換。
25. 依照前述權(quán)利要求20至22中任一項的方法，但是其中第236位Leu(L)已被 Glu(E)替換。
26. 依照前述權(quán)利要求20至22中任一項的方法，但是其中第236位Leu(L)已被 Gly(G)替換。
27. 依照前述權(quán)利要求20至26中任一項的方法，但是其中第238位Lys(K)已被 Ala㈧替換。
28. 依照前述權(quán)利要求20至27中任一項的方法，但是其中第267位Asp(D)已被 Ala㈧替換。
29. 依照前述權(quán)利要求20至28中任一項的方法，但是其中第273位Phe(F)已被 Ala㈧替換。
30. 依照前述權(quán)利要求20至28中任一項的方法，但是其中第273位Phe(F)已被 Leu (L)替換。
31. 依照前述權(quán)利要求20至28中任一項的方法，但是其中第273位Phe(F)已被 Asp⑶替換和/或第275位Tyr (Y)已被Glu (E)替換。
32. 依照前述權(quán)利要求20至28中任一項的方法，但是其中第273位Phe(F)已被 Thr (T)替換和/或第275位Tyr (Y)已被Glu (E)替換。
33. 依照前述權(quán)利要求20至30中任一項的方法，但是其中第275位Tyr(Y)已被 Ala㈧替換。
34. 依照前述權(quán)利要求20至33中任一項的方法，其中所述至少一種編碼第一重鏈的 核酸構(gòu)建體進一步包含編碼SEQ ID NO :2所示的CH2區(qū)的序列，但是其中第118位Thr (T) 已被Gin (Q)替換和/或第296位Met (Μ)已被Leu (L)替換。
35. 依照前述權(quán)利要求20至33中任一項的方法，其中所述至少一種編碼第一重鏈的 核酸構(gòu)建體進一步包含編碼SEQ ID NO :2所示的CH2區(qū)的序列，但是其中已發(fā)生了下述替 代中的一處、兩處或所有三處：第120位Met (M)已被Tyr (Y)替換；第122位Ser(S)已被 Thr (T)替換；和第124位Thr (T)已被Glu (E)替換。
36. 依照前述權(quán)利要求20至33中任一項的方法，其中所述至少一種編碼第一重鏈的 核酸構(gòu)建體進一步包含編碼的序列SEQ ID NO :2所示的CH2區(qū)，但是其中第302位Asn(N) 已被Ala㈧替換。
37. 依照前述權(quán)利要求20至33中任一項的方法，其中所述至少一種編碼第一重鏈的核 酸構(gòu)建體進一步包含編碼的序列SEQ ID NO :2所示的CH2區(qū)，但是其中第302位Asn (N)已 被Ala (A)替換且第175位Thr (T)已被Ala (A)替換且第248位Glu (E)已被Ala (A)替換。
38. 依照前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建 體包含編碼如下CH區(qū)的序列，所述CH區(qū)經(jīng)過修飾，使得鉸鏈區(qū)中的所有半胱氨酸殘基已被 刪除或已被其它氨基酸殘基替代。
39. 依照權(quán)利要求38的方法，其中所述CH區(qū)經(jīng)過修飾，使得鉸鏈區(qū)的半胱氨酸殘基已 被具有不帶電荷的極性側(cè)鏈或非極性側(cè)鏈的氨基酸殘基替代。
40. 依照前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建 體包含編碼IgG4 CH區(qū)的序列，其中與SEQ ID No :1之CH序列的氨基酸106和109對應的 氨基酸已被刪除。
41. 依照前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建 體包含編碼IgG4 CH區(qū)的序列，其中與SEQ ID No :1之序列的氨基酸殘基106和109對應 的氨基酸殘基中的一個已被不同于半胱氨酸的氨基酸殘基替代，而與SEQ ID No :1之序列 的氨基酸殘基106和109對應的氨基酸殘基中的另一個已被刪除。
42. 依照前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建 體包含編碼IgG4 CH區(qū)的序列，其中至少與SEQ ID N〇:l之CH序列的氨基酸殘基106至 109對應的氨基酸殘基已被刪除。
43. 依照前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建 體包含編碼IgG4 CH區(qū)的序列，其中至少與SEQ ID No :1之序列的氨基酸殘基99至110對 應的氨基酸殘基已被刪除。
44. 依照前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建 體包含編碼CH區(qū)的序列，所述CH區(qū)除前述權(quán)利要求任一項中規(guī)定的任何突變外，包含SEQ ID No : 2之氨基酸序列。
45. 依照前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建 體包含編碼IgG4 CH區(qū)的序列，其中所述CH區(qū)經(jīng)過修飾，使得整個鉸鏈區(qū)已被刪除。
46. 依照前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建 體包含編碼CH區(qū)的序列，所述CH區(qū)經(jīng)過修飾，使得它不包含任何供N-連接糖基化的受體 位點。
47. 依照權(quán)利要求46的方法，其中所述CH2區(qū)中供N-連接糖基化的NST受體位點已被 修飾成選自下組的序列：GST，MST，CSE，DSE，DSP，ESP，GSP，HSE，NSE，PSP 和 SSE。
48. 依照權(quán)利要求1或權(quán)利要求3至47中任一項的方法，其中所述第二重鏈是IgGl、 IgG2、IgG3或穩(wěn)定化IgG4重鏈或IgA，優(yōu)選IgGl重鏈。
49. 依照前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述混合物中的至少一種、至少兩種、例 如所有抗體是人抗體。
50. 依照前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中生成三種或更多種不同抗體的混合物、諸 如四種或更多種不同抗體的混合物、例如五種或更多種不同抗體的混合物。
51. 依照前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中生成不到20種不同抗體的混合物。
52. 依照前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述宿主細胞包含超過一種編碼輕鏈的 核酸構(gòu)建體，優(yōu)選其中每種所述重鏈能夠與每種所述輕鏈配對以形成功能性抗體。
53. 依照前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述混合物的所有抗體針對同一靶物。
54. 依照權(quán)利要求53的方法，其中所述混合物的抗體不競爭對所述靶物的結(jié)合。
55. 依照權(quán)利要求1至52中任一項的方法，其中所述混合物中的兩種或更多種抗體針 對不同靶物。
56. 依照前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述方法包括將所述宿主細胞培養(yǎng)至少 20個群體倍增。
57. 依照前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述方法進一步包括從所述細胞培養(yǎng)物 收獲所述混合物的步驟。
58. 依照前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述方法進一步包括純化所述抗體混合 物的步驟。
59. 依照前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述宿主細胞是哺乳動物細胞，諸如CH0 細胞。
60. 依照前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述共同輕鏈包含SEQ ID NO :8所示的 序列。
61. 依照權(quán)利要求60的方法，其中所述共同輕鏈進一步包含選自下組的序列：SEQ ID NO :9,10和11，諸如包含選自下組的序列的共同輕鏈：SEQ ID NO :12，13和14。
62. 依照前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述核酸穩(wěn)定整合入所述宿主細胞的基 因組。
63. -種組合物，其包含可通過前述權(quán)利要求中任一項的方法獲得的抗體混合物。
64. 依照權(quán)利要求63的組合物，其用作藥物。
65. -種適合于在生成包含兩種或更多種不同抗體的混合物中使用的重組宿主細胞， 其中所述宿主細胞包含： a) 至少一種編碼共同輕鏈的核酸構(gòu)建體，和 b) 兩種或更多種編碼重鏈的核酸構(gòu)建體，所述兩種或更多種核酸構(gòu)建體包含 bl)兩種或更多種編碼兩種或更多種不同的第一重鏈的核酸構(gòu)建體，其中所述第一重 鏈的每個恒定區(qū)的氨基酸序列經(jīng)過修飾，使得鉸鏈區(qū)及如免疫球蛋白亞型所要求的CH區(qū) 的其它區(qū)域，諸如CH3區(qū)，不含有任何能夠在IVIG存在下或在施用于哺乳動物或人類時與 相同的CH區(qū)形成二硫鍵或共價或穩(wěn)定非共價重鏈間鍵的氨基酸殘基， 或 b2)至少一種編碼第一重鏈的核酸構(gòu)建體，其中恒定區(qū)的氨基酸序列經(jīng)過修飾，使得鉸 鏈區(qū)及如免疫球蛋白亞型所要求的CH區(qū)的其它區(qū)域，諸如CH3區(qū)，不含有任何能夠在IVIG 存在下或在施用于哺乳動物或人類時與相同的CH區(qū)形成二硫鍵或共價或穩(wěn)定非共價重鏈 間鍵的氨基酸殘基，和 至少一種編碼第二重鏈的核酸構(gòu)建體，所述第二重鏈能夠在IVIG存在下或在施用于 哺乳動物或人類時與相同的CH區(qū)形成二硫鍵或共價或穩(wěn)定非共價重鏈間鍵。
66. 依照權(quán)利要求65的宿主細胞，其中所述宿主細胞是哺乳動物細胞，諸如CHO細胞。
67. -種包含重鏈和輕鏈的重組抗體，其中所述輕鏈包含SEQ ID NO :8所示的序列。
68. 依照權(quán)利要求67的抗體，其中所述輕鏈進一步包含選自下組的序列：SEQ ID NO: 9,10和11，諸如包含選自下組的序列的輕鏈：SEQ ID NO :12，13和14。
69. 依照權(quán)利要求67或68的抗體，其中所述抗體是雙特異性抗體。
70. 依照權(quán)利要求67或68的抗體，其中所述抗體是單價抗體。
71. 依照權(quán)利要求67或68的抗體，其中所述抗體是多克隆抗體，諸如多克隆二價抗體 或多克隆單價抗體。
72. 依照權(quán)利要求67至68任一項的抗體，其用作藥物，諸如用于治療癌癥的藥物。
【文檔編號】C07K16/32GK104262483SQ201410421605
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2010年1月26日 優(yōu)先權(quán)日:2009年1月26日
【發(fā)明者】P.帕倫, J.J.尼杰森, A.F.拉布里杰恩, J.舒爾曼, T.文克, J.范德溫克爾, S.洛夫里克斯, I.拉斯特斯 申請人:根馬布股份公司