專利名稱：生物合成產(chǎn)生的吡咯啉-羧基-賴氨酸以及通過吡咯啉-羧基-賴氨酸和吡咯賴氨酸殘基化 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將遺傳編碼的氨基酸選擇性地弓丨入蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及此類氨基酸的化學(xué)衍生化。
背景技術(shù)：
甲烷八疊球菌科(Methanosarcina)的產(chǎn)甲烷古細菌的甲胺甲基轉(zhuǎn)移酶天然含有吡咯賴氨酸(PYL)。吡咯賴氨酸是共翻譯地摻入各mRNA中閱讀框內(nèi)UAG密碼子的賴氨酸類似物，并且其被認為是第22種天然氨基酸。


圖1.吡咯賴氨酸(PYL)和吡咯賴氨酸類似物吡咯啉-羧基-賴氨酸(PCL =PCL-A 或PCL-B)的結(jié)構(gòu)。圖2.吡咯賴氨酸㈧和PCL(B)的可能的生物合成途徑的比較。圖3.用吡咯賴氨酸㈧和PCL(B)對pylTtRNA的氨?；?。圖4A.攜帶有用于在哺乳動物細胞中摻入生物合成衍生的PCL或吡咯賴氨酸的 pylT、pylS、pylB、pylC和pylD的質(zhì)粒，以及攜帶有模式蛋白hRBP4的單位點TAG突變基因構(gòu)建物的質(zhì)粒。圖4B. hRBP4、mEPO、hEPO和mlgGl的單位點TAG突變基因構(gòu)建物。通過箭頭指出了所述單位點。圖5.攜帶有用于在大腸桿菌(Escherichia coli)細胞中摻入生物合成衍生的 PCL或吡咯賴氨酸的pylT、pylS、pylB、pylC和pylD的質(zhì)粒。圖 6A.在 HEK293F 細胞中表達 hRBP4。hRBP4 的 TAG 突變構(gòu)建物(#1-9)。SDS-PAGE 之后用抗His抗體進行蛋白質(zhì)印跡。^kDa處的箭頭指示全長hRBP4。圖6B和6C.在D-鳥氨酸的存在下在HEK293F細胞中產(chǎn)生的純化的hRBP4Wie62PCL 的 SDS-PAGE (A)和質(zhì)譜(B)。圖7. hRBP4Phel22PCL的胰蛋白酶消化的質(zhì)譜分析表明在靶Wiel22TAG位點摻入 7 PCL0 YffGVASF * LQK (F * = PCL) (SEQ IDNO 17)的指定 MS/MS 譜。圖8. hRBP4Phel22PCL的胰蛋白酶消化的質(zhì)譜光譜測定分析(YWGVASF * LQK的2+ 離子的TIC和EIC) (SEQ ID NO 17)表明在靶Phel22TAG位點摻入了 PCL0圖9. hRBP4Phe 122PCL的胰蛋白酶消化的質(zhì)譜分析。該質(zhì)譜顯示了 YWGVASF *
24LQK(SEQ ID NO 17)的3+和2+前體，表明在靶Phel22TAG位點摻入了 PCL0圖10.在HEK293F細胞的裂解產(chǎn)物中檢測從D-鳥氨酸生物合成的PCL。圖11.在HEK293F細胞中，N-ε-環(huán)戊基氧基羰基-L-賴氨酸(CYC)摻入各種 hRBP4TAG突變蛋白質(zhì)中。圖IlA顯示了 CYC在hRBP4中不同位點的摻入，如通過SDS-PAGE 和用抗-Hig-標簽及抗-RBP4抗體的蛋白質(zhì)印跡法所檢測的那樣。圖IlB顯示了純化的 hRBP4Phe62CYC (突變體 #2)的 SDS-PAGE 結(jié)果。圖 IlC 顯示了 hRBP4Phe62CYC 的質(zhì)譜。圖12.在hRBP4突變體Phe62CYC的TAG位點摻入CYC的質(zhì)譜驗證。圖13.作為各種前體的函數(shù)的PCL摻入，以及應(yīng)用HEK293F細胞將各種吡咯賴氨酸類似物(包括CYC)直接摻入hRBP4TAG突變蛋白中(圖13A和圖13B)，以及應(yīng)用生物合成基因pylB、pylC和pylD的不同組合的PCL摻入(圖13C)。圖13A是使用了抗-His-標簽抗體的未純化樣品的蛋白質(zhì)印跡，且圖13B是Ni-NTA純化的蛋白質(zhì)的SDS-PAGE凝膠。圖14. PCL生物合成的可能前體㈧，以及各種吡咯賴氨酸類似物⑶。圖15.用于在HK100細胞中將PCL摻入FASTE的各種前體和基因組合的評估。圖16. PCL(PCL-A)形成的可能生物合成流程。圖17A.生物合成產(chǎn)生的PCL在小鼠IgGlFc結(jié)構(gòu)域中單TAG編碼位點G個位點) 的位點特異性摻入。圖17B.生物合成產(chǎn)生的PCL在促紅細胞生成素(EPO)中單TAG編碼位點(11個位點)的位點特異性摻入，通過SDS-PAGE所檢測。圖18.生物合成產(chǎn)生的PCL在人脂肪酸合成酶(FAS-TE)硫酯酶結(jié)構(gòu)域中單TAG編碼位點O個位點)的位點特異性摻入。圖18顯示了 SDS-PAGE(A)和PCL摻入的質(zhì)譜(B)。圖19.生物合成產(chǎn)生的PCL在FKBP-12中的單TAG編碼位點(1個位點)的位點特異性摻入。圖19顯示了 SDS-PAGE(A)和PCL摻入的質(zhì)譜(B)，以及FKBP12-I90PCL的晶體(C)。圖20.生物合成產(chǎn)生的PCL在成纖維細胞生長因子21 (FGF21)中的單TAG編碼位點(20個位點)的位點特異性摻入。SDS-PAGE顯示了 PCL在多個位點摻入FGF21中。圖21.圖21A顯示了在pylB存在或不存在下，Pl或PCL摻入谷氨酰胺 Gln21 (CAA)突變?yōu)門AG終止密碼子的mTNF- α的SDS-PAGE分析。圖2IB是評估蛋白質(zhì)純度的SDS-PAGE。圖21C是在大腸桿菌中表達的mEGF TyrlOTAG的完整質(zhì)譜，提示了具有摻入的(圖21C，底部)并且主要是PCL(圖21C，頂部)的蛋白質(zhì)的混合物。圖22.用2-氨基-苯甲醛對PCL化學(xué)衍生的可能反應(yīng)流程。圖23.用2-氨基苯甲醛、2-氨基苯乙酮和2-氨基-5-硝基-二苯甲酮衍生化PCL 后的假設(shè)的蛋白質(zhì)綴合物及質(zhì)量改變。圖24. 2-氨基-苯甲醛Q-ABA)衍生的hRBP4Phel22PCL的質(zhì)譜分析。圖25. 2-ABA-衍生的hRBP4Wiel22PCL蛋白質(zhì)的胰蛋白酶消化的質(zhì)譜分析證實了在TAG位點摻入PCL殘基的衍生化。YffGVASF * LQK肽(SEQ ID NO 17)。圖26.用2-ABA衍生化hRBP4Wiel22PCL的pH依賴性的評估。圖27.評估作為反應(yīng)物與蛋白質(zhì)濃度比的函數(shù)的反應(yīng)效率、以及與2-ABA、2_ANBP 和2-AAP反應(yīng)性。圖28.以大于4700的摩爾比(A :2_ABA超過蛋白質(zhì)4700倍)以及摻入有OMePhe的hRBP4(B 超過15400倍)的衍生化。圖29.用2-氨基-苯乙酮Q-AAP)對FAS-TE Tyr2454PCL的衍生化。未處理的樣品(A和C)以及在pH 5. O(B)和pH 7.4(D)用2-AAP衍生的樣品的質(zhì)譜。圖30.通過用2-氨基-苯甲醛或2-氨基-苯甲醛類似物化學(xué)衍生化吡咯賴氨酸和/或PCL，從而位點特異性修飾蛋白質(zhì)的一般反應(yīng)流程。圖31.通過摻入蛋白質(zhì)的PCL殘基將功能化PEG聚合物2-氨基-苯乙酮-PEG8 (2-AAP-PEG8 ；TU3205-044)偶聯(lián)至蛋白質(zhì)的實施方案的圖示說明。圖 32.用 2-AAP-PEG8 衍生化 hRBP4Phel22PCL。在 pH 7. 5 (A)禾口 pH 5. 0 (B)用 2-AAP-PEG8衍生化后，122位摻入了 PCL的hRBP4的質(zhì)譜，與未反應(yīng)的hRBP4Wiel22PCL蛋白質(zhì)(C)以及添加了 2-AAP-PEG8的野生型hRBP4(D和E)和未添加2-AAP-PEG8的野生型 hRBP4相比較。圖33.用2-AAP-PEG8對FAS-TE Tyr2454PCL的衍生化。未反應(yīng)的蛋白(A)以及與 2-AAP-PEG8 (TU3205-044)反應(yīng)的 FAS-TE Tyr2454PCL 蛋白(B)的質(zhì)譜。圖 33C 和 33D 顯示了 2.4kDa 2-AAP-PEG (TU3205-048)對 FAS-TE Tyr2454PCL 的衍生化。(圖 33C 在室溫下衍生化，而圖33D在4°C衍生化)。圖 34.用 0. 5kDa 2-AAP-PEG (2-AAP-PEG8)、2. 4kDa 2-AAP-PEG 禾口 23kDa 2-AAP-PEG以所示摩爾比對FAS-TE Tyr2454PCL的聚乙二醇化。圖 35.用 2-AAP-PEG8 對 FGF21Lys81PCL 的衍生化。未反應(yīng)的 reF21Lys84PCL (A) 和在用2-AAP-PEG8衍生化后的FGF21Lys84PCL(B)的質(zhì)譜。圖36. FGF21蛋白質(zhì)的聚乙二醇化。在用23kDa 2-AAP-PEG對7種FGF21PCL突變體衍生化后獲得的SDS-PAGE結(jié)果顯示了部分純化之前(A)和之后(B)的PEG-FGF21、全長 (FL) FGF21-PCL 和截短的(TR) FGF21-PCL。圖37. EPO蛋白的聚乙二醇化。用23kDa 2_AAP_PEG對小鼠EPOPCL突變體衍生化后的 SDS-PAGE。圖38.用氨基糖對PCL的衍生化。其中將D-甘露糖胺與其中摻入了 PCL的蛋白質(zhì)(圖示為R1)偶聯(lián)的一般反應(yīng)流程。圖39.用D-甘露糖胺對hRBP4Wiel22PCL的衍生化。在與甘露糖胺反應(yīng)后，在122 位摻入了 PCL的hRBP4的質(zhì)譜。圖40.用D-甘露糖胺對FAS-TE Leu2222PCL的衍生化。在2222位置摻入了 PCL 的未反應(yīng)的人脂肪酸合成酶(FAS-TE) (FAS-TE Leu2222PCL/Leu2223Ile) (A)，以及與甘露糖胺反應(yīng)的蛋白質(zhì)⑶的質(zhì)譜。圖41.通過使與寡糖連接的2-ABA部分與摻入蛋白質(zhì)的PCL反應(yīng)，從而將寡糖位點特異性地與蛋白質(zhì)連接的實施方案的圖示說明。圖42.通過交聯(lián)具有摻入其中的PCL的蛋白質(zhì)從而形成的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)綴合物 (異源二聚體、異源三聚體、同源三聚體)的某些實施方案的圖示說明。圖43.使用PCL特異性、雙官能交聯(lián)劑的同源二聚體形成，如對FGF21Lys84PCL蛋白所描述的那樣。用于形成同源二聚體的雙官能交聯(lián)劑的非限制性實例顯示于A中，以及應(yīng)用該雙官能交聯(lián)劑交聯(lián)的FGF-21Lys84PCL的反應(yīng)混合物的質(zhì)譜顯示于B中。圖44.使用雙官能交聯(lián)劑形成FGF-21PCL突變體蛋白的同源二聚體。圖44A顯示了交聯(lián)的FGF-21的質(zhì)譜，其中該反應(yīng)條件與在圖43中使用的那些有所改變。圖45.用于形成三聚體的交聯(lián)劑的實施方案。圖46.位點特異性標簽和應(yīng)用本文提供的方法標記的各實施方案的圖示說明。圖47.圖47A顯示了與生物素綴合的mEGF-Y10PCL的ESI質(zhì)譜分析。圖47B顯示了應(yīng)用辣根過氧化物酶(HRP)綴合的山羊抗生物素抗體對mEGF-Y10PCL-ABA-生物素綴合物進行蛋白質(zhì)印跡分析。圖47C顯示了與熒光素綴合的mEGF-Y10PCL的ESI質(zhì)譜分析。圖 47D顯示了與二糖綴合的mEGF-Y10PCL的ESI質(zhì)譜分析。圖48.圖48A顯示了與單-硝基苯基半抗原綴合的mTNF-Q21PCL的ESI質(zhì)譜分析。 圖48B顯示了與單-硝基苯基半抗原綴合的mEGF-Y10PCL的ESI質(zhì)譜分析。圖48C顯示了與二 -硝基苯基半抗原綴合的mTNF-Q21PCL的ESI質(zhì)譜分析。圖48D顯示了與二 -硝基苯基半抗原綴合的mEGF-Y10PCL的ESI質(zhì)譜分析。圖49.圖49A顯示了與TLR7激動劑綴合的mEGF-YlOPCL的ESI質(zhì)譜分析，圖49B 顯示了與磷脂綴合的mEGF-Y10PCL的ESI質(zhì)譜分析。圖50.圖50A和圖50B顯示了在兩種不同的pH值(圖50A :ρΗ 5. 0 ；圖50B pH 7. 5)與 PX2-PADRE 綴合的 mTNF_Q21PCL 的 MALDI-T0F 質(zhì)譜分析。圖 50C 顯示了與 BHA-exPADRE 綴合的 mTNF_Q21PCL 的 ESI 質(zhì)譜分析。圖 51.圖 51 是顯示了 BHA-exPADRE 與 mEGF-Y10PCL 偶聯(lián)的 ESI 質(zhì)譜。圖 52.圖 52A 是 BHA-BGl (7. 4kDa)禾口 BHA-BG2 (7. 4kDa)偶聯(lián)至 mTNF-Q21PCL(19. 3kDa)的凝膠移動測試。圖 52B 是 BHA-BG2 (7. 4kDa)偶聯(lián)至 mEGF-Y10PCL(7. 2kDa)的凝膠移動測試。圖53.圖53圖示了此類位點特異性定向連接的實施方案。圖54.圖54A顯示了與2-ABA偶聯(lián)并隨后用20mM NaCNBH3還原1小時的 hFGF21-K150PCL的ESI質(zhì)譜分析。圖54B顯示了透析至IOmM磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)中并在50°C溫育一天后的還原h(huán)FGF21-K150PCL2-ABA綴合物的ESI質(zhì)譜分析。圖55.圖55說明了應(yīng)用NaCNBH3還原或不用其還原的聚乙二醇化FGF21的PCL連接的穩(wěn)定性。還原樣品和未還原樣品的SDS-PAGE凝膠顯示于圖55A。此外，圖55B顯示了在4°C、室溫、37°C、50°C以及95°C溫育60小時的未還原樣品的SDS-PAGE凝膠。圖56. PCL-A與2-ABA反應(yīng)的匪R分析。圖57.圖57A是PCL-A與2-ABA反應(yīng)得到的產(chǎn)物的推定結(jié)構(gòu)。圖57B顯示了 PCL-A 與2-ABA反應(yīng)得到的產(chǎn)物的推定平衡結(jié)構(gòu)。圖57C是還原產(chǎn)物的推定結(jié)構(gòu)。圖58. PCL-B與2-ABA反應(yīng)的匪R分析。圖59.摻入mEGF中的吡咯賴氨酸(Pyl)和PCL的衍生化。發(fā)明_既述本文提供了具有一個或多個摻入其中的PCL的蛋白質(zhì)和/或多肽，其中所述PCL 是生物合成產(chǎn)生的并且摻入該蛋白質(zhì)和/或多肽中。本文還提供了具有一個或多個摻入其中的吡咯賴氨酸(PYL)的蛋白質(zhì)和/或多肽，其中所述Pl是生物合成產(chǎn)生的并且摻入該蛋白質(zhì)和/或多肽中。本文還提供了具有一個或多個摻入其中的PCL以及一個或多個摻入其中的Pl的蛋白質(zhì)和/或多肽，其中所述PCL和Pl是生物合成產(chǎn)生的并且摻入蛋白質(zhì)和/或多肽中。
本文還提供了具有一個或多個PCL部分的蛋白質(zhì)和/或多肽，其中所述PCL是生物合成產(chǎn)生的并且摻入蛋白質(zhì)和/或多肽中，并且一個或多個PCL部分被衍生化，由此使選自以下的基團偶聯(lián)至該蛋白質(zhì)和/或多肽標記物、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚烷基二醇、聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、糖、脂類、光交聯(lián)劑、細胞毒性化合物、藥物、親和標記物、光親和標記物、反應(yīng)性化合物；樹脂、肽、另一種蛋白質(zhì)或多肽或多肽類似物、抗體或抗體片段、金屬螯合劑、輔因子、脂肪酸、碳水化合物、多核苷酸、DNA、RNA、PCR探針、反義多核苷酸、核糖寡核苷酸、脫氧核糖寡核苷酸、硫代磷酸酯(phosphorothioate)-修飾的DNA、修飾的DNA和RNA、肽核酸、糖類、二糖、寡糖、多糖、水溶性樹枝狀聚合物(dendrimer)、環(huán)糊精、生物材料、納米顆粒、自旋標記物、熒光團、含金屬的部分(moiety)、放射性部分、新官能團、與其他分子共價或非共價相互作用的基團、光籠獲(Photocaged)部分、可光化輻射激發(fā)的部分、配體、可光異構(gòu)化的部分、生物素、生物素類似物、摻有重原子的部分、化學(xué)可裂解基團、光可裂解基團、長側(cè)鏈、碳連接的糖、氧化還原活化劑、氨基硫代酸、毒性部分、同位素標記的部分、生物物理探針、磷光基團、發(fā)色團、化學(xué)發(fā)光基團、熒光部分、電子致密基團、磁性基團、嵌入(intercalating)基團、螯合基團、生色團、能量轉(zhuǎn)移劑、生物活性劑、可檢測標記物、小分子、抑制性核糖核酸、siRNA、放射性核苷酸、中子俘獲劑、生物素衍生物、 量子點、納米遞質(zhì)、放射性遞質(zhì)、抗體酶、酶、活化的復(fù)合活化劑(complex activator)、病毒、毒素、佐劑、TLR2激動劑、TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR9激動劑、TLR8激動劑、T-細胞表位、磷脂、LPS-樣分子、鑰孔血藍蛋白(KLH)、免疫原性半抗原、aglycan、變應(yīng)原、制管張素(angiostatin)、抗激素藥、抗氧化劑、適體、指導(dǎo)RNA、皂角苷、穿梭載體、大分子、模擬表位、受體、反膠束、洗滌劑、免疫反應(yīng)增效劑、熒光染料、FRET試劑、放射成像探針、其他的光譜學(xué)探針、藥物前體、用于免疫治療的毒素、固體支持物、-C02Ch2-(OCH2CH2O)P-0X2、以及-0-(CH2CH2O)PCH2CH2-X2(其中ρ是1至10，000,且X2是H、C1^8烷基、保護基團或末端官能團)。在某些實施方案中，此類蛋白質(zhì)和/或多肽具有一個或多個摻入其中的PYL部分， 其中所述PYL是生物合成產(chǎn)生的并且摻入所述蛋白質(zhì)和/或多肽中，該吡咯賴氨酸被衍生化，從而使上文為具有一個或多個摻入其中的PCLl部分的蛋白質(zhì)和/或多肽給出的上述基團之一偶聯(lián)至該蛋白質(zhì)和/或多肽。在某些實施方案中，此類蛋白質(zhì)和/或多肽具有摻入其中的一個或多個PCL和一個或多個Pl部分，其中所述PCL和Pl是生物合成產(chǎn)生的并且摻入所述蛋白質(zhì)和/或多肽中，該PCL和吡咯賴氨酸被衍生化，從而使上文為具有一個或多個摻入其中的PCLl部分的蛋白質(zhì)和/或多肽給出的上述基團之一偶聯(lián)至該蛋白質(zhì)和/或多肽。在某些實施方案中，上述生物合成發(fā)生在真核細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞或昆蟲細胞中。在某些實施方案中，所述細胞是大腸桿菌細胞，而在其他實施方案中，酵母細胞是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或Pichia pastoralis細胞。在某些實施方案中，所述細胞是CHO細胞、HeLa細胞、HEK293F細胞或sf9細胞。本文提供的一個方面是具有式(I)或式(II)結(jié)構(gòu)的化合物R1-(AA)n-R2 R1-(BB)n-R2(I)(II)其中，
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R1是H或氨基末端修飾基團；R2是OH或羧基末端修飾基團；η是1至5000的整數(shù)；每一個AA獨立地選自氨基酸殘基、具有式(A-幻結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基以及具有式￠- 結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基；每一個BB獨立地選自氨基酸殘基、具有式(A-幻結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物、具有式(B-2)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(C-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(D-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(E-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(F-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(G-I) 結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(H-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(1-1)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(J-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(K-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基以及具有式(L-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基；
權(quán)利要求
1.具有式(I)或式(II)結(jié)構(gòu)的化合物 R1-(AA)n-R2 R1-(BB)n-R2其中R1是H或氨基末端修飾基團； &是OH或羧基末端修飾基團； n是1至5000的整數(shù)；每一個AA獨立地選自氨基酸殘基、具有式(A-幻結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基以及具有式(Β-2)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基；每一個BB獨立地選自氨基酸殘基、具有式(Α-2)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(Β-2)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(C-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(D-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(E-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(F-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(G-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(H-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(I-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(J-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(K-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基以及具有式 (L-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基；
2.權(quán)利要求1的化合物，其中環(huán)A選自呋喃、噻吩、吡咯、吡咯啉、吡咯烷、二氧戊環(huán)、 唑、噻唑、咪唑、咪唑啉、咪唑烷、批唑、批唑啉、批唑烷、異巧悉唑、異噻唑、巧惡二唑、三唑、噻二唑、吡喃、吡啶、哌啶、二Wf烷、嗎啉、二噻烷、硫嗎啉、噠嗪、嘧啶、吡嗪、哌嗪、三嗪、三噻烷、吲嗪、吲哚、異吲哚、吲哚啉、苯并呋喃、苯并噻吩、吲唑、苯并咪唑、苯并噻唑、嘌呤、喹嗪、喹啉、異喹啉、噌啉、酞嗪、喹唑啉、喹喔啉、萘啶、蝶啶、奎寧環(huán)、咔唑、吖啶、吩嗪、吩噻嗪、吩13惡嗪、苯基、茚、萘、甘菊環(huán)、芴、蒽、菲、降冰片烷和金剛烷。
3.權(quán)利要求1的化合物，其中環(huán)A選自苯基、萘和吡啶。
4.權(quán)利要求1的化合物，其中每一個BB獨立地選自氨基酸殘基、具有式(A-幻結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式￠- 結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(C-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(D-2)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(E-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(F-2)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(G-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(H-2) 結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(I-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(J-2)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(K-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基以及具有式(L-幻結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基；
5.權(quán)利要求1-4任一項的化合物，其中&是H。
6.權(quán)利要求1-4任一項的化合物，其中&是C1烷基。
7.權(quán)利要求1-6任一項的化合物，其中R7是-LX1。
8.權(quán)利要求7的化合物，其中X1是糖、聚乙二醇、熒光部分、免疫調(diào)節(jié)劑、核糖核酸、脫氧核糖核酸、蛋白質(zhì)、肽、生物素、磷脂、TLR7激動劑、免疫原性半抗原或固體支持物。
9 權(quán)利要求8的化合物，其中L是聚烷基二醇、聚乙二醇、C"亞烷基、鹵素取代的-CV8 亞烷基或羥基取代的-Cp8亞烷基。
10.用于衍生化蛋白質(zhì)的方法，其中所述蛋白質(zhì)具有根據(jù)式(I)的結(jié)構(gòu)，所述方法包括使所述蛋白質(zhì)與式(III)或式(IV)的試劑接觸；其中式(I)相應(yīng)于R1-(AA)n-R2 (I)其中，R1是H或氨基末端修飾基團； &是OH或羧基末端修飾基團； n是1至5000的整數(shù)；每一個AA獨立地選自氨基酸殘基、吡咯賴氨酸氨基酸殘基、具有式(A-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基以及具有式(B-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基；
11.權(quán)利要求10的方法，其中式(A-I)的氨基酸殘基是具有式(Α-2)或式(Α-3)結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基
12.權(quán)利要求11的方法，其中式(B-I)的氨基酸殘基是具有式(Β-2)或式(Β-3)結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基
13.權(quán)利要求12的方法，其中式(A-I)的氨基酸殘基是式(V)的氨基酸的殘基，且式 (B-I)的氨基酸殘基是式(VI)的氨基酸的殘基
14.權(quán)利要求13的方法，其中式(V)或式(VI)的氨基酸是在包含pylC基因和pylD基因的細胞內(nèi)生物合成產(chǎn)生的，并且所述細胞與包含前體的生長培養(yǎng)基接觸。
15.權(quán)利要求13的方法，其中式(V)或式(VI))的氨基酸是在包含pylB基因、pylC基因和pylD基因的細胞內(nèi)生物合成產(chǎn)生的，并且所述細胞與包含前體的生長培養(yǎng)基接觸。
16.權(quán)利要求14或權(quán)利要求15的方法，其中式(V)的氨基酸是具有式(VII)結(jié)構(gòu)的氨
17.權(quán)利要求14或權(quán)利要求15的方法，其中式(VI)的氨基酸是具有式(VIII)結(jié)構(gòu)的氨基酸，
18.權(quán)利要求14或權(quán)利要求15的方法，其中式(V)的氨基酸是具有式(IX)結(jié)構(gòu)的氨基酸
19.權(quán)利要求14或權(quán)利要求15的方法，其中式(V)的氨基酸是具有式(X)結(jié)構(gòu)的氨基酸
20.權(quán)利要求14-20中任一項的方法，其中式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VII)、式(IX) 或式(X)的氨基酸在細胞內(nèi)通過正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)摻入蛋白質(zhì)中，其中所述O-RS用式(V)或式(VI)的氨基酸氨?；?tRNA，并且Ο-tRNA識別細胞內(nèi)mRNA的至少一個選擇密碼子。
21.權(quán)利要求14-20中任一項的方法，其中所述細胞還包含pylS基因和pylT基因，并且式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VII)、式(IX)或式(X)的氨基酸在細胞內(nèi)通過氨?；鵷RNA 合成酶和在細胞內(nèi)識別mRNA中至少一個選擇密碼子的tRNA摻入蛋白質(zhì)中，其中所述氨?；鵷RNA合成酶是pylS基因的基因產(chǎn)物并且所述tRNA是pylT基因的基因產(chǎn)物。
22.權(quán)利要求20或權(quán)利要求21的方法，其中所述選擇密碼子是TAG琥珀密碼子。
23.權(quán)利要求14-22中任一項的方法，其中所述細胞是原核細胞。
24.權(quán)利要求14-22中任一項的方法，其中所述細胞是真核細胞。
25.權(quán)利要求23的方法，其中所述細胞是大腸桿菌細胞。
26.權(quán)利要求對的方法，其中所述細胞是哺乳動物細胞、酵母細胞或昆蟲細胞。
27.權(quán)利要求沈的方法，其中所述哺乳動物細胞是CHO細胞、HeLa細胞或HEK293F細胞。
28.權(quán)利要求沈的方法，其中所述昆蟲細胞是sf9細胞。
29.權(quán)利要求10-28中任一項的方法，其中所述衍生化的蛋白質(zhì)具有根據(jù)式(II)的結(jié)構(gòu)R1-(BB)n-R2(II)其中R1是H或氨基末端修飾基團； &是OH或羧基末端修飾基團； n是1至5000的整數(shù)每一個BB獨立地選自氨基酸殘基、具有式(A-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(B-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(C-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(D-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(E-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(F-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(G-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(H-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(I-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(J-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(K-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基以及具有式 (L-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基；
30.權(quán)利要求四的方法，其中環(huán)A選自呋喃、噻吩、吡咯、吡咯啉、吡咯烷、二氧戊環(huán)、唑、噻唑、咪唑、咪唑啉、咪唑烷、批唑、批唑啉、批唑烷、異巧悉唑、異噻唑、巧惡二唑、三唑、噻二唑、吡喃、吡啶、哌啶、烷、嗎啉、二噻烷、硫嗎啉、噠嗪、嘧啶、吡嗪、哌嗪、三嗪、三噻烷、 吲嗪、吲哚、異吲哚、吲哚啉、苯并呋喃、苯并噻吩、吲唑、苯并咪唑、苯并噻唑、嘌呤、喹嗪、喹啉、異喹啉、噌啉、酞嗪、喹唑啉、喹喔啉、萘啶、蝶啶、奎寧環(huán)、咔唑、吖啶、吩嗪、吩噻嗪、吩氣惡嗪、苯基、茚、萘、甘菊環(huán)、芴、蒽、菲、降冰片烷和金剛烷。
31.權(quán)利要求四的方法，其中環(huán)A選自苯基、萘基和吡啶基。
32.權(quán)利要求四的方法，其中每一個BB獨立地選自氨基酸殘基、具有式(A-幻結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式￠- 結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(C-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(D-2)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(E-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(F-2)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(G-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(H-2) 結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(I-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(J-2)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基、具有式(K-I)結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基以及具有式(L-幻結(jié)構(gòu)的吡咯賴氨酸類似物氨基酸殘基
33.權(quán)利要求10-33中任一項的方法，其中&是H。
34.權(quán)利要求10-33中任一項的方法，其中&是C1烷基。
35.權(quán)利要求10-35中任一項的方法，其中R7是-LX1。
36.權(quán)利要求35的方法，其中X是糖、聚乙二醇、熒光部分、核糖核酸、脫氧核糖核酸、蛋白質(zhì)、磷脂、TLR7激動劑、免疫原性半抗原或固體支持物。
37.權(quán)利要求36的方法，其中L是聚烷基二醇、聚乙二醇、C"亞烷基、鹵素取代的-CV8 亞烷基或羥基取代的-Cp8亞烷基。
38.權(quán)利要求10-37中任一項的方法，其中式(IV)的試劑是
39.權(quán)利要求38的方法，其中L是鍵且X1是聚乙二醇。
40.權(quán)利要求10-39中任一項的方法，其中式(IV)的試劑選自
41.具有式(VII)或式(VIII)結(jié)構(gòu)的化合物
42.權(quán)利要求41的化合物，其中所述細胞包含pylB基因、pylC基因和pylD基因。
43.權(quán)利要求41或權(quán)利要求42的化合物，其中所述前體是D-鳥氨酸、D-精氨酸、 (2S)-2-氨基-6-(2，5-二氨基戊酰氨基)己酸或(2S)-2-氨基-6-((R)-2，5-二氨基戊酰氨基)己酸。
44.權(quán)利要求41或權(quán)利要求42的化合物，其中所述前體是D-鳥氨酸或D-精氨酸。
45.權(quán)利要求41-44中任一項的化合物，其中所述式(VII)或式(VIII)的化合物在細胞內(nèi)通過正交tRNA(O-tRNA)和正交氨?；鵷RNA合成酶(O-RS)摻入蛋白質(zhì)中，其中所述 O-RS用式(V)或式(VI)化合物氨?；?tRNA，并且0_tRNA識別細胞內(nèi)mRNA的至少一個選擇密碼子。
46.權(quán)利要求41-44中任一項的化合物，其中所述細胞還包含pylS基因和pylT基因， 并且所述式(V)或式(VI)的化合物在細胞內(nèi)通過氨?；鵷RNA合成酶和在細胞內(nèi)識別mRNA 中至少一個選擇密碼子的tRNA摻入蛋白質(zhì)中，其中所述氨?；鵷RNA合成酶是pylS基因的基因產(chǎn)物并且所述tRNA是pylT基因的基因產(chǎn)物。
47.權(quán)利要求45或權(quán)利要求46的化合物，其中所述選擇密碼子是TAG琥珀密碼子。
48.權(quán)利要求41-47中任一項的化合物，其中所述細胞是原核細胞。
49.權(quán)利要求41-47中任一項的化合物，其中所述細胞是真核細胞。
50.權(quán)利要求48的化合物，其中所述細胞是大腸桿菌細胞。
51.權(quán)利要求49的化合物，其中所述細胞是哺乳動物細胞、酵母細胞或昆蟲細胞。
52.權(quán)利要求51的化合物，其中所述哺乳動物細胞是CHO細胞、HeLa細胞或HEK293F 細胞。
53.權(quán)利要求51的化合物，其中所述細胞是sf9細胞。
全文摘要
本文公開了吡咯賴氨酸類似物吡咯啉-羧基-賴氨酸(PCL)，以及生物合成產(chǎn)生PCL的方法，其中PCL是天然的、生物合成產(chǎn)生的氨基酸。本文還公開了具有摻入其中的PCL的蛋白質(zhì)、多肽和肽，以及將PCL摻入蛋白質(zhì)、多肽和肽中的方法。本文還公開了位點特異性衍生化具有摻入其中的PCL或吡咯賴氨酸的蛋白質(zhì)、多肽和肽的方法。本文還公開了具有摻入其中的PCL或吡咯賴氨酸的蛋白質(zhì)、多肽和肽的交聯(lián)。
文檔編號C07K2/00GK102264697SQ200980152207
公開日2011年11月30日 申請日期2009年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月24日
發(fā)明者B·蓋爾斯唐格爾, J·格魯內(nèi)瓦爾德, S·E·塞利蒂, T·克羅斯格羅弗, W·歐, 哲郎 宇野, 邱顯博, 郝學(xué)士 申請人:Irm責(zé)任有限公司